differential sorting of snap-25a and snap-25b proteins in neuroblastoma cells

9
Differential sorting of SNAP-25a and SNAP-25b proteins in neuroblastoma cells Johan Andersson a , Gabriel Fried b , Lena Lilja a , Björn Meister c , Christina Bark a1) a Department of Molecular Medicine, Karolinska Institutet, Karolinska Hospital, Stockholm/Sweden b Department of Woman and Child Health, Karolinska Institutet, Karolinska Hospital, Stockholm/Sweden c Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, Stockholm/Sweden Received April 14, 2000 Received in revised version July 11, 2000 Accepted July 12, 2000 Exocytosis ± synaptic proteins ± cell lines ± transport ± subcellular distribution Exocytosis is mediated by high-affinity interactions between different SNARE proteins. The existence of several variants of each SNARE protein suggests that the specificity of fusion may be directed by unique combination of SNARE family members. We examined if two alternatively spliced variants of synaptosomal-associated protein of 25 kD, SNAP-25a and SNAP-25b, possessed distinct cellular distribution if co- expressed within the same neuroblastoma cell. Double-label- ling immunofluorescence histochemistry in combination with confocal laser microscopy of individual cell clones revealed a different subcellular localisation pattern for the two SNAP-25 variants. Sucrose density gradient centrifugation of cell homogenates followed by Western blotting showed that the SNAP-25 protein variants associated with intracellular organ- elles of different density. Taken together, this study shows that two alternatively spliced variants of SNAP-25, differing in only nine amino acids, possess distinct properties at the level of intracellular trafficking, suggesting that the cellular localisa- tion of SNAP-25 protein is regulated at the level of mRNA splicing. Abbreviations. dBcAMP Dibutyryl cyclic AMP. ± ECL Enhanced chemilu- minescence. ± mRNA Messenger RNA. ± PVDF Polyvinylidene difluoride. ± SNAP-25 Synaptosomal-associated protein of 25 kDa. ± TxRd Texas Red Introduction Regulated vesicular secretion in neurons and neuroendocrine cells is mediated by a 7S core complex comprised of t- target membrane) SNAREs SNAP-25 and syntaxin, and v- vesicle membrane) SNARE synaptobrevin/VAMP proteins. This ternary complex of SNARE proteins is similar to fusion machineries that traverse intracellular membrane traffic in all cells Söllner et al., 1993a, b; Rothman, 1994; Südhof, 1995; Hanson et al., 1997; Martin, 1997; Gerst, 1999). Presently, the leading hypothesis is that it is the formation of this ternary complex that drives membrane fusion Fasshauer et al., 1997; Hanson et al., 1997; Lin and Scheller, 1997; Jahn and Hanson, 1998; Poirier et al., 1998), and it has been shown that recombinant v- and t-SNARE proteins reconstituted into separate lipid bilayers promote spontaneous fusion Weber et al., 1998). SNAP-25 was first identified as a neuron-specific mRNA in murine brain and the protein was discovered to predominantly localise in nerve terminals Branks and Wilson, 1986). SNAP- 25 is widely but differently distributed in the nervous system and in neuroendocrine and endocrine cells with an onset of gene expression that correlates to neuronal maturation Oyler et al., 1989; Catsicas et al., 1991; Bark and Wilson, 1994a; Jacobsson et al., 1994). Direct evidence of SNAP-25 involve- ment in neurosecretion was determined when SNAP-25 was identified to be the substrate for botulinum neurotoxins serotypes A/E Huttner, 1993; Washbourne et al., 1997; Ludger and Galli, 1998; Montecucco, 1998), and by direct mutational analysis of the carboxy-terminus of the protein Criado et al., 1999). The enzymatic cleavage of SNAP-25 results in inhibited synaptic transmission Blasi et al., 1993; Schiavo et al., 1993). However, evidence indicating a func- tional role for SNAP-25 in neurite extension of cultured cells in vitro and axonal elongation in vivo suggests also other capacities for this protein Osen-Sand et al., 1993). There exist two isoforms of the protein, which are generated by obligate alternative splicing between two similar but distinct exons 5a and 5b Bark, 1993; Bark and Wilson, 1994a). The alternative splicing modifies a domain of the protein which is substrate for palmitoylation and is required for the association of SNAP-25 with plasma membranes Hess et al., 1992; Veit et al., 1996; EJCB 781 European Journal of Cell Biology 79, 781 ± 789 2000, November) ´ Urban & Fischer Verlag ´ Jena http://www.urbanfischer.de/journals/ejcb 0171-9335/00/79/11-781 $15.00/0 1) Dr. Christina Bark, Department of Molecular Medicine, Karolinska Institutet, Karolinska Hospital L1:01, S-171 76 Stockholm/Sweden, e- mail: [email protected], Fax: 46 8 30 34 58.

Upload: johan-andersson

Post on 21-Sep-2016

212 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

����������� ������ �� ������� ��� �������������� �� ����������� ��

����� �������� �� ��� ���� � ���� ������� ���� ������� ������� ������� ��������� �� ����� �� ��������� !������� "���� ���� !������� #������� $��������%$&���� ��������� �� '���� ��� ����� #������ !������� "���� ���� !������� #������� $��������%$&����� ��������� �� (� �������� !������� "���� ���� $��������%$&����

)����*�� ���� �+� ,---)����*�� �� �*��� *���� � �. ��� ,---�������� � �. �,� ,---

���������� ������� � ����� ���� ���� � ���� � ���������� ���� ������

���������� �� ����� � ������������� ����������� ���������� ����� �������� �� ������ �� ����� �������� ����� ����� ������ ������� ���� �� ���������� �� �������� ������ � ����� �� ������� �� ����� ����� ��� ����� �� ��� ����������� ������ �������� ����������������������� ������ �� !" #$% ���&�!"� ������&�!" % ������� �������� ������� ������ ����� �� ��������� ������ �� �� ���� ������ ���� $�� ���� ������ ������������� ������������ �� �� ������� ������������ ���� ��������� �� ���������� ��� ����� ����� �������� �� ������� ������������ ������ ��� �� ��� ���&�!"��������� ������ ������ ������� ������������� �� ����������� ������� � ���� ������� ����� ���� �����&�!" ������ �������� ��������� ���� ������������ ��������� �� ������� ������� ��#� ������% ���� ����� ����� ������� ����������� ������ �������� �� ���&�!"% �������� �� ������� ���� �����% ������ �������� �������� �� �� ��� �������������� �������#���% ��������� ���� �� ������� ������������� �� ���&�!" ������ �� ������� �� �� ��� �� ������������

������������ ������ ��� � � � ��� ���� � ��� �������� ����������������� � ������������� ���� � ���� � � !� ����� �"�� ���� �#����$% # ��&� � ������� ����� &� ��� " $% '��� � ()�� (�)�� ���

������������

)�/ ����� *��� �� ������� �� �� �� ��� �� ������������� � �������� . � 0$ ��� ������1 ������� �� �2 3��/��

��� ���� $(�)4 $(�52,6 ��� .���1��� ��� *2 3*�������� ���� $(�)4 .����� �*��%7��5 ������8 9������. ������1 �� $(�)4 ������ � ����� �� � ������������ ���� ��*�� �������� �� ��� ��� ������ �� ������� 3$����� �� ��8� �::;�� < )������� �::+< $=����� �::6<#���� �� ��8� �::0< ������ �::0< ���� �:::�8 5�����.� ���������/ �.������ � ���� �� � ��� �������� �� ��� ����.������1 ���� ��*� ��� ��� � ��� 3���� � �� ��8� �::0<#���� �� ��8� �::0< ��� ��� $������� �::0< ���� ��� #������::>< 5���� �� ��8� �::>�� ��� �� �� ��� ��&� �������� ����� *2 ��� �2$(�)4 ������ ������� ��� ���������� ����� ���.� ������ �������� � ��� 3'� ��� ��8� �::>�8$(�52,6 &� ��� ���������� � � �� ��2������� �)(� ��

� ��� ��� ��� ��� ������ &� ����*��� �� �����������.������� �� ��*� ������� 3���� ��� '����� �:>?�8 $(�52,6 � &����. � ���������. ���� ��� �� ��� ��*� .������ �� �� ��������� ��� �������� ���� &��� �� ���� ��/��� �1����� ���� ������� �� �� ���� ��� ����� 3@.���� ��8� �:>:< ������ �� ��8� �::�< ��� ��� '����� �::+�<���� �� �� ��8� �::+�8 ����� �*������ �� $(�52,6 ��*��*�2���� �� �� �������� &� ��������� &��� $(�52,6 &����������� �� � ��� ���� �� �� ��� � �� ���1�����.�� �%4 3# ����� �::;< '�� � �� �� ��8� �::0<� �/� ��� ������ �::>< ������ ���� �::>�� ��� . ������ �������� ����.� �� ��� �� �1.2����� �� ��� ������3����� �� ��8� �:::�8 9�� ��A.����� ����*�/� �� $(�52,6� �� �� ���� ���� .������ �������� 3���� �� ��8� �::;<$����*� �� ��8� �::;�8 #�&�*�� �*������ ���������/ � � ��2������ ��� �� $(�52,6 �� �� ��� �1������ �� � �� �� ���� ��*��� ��� �1���� ����/����� �� *�*� //�� ��� ������������� �� ��� ������ 3@��2$��� �� ��8� �::;�8 9��� �1���&� ����� �� ��� ������� &���� �� /������� . � ��/�����������*� ������/ ��&��� �&� ����� � ������� �1�� 6���� 6 3���� �::;< ��� ��� '����� �::+��8 9�� ��������*�������/ ������� � ������ �� ��� ������ &���� � ���� ���������.������ ��� � �B ��� �� ��� ��������� �� $(�52,6&��� ����� ��� ��� 3#� �� ��8� �::,< 7��� �� ��8� �::?<

���� � !��� &��� * ����� " ���� � � � �"+ ,-. � ,-/ 0$111+ � !����2 3 4 5���6 ������ ������ 3 *������&788999�����"��������8: ������8�:�

-�0�2:;;6%--%0:%��20>� C�68--%-

�� �8 ������� ���� ��������� �� ����� �� ��������� !�������"���� ���� !������� #������ ��D-�� $2�0� 0? $��������%$&����� �2����D �������8���E������8��8�� ��1D � +? > ;- ;+ 6>8

���� ��� �� � �::0< ���A��� �� ��8� �:::< !������ �� ��8� �:::�8$� ��� �� �)(� �1����� ��*� ���������� ���� $(�52,6� ������ � ��*�����������. ����� ��� �� � ����������� &���� ��� $(�52,6 ������� � ��� � �� ���������� ����� �� �� �� ��� 3��� �� ��8� �::6�8 $(�52,6������� /� �1���� �� �����*� ��&� ��*�� ���� ��� $(�52,6 ������ � ��� �������� ����� �� �� ��������� ���� ��� ��������� ��� � �� � �� �� �� ������ 3���� �� �� ��8��::+< ��� �� ��8� �::6< ���� �� ��� ������ �::?< �������2����� �� ��8� �:::�8 #�&�*�� ��� � �������� ��������� ��&��� ���� �&� $(�52,6 ������ ����� �� ����� �����8'� �.�������� ���� ��� ��������� ��&��� $(�52,6� ���

$(�52,6 ������ �� � ��� ���2 �����/ ������ &� �������� ��� �������� �� ���� ���� ��� ���������/ �� $(�52,68 "� ��� �� ��� ��� ��� ����.� &� �� ��� ��� �����(��-> F �6 �� � ������ ���� ���� �� /������ ��& ����������� ��*��. �1����/ ��//�� *����� �� ��� ���.�������89�� ���� ���� (��-> F �6 � � �. �� ��&��� ��� �� ��� � ������ ���� ���� (�>9�, ��� � �� /����� ���� ���� �?2�G2� 3(���� �� ��8� �:0?�8 '� ��*� ����� � ��*�� ������� ���� ������ �. � �. $(�52,6� ��� $(�52,6 ������ &���2�� ��� ��� �� � ������ ����� . ��/ �1����� ���� ��&��� �������� �������2��/ ����� �� ��� �� �1.2������� ����� �������� $(�52,6 �����8 ���� /�������/ �� ������������ �� (��-> F �6 ���� ��2�1����/ $(�52,6���� $(�52,6 � &� ��*� ����.�� ��� ���� �� ���� ������ $(�52,6� ��� $(�52,6 ��/ ��� ���� ���������� ���� &��� ��� �������. ��� ��� �����. ������ 2/����� �����&�� . ��� �� ������/8

#������ ��� ���$��

%�&��� ��������������%9� ����.� �� ��� $(�52,6� ��� $(�52,6 �)(� &�� ����/�2�� �. �1���� �� (��-> F �6 ����� ����� )(�&� ������� ��� ������ � �� � ��/ ��� )(��. ���� !�� 3H"��4( �� #� �����.��������/ �� ��� ��� ���� �I ��� �����8 )9 3�*�� ������2����25�) &� ������� ��/ ��� $ ��$����9� )925�) $.���3���� 9�������/�� "��� ������ /� ��� G$��8 @�� ��������� ���������/ �� �1�� , ��� �� $(�52,6� ��� $(�52,6 � 6�2�9� ��� ��� ��� ��� ��� �9�2;�� ��� �&� �����2����������� ������� �� �1�� 6�� 6�29�� 9�9 ��9 9�� 9�� �99 �99��2;�� ��� �1�� 6 � 6�2��9 ���9�� �99 ��9 ���9��2;� &��.������� 3���$��� 5��� ������8 9�� 5�) ������������� &�������� ��/ �- ���� ����� ���� ��� �- ���� �� �����$(�52,6�2 � $(�52,6 F ������� ���� &��� �� ��������/ ���2���� � �� 6- �� ��� �� ;6 �.���8 9�� ��������� 5�) ��� �� &��������� �� � ,J �/��� /��8

�� ������(��-> F �6 ���� &�� � ������ ��� �9��� #�2�,;�08 ���� &������������ �� � � ����I �������� 4�/��I ���� � 3�� ���%9����� ��� �������� $&����� ���������� &��� �-J ������ ���� � �3$7�� #�K� ������� $&������ -8;J (�#�@;� + �� �2/� �������� �� (�2�. *��� ��� �-- �/%�� ����������%������.��� 3�������!�� ������ �����.� ��� ���� �� ;0 �� �� � � �������� ��� ��� &���:6J ��%6J �@,8 ���� &�� ������������� &��� -86 �� ���5 ������5 3$�/��� $� �� �� �@� G$��8

'���������� ��� �����$���� �� ���� ���������� 3�� �-6� &�� ������ ���� ;62�� ������ ���� 3( ��� )�������������� ������ &��� + F ? �/ �����/��%��, 3$�/��� ��� /�&� �� ,+

�� 8 9��������� &�� ������� ��/ ������������� ��� @���2�4�� ��� ��� ������� /�*�� . ��� ��� ���� � &� �����&�� 3����9�������/�� "��� ������ /� ��� G$��8 ��� ������� �� ��//��$(�52,6� ��� $(�52,6 �1����� ������ 3��� �� ��8� �::6���/���� &��� � ���2������� �1����� ���� �� &�� ��1�� �� �0 D0 D� ���� ��� ; �/ �� ��� �(� ��1� � &� ����� �� ���� ;62�������8 $�� �. ��������� ���� &�� ������� &��� �+�> 30-- �/%������ �� ���� ������ ����� &�� ����������8 $ �B ����. ��� �����&�� ���������8 @� ��� ���� ����� ����.�� �� $(�52,6� �����/� 2����� 3#��%$(�52,6 ���.� �1����� @9)20� @9)2> ��� @9)26&�� �� �� � ��� �1�������8 @� ��� ���� ����� ����.�� ��$(�52,6� ���.�%$(�52,6 #� �1����� 5G$�,� 5G$��: ���5G$�;, &�� ������� �� � ��� �1�������8

