drug discovery from medicinal plants; from chemical ...research.shahed.ac.ir › wsr › sitedata...

Drug Discovery From Medicinal Plants;

From Chemical Analysis to Formulation

Hossein Dehghan

Medicinal Plants Research Center

Shahed University

2

Only 39% of the 877 molecules of new drugs can be classified as truly synthetic in origin.

16.4% correspond to synthetic molecules containing a pharmacophore derived directly from natural products.

12% are actually modeled on a natural product.

Close to 70% of new drugs are naturally derived or inspired.

Natural Products

G

y

Me

3

Drug discovery from medicinal plants

Crude extract,

essential oil,

fixed oil, …

Fractions of extracts,

essential oils ,… Pure compoundPlant Extraction FractionationIsolation &

Purification

Primary

Bioassay

Secondary

Bioassay

Target bioactivity

In vitro or in vivo assays

Bioavailability, Toxicity,

Metabolism, …New drug candidateClinical trials

New

Drug

Bioactive Sample

4

Bioassay Methods

In vitro

Biological studies which are done in a test tube:

Antioxidant assays

Antimicrobial assays

Enzymatic assays

Toxicology assays

Anticancer assays

….

In vivo

Biological studies which are done inside an organism

5

In vitro Assays

Antioxidant assays DPPH radical scavenging (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)

ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid))

FRAP (ferric reducing antioxidant power)

Antimicrobial assays

Enzymatic assays

Human pathogenic bacteria

Human pathogenic fungi

Plant pathogenic fungi

α-Amylase inhibition assay

α-Glucosidase inhibition assay

Tyrosinase inhibition assay

6

Bioassay screening

An effective method to achieve new drugs in the shortest time possible

A rapid method to determine the most active samples through a library

The greater the number of samples studied, the greater the chance of success.

Anti-Alzheimer

Galantamine

Galanthus woronowii

7Anti-malaria

Artemisia annua

Arteether

Artemisinin

Anticancer

Taxol

Taxus baccata

Bioassay screening

Cinnamomum zeylanicum Morus alba Syzygium aromaticum Vaccinium arctostaphylos

Portulaca oleraceaCrataegus oxyacantha Teucrium polium Hibiscus sabdariffaTrigonella foenum-graecum

Rubus fruticosus

8

α-Glucosidase and α-amylase inhibitory effect and antioxidant activity of ten plant extracts traditionally used in Iran for diabetes

Bioassay screening

Allium paradoxum Buxus hyrcana Convolvulus persicus

Eryngium caucasicum

Heracleum persicum

Parrotia persicaPimpinella affinis Primula heterochroma

Ruscus hyrcanus

Pyrus boissieriana

Smilax excelsa9

Antioxidant and antidiabetic activities of 11 herbal plants from Hyrcania region, Iran

Bioassay screening

Polypodium interjectum Polystichum woronowii Polystichum aculeatum Dryopteris affinis

Asplenium scolopendriumAthyrium filix-femina Asplenium adiantum-nigrum Pteris cretica

10

Cytotoxicity, Antioxidant Activity and Phenolic Content of Eight Fern Species

from North of Iran

Bioassay screening

11

Extraction and Fractionation in Drug Discovery

Crude extract,

essential oil,

fixed oil, …



Purification

Primary

Bioassay

Secondary

Bioassay

Target bioactivity




New

Drug

Bioactive Sample

12

Extraction Methods

Infusion

Decoction

Digestion

Maceration

Percolation

Continues hot extraction

Supercritical Fluid extraction

Counter current extraction

Microwave assisted extraction

Ultrasound assisted extraction

Fractionation Methods

Decantation

Fractional distillation

Chromatographic methods

13

Sequential Polarity Extraction

A valid method to partially separate (fractionate)constituents of the plant in extraction step

