dra. alírica i. suárez h. utpl, loja, marzo...
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Dra. Alírica I. Suárez H.
UTPL, Loja, Marzo 2015
•Las plantas como fuentes de
agentes terapéuticos contribuyen
aún en la actualidad a los
programas de atención primaria de
salud, de igual manera que a la
economía, tanto en los países en
desarrollo como en las naciones
industrializadas.
2
Newman DJ, and Cragg GM. (2012), Natural Products as Source of New Drugs over the Last 25 Years. J. Nat. Prod.75, 311-335
B = Biológica
N = P. Natural
ND =
Derivado de
P.
Natural
S =
Totalmente
Sintético.
S* =
Sintético,
Farmacóforo
es PN.
V = Vacuna
NM =
Mimético
de origen
natural
3
Newman DJ, and Cragg GM. (2012), Natural Products as Source of New Drugs over the Last 25 Years. J. Nat. Prod.75, 311-335
4
Newman DJ, and Cragg GM. (2012), Natural Products as Source of New Drugs over the Last 25 Years. J. Nat. Prod.75, 311-335
5
6
AcalyphaAlchornea
CnidosculusAmanoa
Senefelderopsis
Phyllantus
Croton
7
Cáncer
Diabetes
Hipertensión
Inflamación
Dolor
Heridas
Ulceras
Problemas digestivos
Malaria
Perdida de peso
Estreñimiento
8
Salatino A, Faria-Salatino ML, Negri G. 2007. Traditional uses, Chemistry and Pharmacology of Croton species (Euphorbiaceae). J Brazil Chem Soc. 18: 11-33.
9
Venezuela
Croton
malambo
cuneatus
micansmatourensis
caracasanus sucrensis
huberi
pungens
hircinus
gossypiifolius
rahmnifolius
rodolens
18 especies estudiadas
22% de Venezuela
“pregonero”
10
Toxicidad
Comprobación
de la actividad
Nuevas y desconocidas
Actividades
11
Validación de las plantas medicinales
12
Validación
No puede ser concebido como la construcción
de experimentos para asegurar un resultado positivo.
Significa realmente la evaluación neutral
para demostrar o refutar un efecto biológico,
sin una presunción de su efectividad
Cordell, G. Phytochem. Lett. 10 ( 2014)
Identificar
Caracterizar
Nuevos compuestos lideres
Confirmación de las
Propiedades medicinales
de las Plantas13
14
O
O
O
O
OH
O
OO
H
H
OH
OH
H
O
OOH
OH
OH
O
OOH
OH
OH
O
OH
O
O
O
O
O
OH
N OO
HN
H
HO
O
15
O
OH
O
O
O
O
O
OH
•Toxicidad aguda y crónica
• Antinociceptiva
•Antiinflamatoria
•Hipoglicemiante
•Antibacteriana
•Malaria
•Antiparasitaria (Leishmaniasis, Tripanosomiasis)
•Sedante
• Antialimentaria (insectos)
•Citotoxicidad (en líneas de cáncer humano)
•Apoptosis (mecanismos de acción)
Farmacología Biología Molecular Inmunología
16
Antiinflamatorio
Antinociceptivo
Citotóxico en líneas tumorales
Efectivo en diabetes (en animales tratados con aloxano)
Antibacteriano
Toxicidad muy baja
Suárez A.I, Ávila M, Chavez K. “Diterpenos Bioactivos de Croton malambo Karst”. Revista
Facultad de Farmacia-UCV. 2014 (en prensa).
Morales A., Alvarez A., Arvelo F, Suárez A.I., Compagnone R S., Galindo-Castro I. The
natural diterpene ent-16β-17α-dihydroxykaurane down-regulates Bcl-2 by disruption of the Ap-
2α/Rbtranscription activating complex and induces E2F1 up-regulation in MCF-7 cells.
Apoptosis, 2011, 16, 1245-1252.
Suárez A.I,. Vasquez LJ, Taddei A, Arvelo F,. Compagnone RS. “Antibacterial and cytotoxic
activity of leaf essential oil of Croton malambo”. Journal of essential Oil Bearing Plants.
2008, 11 (2), 208-213.
