eine evaluation der intestinalen mikrozirkulation bei ... · intermediär, 2= normal), so dass...

E I N E E V A L U A T I O N D E R I N T E S T I N A L E N M I K R O Z I R K U L A T I O N B E I P A T I E N T E N M I T

C H R O N I S CH - E N T Z Ü N D L I C H E N D A R M E R K R A N K U N G E N M I T T E L S

K O N F O K A L E R L A S E R E N D O S KO P I E

D IS SER TA TI ON

ZU R ER LA NGU NG D ES A K AD EM IS C HEN GR AD ES

D O C TO R M ED I CI NA E ( D R . MED .)

VOR G E L EGT D EM R A T D E R MED I Z IN IS C HEN FA KU L TÄ T

D ER FR I ED R I C H - SC H IL LE R -U NI VER SI TÄ T J ENA

von Juliane M. Groß geb. Kaden

geboren am 01.05.1984 in Jena

- 2 -

GUTACHTER

1. PROF. DR. MED. ANDREAS STALLMACH, JENA

2. PROF. DR. MED. UTA DAHMEN, JENA

3. PD DR. MED. HABIL. MICHAEL HOCKE, MEININGEN

TAG DER ÖFFENTLICHEN VERTEIDIGUNG: 04. FEBRUAR 2014

- 3 -

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

Abb. Abbildung

AI Area Index im Vessel Detection Programm

5-ASA 5-Aminosalicylsäure

ATG16L1 Autophagy related 16-like 1

CAM cellular adhesion molekule

CARD15 c-Terminal Caspase Recruitment Domain 15

CD Cluster of differentiation

CDAI Crohn’s Disease Activity Index

CDEAS Crohn’s Disease Endomicroscopic Activity Score

CED Chronisch-entzündliche Darmerkrankung

cLE konfokale Laserendoskopie

CU / Colitis Ulcerosa C. ulcerosa

DSS Natrium Dextran Sulfat

GALT gut associated lymphoid tissue

GWAS Genom-weite Assoziationsstudien

IFN-γ Interferon-Gamma

IL Interleukin

IRGM Immunity-related GTPase family M protein

LENG Vessel length, Gefäßlänge im Vessel Detection Programm

LI Length Index im Vessel Detection Programm

max Maximum

MC / Morbus Crohn M. Crohn

min Minimum

MTX Methotrexat

MUC1 Mucin-Gene

MW Mittelwert

- 4 - n Anzahl

NBI Narrow-band Imaging

NFκB Nuclear factor-kappa B

NOD2 Nucleotid Oligodimerisation Domain 2

NSAR Nicht-steroidale Antirheumatika

p Wahrscheinlichkeitswert

PTGER Prostaglandin E2 receptor

ROI Region of Interest

SD standard deviation, Standartabweichung

Tab. Tabelle

TBNS trinitrobenzene sulfonic acid

TGF-β Transforming Growth Factor β

Th T-Helfer-Lymphozyt

TLR Toll-like-Rezeptor

TNF-α Tumor-Nekrosefaktor α

VD Vessel Diameter, Gefäßdurchmesser im Vessel Detection Programm

VEGF vascular endothelial growth factor

- 5 -

INHALTSVERZEICHNIS

1. Zusammenfassung .............................................................................................................. 7

2. Einleitung ........................................................................................................................... 9

2.1 Klinische und epidemiologische Betrachtungen der chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen ............................................................................................................... 9

2.1.1 Therapie der chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen ............................... 10

2.2 Ätiologie und Pathogenese ........................................................................................... 11

2.2.1 Rolle der Mikrovaskularisation in der Ätiologie und Pathogenese der chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen ............................................................................... 17

2.3 Gefäßdarstellung mittels konfokaler Laserendoskopie ................................................ 21

3. Ziele der Arbeit ................................................................................................................. 23

4. Methodik .......................................................................................................................... 25

4.1 Patienten ....................................................................................................................... 25

4.2 Das Laserendoskop mit konfokaler Einheit .................................................................. 26

4.3 Untersuchungsablauf .................................................................................................... 28

4.4 Bildauswertung ............................................................................................................. 29