������������������� ��� (����� ������)��� ��� �������������� ��� '���� ��� ����.�� (��-> F �6 �����5G$ ���@9) ���� ����� &�� � �� �� �� ��� ������ �� �����5 ������ ��. 3�� � �*��8 ���� &�� �.�� �� 6 ��� �� �� 5�$ 3,80 ��!��� �8, �� !#,5@+� -86 �� �/��,� �;> �� (���� >8� ��(�,#5@+�� �J 9���� L2�-- � �J $�$ ��� � �� ����.�����.�2 ����.� �� ���� 35�$��� ��� ����/�����8 �.��� &�� ������ .������ /����� 3�?---�� 6 ����� ������� �� ��& � �� ��� �� ������ �������������� �1�������� ��� �.��� &�� �������� .�����/ +- �� ���� �� 3��� ������� $�� ���/�� ��� G$�� � ,- �������� �%� �/��� 3$���� � A �����������/.� �� ;- ���8 ����2������ ���� ��. #5�2� &� � �� �� ��� ����1 �� +- ��� �� + ��8 9���������� �.��� &�� ����� �� ���� � � �� ��� ��������������3?-- ��%� �<��- �/ ����� ������%��� 3, �� �� + ���8 9�� ����������&� &���� ���� ���� �� 5�$ ��� ���� ��� ��� M���������� ���N� ���������� &� ����*�� �� 6- �� ������/ �.� 3,-J /�.����� �-J �2��������������� +J $�$� -8--+J ��������� � �� �,6 �� 9�2#��� �# ?8>�8 ��'���� ��� ����.� �� ����� $(�52,6� �- �/ �� �����.��� &�� ����*�� �� ������/ �.�8 9�� ����� &�� ����� �� 6 ������ ������� . �-J � �,J $�$25��4 �� ����/ ��� 3,6 ��9�� ,-- �� /�.����� -8�J $�$� �# >8;�8 9�� ������ &�� ��������� �������� ��� ��� ��� 3#. ��� 4�� � 57��� ������ ����$������� � ����/������� G!� �� � ���)�� ��������� 3����� ���D ,6 �� 9�� �:, �� /�.����� ,-J ���������8 9�� ��� ���&�� ������ �*���/�� �� 5�$29 3?+ ��(�,#5@+� ,� ��(�#,5@+��-- �� (���� -8�J 9&���2,-�� ��� ;J ������ 3������ ����$������� �����&�� . �1����*� ����/ �� 5�$298 ����� &�� ��� ����&��� ����. ���� ���� 3�,��6� ,86 F 6 �/%��< ��� :4�- � �/%�� ����������� �� ��� ��������������������< $�">�� � D�---- �� ����.��� ����� $(�52,6 �� �.���� �� ������/ ��� �� � � �� ���������� � ��� &��� � � D�---- ��� ���� �� � ������� ���1����3#)5�2���� /���� � ��2����2�� � "/� ������. ���� ��. 3��2!@5�99$ ��� �������/��� ������� �� +6 ��� �� ��� ������2� �8 4�� 3�������� ������ ���������� &� ������� ��/ ���4�� 5� '���� �������/ )��/��� �������/ �� ��� ��� ���� �I��� ����� ���� ��� ����� &�� �1���� �� #.������2�5 3���2��� ���� $�������8 9�� �1���� ���� &�� ��*������ �� !���� �L,+����� �� &��� ��� ��1�� �� !���� ��+8�� ����.� �� ��� ���2��� �.������ �������� ���� �� ����2

/����� &�� ������ � ���� �� ���& � ������. ���� ����2/���A����� ��� �.��� &�� ������ /�� �� � ������� @����� 9�L ��������� /� ��/ � 9��2�,- ��1��2��/�� ��� �� ,>----���1 ��;- ���8 9�� ��� ��� ��� ��� ���2��� ������� &�� ���� ������ �� �-J $�$25��4 ��� ������� ���� 57�� ��� ������ ��� �� ������ � ���� �� � �*�8

���������������� ��������)�� ��� ���� ������� ����.�� @9) ��� 5G$ ���� ����� &�������� ���� �����/��2������ /�� ��*���� ��� /�&� �� ;62�������� ����8 ���� &�� � �����. ������������� &��� �����5 ������ ��. 3�� � �*�� ��� �� ��1����� ��� ��� ��������/8 $���2���� &� ������� � ���2������ �� #�2�������2��//�� $(�52,6 ������&��� ��� ���� &�� ��� ��� �� ������������ �� � �����/�� ���� �� �� �� �� ��&2� � ���� �8 � ��/ ���� ���������� � ������

� � *� ������� �+ ;� ���� �� ��� ����

������� �� ��� #�2��//�� ������ �//�/���� ���� �� � ����� ���� ��� 8 9� �*��� ���� ��� ����� ���� &�� ���� ��&� �� , F ; ��.� ������ ���� &�� � �� �� �� ��� �����8 ���� &�� ���� �� 5�$ ��� ��1���� ,- ��� �� ���2���� +J �����������.��8 ���� �- ��� �� �����2 �������� �� -8+J ������� ��� ���� &�� ������ �� � �� �� �-J/��� � � 3$�/���%5�$8 5���. ��� �� ������ ������. ���� ����&�� ������� �� ;- ��� ���� �� ������/ �� ���� &��� �1����*� ����/�� 5�$ �� ��&���8 9�� ��*���� &�� �� ���� �� ����2���� ���� �3+J �2���.�/������� >-J /�.����� �� 5�$� �# 08?� � 7��������37���� �� ������ � ���/���� ���G$��8 ���� &�� �1������ �� ����2)�� )�������5� ��� ������/ �������� ���/��/ .����B ����� &��� � �.����%�/�� ��1�� /� ���< � (���� 4����� ""�������� &� ��8 9�� ���/� &�� ������ &��� ��� � 5����2��� 68- ���&�� ��� ������ ��/ � � �� 5����/���. ;--- �����8

������� ������������� ��� ��������������� ���� /������� �� ���� �, ���� 3�-- �� �� �������� �� ���� &��/�&� �� � �����. �� ����1������. �� �-? ���� ��� �������������&��� -86 �� ���5 �� +> �� ��� ��*���� �� 6 �� �� 5�$8 � � ���//�/����� �� ��� &��� ��� #� ��/ &��� ��� ���� ����� &��������������� �� ��*��/ ����� ���%� �� �����/�� ���� &��������5� ��� ��� ����� &� ����&�� �� ������ �� �� ���/� ����+> �� �� ��� ���� �8 9�� ���� ������ &� ������ /�� �� ��&���� 30-- ��� ; ����� � ������ �� ,8- �� �� -8,6 � ��� ���������� &��� �- �� ����� � �������� ���� �# 08;� �������/����� �� ��� �� � 9�����2/�� ����/���� ��/ 6- ���� ����� �����8 9�� ����/����� &� ������ /�� �� >--� �� �- ���� ��� ��� �������� 3$�� &� ������ /�� �� �----� �� ;- ��� �� .���� � ����� �������� 3$,� ���� &� � � ���� � ����� �����. /������ 3-8,6 F,8- � ����8 9�� /������ &� ������ /�� �� ,>----���1 �� :- ����� � ������� �20- ������ /� ��/ �� $'2+� ���� ��� �? F �0������� 30-- �� ����� &�� ���� ��. ��������� ��� ��� ��� �� ���/������ ��/ � .��/� &��� ��� ��� ��� �� � +6� ��/��8 9�� �������. ����� ��� /������ &� �1������ . ����.��/ ��� ������*� ����1 ������ �������8 ������� &�� ��A�� ���� ����.�� . ��� �� ������/84B �� ��� �� �� ������ ��� ���� ������� &�� ������ �� 086J$�$25��4��� ������� ���� �������� ������ ��� 3$����������� $�� ���� ����� �����.�8 ��� ��� &�� ��� ���� &������������ ���� ���� �����&�� . 4�� � ���� �� � �*�8

���������9�� �����&��/ ���� ���� &�� ��D ����2#� �� � ���������� "/�,

3�,��6< ������/�2�������� �� #���������� �����.�< ����2���.� �� � ���������� "/�� 3:4�-< $���� � A �����������/.� ���G$��< ���� ����2�� � "/�� �� ���� �� �"9� � 9�1� )�� 391)������ /��� ����2�� � "/�, �� ���� �� �"9� � 91)� 3$� ���������������/. ������� "��8� �����/���� ��� G$��< ����2$(�52,6 3$�">�� $��� �/� ���������� "��8� ��������� ��� G$��< ����2.����� 3�+,�� � /��� ��� �8 �8 �A����� )��������� G��*���.�<����2.�������/��� 3O:+-� � /��� ��� �8 9 $=����� ##�"� G��*89�1� $� ��&�����< ����2.�������/��� "� 3� /��� ��� �8 )8 �������125�����2"���� � �= ����.�������� ������� ������/��� ����2�.�< ����2� �@5� 3� /��� ��� �8 �8 ������� �� �� $���� #������������2.���1�� 3#5�2�� $�/��� $�8 �� �� �@� G$��< ��� ����2(5O35���� �� �� ������� "��8� �������� ��� G$��8

%���

��������� �� ��������� ������ �� �*!+ ,!� ��"� ��� �� �*�� ��� �� ��� $(�52,6� ��� $(�52,6 �)(�&�� ����/��� �. �1���� �� (��-> F �6 ���� &� �������2������� )925�) 3��/8 ��8 9���� )(� &� ���������� � �� �� ����� �*�� ����� �� ��� ��������� . ������ $(�52,6�2 � $(�52,6 F ������� ���� ���8 � ��&� ��

��/ � � ��� $(�52,6� ��� $(�52,6 �)(� �� �12���� �� ��� (��-> F �6 �� � ������ ���� ����89� �1����� ��� ���� �� ����������� �� ����/��� $(�52

,6 ������ &� ������� ��� ���� ������� �1������� ��/ �� ����2$(�52,6 ���������� ���� ��. �� (��-> F �6���� ���� ��� ��� � �� �� �� ��� ������ �� �����5 ������ ��. 3��/8 ,�8 9�� ����.� ��&�� � �������� ������/�� ����/��� $(�52,6 ��� �� ��� ����� ��� ��� ��� ������ ���� �/���8