We would have almost all of the constituents

Fractional extract 1

Solvent 1 +

Residual PlantPlant

&

Solvent 2

+

Fractional extract 2Residual Plant

&

Solvent 3

+


&

Solvent 2

+


&

14

Bioassay-Guided Fractionation in Drug Discovery

Crude extract,

essential oil,

fixed oil, …



Purification

Primary

Bioassay

Secondary

Bioassay

Target bioactivity




New

Drug

Bioactive Sample

15

Fractionation Methods

Crystallization methods


Distillation methods

Sublimation

Combinatorial methods

…

Bioassay Methods

CC

HPLC

GC

TLC

…

In vitro


Antioxidant assays

Antibacterial assays

Enzymatic assays

In vivo


16

Bioassay-guided fractionation

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12 F13 F14 F15 F16 F17 F18 F19 F20 F21 F22 F23 F24 F25 F26 F27 F28 F29

0

50

100

F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10

0

1000

2000

3000

n-Hexane E.A. Methanol

MIC

(μg

/ml)

MIC

(μg

/ml)

Investigation of Antibacterial Activity of Pimpinella affinis Leaves

Against E. coli and S. aureus and Separation of Active FractionsM

IC(μ

g/m

l)

17Abu-Darwish, M. S., & Efferth, T. (2018). Medicinal plants from near east for

cancer therapy. Frontiers in pharmacology, 9, 56.

Crude extract,

essential oil,

fixed oil, …



Purification

Bioactive sample

Primary

Bioassay

Secondary

Bioassay

Target bioactivity




New

Drug

Bioassay-Guided Purification in Drug Discovery

18

Purification Methods




Sublimation


…

Bioassay Methods

CC

HPLC

GC

TLC

…

In vitro


Antioxidant assays


Enzymatic assays

In vivo


19

Bioassay-guided Purification

Bioassay-guided purification of α-amylase, α-glucosidase inhibitors andDPPH radical scavengers from roots of Rheum turkestanicum

0

20

40

60

80

100 α-amylase α-glucosidase

-20

0

20

40

60

80

100

120

F1

F2

F3

F4

F5

F6

F7

F8

F9

F10

F11

F12

F13

F14

F15

F16

F17

Aca

rbose

Inh

ibit

ion

(%

)

Inh

ibit

ion

(%

)

20

α-Glucosidase inhibitory and antioxidant activity of furanocoumarins fromHeracleum persicum

n-Hexane Extract

Psoralen

Heratomin

Angelicin

Xanthotoxin

Bergapten

Isopimpinellin

Isobergapten

Sphondin

Pimpinellin

5-Methoxyheratomin

Moellendorffiline

Fraxetin

β-Sitosterol

Column Chromatography

21

Heratomin

Angelicin

Xanthotoxin

Bergapten

Isopimpinellin

Isobergapten

SphondinPimpinellin

5-Methoxyheratomin

Moellendorffiline

Fraxetin

Psoralen

22

Isolation Methods




Sublimation


…

Bioassay Methods

CC

HPLC

GC

TLC

…

In vitro


Antioxidant assays


Enzymatic assays

In vivo


23

TLC Bioautography

A simple, rapid, and inexpensive method to detect bioactive compounds

In TLC bioautography, both separation and antimicrobial assay are performed on the same TLC plate.

This method, as a qualitative technique, gives an idea of the presence or absence of bioactive substances.

Extraction

λ= 366 nm

Bioautographyagainst S. aureus

λ= 254 nm

TLC

The inhibition zones were visualized

as dark spots in a purple background.

24

Bioassay screening of 12 Iranian plants and TLC bioautography-guided

detection of antibacterial compounds from Heracleum persicum

25

Bioassay screening of 12 Iranian plants and TLC bioautography-guided

detection of antibacterial compounds from Heracleum persicum

26

∝ ∝

Q-1HNMR

The basis of qNMR is the proportional relationship between the given integral resonance and the number of protons.

Therefore, the drug content can be calculated with the integral values of the analyte and the internal standard in thesame solution.

