This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

V E R T E I L U N G V O N P L A S M A G R A N U L A 3 1 3

Die Verteilung von Plasmagranula* bei der Sporenbildung von Sacdiaromyces-Bäckerhefen

V o n E . B A U T Z

Aus dem Forstbotanischen Institut der Universität Freiburg i. Br. ** Z. Naturforschg. 10 b, 313—316 [1955]; eingegangen am 15. April 1955)

Plasmagranula, welche sidi mit der „klassisdien Mitochondrien-Darstellungsmethode" nadi A 11 m a n n anfärben lassen, wurden während der Meiosis (Sporenbildung) untersucht. Bei der 1. meiotischen Teilung wird sowohl die Plasmamenge der Hefezellen ( = Asci) als auch deren Anzahl von Granula annähernd 1 : 1 verteilt. Nach erfolgter 2. Teilung ist dagegen die Gesamtzahl der in den Tetraden vorhandenen Granula vermehrt, ebenso die Plasmamenge. Aber auch bei dieser 4-Sporenbildung scheint eine verhältnismäßig geregelte Verteilung erfolgt zu sein. Weiterhin wurde mit der Nadi-Lebend-Reaktion die Aktivität oxydierender Fermente geprüft.

In einer früheren Mitt. ( B a u t z und M a r q u a r d t 1953 1 ) berichteten wir über die Anzahl und statisti-

sche Verteilung der „Grana mit Mitochondrien-Funk-tion" 2 („Mitochondrien") 3, welche sich mit den ver-schiedensten Mitochondrien-Farbstoffen, z. B. nach A l t m a n n 4 , oder dem Nadi-Reagens 5 ' 6 nachweisen ließen. Diese Untersuchungen waren an ruhenden und knospenden Kulturen, somit auch der Mitose, einer untergärigen Bierhefe, Sacdiaromyces cerevi-siae (Weihenstephan) und der atmenden Rhodoto-rula rubra durchgeführt worden. — Da uns nun die statistische Verteilung der Plasmagranula bei der Mi-tose bekannt war, beabsichtigten wir, auch die Ver-hältnisse bei der Meiosis (Sporulation der Hefe) zu studieren. Wir untersuchten deshalb die zu etwa 8 0 % sporulierende Bäckerhefe Sacdiaromyces cerevisiae var. ellipsoideus Yeast foam 7.

E p h r u s s i 8 u. a. hatten an Bäckerhefen festge-stellt, daß bei der Sporulation stets die Möglichkeit zur Atmung vorhanden sein muß. Wir prüften des-halb unsere sporulierenden Hefen auch mit dem Nadi-Reagens auf oxydierende Fermente.

* Diese Plasmagranula werden in der neueren botan. Literatur, obwohl sie mit verschiedenen gebräuchlichen Mitochondrien-Darstellungsmethoden anzufärben sind, als Sphärosomen bezeichnet (s. E. B a u t z , Ber. dtsch. Bot. Ges., im Druck).

** Mit Unterstützung der D e u t s c h e n F o r -s c h u n g s g e m e i n s c h a f t .

1 E. B a u t z u. H. M a r q u a r d t , Naturwissenschaf-ten 40, 531 [1953].

2 H. M a r q u a r d t , Ber. dtsch. Bot. Ges. 65, 197 [1952],

3 E. B a u t z , Ber. dtsch. Bot. Ges. 67, 281 [1954],

Material und Methode

Die Yeast /oam-Kulturen wurden in 12% zucker-halti-ger steriler Bierwürze bei 30° C gezogen. Zu Untersudiun-gen mit „normal sich vermehrenden (knospenden)" Hefen verwendeten wir stets 48 Stdn. alte Kulturen. Um Sporen-bildung zu erhalten, gaben wir 2-Tage-Kulturen auf ste-rile Gipsblöckchen, welche mit Aqua dest. feudit gehalten wurden (Methode nach H a n s e n 1911) 9>10.