� -# ���� " #����$%� ��� #����$% &� ��������

'��� (� 4���/��� �1����� �� $(�52,6 �)(� �� (��-> F �6����8 )925�) ��/ $(�52,6�2 � $(�52,6 F ������� ���� ��� �2������ &��� �� )(� 3���� � ��� ,� � )(� ������ ��� (��-> F�6 �� � ������ ���� � ��������� �� ��� ��/ �8 ���� $(�52,6� ���$(�52,6 �)(� �� �������� �� � �� �� (��-> F �6 ����8

'��� !� 4���/��� �1����� �� $(�52,6 ������ �� (��-> F �6����8 "��/� � ������ *�� �������� ��� �������. ���� ��� ����� ���� � ������ ���� (��-> F �6 &��� �� � ���������� ���� ����3$�"2>�� �� $(�52,68 $(�52,6 � ������� �� ��� ����� ��� ������ �� ��� ���� ���� �/���8

*��������� �� ���� ����������� �� �����.������ ������ ������� ��� ������������������� /�� ��� (��-> F �6 ���� �1���� ��� $(�52,6� ���$(�52,6 �)(� �� � ����� �� �� �����/ �� ��&��� ����&� ����� �� ��� ������ ��*�� ���� �� �����2����������� ���� �� �*���� ��8 9� �1���� �� $(�52,6� ��� ������ �1�� �� ��2����������� &����� ��� ��� (��-> F �6���� &� ������ ��*������ �� �� ���������� �1����/ ������.�������8 "� ��� �� � � �� �� �������. �������� $(�52,6������ ��� ������� �� � ��� �2���2��//�� ��� ���� ��A�#�2��//�� �1����� ���� �� &�� ��8 @�� ��� ���� �� ���� ����� �1����/ $(�52,6� ��//�� &��� � #�������� ��� $(�52,6 ��//�� &��� � �2��� ������� &�������� ��� ���/����� @9)8 $������.� ��2���������� �� �2���2��//�� $(�52,6� ��� #�2��//�� $(�52,6 &� ��2����� ��� ��� � ����/ ���� ����� &�� �������� 5G$8 ��������� @9)20� @9)2>� @9)26� 5G$�,� 5G$��: ���5G$�;, &�� ����� ��� �� ��� �������/���� ���2 ����� �� ��� ��/���� �� � ������ L /����� ���� ����(��-> F �68 ��� ����� �����.�� ������ �� ��*�� �� ���$(�52,6 ������ � ����.�� . �� �� ��� ���� ��������������. 3���� ��� ��&��8 9�� ��� �� �� ����� $(�52,6������ &� �1������ �� @9)20 ��� 5G$�, ���� ����� ���������� �� ��� ��� �� �� ����/��� $(�52,6 ������ ��(��-> F �6 ���� 3��/8 ;��8 9�� ��*�� �� $(�52,6 ������ ��@9)20 ��� 5G$�, ���� ����� &�� � � � , F ; ���� ��/������ �� ��� ��/���� (��-> F �6 ����8 9� �������� �� ��//��$(�52,6� ��� $(�52,6 ������ &�� � �� �� ��� .���1���&� ��� ������������� .���1�� ��/ � .���1��2�����������. ���� ��. �� @9)20 ��� 5G$�, �.���8 ��/ � ; ��& ����2.���1�� ��� ������������� ������� ��������&��� ����2�2��� ��� ����2#� ���� ����8 ���� �� ��� �12������ �A� �� ,6 F ;- ��� �� �� � �������� �� �.��� ��� ��� @9)20 ��� 5G$�, ���� ������ ��&��/ ���� ��//��$(�52,6 ������ ��2���������� &��� .���1�� � 3��/8 ; �8

������� ���������������� ��������)��&���� ����&���� ��� ������� ��������� �� ������� ��� ������� �������9� ����.� ��� ����*�� �� ���� ���� �� $(�52,6� ��� $(�52,6 �� ��� /������� ���� ����� �� �� ��� ���� ��������������. &� �����.�� ��� ��� ���� �� ����������� ���������2��//�� ������ &� ������� �� � ��� �� �����52��� ��� ���� 3��/8 +�8 $(�52,6� ��&�� � ���� � ������/��� /�� � ��� �.������ � &��� � �� ��� ����� ��� ������ �� �� �� ������ &���� ��� $(�52,6 ���������������� � ��� ������� ������ �� ��� ���� �����/���8 "�������� � �� &�� � ������ &��� ���5 &� ������� ��� ���� � �� � ���� � ������ �� �����5 3���� �����&��8 ��/ � +� ��& ���� ���� �� ��� �� ��2����������� ��&��� $(�52,6� ��� $(�52,6 � � ��������� . .����&���� � � �� /����� $(�52,6� ��& � ���� �� ���� ������������/ �� ��������� � ��� �������. �������/ ������� ���� �� (5O� � ��� �� ��/ � +� F�8 @� ��� ��������� $(�52,6 &� �������� �� � ���� �� �/��� ������� ��� ���/� ���� �2�@5 3��/8 +4 F��8

������� ��� ������� ������� /��$���������� &���� �� ��������� �����)"� ��� �� �1����� �� ��� ����������� ����������� �� $(�52,6������ � �*����� . ��� ���� ������� �������. &�

� � �� ��������� &��� ���������� �� �������� �����. ��� /������ ������ /����� ��� '���� ��� ����.� &�������� 3��/8 6�� �8 ����� ��� /������ ������ /����� ��/ �----� �������� ��� ��� 5G$�, ��� @9)20 ��������/����� � �����/ ������� &�� �������8 9������ ���� �� $(�52,6� ��� $(�52,6 &� ������� ������ �� .����� " ��� .�������/��� " 3��/8 6��8 '� ��.����� " � � ���� �� ���� *����� 3����/�� �� ��8��::;� ��� .�������/��� " � � ���� �� ��/� *�����3'����2$������� �� ��8� �::;�8 9�� � �� � ������ �������������� 5G$�, ����/����� ���������� ���� ���$(�52,6� ������ ��� � ��� ���� ���� �� ������� ; F�-� &��� � ��1�� � �� ������� ? 3��/8 6��8 $(�52,6 ��������� � � �� ���&� ���� ����� ��� &� �������� ��������� ; F 6� &��� � ��1�� � �� ������� 6 3��/8 6��8 9������ ���� �� $(�52,6� &� ����� �� ���� �� .����� "�

� 0 *� ������� �+ ;� ���� �� ��� ����

'��� )�� '���� ��� ��&��/ ����� $(�52,6 ������ �� (��-> F �6���� ��� �� �. ��������� ���� �����8 $(�52,6 ������ &�� ���������� &���� ���� �.��� ��/ �� ����2$(�52,6 ���� ��. 3$�">��8 @9)20��� 5G$�, ���� ����� ��*� , F ; ���� ��� $(�52,6 ������������� �� (��-> F �6 ����8 ����� �� �� ����� ��2������2������ �� ��� ������ /��� &�� �� �� �������� ��� �A� �� ����������� ������8 � $.���1�� � ������� &��� �������2��//�� $(�52,6� ��� $(�52,6 ���.�������8 '���� ��� �� ��� ���������������//�� $(�52,6 ������ �������� &��� �� ����2#� ���� ��. 3�,��6����� ����� ��� �� ���� �2�.� ���� ��. 3:4�-� ���� �����8 $(�52,6������ &� ��2��� ������������� ���@9)20 ��� 5G$�, ���� &���.���1�� ��/ �� ����2.���1�� ���������� ���� ��. 3#5�2��� ����������� &��� ��� ���� �� �� �������� ������ ��������� .���34���8����� ���� ����� ��2������������ �� ��� ������ /���&�� �� �� �������� ��� �A� �� ��� �������� ������8 9�� ���� ���������� $(�52,6� ������ ��� @9)20 ���� ��� $(�52,6 ��������� 5G$�, ����� ������*��.8 $(�52,6� ���.������� ��� 5G$�,���� ��� $(�52,6 ���.������� ��� @9)20 ���� �� ��&� �� ��� ���� ����8 9�� ��� ��������� ���� ��� ��//�� $(�52,6� ���$(�52,6 ������ ������� &��� .���1�� �8

&���� ��� ��� � ��� ���� ���� ��� � ��1�� � ��������� 6 F ?8 $.�������/��� " �1�� ���� � �������� ���� 2���� ������ &��� � ��1�� � �� ������� 0 F :8 ����� /� ����&� $(�52,6 ����� �� �� � ���������� �� �*��� ������������ ����*�� �� �����/ ������ &��� ��� ������. �� ��������� ������/ �� ������� ������� ��&�� ���� $(�52,6���� $(�52,6 ������ �� ���� �� *����� �� ��/���.