4.4.1 "Vascularity Score" .............................................................................................. 29

4.4.2 "Vessel Detection" ............................................................................................... 30

4.5 Statistische Auswertung ............................................................................................... 33

5. Ergebnisse ........................................................................................................................ 34

5.1 Auswertung des Bildmaterials mit dem "Vascularity Score" ........................................ 34

5.1.1 Gesamtscore ........................................................................................................ 34

5.1.2 Gefäßmuster ........................................................................................................ 35

5.1.3 Gefäßzusammenhang .......................................................................................... 36

5.1.4 Gefäßverlauf ........................................................................................................ 37

5.2 Evaluation durch den "Vessel Detection"-Algorithmus ................................................ 38

5.2.1 Vessel area und "area index" ............................................................................... 39

5.2.2 Vessel length und "length index" ........................................................................ 40

5.2.3 Vessel diameter ................................................................................................... 41

5.2.4 Korrelationen innerhalb "Vessel Detection" ....................................................... 42

5.3 Korrelation "Vascularity Score“ und "Vessel Detection"-Algorithmus ......................... 42

6. Diskussion ........................................................................................................................ 46

6.1 Vorbetrachtungen ......................................................................................................... 46

6.2 Ergebnisse der Evaluation mit dem "Vascularity Score" und dem "Vessel Detection"-Algorithmus ........................................................................................................................ 48

- 6 -

6.3 Diskussion der Ergebnisse vor dem Hintergrund der aktuellen Literatur .................... 48

6.4 Klinische Bedeutung der Ergebnisse ............................................................................ 51

7. Literatur- und Quellenverzeichnis ...................................................................................... 54

8. Anhang ............................................................................................................................. 70

8.1 Danksagung ................................................................................................................... 70

8.2 Ehrenwörtliche Erklärung ............................................................................................. 71

- 7 -

1. ZUSAMMENFASSUNG

In der Pathogenese der chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) geht man heutzutage von

einer multifaktoriellen Genese aus, welche aus einem komplexen Zusammenspiel von verschiedenen

Störungen besteht. Die aktuellen Konzepte adressieren hier vor allem eine Störung der intestinalen

Barriere unter Beteiligung der mikrobiellen Flora des Darms, die vor dem Hintergrund einer genetischen

Suszeptibilität und dem Einfluss verschiedener Umweltfaktoren zu einer überschießenden Reaktion des

Darm-assoziierten Immunsystems führen und schließlich das klinische Bild eines Morbus Crohn (MC) oder

einer Colitis ulcerosa (CU) bedingen. Eine gestörte mukosale Mikrozirkulation wird zudem als ein

wichtiger Kofaktor in der Ätiopathogenese der CED betrachtet.

Mit dieser Arbeit sollte unter Nutzung der konfokalen Laserendoskopie (cLE) eine Analyse der in-vivo

Darstellung des mukosalen Kapillarnetzes durchgeführt werden. Dazu wurden die Parameter und die

Architektur mukosaler Gefäße sowohl subjektiv unter Nutzung eines selbstevaluierten Scores, sowie

objektiv unter Anwendung eines etablierten Analysealgorithmus erfasst. Ziel war die Beurteilung visuell

und mathematisch erfassbarer Unterschiede in der Gefäßarchitektur bei Patienten mit chronisch-

entzündlichen Darmerkrankungen im Vergleich zu einer Kontrollgruppe.

Wir untersuchten 20 CED-Patienten, davon 10 mit Colitis ulcerosa und 10 mit Morbus Crohn, im Stadium

der klinischen Remission und verglichen diese mit 19 Patienten ohne eine gastrointestinale

Vorerkrankung. Die Darstellung der Gefäßarchitektur des Kolons bei Patienten mit MC und CU erfolgte in

makroskopisch unauffälligen Schleimhautarealen.