Die Plasmagranula wurden zunächst mit der „Mito-chondrien-Färbung nach A l t m a n n 4 " dargestellt. Ent-sprechend den Angaben R o m e i s 1948 fixierten wir die Hefen in 2-proz. Osmiumsäurelösung und Kaliumbi-chromat oder lediglich in Osmiumsäurelösung bzw. 0 s 0 4 -Dämpfen. Die Färbung erfolgte mit Säurefuchsin (Grüb-ler), die Differenzierung in Pikrinsäure. Die empfohlene Farbkonzentration mußte bei unserem Versuchsobjekt auf 1/i—V8 verdünnt werden.

Zum Nachweis oxydierender Fermente verwendeten wir die Indophenolblau-Reaktion in der Variation nach P e i -n e r 5 . P e r n e r hatte das Nadi-Reagens für pflanzlidie Objekte als Lebend-Reaktion ausgearbeitet. Hiernach wurde a-Naphthol und Dimethyl-p-phenylendiamin in dest. Wasser gelöst und Phosphatpuffer dazugegeben. Del PJJ-Wert betrug 6,8, und die Färbezeit dauerte 30 bis 35 Minuten.

4 B. R o m e i s , Mikroskopische Technik, München 1948.

5 E. S. P e r n e r , Biol. Zbl. 71, 43 [1952]. 6 E. B a u t z u. H. M a r q u a r d t , Naturwissenschaf-

ten 40, 531 [1953]. 7 Herrn Prof. W i n g e , Kopenhagen, danken wir für

die Überlassung von Hefestämmen. s B. E p h r u s s i , The Harvey Lectures 46, 45 [1952], 9 E. Chr. H a n s e n , Ges. Theoret. Abh. aus der

Praxis der Gärungsindustrie, Jena 1911. 10 A. J ö r g e n s e n , Die Mikroorganismen der Gä-

rungsindustrie, Jena 1940.

3 1 4 E. B A U T Z

Um die Größe unserer Hefezellen zu bestimmen, er-mittelten wir die Länge und Breite von jeweils 300 Hefe-zellen mit Hilfe eines Okularmikrometers von Zeiß. Aus den erhaltenen Werten konnten die Hefen, welche ja eine weitgehend ellipsoide Form besitzen, als Ellipsenfläche berechnet werden. (Da die „Dicke" von Hefezellen nicht zu messen war, mußte von einer Berechnung des Hefe-volumens als Rotationsellipsoid abgesehen werden.)

30 r

77 22 27 32 37 Anzahl der P/asmagrana ("Mitochondrien")

Abb. 1. Korrelation zwischen Zellgröße und Anzahl der Plasmagranula (Altmannfärbung).

Ergebnisse

1. Zum Vergleich mit unseren früheren Mitochon-drien-Untersuchungen bei der Zellknospung färbten wir auch für die Auszählungen während der Specu-lation zunächst unsere Yeast-foam nach Altmann. Bei einer normal sich in Bierw ürze vermehrenden 2 Tage alten Kultur stellten wir zunächst fest, daß entspre-chend der untergärigen Bierhefe auch bei der Yeast /oam-Bäckerhefe eine deutliche Abhängigkeit zwi-schen Zellgröße und Anzahl von Plasmagranula pro Hefezelle besteht. — Aus Längen- und Breitenmes-sungen von je 300 Yeast foam-Zellen und parallel dazu den Auszählungen der nach Altmann gefärbten Plasmapartikel konnten wir eine tatsächliche positive Korrelation zwischen der Fläche der Hefezellen (als Ellipsenfläche berechnet) und der Anzahl dieser „Mi-tochondrien" nachweisen (Abb. 1).

Der Mittelwert aus diesen „Mitochondrienzahlen" lag bei 24—25 pro Yeast foam-Ze\\e, während die Bierhefe Weihenstephan nur 13—14 besaß.

