dna barcode keragaman genetik, dan konservasi...
TRANSCRIPT
DNA BARCODE KERAGAMAN GENETIK,
DAN KONSERVASI FAUNA INDONESIA
Oleh
M. Syamsul Arifin Zein
Peneliti Madya Bidang Genetika Molekuler Laboratorium Genetika
Bidang Zoologi
Pusat Penelitian Biologi
LIPI
All Birds DNA barcoding Initiative (ABBI) of Inaugural
Workshop (USA, 2005)
Second International Barcode of Life
Conference (Taiwan, 2007)
Zein MSA et al. 2007. Initiative DNA Barcoding Research in Indonesia.
Second International Barcode of Life Conference, Taipei, Taiwan.
Sutrisno H. 2007. Molecular Phylogeny of Indo-Australian Glyphodes and its Allied
Genera (Lepidoptera: Crambidae) Inferred from Mitochondrial COI and COII and
Nuclear EF-Iα Gene Sequences. Second International Barcode of Life
Conference.Taipei, Taiwan.
ILUSTRASI DNA BARCODE
Dasar pemikiran, Tujuan, dan Hasil
Apa yang disebut DNA Barcode ???
Barcoding: adalah pendekatan standar untuk
mengidentifikasi tumbuhan dan hewan dengan urutan
minimal sekuen DNA, yang disebut barcode DNA. (Barcoding is a standardized approach to identifying plants and animals by minimal
sequences of DNA, called DNA barcodes)
Barcode DNA:
Sebuah urutan DNA pendek, dari sebuah wilayah
yang seragam pada genom, yang digunakan untuk
mengidentifikasi spesies. (A short DNA sequence, from a uniform locality on the genome, used
for identifying species).
DASAR PEMIKIRAN STANDARISASI
DNA BARCODE
Mempercepat pembangunan perpustakaan
referensi urutan DNA yang konsisten dan
komprehensif
Mempercepat pengembangan teknologi yang
ekonomis untuk identifikasi spesies
TUJUAN
AGAR SIAPAPUN, DIMANAPUN,
KAPANPUN DAPAT
MENGIDENTIFIKASI DENGAN
CEPAT DAN AKURAT SPESIES
DARI SPESIMEN APAPUN
KONDISINYA
DNA BARCODE FAUNA....?????
DNA GENOME INTI
DNA MITOKONDRIA
DNA INTI: Exon dan intron
Exon adalah sekuens DNA yang ditranskripsi menjadi RNA dan ditranslasi menjadi polypeptida (coding region)
Intron adalah sekuens DNA yang tidak diubah menjadi RNA dan protein (Non coding region)
DNA MITOKONDRIA Genom DNA mitokondria berbentuk sirkuler, berisi 13 gen penyandi protein, 22 gen
transfer RNA (tRNA), 2 gen ribosoma (rRNA), dan daerah kontrol (control region/D-
Loop) dengan panjang sekitar 16.775 pasang basa (DESJARDIN dan MORAIS, 1990).
Mengapa barcode DNA Fauna dengan DNA mitokondria ?????
Mitokondria:
Merupakan organel yang memproduksi energi dalam sel tumbuhan dan
hewan, Dua puluh tahun penelitian telah menetapkan utilitas urutan DNA
mitokondria dalam membedakan antara spesies hewan yang berhubungan
erat.
Perbedaan antara spesies lebih besar
Jumlah copy:
Ada 100-10,000 lebih banyak salinan mitokondria dibandingkan DNA inti per sel, membuat pemulihan, terutama dari sampel kecil atau sebagian rusak, lebih mudahdan lebih murah
Relatif sedikit perbedaan dalam spesies
Dalam kebanyakan kasus, kecilnya perbedaan intraspesifik dan besarnya perbedaan interspesifik merupakan sinyal batas genetik yang berbeda antara sebagian besar spesies, memungkinkan identifikasi yang tepat dengan barcode DNA mitokondria
Gen di DNA mitokondria
Semua merupakan daerah coding ( tidak diselingi intron dan extron seperti pada gen inti), sehingga dapat amplifikasi langsung. Sedangkan pada gen inti sering terganggu dengan daerah non coding (intron) yang sering amplifikasi sulit dan tak terduga.