Auf der Basis der Auswertung des Bildmaterials wurde ein Bewertungsmaßstab für Gefäße – der

sogenannte "Vascularity Score" - entwickelt. Dieser integriert verschiedene Eigenschaften der

Gefäßarchitektur, die sich bei chronisch-inflammatorischen Prozessen verändern können. Dazu wurden

a) das Gefäßmuster (honigwabenartige Gefäßstruktur), b) der Gefäßzusammenhang und c) der

Gefäßverlauf beurteilt. Für jeden dieser Parameter wurden 0-2 Punkte vergeben (0 = pathologisch, 1=

intermediär, 2= normal), so dass insgesamt minimal 0 Punkte (hochpathologischer Befund) und maximal 6

Punkte (Normalbefund) vergeben wurden. Nachfolgend wurden die gespeicherten Bilddateien mit Hilfe

des Programm „Vessel Detection“, welches auf Grundlage eines mathematischen Algorithmus

semiautomatisch in der Lage ist, innerhalb der Bilder mit Kontrastmittel durchflossene Gefäße zu

detektieren, hinsichtlich ihrer Gefäßdichte (vessel area/area index), Gefäßlänge (vessel length/length

index) und den Gefäßdurchmesser (diameter) analysiert.

- 8 - Die deskriptive Auswertung mit Hilfe des "Vascularity Score" ergab für die Gruppe der CED-Patienten

einen signifikanten Verlust des honigwabenartigen Gefäßmusters (p < 0,01), des Gefäßzusammenhangs

(p < 0,01) und des Gefäßverlaufs (p < 0,01) im Vergleich zu den Kontrollen. Innerhalb der CED-Patienten

zeigten sich für den Gesamtscore, sowie das Gefäßmuster ebenfalls signifikante Unterschiede. So weisen

Patienten mit einer CU gegenüber MC-Patienten eine signifikant niedrigere Punktzahl für das

Gefäßmuster (p = 0,02), sowie den Gesamtscore auf (p = 0,01) und zeigen damit ein höheres Maß an

pathologischen Veränderung des Kapillarnetzes. Die Analyse mittels "Vessel Detection" bestätigte diese

Ergebnisse (siehe Tab. 1) und zeigte für die gesamte Gruppe der CED-Patienten und, insbesondere den

Patienten mit M. Crohn eine signifikant reduzierte Gefäßdichte (CED: p = 0,03 / MC: p < 0,01 / CU: p =

1,00), sowie eine reduzierte Gefäßlänge (CED: p = 0,04 / MC: p < 0,01 / CU: p = 1,00).

TABELLE 1: ERGEBNISSE FÜR GEFÄßDICHTE-INDEX UND GEFÄßLÄNGE DURCH "VESSEL DETECTION"

CED Morbus Crohn Colitis ulcerosa Kontrollgruppe Median (min/max) Median (min/max) Median (min/max) Median (min/max)

area index 0,17 0,11 / 0,34 0,16 0,12 / 0,22 0,18 0,11 / 0,34 0,2 0,14 / 0,33

vessel length [μm]

3037 1657 / 4603 3178 2000 / 3989 2768 1657 / 4603 3618 2039 / 5833

Veränderungen des mukosalen Kapillarnetzes sind im Rahmen von akuten und chronischen

Entzündungsprozessen in tierexperimentellen Studien sowie in humanen Untersuchungen ex vivo

beschrieben worden. Die cLE ermöglicht erstmals eine in vivo Darstellung mukosaler Gefäßstrukturen.

Durch die Nutzung des neu entwickelten mathematischen Algorithmus konnten wir in einer objektiven

Evaluation die subjektiv beschriebenen Gefäßalterationen bestätigen. Zudem besteht eine enge

Korrelation der Parameter beider Evaluationsverfahren mit- als auch unter-einander. Zusammenfassend

zeigt sich, dass trotz makroskopisch unauffälligem Befund der Mukosa und dem Vorliegen einer klinischen

Remission signifikante Veränderungen des mukosalen Kapillarnetzes nachweisbar sind. Die Signifikanzen

in der Gruppe des Morbus Crohn bestätigen histologische Ergebnisse in der Literatur und stützen

pathophysiologische Vorgänge einer gestörten Mikrovaskularisation in Entstehung und Verlauf des M.

