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La diagnostica di laboratorio

Maria Rosaria Capobianchi, [email protected]

Antonino Di Caro, [email protected]

Concetta Castilletti, [email protected]

Corso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola

per i medici dei servizi di Pronto Soccorso del Lazio

Istituto Nazionale per le Malattie Infettive (INMI) “Lazzaro Spallanzani”, Roma

22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014

WHO Collaborating Center for clinical care, diagnosis, response and training on Highly Infectious Diseases


Outline

•Diagnostica di base

•Diagnostica differenziale

•Diagnostica specifica per Ebola




22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014


Outline







22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014

FAQ 1. Possono essere eseguiti

test diagnostici nei laboratori

locali (urgenza, microbiologia,

virologia, ecc.) prima di avere il

risultato del test per Ebola?

SI: se si adottano le adeguate misure di protezione

il rischio per i laboratoristi è molto basso in caso

di “bassa probabilità di malattia da virus ebola ”, e basso

in caso di “elevata probabilità”




22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014




22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014

Prelievi




22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014

•Valutazione del rischio

�Unlikely to have a VHF

�Low possibility of VHF

�High possibility of VHF

�Confirmed VHF

• Avvisare il laboratorio locale del rischio assegnato, per consentire

l’adozione di adeguate misure di biosicurezza

•Inviare i campioni al laboratorio locale in

contenitori chiusi e infrangibili

Prelievi




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�Emocromo

�elettroliti

�transaminasi

�PCR

�coagulazione

�ecc.

• Le indagini chimico-cliniche possono essere eseguite in loco,

privilegiando i POCT (Point of Care Testing) o sistemi chiusi che

consentano ad es. di forare la provetta e di centrifugarla, ove

necessario, in modo automatico

• Le provette contenenti i campioni vanno sempre aperte sotto

cappa, proteggendo occhi e mucose da eventuali spruzzi

• Se non si dispone di un laboratorio in grado di osservare queste

misure, inviare i campioni allo Spallanzani

Indagini chimico cliniche


Outline







22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014

• Malaria • Dengue• Febbre tifoide

• Shigellosi

• Colera

• Leptospirosi

• Peste

• Rickettsiosi

• Febbre ricorrente

• Borreliosi da pidocchi

• Meningiti e sepsi

• Epatiti• Altre febbri emorragiche virali




22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014

Diagnostica differenziale

FAQ 2. Il test di malaria può

essere eseguito in loco?

Si, se si adottano adeguate

precauzioni

�Privilegiare il test rapido (POCT)• le positività vanno confermate con i test convenzionali

�In PS l’operatore è protetto dai dispositivi di protezione e

dalle procedure

�In laboratorio il POCT va eseguito in BSL2, sotto cappa,

proteggendo gli occhi e le mucose da eventuali spruzzi

In caso di impossibilità di eseguire il test in loco, o in caso di

elevata probabilità di MVE, la ricerca del parassita malarico

può essere eseguita all’INMI

�Test rapido (risultato comunicato in tempo reale)

�Conferma con goccia spessa


Outline







22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014

Il virus ebola, come gli altri

filovirus, è un virus di gruppo di

rischio 4•Alta contagiosità

•Elevata mortalità

•Assenza di terapia specifica

•Assenza di vaccini

La diagnostica per virus di gruppo di rischio 4

non è assimilabile ad analoghe procedure per

microrganismi di gruppo inferiore, in quanto

presenta requisiti strutturali, professionali ed

organizzativi peculiari.




22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014

Difficoltà del laboratorio�Necessità, specie in assenza di un sospetto clinico ben indirizzato, di

una diagnosi differenziale ad ampio spettro

�Scarsità/assenza di kit commercialmente disponibili, validati

�Scarsità di materiali di riferimento per lo sviluppo e la validazione

dei metodi diagnostici

�Necessità di partecipare ai network internazionali per poter

accedere a: metodi, materiali/agenti, EQA, assistenza/conferme dei

risultati

�Necessità di sviluppare, spesso in fretta, metodi nuovi e, in assenza

di standard di riferimento, di sviluppare metodi di conferma

�Necessità di laboratori ad alto biocontenimentoCorso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola



22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014

• Ricerca diretta del virus mediante metodi molecolari basata su un

test iniziale di screening e vari test successivi di conferma

• Caratterizzazione molecolare mediante sequenziamento ed analisi

filogenetica

• Ricerca diretta del virus mediante metodi colturali

• Ricerca diretta del virus mediante microscopia elettronica

• Ricerca degli anticorpi mediante Immunofluorescenza indiretta

(IgM e IgG)

• Ricerca di anticorpi mediante test di neutralizzazione

• Diagnosi differenziale verso le principali eziologie alternative,

nonché verso altre cause di sindromi emorragiche, incluse Lassa,

Dengue, Alkhurma, febbre gialla, ecc.

Capacità diagnostiche per Ebola allo Spallanzani




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Blood specimens sent to

BSL3/4 VHF national

reference laboratory




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Algoritmo di laboratorio

Cinetica dell’RNA (SUDV Uganda 2000)L’RNA virale è presente ad alti titoli fino a 10 g dopo inizio sintomi;

la sensibilità dei test non è un problema rilevante

Towner, J Virol 2004

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Ricerca del virus mediante test di biologia

molecolare (EBOV-RVNA)

� Rilevazione di una sequenza genica di EBOLA

con RT-PCR Real-Time

� Conferma dei positivi con un metodo basato su un target diverso, ed esecuzione di una PCR classica

� Caratterizzazione mediante sequenziamento della regione amplificata con PCR classica

� La sequenza ottenuta viene confrontata con le sequenze disponibili nelle banche dati accessibili

via Web

� Real-time PCR semi-quantitativa per il monitoraggio clinico




22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014

Dall’arrivo dei campioni al laboratorio di virologia

dello Spallanzani, attivo h24

Test rapido malaria 1 ora

Real Time PCR Filovirus (Ebola) 4-6 ore

A meno di imprevisti….

Tempi di risposta




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McElroy, JID 2014

A proposito di imprevisti•Il campione è fuoriuscito dalla provetta primaria

�Necessità di bonificare la superficie esterna

�Difficoltà a recuperare il campione residuo

disponibile

•Le informazioni sull’etichetta sono

incongruenti con quelle della scheda�Necessità di contattare chi ha inviato il

campione per escludere scambi di provette

•Il campione contiene inibitori o sostanze che interferiscono con il saggio

�Necessità di ricominciare dall’estrazione

•Altre circostanze impreviste (es. Scheda all’interno della

confezione)




22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014

McElroy, JID 2014

A proposito di imprevisti•Il campione è fuoriuscito dalla provetta primaria

�Necessità di bonificare la superficie esterna

�Difficoltà a recuperare il campione residuo

disponibile

•Le informazioni sull’etichetta sono

incongruenti con quelle della scheda�Necessità di contattare chi ha inviato il

campione per escludere scambi di provette

•Il campione contiene inibitori o sostanze che interferiscono con il saggio

�Necessità di ricominciare dall’estrazione

•Altre circostanze impreviste (es. Scheda all’interno della

confezione)




22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014

Dudas, PloS Curr Outbreaks 2014

Esami accessori per la conferma

Il sequenziamento




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Anticorpi




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La ricerca degli anticorpi in genere ha

valore di documentazione retrospettiva

•Le IgM compaiono dopo 3 giorni e sono

fugaci (< 3 settimane)

•Le IgG persistono a lungo e sembrano essere protettive

Cinetica della comparsa di IgG e IgM EBOV (Kikwit, DCR 1995)

Ksiazek, JID 1999

IgM IgG




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24

Rivelazione della risposta umorale e

cellulare specifica

• Risposta umorale: eseguita mediante metodi appositamente allestiti in laboratorio (immunofluorescenza indiretta e test di sieroneutralizzazione.

• Per la risposta cellulare vengono eseguite colture di linfomonociti esposti agli agenti identificati, e la rilevazione delle sottopopolazioni linfocitarie attivate viene eseguita mediante rilevazione citofluorimetrica delle citochine intracitoplasmatiche.