27

Q-NMR has been widely applied in complex mixtures (environmental toxicity, drug toxicity, diseasediagnosis, cancer metabolism, pathophysiology of disease, stress, nutrition, drug metabolism, plant

metabolism, bacterial metabolism, and cell-virus interactions).

Q-1HNMR

QNMR can be conducted without analyte reference materials.

ONMR can provide structural information and does not destroy the samples.

QNMR can undertake multicomponent analysis in a mixture without pre-isolation.

QNMR requires a comparatively short time.

28

1HNMR of n-hexane extract of H. persicum roots

29

Detection of reference peaks

Pimpinellin

(8)(4)

(7)

(2)

(3)

(6)

(11)

30

(12)

(9)(10)

(13)

31

32

98.05 %

HPLC chromatogram

Determination of purity of pimpinellin solution (external reference standard) by HPLC

33

Linearity of artificial reference signal calculated for pimpinellin

Standard Curve

34

PX(%) = Pstd IXIstdNstdNX MxMstdWstdW × 100روترکیبدر

Calculation

Where, P, I, N, M, W and P are purity, integral area, number of nuclei, molar mass and

gravimetric weight of compound (X) and standard (std), respectively.

The purity of main component X can be calculated directly from the NMR spectrum using the following

formula:

%18/1

%7/2

%5/0

%4/1 %3/9

%3/7 %1/5

%1/3 %1/3

%0/6 %0/1

Heratomin (۹)

شناسایی نشده

Pimpinellin (۸)

Isopimpinellin (۴)

β-Sitosterol (۱۳)

Isobergapten (۶)Sphondin (۷)

Moellendorffiline (۱۱)5-Methoxyheratomin (۱۰)

Fraxetine (۱۲)

Xanthotoxin (۳)

Bergapten (۲)

%46/8

35

1HNMR of n-hexane extract of H. persicum roots

36

Formulations

Purslane healing cream

Thyme mouthwash

Edible antifungal tomato coating

37

ویموضعحرارتکاهندهتب،کاهندهجگر،حرارتوخونمسکنصفرا،مسکنآنازشدهآبگرفتهوهواییاندامواستتروسردگیاهیخرفهسنتیطبدر.میباشداسهالضد

کاهشوعطشرفعجهتواستخواصهمینداراینیزخرفهبذر.میشوداستفادهآتشباسوختگیاثردرآسیبدیدهپوستهایدرترمیمآنازهمچنین.استهشداستفادهآتشاثردرسوختگیدرمانجهتبادامروغنیاگلروغنهمراهبهآنضمادازمختلفمنابعدر.میشوداستفادهموضعیصورتبهومعدهدمای

سنتیخرفه در طب

االدویهمخزنکبیر،قرابادیناعظم،اکسیر


38

Purslane Healing Cream

کشت خرفه

استخراج عصاره خرفه

استخراج روغن

فرموالسیون کرم خرفه

آنالیز اسیدهای چرب روغناندازه گیری عدد اسیدی روغن

اندازه گیری قدرت مهار آنزیم تیروزینازاندازه گیری قدرت آنتی اکسیدانی

اندازه گیری مقدار کل ترکیبات فنولی

39


40


خرفهروغناسیدیعددسازماندرگیاهیروغنهایمختلفاستانداردهایمطابق.میباشد2.15±0.08معادلخرفهروغناسیدیعددمقدار

قبولقابلبدستآمدهروغناسیدیعددلذا.باشد5/3ازکمتربایداسیدیعددمعموالً،(8636استانداردمانند)استاندارد.میباشدروغنخوبکیفیتنشاندهندهامراینواستتأییدموردو

خرفهعصارهفنولیترکیباتمیزانفنولیترکیبیکاسیدگالیک.میباشد(اسیدگالیکمعادل)فنولترکیباتگرم8.15±0.41دارایخرفهعصارهلیترهرتجربی،بخشدرکلفنلتستازبهدستآمدهدادههایبامطابق