�������� �����.8 9� ��� �1��������� ������� ��� �2���� ��� ������ �� ��� �&� ���������. ��//�� $(�52,6*����� �� �������� ���� �� ����������8 9�� � �� ������� ������. �� $(�52,6 ������ &� ����� �� ������� �������*� ��/�� �����. &� �������� ��/ ��� @9)20 ��������� 3��/8 6 �8 9�� ��� /������ ����.� ��������� ���� ���� �� ������� �� $(�52,6� �� �� � �� �� �� ��� �� ��

� �# ���� " #����$%� ��� #����$% &� ��������

'��� *� "�� ���� ������� ����/���� ������ *�� �������� ��� �������.�� (��-> ���� ������ ��*��. �1����/��//�� $(�52,6� ��� $(�52,6 ��2����8 $(�52,6� 3 �� �� �� ��� $(�52,6 3� �� �� �� �� ������������. ���� 2 ��� �� (��-> ����8 O����& ���� �� ��������� ��� ��� �� ��2���� ���� ��$(�52,6�2 ��� $(�52,6 F ���������/� �� �� ������. �� ��� ���� �����/���8 $(�52,6� 3 �� �� � ��� +� ������. ������� �� ��� ����� �.������ ����� ���� � &��� � �� �� �� ����� 3��+�� &��� ��� �� �������� O 3(5O� ��� �� 3,�8 @� ��� ���� ����� $(�52,6 3� �� ��� ��� �� �� �� � �����������.������� �� ��� ���� ���� �/��� ��� �� ���� �1���� �� ��� �������/ �.��������� ����� 3�� ��8 "� ��� ���� �����/���� $(�52,6 ��& � ����� ������/������ � � �*�� &��� ���� ���� �� �2�@5 3� �� �� '�� � ���� �� ��� ���/�������18 O����& ���� �� - ��& ����� ��2���� ���� �� $(�52,6 ��� �2�@58 ��� �- ��8

������� 3��/8 6�� �8 9� ������ ��� ������/� ������ ����2/����� &�� ��� ������. ������ �� ��/�2���� ������ /�2���� �� /������ � ��� ��� ��� � ��� ���2��� �.�������������8 "� ��/ � 6� &� ��& ���� � *�. ���� ��� �� ��$(�52,6� ������ �� �� � �������� �� ��� ��� ���2����������8

�������

����.������ �� ������ ������� ��� ������� �������"� ��� ����� � �. &� ����� �� ��*���� � ����� .��� ������.� �� ��� ���� �� ���� ���� �� $(�52,6� ���$(�52,6 ������ &����� ��� ��� ����8 "� ��� �� � � �� �������/ �� ��� �������� ������ *����� ��� ���� ����� &������� (��-> F �6 ���� ����� ���� ������ ��*��. �1���� ��� ����� �� $(�52,6 &��� �������� �������2��/ �� ����� �1.2�������8 9�� (��-> F �6 �� � ������ L /�����

� 1 *� ������� �+ ;� ���� �� ��� ����

'��� "� $ ��� /������ ����.� �� $(�52,6� ��� $(�52,6 ��2�� ����8 �� 9�� ���/�� 3���� �� �� �����. � $�/������ B ��������2���� �� $(�52,6� ��� $(�52,6 ������ �� �������� �����. �������� ����.�� . ��� �� ������/ 3���� �� ��8 $ ���� �� ���� ������ �����2��//�� $(�52,6� 3�� ����� ��� #�2��//�� $(�52,6 3���� ��� �� ��������� ��� ���52������ (��-> F �6 ���� 35G$�,������ �� ��&�8 9�� ���� �� � ��& � ���������*� ��� �� ��� ����� ���� ���� �� �����2��//�� $(�52,6� ��� #�2��//�� $(�52,6 �� �������� �� .����� ��� .�������/��� "8 � ���D �����./������ ������� , F �+8 9�� �����. 3/�*�� � � ���� �� ���������� &� � �����&D �������D � 3-8,6�< , 3-8;6�< ; 3-8+?�< + 3-86;�< 63-8?-�< ? 3-8?:�< 0 3-800�< > 3-8>?�< : 3-8:6�< �- 3�8-6�< �� 3�8�+�< �, 3�8,,�<

�; 3�8;��< �+ 3�8;:�< �6 3�8+6�8 � ���������/ ���� ���� �� #�2��//�� $(�52,6� 3�� ����� ��� �����2��//�� $(�52,6 3���� ��� ����������� ��� ���52������ (��-> F �6 ���� 3@9)20 ������8 9������ �� � ��& � ���������*� ��� �� ��� �� ��� ���� ���� ��#�2��//�� $(�52,6� ��� �����2��//�� $(�52,6 8 � ���D �����./������ ������� , F �+8 9�� �����. 3/�*�� � � ���� �� ���������� &� � �����&D �������D � 3-8,6�< , 3-8,6�< ; 3-8,?�< + 3-8;6�< 63-8+;�< ? 3-86-�< 0 3-8?-�< > 3-8?:�< : 3-8>��< �- 3-8:��< �� 3�8-?�< �, 3�8�?�<�; 3�8,0�< �+ 3�8;>�< �6 3�8+:�8 �� ��� �� ��� �� �� $(�52,6� ������� �� ��� �.������ ������� �� ���52������ @9)20 ����8"�� �� ��� ��&��/ �.������ ��� ��� ���2 � �� $(�52,6��������� &��� �� ����2#� ���� ��. 3�,��6�8

���� ���� �� ��*�� �. ��� �� �� � ��� �� .������������ ��� �1�� �� ���. �� ���� ����������� 3#���� ��8� �::�< ���� ��� #��� �::6< ���� �� ��8� �::6�8 (��-> F�6 ���� �1���� �� ���2���� ����� ���� �������� ���������� �������� �� ���5 ��*�� ��� ��� ��� � ��������.���� &��� � �� �� �.�� � 3(���� �� ��8� �:0?� �:0>�8'� ����������� ���� ��� ���� ����� &� �� ��*��� �� �������2� �� ����/ ��� ������ �������. ����� �� � �� ���� ������� �� � �� ��� �������� $(�52,6 ������ &�� ���������.���� � ���������������� �� &� �� � ��� �� �� ��������� �� (��-> F �6 ����8� ��&� &��� )925�) ��� $(�52,6� ��� $(�52,6

�)(� �� ����/��� �. �1���� �� (��-> F �6 ����8 9������/��� ����������� �� $(�52,6 ������ �� �����52������ �� � ������ ���� &� ��������� . ��� ���� �2������ �������. ��/ � �� � ���������� ���� ��.3$�">��8 ����� /� ��� ���� ��. � &����. ��� ���� � ���1��������� ���� ��&��/ �� �� �� ��� ��� �������. �� ��� $(�52,6� ��� $(�52,6 ������8 "� � ����&���.���� ��� ����� ��� ��� � ���/�. �� ����� . ��� ���� ��. � ���� � ��� � �������� ������/ �� ��� ���� �����/���8'� �� ��� ������� �� �������2��//�� �1����� ���2

� �� �� ������ ��� ����*�� �� ����� �� $(�52,68 4������2��//��/ ��/�� ���� ���� ��� ������� �� ��� ������ ���������� ��� �1������� &�� ������� �� �&� ��� �������� ���� ����� &��� ��� ��/ ��*� ��� &������8 "���������� &� ������� $(�52,6� ��� $(�52,6 ��������.��/ ��� ��� ��/ ��&��� �&� �� �� ���� �����8"�������/�.� ��� ������. �� ��� ������ &� � �*�� &�������� �.������ ��� ��� �� ��� ����� ��� ���8 9��� �*����� ��. ������ ���� � � �� �*�2�1����� ��$(�52,6 ���� ������ �B ��� �� ������ �� �������/8#�&�*�� �'���� ��� ����.� �� ����� $(�52,6 �� 5G$ ���@9) ���� ����� ������� �� (��-> F �6 ���� ��&�� ���. �, F ;2���� ������ �� ����� ������8 � .���1�� �� ��������� �� � �������� �� �������� �� $(�52,6 ���������/��� ��� ��� ��/����/ 3'�� � �� �� ��8� �:::< 7�/���� ��8� ,---�� &� ��*���/���� �� � ��//�� ���� �� �� �� ��� �� ����/��� .���1��8 ���� �2���� ��� #�2��//��$(�52,6 ���� �� &�� ��2����������� &��� .���1��8 "� ��������� �� ����� � � ���� ����/��� �. �1���� $(�52,6������ �1�� �� ��/���. �������� ������/ ������ ��������/�� &���� ����2$(�52,6 ���� ��. �� ��� �� �� ���������89�� ��. ������ ���� ��� $(�52,6 ������ ���/�� ���2���������� ����/� � ��/ ������ ��� ��� �1��.����� �.�������� . �1����/ ������� ���������.8 #�&�*�� ��� �������2��/ �� ��� �� �1.2����� �� ��� $(�52,6� ��� $(�52,6 ������ �� � �. �� ��� ������� &��� ���� ���� �� �����2���� ���� �������� �� �����. ����� �� �� ���� ���� � ��/���� �� ��� ���� ������������� ���� �� ��� $(�52,6 ������89�� ��. �1����� &�. ��� �.�������� ������/ � ������� ���� &��� ��������/ ��//�� $(�52,6 ������8 "���2����/�.� ��//�� $(�52,6 &� �����������. �� �� �� ����� ���� ����������� �� ��� ���/� ������ 8 $���� ������� �� � ��� ���� �� �� �����/ �� ��&��� ����/��� �.�1���� $(�52,6� ��� $(�52,6 ������� &� �������������� �� ��� $(�52,6 ������ � ��� ����� ������� ����� ���/� ������ �� ���2��������� ����8 "� ��. � ��� ������ $(�52,6 � ��� ���� ������. �� � �� �� ���� ���� �������� .���� �� �����8 #�&�*�� ����������� ��$(�52,6 �� ��� ���/� ������ �� ��� ������ �� *�*� �������� �� �� 3��/�� ��� �����P���� ,---�8 "� ����

�� �� $(�52,6 &� //���� �� ���. � ��� �� *��������������/ &����� ��� ���/� ������ 89�� ������������ ������/ &�� �������� . ���� ��

������������ �� ����/����� ��� 5G$�, ��� @9)20 ����89�� ������. �� $(�52,6 ������ &� ����� �� ������� �������*� ��/�� �����. � ������� �� ��� $(�52,6� ������8'� �� .����� " � � ���� �� ���� *����� 3����/���� ��8� �::;� ��� .�������/��� " � � ���� �� ��/� *�����3'����2$������� �� ��8� �::;�8 � �1������� ��� ���� ���� ��.����� " ��&�� ��1�� � ��*�� �� ��&� �����. �������8#�&�*�� ��� ���� ���� &� ��� ��� ��� .����� &���� ����� �� ��/�� �����. �������8 9�� � ���&� �� � � ��� �� ��/��. ���� �������8 $.�������/��� " ��� ��&�� ����1������ ���� ���� &��� � ��1�� � �� ��/�� �����.�������8 9�� ��������� ��&��� $(�52,6� ��� $(�52,6 ������ ��� �������� �� *����� �� �������� �����. �����.��&�� ���� ��� �&� ������ �� �������� &��� �������*�����8 #�&�*�� �� ���� *����� ������� �� ���� ��� ��/��1��.����� *����� � ������� ��� ����� �� � � �����*���/����8 "��������.� � ���� ������� �� ��� $(�52,6������� �� �� � �������� �� ��&� �����. ������� //����/��� ������ �� � �� �� ���� �� $(�52,6�8 9�� ������/&� � ��� ��*���/���� . '���� ������/ �� ���2 ���2��� �.������ �������� &���� ��&�� ���� ����� /� ���� �� ������� �� $(�52,6� �� �� � ��������� ��� ������.�� ��� $(�52,6 ����� &� ����� �� � ��� ���2����2���� ���8

����� ���� ��������� ���/��� ������� ��� ������� ��� �.���� �� �$� ������ �� �$��������9�� ��������*� ������/ �� �1�� 6 �B ���� ��� ��� ����.$(�52,6 ������� � �� �� �&� ������ �������/ �� ���� ��,-? ����� ���� 3���� �::;�8 41�� 6 ������� ��� ���.�.����� ����� �� ��� ������8 ����� /� ��� �� �.������� ������� �� ��� $(�52,6� ��� $(�52,6 ���.����������� �.����� B ���� ����� �� � �������� �/�������� ����B ���� �����1�� //����/ ���� ��� ���� �� ������2�������� ����. ��.������ � ��������8 �� ���� �&� �� ��� �.�������� � ��*� ��� ��� ��&� �� � �������� �� ��/����/ ��$(�52,6 �� ��� ����� ��� ��� 3!������ �� ��8� �:::�8#�&�*�� ��� ��� ���� ��������� �� ��� ����� �����B ���� �� �1�� 6 ��. ��*� � �/�������� ������ �� �1������ ��� ���� �� ��� ������8 '� ������� ������� �������������� �� ��� �/��� �������/ ��&��� $(�52,6� ���$(�52,6 �� ��� ������ �.��� � �� � �� ��� $(�)4������1 3$ ���� �� ��8� �::>�8 9�� �.������� ������1 ������� .���1��2��� ��� � �>- F ,?,< .����� �*�� ""� � F :?< ����&� ��/���� �� $(�52,6�� ���������/ �� ��� � ���� F >; ��� �,- F ,-?8 ��� � ��� �� ��� ��*� �������/ ��� � ��&��� $(�52,6� ��� $(�52,6 �� �� �� �� ��� �1������� �� ��� ����18 9�� � �� �� �� ��2������� ������ &���� ���� � *�� ��� ��� ����. � �� �8 9�� � �*����� ������� �������/ ����� ���� �� �������� �� ��� ���� �� ��������� ���/�. //�� ���� ��������*� ������/ ���. ���������� � �������� ��� �� ���� �� ��/����/ ����� /� ������������ ��&��� $(�52,6� ��� $(�52,6 &��� ��� �����.����/� ��� �*���� � �� � �� ��� $(�)4 ������18

2������ �� �$� ������ ��������. ��� �� ������� 3��� ���������� � ��� �� �� ������������� ���� $(�52,6 �� �� ���� �� � *�. ��& ��������� ������. � �� � ��� �� ������ �� �2�������. � � �*��

� �# ���� " #����$%� ��� #����$% &� ��������

���. &��� ��� ������ � �� ������1 &��� ���� ���������3���� � �� ��8� �::0�8 9�� �����2������� �� $(�52,6 ������ �� ����������� ����1 &���� ������� &��� .���1��8 "������ ����� ���� � F >; �� $(�52,6 �� �����/ �� �2�������������� &���� � �B ��� �� ���������� &��� ��� �2�������#; ������ 3��� � �:: F ,+;� �� .���1��� � ��&� ��� .�1��������� ���� ��� ��� �/�������� �� ���� ������ �� ����.��� � �� � 3������� �� ��8� �::+< #�.��� �� ��8� �::+<Q���/� �� ��8� �::0< $ ���� �� ��8� �::>�8 9�� �� �1.2���������� �� $(�52,6 � �������� �� ��� � �*��� ��� ��.������ �������� � ��&� . �1������� &��� �� ��� ��� ���1�� 3���� �� ��8� �::;< $����*� �� ��8� �::;< ������ �2��� �::>� ��� ��/��2�����2���� � ������ 3����� �� ��8��:::�8 $(�52,6 � � ���� �� ������ ����� �� �����. ����� ���� ��� � �� ������� �>0 ���� �� ��� �� �1.2����� 3$����A��� �� ��8� �::?< ���� � �� ��8� �:::�� ��� 5!�������.���� ��� �������� �� ������� �;> �� *��� 3)���/���� �������� �:::�8 9�� ������ ������ �� ��� ������ ������ ���. �/��� �� *������ ��&��� $(�52,6� ��� $(�52,6 8 $�*��� � ��� �� ��� �.����� ��� � &����� ��� M�.�����2B ����N �� �������.����� ��� �� �B ��� �� $(�52,6�������/ �� ��� ����� ��� ��� 3#� �� ��8� �::,< 7����� ��8� �::?< ���� ��� �� � �::0< ���A��� �� ��8� �:::< !�������� ��8� �:::�8 "� ��. � ��� ����� ���� ��� ����. ��.������ ��� ��������� �� ��������� &��� ��. ��� ��� ����������&����� ��� ����� �8/8 ������ *�����8 "� �� ��� �������������� ���. ������ ����� �� .���1�� ������� &��� $(�52,63������ �� ��8� �::+< 5�*�� �� ��8� �::+�� ���� .���1�� � ���� ��2�> ��������� &��� $(�52,6 ��� /�� � ��� �1��3����� �� ��8� �::6�� ��� ���� 7��5%.���1��%$(�52,6��� � �� �� ������1 �� �� �. � ��/ �1���� ������3$���� ��� ����� �::0�8 "������ �� &� ������. ��&� ����.���1�� ��� �������� $(�52,6 ��� � ��/ ���������/ ������ ��� ������A����� 37�/�� �� ��8� ,---�8 9�� � ����. ��.���1�� �� ��2���������� ��//�� $(�52,6 ������ � ��/��� �������������� //�� ���� $(�52,6 ��� .���1�������� �� ��2�������� &����� ��� ��� ������1 ��� �� �� �� � ������ ����8