2. Nachdem wir nun sowohl die Größe als auch die Anzahl von Plasmagranula = Sphärosomen („Mito-chondrien") der Yeast /oam-Normalkultur ermittelt hatten, konnten wir nun die Vorgänge während der Sporulation genauer untersuchen.

Abb. 2 a. Verteilung der Plasmamenge bei der 1. meio-tischen Teilung, n = gesamte Plasmamenge in der Spore, wovon r in der einen und n-r in der 2. Spore enthalten

sind.

Summenhäufigkeit %-100 [%] —

Abb. 2 b. Verteilung der Plasmagranula bei der 1. meio-tischen Teilung, n — Anzahl der „Mitochondrien" (Gra-

nula), r in der einen, n-r in der anderen Spore.

Zur Sporulation wurden 2 Tage alte Hefe-Kulturen auf mit dest. Wasser getränkte, sterile Gipsblöckchen gebracht9. Diese Hefen wurden dannn, bevor die Sporenbildung einsetzte (nach etwa 24 Stdn.), ge-prüft. Auszählungen und Messungen ergaben, daß die Anzahl der Plasmagranula vollkommen und die Größe der Hefezellen (Fläche der Hefe minus Va-kuolenfläche) annähernd unverändert blieb, soweit unsere summarischen Messungen dies erschließen las-sen. Sobald die Sporenbildung einsetzte und bei einem großen Teil der Mutterzellen (Asci) die erste meiotische Teilung erfolgt und somit 2 Sporen ent-standen waren, ergaben die Auszählungen der Grana pro Spore, daß die Verteilung von Plasma und Grana ziemlich gleichmäßig 1 : 1 verlaufen war. Von dieser Idealverteilung traten allerdings häufig geringe Abweichungen auf. In seltenen Aus-nahmefällen fanden wir aber auch stärkere Fehlver-teilungen, bei welchen man sofort eine große und eine kleine Spore erkennen konnte. In Abb. 2 a und 2 b sind die Verteilungen als Summen-Häufigkeits-Kurven statistisch dargestellt11. Abb. 2 a zeigt die

11 Herr Dr. P. I h m , Bot. Inst. Freiburg, gab mir Rat-schläge für die statistisdie Berechnung.

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1. meiot. Teilung 2. Teilung 2 Sporen 4 Sporen

Fläche 17,06 26,1

Anzahl der Plasmagranula 24,5 30

Häufig-keit [%]

Stärkste Abwei-chung v. Ideal-

verteilung [°/ol

a) 4 gleiche Sporen 1. b) 2 gr. u. 2 kl.

c) 1 kl. u. 3 gr. 1 gr. u. 3. kl.

50 30

4 20 33

a) 4 mit derselben Grana-Anzahl

2. b) 2 mit gr. u. 2 kl. c) 1 mit kl. u. 3 mit gr.

1 mit gr. u.3 mit kl.

54

31

9

26 32

Tab. 1. Plasmamenge und Anzahl Granula innerhalb der Asci (Werte aus jeweils 300 untersuchten Asci).

Aufteilung der Plasmamenge und Abb. 2 b diejenige der Plasmagranula. Beide Abbildungen zeigen einen einander sehr ähnlichen Verlauf.

Bei der verwendeten Darstellungsmethode wird auf der Abszisse die Summenhäufigkeit r/n. 100 ( % ) eingetragen, n ist die Gesamtplasmamenge, aus den beiden Sporen berechnet, davon enthält eine Spore r und die andere n-r Plasma. Auf der Ordinate kann man die Häufigkeit in Prozenten errechnen (die Häu-figkeitsprozente für die einzelnen aus der x-Achse zu entnehmenden Werte kann hier nicht direkt auf der Ordinate abgelesen werden, sondern muß jeweils, also für jeden Wert, aus der Prozent-Einteilung er-rechnet werden).