Morales A., Perez P., Mendoza R., Compagnone R.S., Suárez A.I., Arvelo F., Ramirez J.L.,
Galindo-Castro I. “Cytotoxic and proapoptotic activity of ent-16β-17α-dihydroxykaurane on
human mammary carcinoma cell line MCF-7” Cancer Lett., 2005, 218, 109-116
Suárez A.I. Salazar M.M., Compagnone R.S., Tillet S., Delle Monache F.,
Digiulio,“Antinociceptive and anti-inflammatory effects of Croton malambo aqueous extract”,
Journal of Etnopharmacology, 2003, 88 (1) , 11-14
17
t-dehidrocrototonina
antiinflamatorio, antiestrogenico,
antigenotóxico y gastroprotector.
cajucarinolido
antiinflamatorio
Isocajurinolido
16β-17α-diol-entkaurano
OH
OH
OH
OH
O
O
O
H
O
OH
OH
O
OO
OH
H
H
OO O
H
H
O
O
O
OH
O
H
O
O
O
H
O
Citotóxicos, evaluados sobre 7 líneas
de células tumorales humanas, con
IC50 entre 0,213-0.017 µM18
HO
H
H
H
H
HO
OH
H
H
H
H
2 3
Química de C. malambo
HO
H
H
H
H
HO
OH
H
H
H
H
2 3
O
O
O
O
H
19
O
O
OHH
Efecto citotoxico de DHK sobre un cultivo de células MCF-7.
El efecto fue visualizado a las 48 horas de tratamiento con la IC50 del DHK.
IC50 = 12.5ug/ml
H
OH
OH
Morales A., Perez P., Mendoza R., Compagnone R.S., Suárez A.I., Arvelo F., Ramirez J.L., Galindo-
Castro I. “Cytotoxic and proapoptotic activity of ent-16β-17α-dihydroxykaurane on human mammary
carcinoma cell line MCF-7” Cancer Lett., 2005, 218, 109-11620
21
•Morales A., Alvarez A., Arvelo F, Suárez A.I., Compagnone R S., Galindo-Castro I. The
natural diterpene ent-16β-17α-dihydroxykaurane down-regulates Bcl-2 by disruption of the
Ap-2α/Rbtranscription activating complex and induces E2F1 up-regulation in MCF-7 cells.
Apoptosis, 2011, 16, 1245-1252.
Control
6 horas
9 horas
Páncreas de rata tratada
Con extracto acuoso de
C. malambo por 17 días
Páncreas de rata normal
Páncreas de rata
tratada con aloxano
Manuscrito en preparación22
Croton malambo
Actividad antiinflamatoria
Actividad hipoglicemiante
Baja toxicidad
.Suárez A, Blanco Z, Compagnone R, Salazar-Bookaman M, Zapata V, Alvarado C. 2005. Anti-inflammatory activity of
Croton cuneatus aqueous extract. Journal of Ethnopharmacology. 105:99-101
23
•Torrico F., Cepeda M., Guerrero G., Melendez F., Z. Blanco, D. J. Canelon, B. Diaz, Compagnone R.S., Suarez A. I.,
"Hypoglycaemic effect of Croton cuneatus in streptozotocin-induced diabetic rats" Brazilian Journal of Pharmacognosy,
2007, 17, 166-169.
O
OH O CH3
MeO OMe
CH2
CH3
CH3
H
CH3
OH
lichexantona (13) selin-11-en-4α-ol (14)
N
NH
O O
CH3
O
R
R1
CH3
R=R1=H julocrotonina (15)
R=H, R1=OH julocrotrol (16)
R=OH, R1=H isojulocrotol (17)
R=R1= O julocrotona (18)
Croton cuneatus Química
24
•Suárez A.I., Blanco Z., Delle Monache F., Compagnone R.S. “Three New Glutarimide
Alkaloids isolated From Croton cuneatus” Natural Product Research, 2004, 18, 421-426
25
Mijares M., Martínez G., Chirinos P., Suárez A.I., Compagnone R.S., Blanco Z, De Sanctis J.B. Efecto del julocrotol,
isojulocrotol y julocrotona sobre la producción de especies reactivas de oxígeno en leucocitos humanos estimulados con
PMA. Revista de la Facultad de Farmacia, 2012, 75 , 25-32.