Results so far suggest that a
mitochondrial gene will enable
identification of most animal species.
Mengapa Standarisasi DNA Barcode Fauna
menggunakan COI ? Menggunakan Gen Protein DNA Mitokondria: Mendefinisikan wilayah standar dan membuat perbandingan antara urutan gen penyandi
protein yang mudah, karena gen protein umumnya tidak memiliki insersi dan delesi seperti yang ada di dalam gen ribosom.
Mitokondria Gen penyandi protein pada DNA mitokondria umumnya mengandung perbedaan lebih tinggi dari gen ribosom dan dengan demikian lebih mungkin untuk membedakan antara spesies yang berhubungan erat.
KESEPAKATAN INTERNASIONAL DNA BARCODE
FAUNA
Menggunakan Gen COI DNA Mitokondria:
Gen Cytochrome c oxidase subunit I (COI) merupakan reprensentatif dari semua gen penyandi protein DNA mitokondria
Segmen dekat terminus 5’ dari COI sepanjang sekitar 650 pasang basa merupakan daerah yang digunakan sebagai barcode DNA untuk fauna (Herbert et al. 2003)
COI terbukti memiliki variasi intraspesifik rendah, tetapi interspesifik divergensinya tinggi antara taksa yang berdekatan (closely allied taxa) (Ward et al. 2005; Hajbabaei et al. 2006a).
Primer Universal Standard: (amplifikasi muda dan hasil sekuen baik).
An Internal ID System for All Animals
Typical Animal Cell
Mitochondrion
DNA
mtDNA
D-Loop
ND5
H-strand
ND4
ND4L
ND3 COIII
L-strand
ND6
ND2
ND1
COII
Small ribosomal RNA
ATPase subunit 8
ATPase subunit 6
Cytochrome b
COI COI
The Mitochondrial Genome
DNA BARCODE PADA
MAMALIA
Universal Primer Mamalia: FORWARD:
LepF1-tl: 5”TGT AAA ACG ACG GCC AGT ATT CAA CCA ATC ATA AAG ATATTG G3”
VF1-tl: 5”TGT AAA ACG ACG GCC AGT TCT CAA CCA ACC ACA ARG AYA3”
VF1d-tl: 5”TGT AAA ACG ACG GCC AGT TCT CAA CCA ACC ACA ARG AYA TYG G3”
VFli-tl: 5”TGT AAA ACG ACG GCC AGT TCT CAA CCA ACC AAA GAA TGG3”
REVERSE:
LepR1-tl: 5”cag gaa aca gct atg cta aac ttc tgg atg tcc aaa aaa tca3”
VR1-tl: 5”cag gaa aca gct atg act aga ctt ctg ggt ggc cra ara ayc a3”
VR1d-tl: 5”cag gaa aca gct atg act aga ctt ctg ggt ggc caa aga atc a3”
VRli-tl: 5”cag gaa aca gct atg act aga ctt ctg ggt gcc aaa ac3”
(Ivanova et al. 2006). Mix 1:1:1:3
Primer untuk sekuensing: (Messing 1983)
M13F: 5”tgt aaa acg acg gcc agt3”
M13R:5”cag gaa aca gct atg ac3”
Hasil amplifikasi primer universal
Capillary Sequence Read
Barcode menegaskan
kesatuan dari spesies
Homo sapiens
Perbandingan menunjukkan
bahwa kita berbeda satu sama
lain dengan hanya 1 atau 2
nukleotida dari 648, sementara
kita berbeda dari simpanse
pada 60 lokasi dan gorila di 70
lokasi.
Teknik Molekuler untuk Identifikasi Spesies Ordo Cetartiodactyla
Menggunakan DNA Barcode (Zein MSA&Fitriana YS,2012)
ZooIndonesia:21(02):1-8.