Z. B. finden wir in Abb. 2 a auffallend oft die Summenhäufigkeit 5 0 % , d. h. 5 0 % der Gesamt-plasmamenge ist in der einen Spore und 5 0 % in der anderen. Wir lesen auf der Y-Achse für die Häufigkeit dieser Idealverteilung 4 1 — 6 0 % , d.h. 19% unserer untersuchten Asci hatten die ideale 1 : 1 Verteilung.

Bei der Aufteilung der Plasmamenge ist die Ab-weichung von der 1 : 1 Verteilung geringer als bei der Granula-Verteilung. Bei der Plasmaverteilung be-trug die Abweichung bei 80 %, dem weitaus größten Teil der untersuchten Asci, nur 1 9 % der höchstmög-lichen Abweichung (Abb. 2 a: y-Achse 1 0 — 9 0 % ; x-Achse 42—61%) ; bei der Verteilung der Partikel ist sie 2 7 % (Abb. 2 b: y-Achse 1 0 — 9 0 % ; 4 0 — 6 7 % ) .

Wir dürfen nach diesen Berechnungen sagen, daß bei der 1. meiotischen Teilung sowohl die Plasma-menge als auch die Anzahl der Plasmagranula = Sphärosomen („Mitochondrien") ziemlich gleichmäßig auf die beiden Sporen verteilt wird.

Wir verfolgten nun die Sporenbildung weiter und färbten wiederum nach Altmann, sobald in den mei-sten Asci die jeweils 4 Sporen zu erkennen waren. Asci mit 3 oder 5 Sporen wurden nicht untersucht. — Nach den bisherigen Ergebnissen aus dem 2-Sporen-Stadium würde man nun einfach eine weitere Halbierung der bei der 1. Teilung entstandenen Spo-

Tab. 2. Verteilung von 1. Plasmamenge und 2. Granula innerhalb der Tetraden (Untersuchungen von je 300 Asci).

ren erwarten. Es stellte sich aber heraus, daß die Größe der 4 Sporen zusammengerechnet, sowie die Anzahl sämtlicher Plasmagrana der 4 Sporen, größer war als bisher (Tab. 1). Die 4 Sporen besitzen ins-gesamt etwa 30 Granula und damit jede einzelne im Idealfall 7—8. Aber auch bei diesen Auszählungen erhielten wir Abweichungen von den Erwartungs-werten. Etwa die Hälfte aller untersuchten Asci hatte 4 Sporen mit nahezu gleicher Größe und derselben Anzahl von Plasmagranula also kaum bemerkenswerte Abweichungen von einer 1 : 1 : 1 : 1 Verteilung. 3 0 % der geprüften Asci besaßen jeweils 2 große und 2 kleine Sporen mit entsprechend Granula, deshalb war natürlich die Abweichung von der Idealverteilung er-heblich größer (20—26%). Die restlichen 1 5 — 2 0 % Asci hatten entweder 1 große und 3 kleinere oder auch 1 kleine und 3 größere Sporen (Tab. 2).

Es zeigte sich somit, daß die Verteilung bei den Tetraden, den 4 Sporen, ziemlich geregelt 2 5 : 2 5 : 2 5 : 2 5 % erfolgt sein mußte, obgleich ja die Gesamtplasmamenge und Granulazahl inzwischen zu-genommen hatte.

In einigen Asci (bis zu 10%) fanden wir u. U. kleine Portionen von Plasma mit 1 bis zu 4 dieser Plasmapartikel außerhalb der Sporenmembranen lie-gend. Somit waren geringe Mengen von Plasma und vor allem auch Plasmapartikel nicht mit in die beiden Sporen der 1. Teilung gelangt.