Valores de las concentraciones inhibitorias medias del julocrotol, el
isojulocrotol, la julocrotona y la talidomida sobre la producción de nitrito en
macrófagos múridos RAW 264.7 estimulados con el LPS
IC50 M
Compuesto 24h 72h
Julocrotol 16,19 (14,78-17,73) 10,68 (9,38-12,16)
Isojulocrotol 21,75 (20,29-23,32) 14,64(12,99-16,51)
Julocrotona 11,51 (10,70-12,38) 5,09 (4,22-6,15)
Talidomida 172,00 (163,00-181,50) 187,60 (174,50-201,60)
1,76 (1,35-2,28) 1,14 (0,89-1,46)
Quercetina 4,76 (4,14-5,47) 5,38 (4,55-6,39)
Aminoguanidina 11,13(10,05-12,32) 4,84 (4,20-5,59)
La concentración del NO fue medida por el método Griess. Los datos representan la concentración
inhibitoria 50 (IC50) y el intervalo de confianza del 95%. n=4. Los valores de IC50 fueron
determinados por una regresión no lineal utilizando el programa Graphpad Prism versión 5,03.
Dexametasona
Para la inhibición del óxido nítrico el orden de potencia fue:
Julocrotona > Julocrotol > Isojulocrotol >> Talidomida
26
Valores de las concentraciones inhibitorias medias de los alcaloides
glutarimídicos sobre la producción del peróxido de hidrogeno en leucocitos
humanos estimulados con el PMA
IC50 (M)
Compuesto Linfocitos Monocitos PMN
Julocrotol 91,99 42,33 19,88
Isojulocrotol 47,72 53,39 27,85
Julocrotona 52,83 36,95 17,59
Talidomida >250 >250 >250
Los datos representan la concentración inhibitoria 50 (IC50). n= 2 Los valores de IC50 fueron
determinados por una regresión no lineal utilizando el programa Graphpad Prism versión 5,03.
Para la inhibición del peróxido de hidrógeno el orden de potencia fue:
MONOCITOS= PMN: Julocrotona > Julocrotol > Isojulocrotol >>> Talidomida
27
Valores de las concentraciones inhibitorias medias de los alcaloides
glutarimídicos sobre la producción del TNF- en macrófagos múridos RAW
264.7 y hPBMCs estimuladas con el LPS
IC50 M
Compuesto RAW 264.7 hPBMCs
Julocrotol 23,41 (22,06-24,83) 25,25 (23,57-27,06)
Isojulocrotol 31,91(29,68-34,30) 33,69 (32,61-34,80)
Julocrotona 14,84 (13,96-15,76) 15,72 (13,85-17,84)
Talidomida 164,10 (146,30-184,10) 174,00 (155,80-194,40)
El TNF- fue medido por ELISA tipo Sándwich. Los datos representan la concentración inhibitoria
50 (IC50) y el intervalo de confianza del 95%, de las células tratadas respecto a los controles
estimulados con LPS 24h (n= 3).
Para la inhibición de la la secreción del TNF-α el orden de potencia fue:
RAW 264.7= hPBMCs: Julocrotona > Julocrotol > Isojulocrotol >>> Talidomida
28
LPS
Monocitos
Linfocitos
PHA
PMA
TCR
CD3
CD
14/T
LR
4
IKKsP P
p65
RelIκB
Ser32
IκB
P P
Ser36
AG, TalAG, Tal
p50
p65
Relp50
P
Ser36
NNúúcleocleo
p65
Relp50
P
Ser36
Transcripción
gen IL-10
gen COX-2 COX-2 PGs
AG, TalAG, Tal
AG,TalAG,Tal
gen IL-12 IL-12
gen TNF- TNF-
Sitio κB
PMN
PMA
NADPH
PKC
H2O
2Intracelular
O2
-
Extracelular
AG, TalAG, TalAGAG
CD69 Linfocitos
AGAGAGAG
CD69Monocitos
TRAF-6
IRAK
MyD88
TRADDTN
FR
1
TRAF2
RIP
TNF-
Nox4
Rac1
NADPH
NADP
O2-O2
IL-10
MD2
CD69
CD69
CD69
AG,TalAG,Tal
AG?, TalAG?, Tal
IKKsP P
p65
RelIκB
Ser32
IκB
P P
Ser36
AG, TalAG, Tal
p50
p65
Relp50
P
Ser36AG, TalAG, Tal
AG?, TalAG?, Tal
p65
Relp50
Transcripción IL-2
AG, TalAG, Tal
Inhibición de la producción de los mediadoresinflamatorios NO, O2
-, H2O2 TNF-, IL-12, IL-10, yla expresión de CD69.