112 spesimen, 4 famili, 10 marga and 15 spesies
Jarak genetik:
intraspesies : 0-0,7% (0,13±0,05%)
interspesies : 2-28%
intragenera : 8,8-27,4 (1,36±0,037%)
intergenera : 8,8-27,4%
intrafamily : 5,8-11,9% (7,8±2,85)
interfamili : 18,6-26,3%
Hasil rekonstruksi pohon filogeni Cetartiodactyla menunjukkan semua
spesies membentuk sebuah cluster kohesif yang jelas berbeda.
BARCODING DNA PADA SURVEI KOMUNITAS KELELAWAR PEMAKAN
SERANGGA DI INDONESIA
(DNA Barcoding in Surveys Microbat Communities in Indonesia)
(Zein and Fitriana)
Evaluasi pada
136 individu
6 Famili
45 spesies
Sekuen divergensi intraspesifik gen CO1 0.000 -
0,260.
Hipposideros papua.MG 3540
Hipposideros papua.MG 3542
Hipposideros papua.MG 3539
Hipposideros papua.MG 3538
Hipposideros papua.MG 3537
Hipposideros muscinus.MG 2967
Hipposideros muscinus.MG 2968
Hipposideros sabanus.MG 2745
Hipposideros cervinus.MG 2844
Hipposideros ater.MG 1687
Hipposideros ater.MG 1685
Hipposideros ater.MG 1686
Hipposideros diadema.MG 1237
Hipposideros diadema.MG 1556
Hipposideros diadema.MG 3545
Hipposideros diadema.MG 3650
Hipposideros larvatus.MG 2839
Hipposideros larvatus.MG 2840
Hipposideros larvatus.MG 2847
Hipposideros larvatus.MG 3299
Hipposideros
Pipistrellus Pipistrellus javanicus.MG 113
Asseliscus tricuspidatus.MG 3551
Asseliscus tricuspidatus.MG 3547
Asseliscus tricuspidatus.MG 3529
Asseliscus tricuspidatus.MG 3530
Asseliscus
Megaderma spasma.MG 2793
Megaderma spasma.MG 2794
Megaderma spasma.MG 106
Megaderma spasma.MG 2897
Megaderma spasma.MG 2902
Megaderma
Miniopterus pusillus.MG 3378
Miniopterus pusillus.MG 3379
Miniopterus schreibersi.MG 3367
Miniopterus australis.MG 1710
Miniopterus
Miniopterus australis.MG 3533
Miniopterus australis.MG 3534
Miniopterus australis.MG 3711
Miniopterus australis.MG 3532
Miniopterus australis.MG 2845
Miniopterus
Miniopterus schreibersi.MG 3536
Miniopterus schreibersi.MG 3699
Miniopterus schreibersi.MG 3700
Miniopterus
Pipistrellus Pipistrellus javanicus.MG 152
Miniopterus Miniopterus schreibersi.MG 90
Miniopterus schreibersi.MG 1018
Miniopterus schreibersi.MG 1709
Miniopterus magnater.MG 3247
Miniopterus medius.MG 2843
Miniopterus medius.MG 2841
Miniopterus medius.MG 2842
Miniopterus
Mosia Mosia nigrescens.MG 3681
Scotophilus kuhlii.MG 761
Scotophilus kuhlii.MG 763
Scotophilus kuhlii.MG 765
Scotophilus kuhlii.MG 796
Scotophilus kuhlii.MG 805
Scotophilus
Mops sarasinorum.MG 1528
Mops sarasinorum.MG 1529
Mops sarasinorum.MG 1513
Mops sarasinorum.MG 1519
Mops sarasinorum.MG 1511
Mops
Hipposideros Hipposideros diadema.MG 543
Chaerephon plicata.MG 2851
Chaerephon plicata.MG 2852
Chaerephon plicata.MG 2850
Chaerephon plicata.MG 2853
Chaerephon
Otomops Otomops formosus.MG 2539
Emballonura alecto.MG 2895
Emballonura alecto.MG 2894
Emballonura alecto.MG 2482
Emballonura alecto.MG 2498