3. Als Ergänzung zu den beschriebenen Beobach-tungen wurden mit der sporulierenden Yeast foam auch Nadi-Reaktionen an lebenden Hefezellen durch-geführt. Bei den Würze-Kulturen zeigten nur 8 0 % der Hefezellen eine schwache Indophenol-Blaufär-

3 1 6 V E R T E I L U N G V O N P L A S M A G R A N U L A 316

bung. Die Plasmagranula waren bei diesen Kulturen nur blaß- oder hellblau angefärbt. Im Gegensatz zu den Hefen aus dem flüssigen und 12% zudcer-halti-gen Nährmedium hatten nach 24-stdg. Aufenthalt auf dem mit dest. Wasser getränkten Gipsblöckchen 90 % der Hefezellen blaue oder tiefblaue Sphärosomen („Mitochondrien"). Auch nadi 2 bis 3 Tagen blieb die Färbung bei den inzwischen zu Asci gewor-denen Hefen sehr intensiv. Wir fanden sowohl rein nadi-positive als auch negative Tetraden. In sel-tenen Fällen, in etwa 1 % , fanden wir auch Asci, bei welchen die einzelnen Sporen verschieden reagierten, und somit positive und negative Sporen in ein und demselben Ascus vorkamen.

Diskussion der Ergebnisse

Wir konnten in der vorliegenden Arbeit die Er-gebnisse, welche E p h r u s s i 8 u. a. aus genetischen Kreuzungsexperimenten erhielten, nämlich, daß wäh-rend der Sporenbildung eine starke Atmungsaktivität vorhanden sein muß, zytologisch mit Hilfe der Nadi-Reaktion bestätigen. Bei unserer in Würzemedium nur gering atmenden, entsprechend auch nur zu einem Teil und zudem schwach indophenolblau-bil-denden Yeast foam nahm die Intensität der Nadi-Färbung und Anzahl positiv reagierender Hefen zu Beginn der Sporulation erheblich zu.

Die mit Indophenolblau- oder mit Altmannfärbung nachweisbaren Plasmagranula werden während der Sporenbildung und somit der Meiosis (Reduktions-teilung) einigermaßen geregelt weitergegeben. Wir konnten statistisch belegen, daß sowohl die Plasma-masse als auch die Plasmagranula bei der ersten meiotischen Teilung annähernd 50 : 5 0 % auf die bei-den zunächst entstandenen Sporen verteilt werden. Bei 8 0 % , dem größten Teil der Asci, ist die Abwei-chung von der Idealverteilung ziemlich gering, und nur etwa 2, evtl. 8 % , haben eine stärkere Fehlver-teilung.

Bei der Verteilung der Plasmamenge war die Streuung ganz allgemein kleiner, d. h. es wurde exak-ter aufgeteilt als bei der Verteilung der Plasmaparti-kel. Wir nehmen an, daß schon bei der Korrelation die Streuung von Zellgröße und Granula-Anzahl hier-bei sehr ins Gewicht fällt. Außerdem hatte sich zei-gen lassen, daß bei einigen Asci kleine Mengen von Plasma, vor allem aber einzelne Granula, außerhalb

der Sporenmembran liegen können und somit nach Beendigung der Sporulation und dem darauf-folgen-den Auskeimen der Sporen zugrunde gehen müssen. Diese Tatsache bewirkt eine zusätzliche Streuung bei der Granula-Verteilung.

Im Gegensatz zu den annähernd idealen Verteilun-gen bei der 1. meiotischen Teilung waren die Anzahl dieser Granula, und die Größe bei den in der 2. meiot. Teilung entstandenen 4 Sporen vermehrt. Wir müs-sen demnach wohl annehmen, daß inzwischen schon ein Wachstum der Sporen begonnen hatte. Aber auch bei der 2. Teilung scheint eine verhältnismäßig ge-regelte Verteilung vor sich gegangen zu sein.

Vergleichen wir nun diese Befunde aus den Unter-suchungen während der Reduktionsteilung (Meiosis) mit früheren Berichten über die Verteilung dieser Plasmapartikel bei der Tochterzellbildung (Mitose), so können wir zunächst in beiden Fällen eine Weiter-gabe von Plasma der Mutterzelle mit einer entspre-chenden Anzahl von Plasmapartikeln verfolgen.