Aumento de la producción de la IL-4 e IL-10.
El mecanismo de acción involucró la inhibiciónde la activación de la vía del NF-B.
Todos los compuestos fueron más activos quela talidomida.
La julocrotona fue el más activo de loscompuestos evaluados.
Núcleo
p65
Relp50
P
Ser36
Transcripción
gen NOS-2 NOS-2 NO
gen COX-2 COX-2 PGs
AG, TalAG, Tal
gen TNF- TNF-
JulocrotolJulocrotol, Tal, Tal Translocación
nuclear
LPS
CD
14
/TL
R4
IKK
P
p65
RelIκB
Ser32
IκB
P P
Ser36
p50
p65
Relp50
P
Ser536
AG, TalAG, Tal
TRAF-6
MyD88
Nox4
Rac1
NADPH
NADP
O2-O2
MD2
AG, TalAG, Tal
IRAK
IKK
IKKP
Proteasoma
AGAG: Alcaloides glutarimídicos
Tal: Talidomida
(1)(Keifer y col 2002)
Aumentan
Disminuyen
PGs: Prostaglandinas
LPS: Lipopolisacárido
¿¿AG?, TalAG?, Tal
Mecanismo de acción en los macrófagos RAW 264.7 estimulados en con el LPS
Mecanismo de acción antineoplásico de los
alcaloides glutarimídicos en las células HL-60
29
Croton huberi
O
OMe
OMe
OMe
OOH
MeO
Retusin (antitumoral)
N-metil-5-hidroxi-Δ3-pirrolin-2-ona
OOH
OH O
OH
CH3
OO
OHOH
OH
CH3
quercitrina
N
CH3
OHO
26. Suárez A, Tapias E, Compagnone R, Tillett S, Díaz B, Canelón D, Blanco Z. 2005. Chemical Constituents from Croton huberi.
Revista Facultad de Farmacia. 68:14-18.
O
O
O
O
OH OH
OH
OH
OH
OH
O
O
OH
Tilirosido (antitumoral)
30
O
O
H
O
O
CH3
H
1
35
6
7
8
9
1011
12
13
14
15
16
17
18
1920
24
O
O
H
O
O
CH3
OO
O
H
O
O
CH3
O
O
H
O
O
CH3
HO
Crotocarasin A Crotocarasin B and C
Croton caracasanus
Crotofolin E
Crotacarasin D
•Chavez K, Riina R, Compagnone R.S, Suárez A.I. Briceño A., Gonzalez T., Landaeta C., Squitieri E.
Crotofolanes diterpenes from Croton caracasana 2013, 8(12), 1679-1682. Natural Products Communications
O
OOH
OCH3
OCH3
H3CO
OCH3
OCH3
2
3
45
6
7
8
9
10
1´
2´
3´
4´
5´
6´
Acción leishmanicida en amastigotes
de Leishmania mexicana
31
QuímicaCH2
CH3
CH3
OH
O
O O
OH
CH3
CH2
CH2
OH
O
CH3
CH2
CH3
CH3
OH
O
CH3
CH3
OH
O
CH2
O
O
O
O
OHOH
OH
OH
OH
OH
OH
CH3
Croton gossypiifolius
Suárez AI, Chávez K.; Blanco Z.; Tillett S, Torrico F, Compagnone R.S Estudio Fitoquímico de la corteza de Croton
gossypifolius Vahl. colectada en Venezuela. Revista Latinoamericana de Química 2013 , 3, 163-170
32
Farmacología
Toxicidad aguda muy baja
Actividad antiinflamatoria
Actividad Citotóxica
Actividad antihistamínica
Croton micans
33
OH
H
H
HH
HOH
H
H HOH
OH
O
H
H
HH
CH2
CH3
CH3CH3H
H
O
34
CH3
CH2
O
CH3
HCH2
OCH3
O
CH3
CH2
O
CH3
HCH2
OH
OCaracasine
ácido de caracasine
Suárez A I, Chávez K, Delle Monache F, Vásquez L, Delannoy D, Orsini G, Compagnone R. 2008. New 3,4-
seco ent-kaurenes from Croton caracasana flowers. Natural Product communications. 3: 319-322.