Emballonura alecto.MG 2521
Emballonura alecto.MG 2795
Emballonura alecto.MG 2801
Emballonura
Taphozous Taphozous melanopogon.MG 2368
Phoniscus atrox.MG 3787
Phoniscus atrox.MG 3788Phoniscus
Harpiocephalus Kerivoula hardwickei.MG 3759
Kerivoula intermedia.MG 3798
Kerivoula hardwickei.MG 4127
Kerivoula papillosa.MG 3797
Kerivoula
Pipistrellus Pipistrellus javanicus.MG 2469
Tylonycteris Tylonycteris robustula.MG 1081
Pipistrellus javanicus.MG 3295
Pipistrellus javanicus.MG 3301Pipistrellus
Nyctophilus Nyctophilus sp.MG 2671
Tylonycteris Tylonycteris robustula.MG 1653
Harpiocephalus Harpiocephalus harpia.MG 3767
Myotis muricola.MG 3290
Myotis muricola.MG 2462
Myotis muricola.MG 1712
Myotis muricola.MG 2439
Myotis muricola.MG 472
Myotis muricola.MG 2747
Myotis muricola.MG 2748
Myotis muricola.MG 474
Myotis muricola.MG 464
Myotis muricola.MG 471
Myotis
100
69
100
100
100
75
100
99
76
92
100
100
100
100
66
100
100
66
88
100
100
100
100
100
70
48
100
48
41
81
100
62
86
100
84
79
100
100
92
100
100
100
100
97
78
99
100
100
100
93
73
78
51
100
48
100
58
100
98
96
96
98
100
99
100
100
58
50
64
59
82
70
51
57
44
70
44
51
25
47
19
35
27
18
13
26
15
2
6
0.02
Hasil Koreksi Identifikasi Lapangan dengan
DNA Barcode No. Spesimen Identifikasi lapangan Blast DNA barcode Kofirmasi
MG 3786 Rhinolophus philippinensis Rhinolophus trifoliatus R. trifoliatus
MG 3367 Miniopterus scheibersi Minioterus australis M. australis
MG 3379 Miniopterus pussilus Miniopterus australis M. australis
MG 3378 Miniopterus pussilus Miniopterus australis M. australis
MG 472 Myotis adversus Myotis muricola M. muricola
MG 474 Myotis adversus Myotis muricola M. muricola
MG 464 Myotis adversus Myotis muricola M. muricola
MG 464 Myotis adversus Myotis muricola M. muricola
MG 2747 Myotis ater Myotis muricola M. muricola
MG 2748 Myotis ater Myotis muricola M. muricola
MG 2895 Emballonura monticola Emballonura alecto M. alecto
MG 2894 Emballonura monticola Emballonura alecto M. alecto
___________________________________________________________________________
Barcoding DNA Kelelawar Pemakan Buah
(Chiroptera: Pteropodidae) Berdasarkan Sekuen Gen COI DNA Mitokondria
(Zein MSA & Fitriana YS)
Evaluasi pada: 120 spesimen, 17 genera, 43 species
Hasil menunjukkan intraspesific divergensi sekuen gen CO1 0- 13.4%.
Ada 3 spesies menunjukkan divergensi sekuen yang tinggi : Rousettus celebensis
(13.4%), Chironax melanocephalus (7.9%), dan Thoopterus nigrescens (2.9%),
Yang lain sekuen divergensinya rendah
Spesies pada genus Dobsonia (Dobsonia viridis, Dobsonia moluccensis, Dobsonia
crenulata); Cynopterus (Cynopterus minutus, Cynopterus brachyotis, Cynopterus
titthaecheilus, Cynopterus sphinx), dan genera Rousettus (Rousettus celebensis
Rousettus amplexicaudatus) menunjukkan closely allied taxa/kesalahan identifikasi
spesies.
