La diagnostica di laboratorio
Maria Rosaria Capobianchi, [email protected]
Antonino Di Caro, [email protected]
Concetta Castilletti, [email protected]
Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola
per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio
Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma
22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014
WHO Collaborating Center for clinical care, diagnosis, response and training on Highly Infectious Diseases
La diagnostica di laboratorio
Outline
•Diagnostica di base
•Diagnostica differenziale
•Diagnostica specifica per Ebola
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La diagnostica di laboratorio
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•Diagnostica di base
•Diagnostica differenziale
•Diagnostica specifica per Ebola
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FAQ 1. Possono essere eseguiti
test diagnostici nei laboratori
locali (urgenza, microbiologia,
virologia, ecc.) prima di avere il
risultato del test per Ebola?
SI: se si adottano le adeguate misure di protezione
il rischio per i laboratoristi è molto basso in caso
di “bassa probabilità di malattia da virus ebola ”, e basso
in caso di “elevata probabilità”
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Prelievi
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•Valutazione del rischio
�Unlikely to have a VHF
�Low possibility of VHF
�High possibility of VHF
�Confirmed VHF
• Avvisare il laboratorio locale del rischio assegnato, per consentire
l’adozione di adeguate misure di biosicurezza
•Inviare i campioni al laboratorio locale in
contenitori chiusi e infrangibili
Prelievi
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�Emocromo
�elettroliti
�transaminasi
�PCR
�coagulazione
�ecc.
• Le indagini chimico-cliniche possono essere eseguite in loco,
privilegiando i POCT (Point of Care Testing) o sistemi chiusi che
consentano ad es. di forare la provetta e di centrifugarla, ove
necessario, in modo automatico
• Le provette contenenti i campioni vanno sempre aperte sotto
cappa, proteggendo occhi e mucose da eventuali spruzzi
• Se non si dispone di un laboratorio in grado di osservare queste
misure, inviare i campioni allo Spallanzani
Indagini chimico cliniche
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•Diagnostica di base
•Diagnostica differenziale
•Diagnostica specifica per Ebola
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• Malaria • Dengue• Febbre tifoide
• Shigellosi
• Colera
• Leptospirosi
• Peste
• Rickettsiosi
• Febbre ricorrente
• Borreliosi da pidocchi
• Meningiti e sepsi
• Epatiti• Altre febbri emorragiche virali
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Diagnostica differenziale
FAQ 2. Il test di malaria può
essere eseguito in loco?
Si, se si adottano adeguate
precauzioni
�Privilegiare il test rapido (POCT)• le positività vanno confermate con i test convenzionali
�In PS l’operatore è protetto dai dispositivi di protezione e
dalle procedure
�In laboratorio il POCT va eseguito in BSL2, sotto cappa,
proteggendo gli occhi e le mucose da eventuali spruzzi
In caso di impossibilità di eseguire il test in loco, o in caso di
elevata probabilità di MVE, la ricerca del parassita malarico
può essere eseguita all’INMI
�Test rapido (risultato comunicato in tempo reale)
�Conferma con goccia spessa
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•Diagnostica di base
•Diagnostica differenziale
•Diagnostica specifica per Ebola
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Il virus ebola, come gli altri
filovirus, è un virus di gruppo di
rischio 4•Alta contagiosità
•Elevata mortalità
•Assenza di terapia specifica
•Assenza di vaccini
La diagnostica per virus di gruppo di rischio 4
non è assimilabile ad analoghe procedure per
microrganismi di gruppo inferiore, in quanto
presenta requisiti strutturali, professionali ed
organizzativi peculiari.