.میباشد

خرفهعصارهآنتی اکسیدانیاثرمیزانعصارهغلظتافزایشباآزادرادیکالمهاردرصد.گرفتقرارارزیابیموردDPPHرادیکالیظرفیتکاهشقدرتاندازهگیریطریقازخرفهعصارۀمختلفغلظتهایآنتیاکسیدانیفعالیتIC50میزاندرحالیکه.است(=mg/mL0.1±4.8(0.175pبابرابر(میکندمهارراآزادرادیکالهایدرصد50کهغلظتییعنی)آزادرادیکالمهاردرعصارهIC50میزان.یافتافزایش.استmg/mL0.02±0.85بابرابرBHTاستانداردترکیب

تیروزینازآنزیممهاردرخرفهعصارهقدرتموجبmg/mL1غلظتباخرفهعصاره.میباشدتیروزینازآنزیمعلیهمهاریقدرتدارایخرفهکهمیدهدنشاننتایجوشداندازهگیریتیروزینازآنزیمبرخرفهعصارهمهاریاثرمیزان1.55±25.06(0.774p=)غلظتبااسیدکوجیکاستانداردنمونهکهاستحالیدراین.شدآنزیممهاردرصدmg/mL1شدمهاریدرصد95.34±1.29سبب.

41


42


کرم هاپایداریبررسینرمکنندگی،ظاهر،وفازییکنواختیوزن،کاهشدرصد،pHازنظرروز،20طی،40±2دمایدرهمچنینواتاقدمایدرکرمهاپایداری.شدندسیبررپوسترویتحریکیاثراتوآبباکردنپاکسهولتایجادشده،فیلمکیفیتپوست،رویانتشارقدرترسانی،رطوبت

.شددادهتشخیصفرموالسیونمناسبترینپایداری،همچنینوشیمیاییوفیزیکیویژگیهاینظرازF4کرمنتایج،بهتوجهبا

43

Edible antifungal tomato coating

Anti spore germination

Anti mycelial growthCoating formulation

Screening of 8 essential oils

1. Pouramini, P., Fotokian, M. H., Dehghan, H., & Hensel, G. (2019). Effect of Thiobacillus and superabsorbent on essential oilcomponents in Thyme species. Journal of Essential Oil Bearing Plants, DOI; 10.1080/0972060X.2019.1623086.

2. Dehghan, H., Salehi, P., & Amiri, M. S. (2018). Bioassay-guided purification of α-amylase, α-glucosidase inhibitors and DPPHradical scavengers from roots of Rheum turkestanicum. Industrial Crops and Products, 117, 303-309.

3. Dehgha, H., & Sadani, S. (2018). Antioxidant activity and phenolic content of the fractions from some Iranian antidiabetic plants.ACTA Scientific Agriculture, 12, 73-77.

4. Sarrafi, Y., Dehgha, H., & Tavahodi, H. (2018). Isolation and identification of natural sterols from Pimpinella affinis. Journal ofApplied Chemistry, 48, 241-250.

5. Sarrafi, Y., Tavahodi, H., & Dehghan, H. (2017). Investigation of Antibacterial Activity of Pimpinella affinis Leaves Against E. coliand S. aureus and Separation of Active Fractions. Journal of Medicinal Plants, 4(64), 109-115.

6. Dehghan, H., Sarrafi, Y., Salehi, P., & Ebrahimi, S. N. (2017). α-Glucosidase inhibitory and antioxidant activity of furanocoumarinsfrom Heracleum persicum. Medicinal Chemistry Research, 26(4), 849-855.

7. Dehghan, H., Sarrafi, Y., & Salehi, P. (2016). Antioxidant and antidiabetic activities of 11 herbal plants from Hyrcania region, Iran.journal of food and drug analysis, 24(1), 179-188.

8. Dehghan, H., Sarrafi, Y., & Salehi, P. (2015). Chemical Composition of the Essential Oil of Convolvulus persicus L. Journal ofEssential Oil Bearing Plants, 18(3), 592-595.