Suárez A I, Chávez K, Mateu E, Compagnone R, Muñoz A, sojo F, Arvelo F, Mijares M, De Sanctis J. 2009.
Cytotoxic activity of seco-entkaurenes from Croton caracasana on human cáncer cell lines. Natural Product
communications. 4: 1547-1550.35
Suárez A.I., Chavez K., Mateu E., Compagnone R.S., Muñoz A., Sojo F.,Arvelo F., Mijares M., De Sanctis J.B.
“Cytotoxic activity of seco-entkaurenes from Croton caracasana on human cancer cell lines”, Natural Product
Communications, 2009, 4, 1547-1550.
Citoxicidad de Caracasine y su ácido
36
HO
O
O
OH
O
O
OH
HO
O
O
O
O
O
OH
Isomicansinoic acid (2)
Ethylmicansinoic acid (3)
•Mateu E, Chavez K, Riina R, Compagnone R.S, Suárez A.I. New 3,4-seco-ent-kaurene dimers from Croton
micans. Natural Products Comunications. 2012, 7, 5-8
•.
•Vivas J, Sojo F, Chavez K, Suárez A.I., Arvelo F. Cytotoxic effect of monomer and dimmer of 3,4-seco-
entkauranes and interactions with antitumoral drugs on cellular line of Human Prostate Cancer. Letters in Drug
Design & Discovery, 2013, 10, 683-688
O
O
R1
OH
O
R2
O
(124) R1= R2= H
(125) R1= R2= -CH3
(126) R1= H, R2= -CH3
(127) R1= H, R2= -CH2CH3
37
Chávez K., Taddei A., Trotta A., Figarella K., Galindo I., Marsiccobetre S. , Arocha I., Compagnone R. S. , Orsini G.
, Tillett S., Suárez A. I. Synthesis and biological evaluation of derivatives of caracasine acid. Biorganic and
Medicinal Chemistry , 2014. (en prensa)
38
O
HO
HO
O
H
H
HO
O
HO
O
H
H
O
HO
O
H
H
O
HO
OH
H
H
O
O
O
H
H
R
O
HO
O
H
H
R
O
X
O
H
H
R
O
HOH
H
11
10
1
13
j k
i l
m-o
p
a-h
q
O
12
PC3 MCF-7 L. mexicana T. cruziFibroblast
Compound IC50 ± SD SI IC50 ± SD SI IC50 ± SD SI IC50 ± SD SI
IC50 ± SD
1 7.9 ± 1.1 5,0 15.8 ± 2.2 2,5 30.8 ± 9.4 1,3 22.3 ± 3.6 1.8 39.7 ± 10.3
2 3.7 ± 0.4 3,1 11.2 ± 3.2 1,0 3.4 ± 0.6 3,3 16.5 ± 1.2 0.7 11.3 ± 2.8
3 4.5 ± 1.4 0,8 3.8 ± 1.6 1,0 1.6 ± 0.4 2,3 2.7 ± 0.2 1.4 3.7 ± 0.8
4 4.0 ± 0.2 1,6 6.6 ± 2.6 0,9 1.5 ± 0.2 4,1 3.1 ± 0.4 2.0 6.2 ± 0.6
5 4.7 ± 0.9 1,5 5.6 ± 0.3 1,3 1.2 ± 0.2 5,8 4.2 ± 0.1 1.7 7.0 ± 0.6
6 5.4 ± 0.4 1,4 5.4 ± 0.8 1,4 1.5 ± 0.2 5,0 4.1 ± 0.6 1.8 7.5 ± 1.1
7 1.9 ± 0.2 41,9 2.1 ± 0.3 37,9 5.5 ± 1.3 14,5 ˃ 31.4 < 0.7 79.6 ± 33.9
8 4.1 ± 1.2 0,8 3.7 ± 0.2 0,8 1.0 ± 0.2 3,1 4.1 ± 0.4 0.8 3.1 ± 0.5
10 6.7 ± 1.3 3,7 22.6 ± 6.9 1,1 5.3 4,7 ND - 24.7 ± 3.1
11 29.2 ± 4.1 0,9 46.3 ± 4.1 0,5 11.6 2,2 42.6 ± 14.0 0.6 25.4 ± 6.0
12 ND - 109.6 ± 2.3 ˃1,4 > 47 ~ 3,3 ND - > 157
13 136.6 ± 30.2 1,5 86.8 ± 12.2 2,4 > 30 ˂6,9 ND - 206.8 ± 29.5
15 ND - 141.1 ± 17.6 0,4 > 44 ˂1,2 ND - 51.9
16 18.1 ± 0.9 2,4 31.5 ± 2.5 1,4 22.1 ± 2.4 1,9 39.3 ± 3.4 1.1 42.7 ± 5.6
PC3: Prostate carcinoma
MCF-7: Breast carcinoma
SI: Selectivity index (IC50 Fibroblast / IC50 cell line)
SD: Standard Deviation
ND: Not determine
-: Not calculated
IC50 (µM) values of caracasine acid (1) and some derivatives for PC3 and MCF-7 cancer cell
lines, promastigotes of Leishmania mexicana, epimastigotes of Trypanosoma cruzi and
fibroblasts.