Harus ada konfirmasi ulang diskripsi spesies yang telah dilakukan
DNA BARCODE PADA BURUNG
Interspesifik Lebih rendah dari 1%
Anas puna and Anas versicolor. Distance: 0.43 - 0.72%
Anas puna 1
Anas puna 2
Anas platalea
Anas versicolor 2
Anas cyanoptera 1
Anas cyanoptera 2
Anas versicolor 1
0.25%
Troglodytes aedon
(up to 4,5%)
Upucerthia dumetaria
(up to 5%)
Intraspesifik lebih besar dari 2%
Myophobus fasciatus
(up to 4,35%)
COI also discriminates between closely
related cryptic species. E.g. Myarchus spp.
M. tyrannulus 1
M. tyrannulus 2
M. tyrannulus 3
M. tyrannulus 4
M. swainsoni 1
M. swainsoni 2
M. tuberculifer 1
M. tuberculifer 2
M. tuberculifer 3
M. tuberculifer
M. swainsoni M. tyrannulus
M. ferox
1%
Criptic species
Urutan sekuen
COI pada
geografis
terpisah,
membenarkan
perlakuan
sebagai spesies
yang berbeda.
Misalnya
Lessonia spp.
Lessonia oreas
Lessonia rufa
L. oreas 1
L. oreas 2
L. oreas 3
L. oreas 4
L. oreas 5
L. oreas 6 L. rufa 1
L. rufa 2
L. rufa 3 L. rufa 4
1%
C. fuscus 1
C. fuscus 2
C. fuscus 3
C. fuscus 4
C. fuscus 5
C. atacamensis 1
C. atacamensis 2
C. atacamensis 3
C. patagonicus 1
C. patagonicus 2
1%
Genus Cinclodes
C. fuscus
1%
L. aegithaloides 3
L. aegithaloides 4
L. aegithaloides 5
L. aegithaloides 1
L. aegithaloides 2
L. fuliginiceps 1
L. fuliginiceps 2
L. fuliginiceps 3
Genus Leptasthenura
L. aegithaloides
L. platensis
L. fuliginiceps
L. aegithaloides
Serpophaga munda Serpophaga subcristata Serpophaga griseiceps
Serpophaga subcristata S. subcristata 1
S. subcristata 2
S. griseiceps 1
S. griseiceps 2
1%
Straneck 1993
The Data Barcode Standard
1.Minimum 500 bp, <1% ambiguous base calls 2.Double stranded sequence 3.Trace files and associated quality scores 4.Primers used to generate sequence 5.Linkages to:
• A morphological voucher specimen • Structured reference to collections • Geospatial reference information • Valid species name • Who performed the identification • Literature citations
How Barcoding is Done
From specimen to sequence to species
Voucher Specimen
DNA extraction CO1 gene DNA sequencing Trace file
Database of Barcode
Records
Collecting
N
D
3
C
O
I
I
I
N
D
2
N
D
1
Membangun perpustakaan referensi barcode :
Spesimen voucher diidentifikasi dengan baik
Sampel Jaringan
Ekstrak DNA
Amplifikasi PCR
Sekuensing DNA
Data submission to GenBank
Pengawetan Jaringan Sampel:
1. Nitrogen cair (paling baik)
2. DMSO
3. Alkohol absolut (pure grade)
Ekstraksi DNA
PCR
Sekuensing
Mamalia
Burung
Insekta
Fauna
Lainnya
Kekuatan
Penawaran alternatif alat identifikasi taksonomi untuk
situasi di mana morfologi tidak meyakinkan.
Fokus pada satu atau sejumlah kecil gen memberikan
efisiensi yang lebih besar
Biaya sekuensing DNA juga menurun karena kemajuan
teknis.
Potensi kapasitas yang tinggi dan dapat memproses
sampel dalam jumlah besar.
Setelah database referensi didirikan, dapat diterapkan
oleh non-spesialis
Beberapa aspek yang paling menarik mengandalkan
teknologi masa depan, misalnya, sequencer genggam
What barcode users would do with the
reference libraries
Inspection stations at every port and international airport for:
Agricultural pest control
Illegal trade in endangered species
Violations of trade quotas
Water quality surveys
Food inspection
Public health monitoring and diagnoses
Beberapa Hasil Penelitian
Menggunakan DNA Barcode
Peta lokasi koleksi material DNA
diberbagai tempat di Indonesia
Terima Kasih