Es zeigten sich aber außerdem noch gewisse Unter-schiede zwischen dem Verhalten bei Mitose und Meiosis der Hefen. Bei der Mitose wird die Vertei-lung in gewisser Weise vorbereitet. Knospende Hefe-zellen sind bekanntlich größer und haben mehr Plasmapartikel oder Sphärosomen („Mitochondrien") als Zellen aus nicht-teilenden, ruhenden Kulturen. Die knospenden Mutterzellen geben aber nicht, wie man etwa erwarten würde, die Hälfte, sondern nur einen geringeren, oft sehr unterschiedlichen Teil ihres Plas-mas einschließlich Plasmapartikel an die Tochterzellen weiter (auch M u n d k u r 1 2 hatte eine Einwanderung von solchen Plasmapartikeln, die er Mitochondrien nannte, in die Tochterzellen beobachtet). Die Tochter-zellen sind bei der Loslösung von der Mutterzelle sehr verschieden groß, mit 3, maximal 12 „Mito-diondrien" = Sphärosomen. Durchschnittlich erhalten sie etwa 4 — 5 dieser Plasmapartikel. Bei der Meiosis wird dagegen die Mutterzelle, welche aus teilenden Kulturen stammt, selbst direkt aufgeteilt, bei der 1. meiot. Teilung annähernd 50 : 5 0 % und durch die 2. Teilung ebenfalls ziemlich gleichmäßig auf die vier Sporen verteilt.

Frl. E. F u h r m a n n , techn. Assistentin der D e u t -s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t , danke ich für die Mithilfe bei der Arbeit.

12 B. D. M u n d k u r , Nature [London] 171, 793 [1953].

Gottfried Bringmann und Renate Kühn, Ergänzende Befunde zur Mikromorphologie der Blüten-Cuticula (S. 317)

Abb. 1. Iris germanica. Cuticula der Innenseite der Blü-tenröhre. Vergr.: 1 : 32 000.

Abb. 6. Fragaria orientalis. Cuticula des Staminodien-Filamentes. Vergr.: 1 : 32 000.

Abb. 2. Hydrangea macrophylla. Cuticula vom Filament. Abb. 7. Wisteria sinensis. Cuticula der Außenseite des Vergr.: 1 : 32 000.

Abb. 3. Hydrangea macrophylla. Cuticula der Innenseite des grünen Blütenblattes. Vergr.: 1 : 32 000.

Schiffchens. Vergr.: 1 : 32 000.

Abb. 8. Brassica rapa. Cuticula der Antheren. Vergr.: 1 : 32 000.

Abb. 4. Hydrangea macrophylla. Cuticula der Innenseite des grünen Blütenblattes. Vergr.: 1 : 32 000.

Abb. 5. Rhododendron spec. Cuticula der Oberseite des inneren Blütenblattes. Vergr.: 1 : 32 000.

Zeitschrift für Xaturforschuni» 10 b. Se i te 316 a

Abb. 9. Wisteria sinensis. Cuticula der Außenseite des Flügels. Vergr.: 1 : 32 000.

Abb. 10. Hydrangea macrophylla. Cuticula der Innenseite des grünen Blütenblattes. Vergr. 1 : 32 000.

Abb. 11. Prunus cerasus. Cuticula der Innenseite des Blü-tenblattes. Vergr.: 1 : 1200.

Abb. 12. Brassica rapa. Cuticula der Antheren. Vergr.: 1 : 1700.

Abb. 13. Scilla sibirica. Cuticula der Innenseite des Blü-tenblattes. Vergr.: 1 : 1200.

Zeitschrift für Xaturforschuni» 10 b. Se i te 316 a

Abb. 14. Medicago sativa. Cuticula der Innenseite des Flügels. Vergr.: 1 : 1200.

Abb. 15. Hydrangea macrophylla. Cuticula der Antheren. Vergr.: 1 : 1200.

Abb. 16. Cyclamen persicum. Cuticula der Oberseite des Blütenblattes. Vergr.: 1 : 1200.