��������� �.������ ��� ����������� �� ������� ��� ������� �������9�� /��� �1����� �� ��.������ ������ ��*��*�� ���� �������� � �/ ����� � ��/ ��*��������� ��� ����1����� �� $(�52,6 ���. �������� &��� �� ������������������ ��� .���� ��� ������ 3������ �� ��8� �::�<��� ��� '����� �::+ < ��� �� ��8� �::6�8 9�� ������. ������ .������ ������ ��� �1�� � �*��� ����� �*������ /������� ����� ��� /� ��������*� ������/ ������ ��� ����. �������� ���%� ��� ������� /��� &��� ���/� ��/�� �� ������/. 3�� ������� �� 3���� �:::��8#�&�*�� ������ ��� �����. �/ ����� � ��/��� ��������*�������/ �� ��� ����. $(�52,6 ������� �� /������ �&������ � ������� ������� �� � �������� ��������� ��&���$(�52,6 ����� �� ��� �������� �� �� ��������8 @ ���� //�� ���� ��� �&� $(�52,6 ������ �1�� �� ����������������� �� ����� ��� ��� ��� �������� �� ��� ��� �/������ ���� ��� ���� �� ��.������ � ����/�� �����. � ��� ��� � �� ��� ����� ���� ��������� �� ��� � ����/ �B ���� �����1�8 9�� ��������*� ������/ ��/���� ��������. ������ ��� ���������. �� $(�52,6 ������������ � ���� �� ���� ����8"� ����� ���� ��� ����� ��*���/����� ��& ���� $(�52

,6� ��� $(�52,6 ������ �� ���������. ���� ��� ��

� �� �� �� � ������ ����8 � ��� ����.� �� �B ��� �������. ��� �������� . &���� $(�52,6� ��� $(�52,6 ���������. ���� &����� � ���� ��� ��� ������� ����� ���/��� ���������/ ��� ���������� � &��� � �� ������ � ���&���/� �� ��� � �������� ��� �� ��� �&� $(�52,6�����8

��#���������� 9�� &�� &� ������ . ��� $&���� (�� ��)����� �� ���� 3�2��%�G -:0�+ F ;-:�� ��/� ��/*���� R��'� �/ ��� ��� �������. �� ������� �� �8 ���� !�������"���� ��� ����� ��� $&���� ������� )����� �� ���� 3�+L20�?+��� �8 ����� ��� 3;;L2�-;6>� �� �8 �����8 '� ����� ������������ ��� 4*� ������ �� *�� � �� ���� &��� ���� � �� �&�� ��� �����. /������ ����.� ��� ��� �� ������/� ������*��.8

%��������

���� "8 �8 3�::;�D $� �� � �� ��� ������� /��� �� $(�52,6 �*���� �������� �1�� �������/ ������� ����� �� ��� ������8 �8 ���8����8 !))� ?0 F 0?8

���� "8 �8� '����� �8 �8 3�::+��D # ��� ��(� ����� �������/ �&��������� ����� �� ��� ��*� ������� ������ $(�52,68 ���� ().�,:� F ,:,8

���� "8 �8� '����� �8 �8 3�::+ �D )�/ ����� *��� �� � ��� ���� ��D $������/ ��/���� ��� ������8 5��8 (���8 ����8 $��8 G$�.(� +?,� F +?,+8

���� "8 �8� #���� !8 �8� ).� ����� �8� '����� �8 �8 3�::6�D �����2������ �1����� �� $(�52,6 ������ ����� � ��/ ��*�/���*����� � ��� �*��� �� �� �� ��*��������8 5��8 (���8 ����8 $��8G$� .!� �6�- F �6�+8

����� �8� �������� 48 )8� ����� 48� ���A� 98� O������� $8� �� ��������58� $=����� 98 �8� (������� #8� ����� )8 3�::;�D ��� ��� � �� �2��1�� � ������*��. ����*� ��� .������ ������ $(�52,68 (�� �)/"� �?- F �?;8

����� 58 �8� '����� �8 �8 3�:>?�D 5����� �� /��� �1����� ��� ��� ��� �*����� . �� �� �. ���A����� �� ������� �)(�8���� )�8 (� � F �?8

������� (8� �������� �8 !8� 5������ !8 48� $������� )8 #8 3�::+�D5�����2������ ���������� ����� ���/ �� ��� ���������. �� ����2���� �� ���������/8 $������ !/)� ��+? F ��+:8

������� $8� �������� �8� ����B*��� �8� $����� 58 58� ������ )8 �8�'����� �8 �8 3�::��D 41����� �� � ����*�� ����2�.��2������������� �� ��*� ������� �������� &��� .�����/����8 5��8 (���8����8 $��8 G$� 00� 0>6 F 0>:8

�������� 48 )8� ��� $8� ������ (8� ����� )8 3�::+�D $(�52,6� � �2$(�)4 &���� ��� �� ��� .���1�� ��� .����� �*�� *�������� ���� ��. ��� ������ ����8 �8 ����8 ����8 !/.� ,0+,0 F,0+;,8

������ �8� ���� �8� 7����/�� $8� � ���S�A� �8 �8 3�:::�D � ��/������� ���� ��� ��� � ����� �� ��� .��������2�������������� �� ,6 ��� 3$(�52,6� � ������� �� �1��.��� �� ������2��� ����8 5��8 (���8 ����8 $��8 G$� ./� 0,6? F 0,?�8

���� �� �8� � �� �8� $���� �8� ����� )8� �=�/�� �8 98 3�::0�D �� �� �� ����/� ��� ��� �����/ �� .���1�� �� $(�52,68 �8����8 ����8 !1!� +6>, F +6:-8

����� �8� #��� #8 H8 3�::6�D "����� �� .������ *����� ������ ��.�����2��������� (��-> F �6 ����D � ���� �� ������������� �.8 $.���� !2� ++ F 6;8

����� �8� #��� #8 H8� ������ �8� #������� 98� ����/��� 58 3�::6�D������� ��� �� �������� O �� ������� . .����� ������������ � �� �� (��-> F �6 �� � ������%/����� �. �� ����8 �8 (� 2�����8 /*� ,?0+ F ,?>-8

������ 48 58� ��5����� 58 $8� ��������� 98 �8� 9����� !8� �� �������� 583�::6�D $���� ��� � ��������A� &��� .���1�� � ��� $(�52,6��� /�� � ��� �1��� � �� ��� �� � �� �� ������1 &��� .���1��8 �8���� ����8 (!.� �-6 F �,-8

� *� ������� �+ ;� ���� �� ��� ����

���� �� $8� 5����/� '8� )������ �8 �8� 4��� �8� ������� $8� �=�����8 3�:::�D ����*��.2��������� ������.������ �� $(�52,6 ������������� �/����.��� � �� �8 �8 (� �����8 1!� �?:: F �0-?8

���� �8 48 3�:::�D $(�)4 ��� $(�)4 �/ ���� �� ��� ���� ��� ��� �1��.���8 ����8 ���8 ���� $��8 ""� 0-0 F 0;+8

�������2������ �8� #�� ��� 58 �8� (������� #8� 5����� �8� �������$8� $��� �� !8 3�:::�D $(�52,6� ��� 2,6 ����� �� ����1���� �� �� ���2������/ ���� ��� ��� � ������ �� �� ����������8 �������8 �8 )).� �6: F �?68

���A���� $8� �������� '8 !8� ������ �8 48 3�:::�D $(�52,6 ���/���� �� ��� ����� ��� ��� ��� /� � ��*�� ��� ���2 �����/ ������8 �8 ����8 ����8 !1*� ,�;�; F ,�;�>8

����/��� 58� 7������� �8� �A����� �8 �8� ���������� �8 3�::;�D $.������*����� ������������ ��� �/ ������ �� .������ � ������8 $������!".� 0>- F 0>68

#��� #8 H8� (������ )8 �8� ) ��� �8 )8� �P���� �8� ����/��� 583�::��D "�� ����� �� �������� �� ��.������ ������� �� �� �2 ������ ���� . .����� "" 8 (�� � )*.� ?:0 F 0--8

#����� 58 "8� #� �� �8 48� ����� )8 3�::0�D (� ��������� ����� F�� .�� �� $(�)4 ������1�8 � 8 @���8 (� � ���8 1� ;�-F ;�68

#�.���� 98� �������� #8� O������� $8� ���A� 98� #���� O8� $=�����98 �8� (������� #8 3�::+�D $.������ *����� ��� ��� � ���������1D ������ �� ��������� �� ���1�� �� ��� �.8 4��@ �8()� 6-6� F 6-?�8