22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014

25

Immunofluorescenza indiretta

Negative control IgM positive sample IgG positive sample




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Identificazione del virus

• Isolamento virale in colture di tessuto (BSL4)

e successiva caratterizzazione degli isolati con

metodi immunologici o molecolari.

• In casi particolari è previsto anche lo studio

morfologico in Microscopia Elettronica, sia

sull’isolato che sul campione biologico iniziale.




22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014

BSL4

-33-50

-35

-15

-5.1

-10

0

-15

-33

-5,1

0< BSL3

BSL3

Coltivazione del virus: BSL4

Fase della malattia Tipologia di campioni Tipologia di contenitore

Fase acuta

sintomatica

(Entro i primi 2-7

giorni dall’esordio)

• Sangue con EDTA per RT-PCR

• Sangue senza anticoagulanti per

sierologia

Eventuali campioni biologici

aggiuntivi:

• Urine

• Tamponi mucosali

• Altro

• Provetta sterile infrangibile con EDTA

• Provetta sterile infrangibile

• Contenitore infrangibile sterile

• Tampone floccato in terreno di trasporto

virale in flacone infrangibile

• Da concordare con il Laboratorio

Fase convalescente

(risoluzione della

sintomatologia, e

comunque non

prima di 15 giorni

dall’inizio della

sintomatologia)

• Sangue con EDTA per RT-PCR

• Sangue senza anticoagulanti per

sierologia

Eventuali campioni biologici

aggiuntivi:

• Urine

• Tamponi mucosali

• Altro

• Provetta sterile infrangibile con EDTA

• Provetta sterile infrangibile

• Contenitore infrangibile sterile

• Tampone floccato in terreno di trasporto

virale in flacone infrangibile

• Da concordare con il Laboratorio

Tipologia di campioni




22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014

Prima di inviare campioni, è necessario contattare il laboratorio.

Il Laboratorio di Virologia è attivo h24.

Il virologo di turno può essere reperito ai seguenti numeri:•0655170666

•3204343793

Il virologo di turno effettuerà con il richiedente la valutazione

congiunta preliminare, e provvederà ad attivare le procedure interne.

Ulteriori recapiti utili:

Accettazione: tel 0655170674; fax 0655170676

Segreteria: fax 065594555




22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014

Preparazione dei campioni.1

• Il campione di scelta per la ricerca del virus è sangue-

EDTA (no eparina)

• I campioni vanno mantenuti a +4°C prima dell’invio

• Il trasporto al Laboratorio deve essere effettuato entro

il più breve tempo possibile, preferibilmente entro le

24 ore e a temperatura refrigerata

• Per tempi di consegna più prolungati, concordare con

il Laboratorio le modalità di preparazione e

conservazione




22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014

• I prelievi devono essere accompagnati dalla scheda

dati, riportata in calce alle istruzioni, compilata in

tutte le sue parti

• Su ogni singolo campione deve essere apposta

un’etichetta riportante a chiare lettere il nome del

paziente, la tipologia del campione (sangue, urine,

altro) e la data di prelievo.

• Le informazioni riportate sulle provette devono

essere coerenti con quelle inserite nella scheda dati.




22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014

Preparazione dei campioni. 2

• Il campione va confezionato seguendo il principio

del triplo involucro

• Il trasporto dei campioni al laboratorio va eseguito

secondo le raccomandazioni per i campioni a

rischio biologico

(Circolare Ministeriale n°3/2003 “Raccomandazioni

per la sicurezza del trasporto di materiali infettivi

e di campioni diagnostici”)

L’invio va concordato con il Laboratorio

Confezionamento e trasporto dei campioni

xCorso di formazione per formatori sulla malattia da virus Ebola



22, 23, 24, 25 e 26 settembre 2014

L’indirizzo cui inviare in campioni è:

Laboratorio di Virologia

Padiglione Baglivi

Istituto Nazionale per le Malattie Infettive “L. Spallanzani”

Ingresso carrabile:

via Giacomo Folchi, 6a

00149 Roma

Consegna dei campioni




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Scheda di raccolta dati per la diagnosi di Laboratorio in caso

di sospetta infezione da virus Ebola




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Recapito del richiedente (possibilmente tel. cellulare)__________




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