39
Compounds
Microorganismos 1 2 3 4 5 6 7 8
B. cereus (G+) 22 22 -- 20 -- -- 25 15
S. aureus (G+) 24 15 -- 12 -- 15 20 12
E. coli (G-) 22 15 -- -- -- -- -- 18
P. aeruginosa (G-) 30 15 -- -- -- 15 18 18
O
O
O
H
H
R
Controls
Microorganismos AN SAM OFX TIL S
B. cereus (G+) 18 -- 28 30 --
S. aureus (G+) 15 15 23 21 --
E. coli (G-) 18 18 25 25 --
P. aeruginosa (G-) 18 -- 25 25 --
Inhibition Diameters reported in mm at C = 1-4 mg/mL; -- = No inhibicion
AN: Amikacin, (30µg); SAM: Ampicillin/Sulbactam (20µg), OFX: Ofloxacin (5µg), Tilmicosin (15
µg),
S: CHCl3/Acetone/EtOH/H2O 15:15:20:50
40
CONCLUSIONES
- En la evaluación de la actividad citotóxica contra las líneas celulares
de cáncer humano MCF-7 y PC3, todos los compuestos evaluados
resultaron activos, pero el ácido fue el mas activo de todos, siendo la
célula PC-3 la mas sensible.
La esterificación del grupo carboxílico aumentó notablemente la
potencia de los compuestos frente a la forma promastigotes de
Leishmania mexicana, especialmente la amida y los esteres.
- En la evaluación de la actividad tripanocida, los ésteres II.2-II.8
resultaron más potentes que el ácido de caracasina, sin embargo,
presentaron una baja selectividad.
-El compuesto II.3 correspondiente al metil éster, resultó el más
potente contra Tripanosoma cruzi con un CI50 de (2.37 ± 0.37) µM.
- En general, el ciclohexil éster del ácido de caracasina (II.7) resultóser el compuesto más potente contra las líneas celulares MCF-7 y
PC3, contra los microorganismos S. aureus, E. coli y P. aeruginosa y
contra parásitos de Leishmania mexicana. Asimismo, fue uno de los
más potentes contra Tripanosoma cruzi.41
Evaluados contra: Leishmania, Tripanosoma cruzi, Bacterias Gram (+) y Gram (
(-) y Células de cáncer MCF-7(mama) y PC-3 (próstata)
Franco Delle Monache
Reinaldo Compagnone
A todos mis tesistas “Croton”
Katiuska Chávez
•Zuleyma Blanco
•Elsa Mateu†
•Gabriela Márquez
•Diana Rivas
•Alejandro Tomassi
•Maria Alejandra Manzano
•Milagros Avila
•CDCH de la UCV
•IIF de Farmacia UCV
•CYTED
•FONACIT
•Iván Galindo
•Francisco Arvelo
•Felipe Sojo
•Annamil Trotta
•Juan De Sanctis
•Margarita Salazar
•Michael Mijares
•Fátima Torrico
•Camilo Di Giulio
•Álvaro Morales
Agradecimientos
42
Stephen Tillett
Ricarda Riina
Giovannina Orsini
Anibal Castillo
43
44