#�� �8 98� $����� 98 �8�'������8 �8� $����� �8 #8 3�::,�D 9�� ,6 ���.���������2�������� ������ $(�52,6 � ��� ���� ����������2��� ���.������� �� ���� �1���� ������ ��� � ���� ���� ���������.������ �� �� �� �($8 �8 (� ���8 (!� +?;+ F +?+�8

# ����� '8 �8 3�::;�D $����. �1��.��1��8 (�� � )/"� �-+ F �-68���� ��� �8� ����� �8 �8� $������� )8 #8� � ����2��//��� �8� �����.�

�8 98� ��//��� 58 @8� ������ �8 3�::+�D "������������� �� .������������ ��� ���� ����� �)(� �� ���������� �� ����������������� ����8 5��8 (���8 ����8 $��8 G$� .(� �,+>0 F �,+:�8

���� ��� �8� ������ �8 3�::?�D ����� �� ��������� �� ����1��.����� �������. �� ��� �� ��� ���. /����8 4���������/.()1� 6;++ F 6;6?8

����� )8� #����� 58 "8 3�::>�D $(�)4 ���� � �� � ��& ��*�������8(�� � ).)� �+ F �68

!������� �8 !8� # �������� $8 �8� '������ �8 '8� �������� �8 3�:::�D )����� ��� �.�����2��� ������ �� ��� �2$(�)4 ���������� $O(�49��� ��� ��� �����/ ��� ���� �� ������A�����8 �8 ����8 ����8!1*� :-6; F :-?-8

����� $8 )8� �� � O8 3�::0�D ��������A����� �� ��� �������.������������ �� $(�52,68 �8 (� �����8 /.� �>?+ F �>?:8

���� )8 �8� $������� )8 #8 3�::0�D $� �� �� �/���A����� �� ���.������ �1��.��� ��� ������18 (� �� (.� �->0 F �-:+8

� �/�� �8� ������ 98 3�::>�D 41��.���D $(�)4 � � �T 4 8 �8(� ���8 (2� +�6 F +,,8

������ 98 �8 �8 3�::0�D $��/� �� �/ ����� �1��.���8 9��� �� ��������8 1� ,0� F ,0?8

������ ���� �8 3�::>�D 5����� ��1�� ��� ��� ��� ������8 � 8@���8 ���� ����8 (2� 6;- F 6;?8

��/��� �8� �����P���� �8 #8 3,---�D $(�52,6 � ����� �� ������/� ������ �� ������ �� ��8 (� ����� ((� >6 F >>8

(����� 58� �������� �8� (��� �/� �8 3�:0?�D $.���� �������� ��&��� ������ �� � ������ L /����� �. �� ���� ��� ������� ��� ����8 5��8 (���8 ����8 $��8 G$� 1)� �,; F �,08

(����� 58 �8� �������� �8 (8� ������� �8 58� #������ �8� � ������ 58�� �����1� �8� (��� �/� �8 3�:0>�D �������� �� .���� ��&������� �� � �� � ������ L /����� �. �� ����� ��� �� ��.�� �8 ���� )�8 (*1� ,+6 F ,6:8

@��2$���� �8� ������� �8� $������ �8 !8� ����� !8 �8� �.���� �8�!��&��� �8� ������/���� �8� ������� $8 3�::;�D "��� ����� �� �1����/�&�� . $(�52,6 ������� ���/�� �������� �� *��� ��� �� *�*�8(�� � )/*� ++6 F ++>8

@.��� �8 �8� #�//��� �8 �8� #��� )8 �8� ������ �/� 48� ������/��.��8� ������ �8 48� '����� �8 �8 3�:>:�D 9�� �������������� �� � ��*��.���������2�������� ������� $(�52,6� ���������. �1���� .�� ���� ��� ������8 �8 ���� ����8 (2.� ;-;: F ;-6,8

5�*��� �8� # � $82�8� �� �� �8 48� ������� (8� 9��/� �8 48� ���������8 !8� $������� )8 #8 3�::+�D $���������. ��� �/ ������ �� � .������*����� ������/ ������18 (� �� ()� ;6; F ;?�8

5����� �8 �8� L���� '8� ������� �8 �8� ����� �8� $���� O82!8� ���������8 !8 3�::>�D 9�� .������ $(�)4 ������1 � � ������� �� 2������ ������� ����8 (�� � $� ��8 ����8 "� 0?6 F 0?:8

)���/�� �8� �������� �8 !8 3�:::�D ����������� ������.������ ��.���1�� ��� .��������2�������� ������ �� ,6 �� 3$(�52,6������8 �8 (� �����8 1!� ?�+ F ?,+8

)������� �8 48 3�::+�D �������� �� �������� �� ������ ������8(�� � )1!� 66 F ?;8

$����*�� �8� )������ @8� ������� $8� 5��*���� �� �� ���� 58���� ���� �8 )8� ���������� �8� ������ ���� �8 3�::;�D "���������2���� �� ��� ��*� ������� ��/�� �� �� ��� � �� ���1�����.�� �� � ��� 48 �8 ����8 ����8 !/0� ,;0>+ F ,;0>08

$����� �8� ����� (8 3�::0�D ��������� �� .���1�� &��� $(�52,6 ���7��5 3.����� �*��� � ��/ �1���� ������8 �8 (� ���8 )�8*0� ;�; F ;,;8

$����A���� O8� (������ 98� @���� �8� $���/ ���� �8� !����� O8�!�A���� $8� 9�������� �8 3�::?�D 5�����.������ �� ,62���.��������2�������� ������8 5�� �� ��*��*����� �� ����������� �2�������� �/ ������ �� �� ��������� �����8 �8 ����8����8 !1(� �+6+> F �+66;8

$������ 98� '��������� $8 '8� � ���� �8� 4�� ����2����/�� #8��������� $8� 9����� 58� )������� �8 48 3�::;��D $(�5������ ���������� �� *����� ��/����/ ��� � ���8 (�� � )/!�;�> F ;,+8

$������ 98� �������� �8 !8� '��������� $8 '8� $������� )8 #8� )���2���� �8 48 3�::; �D � ������ ��� �.2����� �. ����&�. �� *������� ��. ������� �� �B ������ ��� �� .������ *����� ������/�����*����� ��� � ���8 ���� 1"� +-: F +�>8

$=����� 98 �8 3�::6�D 9�� .������ *����� �.���D � ������ �� ������2������ ����������8 (�� � )1"� ?+6 F ?6;8

$ ����� )8 �8� ���� �� �8� ����� )8� � �/�� �8 98 3�::>�D �.���� �� � �� � $(�)4 ������1 ��*��*�� �� .������ �1��.��� ��,8+ R ��� ����8 (�� � )."� ;+0 F ;6;8

7���� �8� $������ 98 #8� )������� �8 48 3�::?�D � ������ �������.�������� .�������/��� ��� ��� �2$(�)4 $(�52,68 �4�$ ����8 )0"���: F �,;8

7�/��� !8� �� ������ �8258� )����� 58 �8 3,---�D 9�/����/ �� $(�52,6�� ��� ��� � �������� . �� ��������� &��� ��� ��/�� $(�)4.���1��8 �8 ����8 ����8 !1"� ,:6: F ,:?68

'����2$�������� �8� 9����� !8� ����� !8 �8� ���.���� !8� $=����� 98 �8��� �������� 58� ����� )8 3�::;�D $.�������/���D � ��� ��������� ��� �� �� ��������2���������/ ��/� ����2��� *�����8 �8(� ���8 ()� ;>:6 F ;:-;8

'�� � ��� 58� 5����AA��� )8� �������� �8� '����� �8 �8� ������ �����8 3�::0�D ��� ��� � �� ���1�� �.�� � ��� 4 �B �� ��� $(�)4����� �� $(�52,6 �� ������.�8 �4�$ ����8 *(0� � F 68

'�� � ��� 58� ��A����� (8� ������ ���� �8� � /�.��� )8 �8� '������8 �8 3�:::�D $(�)4 ��� �.D .���1�� � �������� �� �������/����/ �� $(�52,6 �� ��� ��� ���8������� $�����. ��(� ������� ������/8 � ���� >,08>8

'� �� 98� Q�������� �8 78� ��(�&� �8 �8� '�������� �8� ��������8� 5������ �8� $������ 98 #8� )������� �8 48 3�::>�D $(�)4���D������� �������. �� ��� ��� � ���8 ���� .!� 06: F 00,8

Q���/� 58� ����� O8 �8� 9��� �8� �� �/� �8� $������� )8 #8� �����������8 58 3�::0�D �� �����2������� ������� �����/ ������ &����� ���#;������ �� .���1�� � �B ��� �� $(�52,6 �����/8 ���������.)/� +;�0 F +;,?8

� "# ���� " #����$%� ��� #����$% &� ��������