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Difficoltà del laboratorio�Necessità, specie in assenza di un sospetto clinico ben indirizzato, di
una diagnosi differenziale ad ampio spettro
�Scarsità/assenza di kit commercialmente disponibili, validati
�Scarsità di materiali di riferimento per lo sviluppo e la validazione
dei metodi diagnostici
�Necessità di partecipare ai network internazionali per poter
accedere a: metodi, materiali/agenti, EQA, assistenza/conferme dei
risultati
�Necessità di sviluppare, spesso in fretta, metodi nuovi e, in assenza
di standard di riferimento, di sviluppare metodi di conferma
�Necessità di laboratori ad alto biocontenimentoCorso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola
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• Ricerca diretta del virus mediante metodi molecolari basata su un
test iniziale di screening e vari test successivi di conferma
• Caratterizzazione molecolare mediante sequenziamento ed analisi
filogenetica
• Ricerca diretta del virus mediante metodi colturali
• Ricerca diretta del virus mediante microscopia elettronica
• Ricerca degli anticorpi mediante Immunofluorescenza indiretta
(IgM e IgG)
• Ricerca di anticorpi mediante test di neutralizzazione
• Diagnosi differenziale verso le principali eziologie alternative,
nonché verso altre cause di sindromi emorragiche, incluse Lassa,
Dengue, Alkhurma, febbre gialla, ecc.
Capacità diagnostiche per Ebola allo Spallanzani
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Blood specimens sent to
BSL3/4 VHF national
reference laboratory
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Algoritmo di laboratorio
Cinetica dell’RNA (SUDV Uganda 2000)L’RNA virale è presente ad alti titoli fino a 10 g dopo inizio sintomi;
la sensibilità dei test non è un problema rilevante
Towner, J Virol 2004
17
Ricerca del virus mediante test di biologia
molecolare (EBOV-RVNA)
� Rilevazione di una sequenza genica di EBOLA
con RT-PCR Real-Time
� Conferma dei positivi con un metodo basato su un target diverso, ed esecuzione di una PCR classica
� Caratterizzazione mediante sequenziamento della regione amplificata con PCR classica
� La sequenza ottenuta viene confrontata con le sequenze disponibili nelle banche dati accessibili
via Web
� Real-time PCR semi-quantitativa per il monitoraggio clinico
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Dall’arrivo dei campioni al laboratorio di virologia
dello Spallanzani, attivo h24
Test rapido malaria 1 ora
Real Time PCR Filovirus (Ebola) 4-6 ore
A meno di imprevisti….
Tempi di risposta
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McElroy, JID 2014
A proposito di imprevisti•Il campione è fuoriuscito dalla provetta primaria
�Necessità di bonificare la superficie esterna
�Difficoltà a recuperare il campione residuo
disponibile
•Le informazioni sull’etichetta sono
incongruenti con quelle della scheda�Necessità di contattare chi ha inviato il
campione per escludere scambi di provette
•Il campione contiene inibitori o sostanze che interferiscono con il saggio
�Necessità di ricominciare dall’estrazione
•Altre circostanze impreviste (es. Scheda all’interno della
confezione)
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McElroy, JID 2014
A proposito di imprevisti•Il campione è fuoriuscito dalla provetta primaria
�Necessità di bonificare la superficie esterna
�Difficoltà a recuperare il campione residuo
disponibile
•Le informazioni sull’etichetta sono
incongruenti con quelle della scheda�Necessità di contattare chi ha inviato il
campione per escludere scambi di provette
•Il campione contiene inibitori o sostanze che interferiscono con il saggio
�Necessità di ricominciare dall’estrazione
•Altre circostanze impreviste (es. Scheda all’interno della
confezione)
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Dudas, PloS Curr Outbreaks 2014
Esami accessori per la conferma
Il sequenziamento
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Anticorpi
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La ricerca degli anticorpi in genere ha
valore di documentazione retrospettiva
•Le IgM compaiono dopo 3 giorni e sono
fugaci (< 3 settimane)
•Le IgG persistono a lungo e sembrano essere protettive
Cinetica della comparsa di IgG e IgM EBOV (Kikwit, DCR 1995)
Ksiazek, JID 1999
IgM IgG
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24
Rivelazione della risposta umorale e
cellulare specifica
• Risposta umorale: eseguita mediante metodi appositamente allestiti in laboratorio (immunofluorescenza indiretta e test di sieroneutralizzazione.