9. Valizadeh, H., Sonboli, A., Kordi, F. M., Dehghan, H., & Bahadori, M. B. (2015). Cytotoxicity, antioxidant activity and phenoliccontent of eight fern species from North of Iran. Pharmaceutical Sciences, 21(1), 18.

10.Sonboli, A., Bahadori, M. B., Dehghan, H., Aarabi, L., Savehdroudi, P., Nekuei, M., ... & Mirzania, F. (2013). ChemotaxonomicImportance of the Essential‐Oil Composition in Two Subspecies of Teucrium stocksianum Boiss. from Iran. Chemistry &biodiversity, 10(4), 687-694.

11.Salehi, P., Asghari, B., Esmaeili, M. A., Dehghan, H., & Ghazi, I. (2013). -Glucosidase and-amylase inhibitory effect and antioxidantactivity of ten plant extracts traditionally used in Iran for diabetes. Journal of Medicinal Plants Research, 7(6), 257-266.

12.Kaboudin, B., Moradi, K., Safaei, E., Dehghan, H., & Salehi, P. (2012). A Proline-Based Aminophosphinic Acid Ligand and It’sVanadyl Complex: Synthesis, Characterization and In Vitro Inhibitory Effects on α-Amylase And α-Glucosidase. Phosphorus, Sulfur,and Silicon and the Related Elements, 187(12), 1521-1527.

References

45

“Thank You”

48

Q-NMRنسبیQ-NMRمطلق

نمونهگیرینسبیغلظتمولیهرترکیبدراندازه.داردبرایمخلوطهایسادهکاربرد

رکیباتمستقلازسایرتبهصورتاندازهگیریکمّیهرترکیب.سادهوپیچیدهکاربردداردمخلوطهایبراینمونهدر

49

داخلیاستاندارد

داستاندارنمونهیکبهنیازاست،نسبیصورتبهنمونهسیگنالانتگرال1HNMRطیفدرکهآنجاییاز•.اشدمیبنظرموردنمونهمطلقغلظتتعییننهایتدروغلظتهانسبتتعیینجهتمشخصغلظتبا(معیار)

.باشداثربیآنالیزموردنمونهوحاللبهنسبتبایداستاندارد•باشدطیفازمناسبایمحدودهدرمناسبهاییسیگنالدارای•لمحلوبهشدهافزودهاستانداردنمونهوزندقیقگیریاندازهلزوم•استانداردنمونهباالیخلوصلزوم•ات نمونهگاهی اوقات نمونه استاندارد باعث تغییر در جابجایی شیمیایی ترکیب•

خارجیاستاندارد

:هم مرکزتیوبواستداخلیاستانداردروشمشابهروشایندربه دست آمدهطیف

اباستانداردنمونهبرهمکنشدرنتیجهواختالطعدمآنتفاوت.می باشدآنالیزموردنمونهترکیبات

تاباشدطیفازمناسبایمحدودهدرمناسبهاییسیگنالداراینمونهواستانداردهایسیگنالبینایهمپوشانی

:جداگانهگیریطیفستگاهدوشرایطکردنکالیبرهدراستانداردنمونهمطلقانتگرالاز

درموجودترکیباتیاترکیبمطلقانتگرالسپسوگرددمیاستفاده. شودمیاندازه گیریگرفتهصورتکالیبراسیوناساسبرنمونه

50

Q-1HNMRبهکمکاستانداردخارجیومرجعداخلی

(میکندکههماننداستانداردداخلیعمل)یکاستانداردخارجیباغلظتمشخصویکمرجعداخلیازدراینروش.میشوداستفاده

.میشودهمزماناستفادهبهطورازمزایایدوروشاستانداردداخلیواستانداردخارجیبهاینترتیب.نباشداینروشدیگراحتیاجبهخلوصباالومقداردقیقاستاندارداینامرسببمیشودکهدر

drug discovery from medicinal plants; from chemical ...research.shahed.ac.ir › wsr › sitedata...

Documents