• Per la risposta cellulare vengono eseguite colture di linfomonociti esposti agli agenti identificati, e la rilevazione delle sottopopolazioni linfocitarie attivate viene eseguita mediante rilevazione citofluorimetrica delle citochine intracitoplasmatiche.
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25
Immunofluorescenza indiretta
Negative control IgM positive sample IgG positive sample
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26
Identificazione del virus
• Isolamento virale in colture di tessuto (BSL4)
e successiva caratterizzazione degli isolati con
metodi immunologici o molecolari.
• In casi particolari è previsto anche lo studio
morfologico in Microscopia Elettronica, sia
sull’isolato che sul campione biologico iniziale.
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BSL4
-33-50
-35
-15
-5.1
-10
0
-15
-33
-5,1
0< BSL3
BSL3
Coltivazione del virus: BSL4
Fase della malattia Tipologia di campioni Tipologia di contenitore
Fase acuta
sintomatica
(Entro i primi 2-7
giorni dall’esordio)
• Sangue con EDTA per RT-PCR
• Sangue senza anticoagulanti per
sierologia
Eventuali campioni biologici
aggiuntivi:
• Urine
• Tamponi mucosali
• Altro
• Provetta sterile infrangibile con EDTA
• Provetta sterile infrangibile
• Contenitore infrangibile sterile
• Tampone floccato in terreno di trasporto
virale in flacone infrangibile
• Da concordare con il Laboratorio
Fase convalescente
(risoluzione della
sintomatologia, e
comunque non
prima di 15 giorni
dall’inizio della
sintomatologia)
• Sangue con EDTA per RT-PCR
• Sangue senza anticoagulanti per
sierologia
Eventuali campioni biologici
aggiuntivi:
• Urine
• Tamponi mucosali
• Altro
• Provetta sterile infrangibile con EDTA
• Provetta sterile infrangibile
• Contenitore infrangibile sterile
• Tampone floccato in terreno di trasporto
virale in flacone infrangibile
• Da concordare con il Laboratorio
Tipologia di campioni
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Prima di inviare campioni, è necessario contattare il laboratorio.
Il Laboratorio di Virologia è attivo h24.
Il virologo di turno può essere reperito ai seguenti numeri:•0655170666
•3204343793
Il virologo di turno effettuerà con il richiedente la valutazione
congiunta preliminare, e provvederà ad attivare le procedure interne.
Ulteriori recapiti utili:
Accettazione: tel 0655170674; fax 0655170676
Segreteria: fax 065594555
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Preparazione dei campioni.1
• Il campione di scelta per la ricerca del virus è sangue-
EDTA (no eparina)
• I campioni vanno mantenuti a +4°C prima dell’invio
• Il trasporto al Laboratorio deve essere effettuato entro
il più breve tempo possibile, preferibilmente entro le
24 ore e a temperatura refrigerata
• Per tempi di consegna più prolungati, concordare con
il Laboratorio le modalità di preparazione e
conservazione
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• I prelievi devono essere accompagnati dalla scheda
dati, riportata in calce alle istruzioni, compilata in
tutte le sue parti
• Su ogni singolo campione deve essere apposta
un’etichetta riportante a chiare lettere il nome del
paziente, la tipologia del campione (sangue, urine,
altro) e la data di prelievo.
• Le informazioni riportate sulle provette devono
essere coerenti con quelle inserite nella scheda dati.
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Preparazione dei campioni. 2
• Il campione va confezionato seguendo il principio
del triplo involucro
• Il trasporto dei campioni al laboratorio va eseguito
secondo le raccomandazioni per i campioni a
rischio biologico
(Circolare Ministeriale n°3/2003 “Raccomandazioni
per la sicurezza del trasporto di materiali infettivi
e di campioni diagnostici”)
L’invio va concordato con il Laboratorio
Confezionamento e trasporto dei campioni
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L’indirizzo cui inviare in campioni è:
Laboratorio di Virologia
Padiglione Baglivi
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Ingresso carrabile:
via Giacomo Folchi, 6a
00149 Roma
Consegna dei campioni
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Scheda di raccolta dati per la diagnosi di Laboratorio in caso
di sospetta infezione da virus Ebola
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