Crohn. Ob die nachgewiesenen Gefäßalterationen als Ausdruck einer primären pathogenetischen

Veränderung oder aber als Folge von stattgehabten Entzündungsprozessen in der Mukosa verstanden

werden müssen, lässt sich nicht abschließend beantworten und erfordert weitergehende Studien. Die

Bedeutung der Ergebnisse für die Beurteilung des klinischen Verlaufes bleibt letztlich unklar. Es ist jedoch

gut vorstellbar, dass Patienten mit einer ausgeprägteren Störung der intestinalen Mikrozirkulation ein

erhöhtes Rezidivrisiko aufweisen und die cLE somit zur besseren Prädiktion dieses Risikos genutzt werden

könnte.

- 9 -

2. EINLEITUNG

2.1 KLINISCHE UND EPIDEMIOLOGISCHE BETRACHTUNGEN DER CHRONISCH-ENTZÜNDLICHEN DARMERKRANKUNGEN

Die Gruppe der chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) umfasst im Wesentlichen zwei

Entitäten – den Morbus Crohn (MC) und die Colitis ulcerosa (CU). Patienten mit MC und Patienten mit CU

teilen eine Reihe an Gemeinsamkeiten, weisen jedoch auch charakteristische Unterschiede in ihrer Klinik

auf. Das Risiko an der jeweiligen Entität zu erkranken, wird vor allem durch Umwelteinflüsse und

prädeterminierende genetische Faktoren, die u. a. verschiedene immunologische Mechanismen

beeinflussen, bestimmt.

Die Prävalenz beider Erkrankungsentitäten ist für die Geschlechter ähnlich verteilt (Matricon et al. 2010),

wobei sich in der Gruppe der Patienten mit Colitis ulcerosa eine leichte Häufung des männlichen

Geschlechts, in der Gruppe der Morbus Crohn-Patienten hingegen eine des weiblichen Geschlechts findet

(Hanauer 2006). Für beide Gruppen der chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen wurde ein erster

Altersgipfel zwischen dem 15. und 30. Lebensjahr beschrieben. Der zweite beschriebene Gipfel der

Neuerkrankungen liegt tritt im höheren Alter zwischen 50 und 70 Jahren, der sich aber in neueren

Arbeiten nicht mehr sicher identifizieren ließ (Andres 1999, Bernstein et al. 1999). Die Inzidenz und

Prävalenz der chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen weist ein deutliches Nord-Süd-Gefälle auf mit

der höchsten Neuerkrankungsrate in Nordamerika und Nordeuropa. Die niedrigsten Erkrankungsraten

finden sich im Bereich der südlichen Hemisphäre (Baumgart et al. 2012). Ethnologische Studien haben

eine erhöhte Suszeptibilität für beide Erkrankungen bei Menschen kaukasischer und jüdischer

Abstammung gezeigt (Roth et al. 1989). Demgegenüber werden chronisch-entzündliche

Darmerkrankungen bei Nicht-Weißen aus Entwicklungsländern nur selten beobachtet (Loftus 2003). Dies

bestätigt die Tendenz beider Erkrankungen, eher in sozioökonomisch besser gestellten

Gesellschaftsschichten aufzutreten (Trallori et al. 1996, Loftus 2000, Andres 1999).

Der Morbus Crohn kann, anatomisch betrachtet, einen Befall des gesamten Intestinaltraktes vom Mund

bis zum Anus aufweisen, wobei zumeist das terminales Ileum und/oder das Kolon betroffen sind.

Typischerweise zeigt sich einen diskontinuierlichen, transmuralen Befall der Darmwand. Die Colitis

ulcerosa ist hingegen auf Rektum und Kolon beschränkt und ist bei verschiedenen Patienten durch eine

unterschiedlich weite, kontinuierliche Ausdehnung im Sinne einer Proktitis über eine Linksseiten-Kolitis

bis hin zur Pankolitis nach proximal gekennzeichnet (Silverberg et al. 2005). Histologisch lässt sich ein

mukosaler Befall der Darmschleimhaut nachweisen (Lennard-Jones und Lockhart-Mummery 1968).

- 10 - Grundsätzlich lassen sich verschiedene Verlaufsformen identifizieren. So gibt es

a) Patienten, die bei Erstmanifestation eine hohe Krankheitsaktivität zeigen, und anschließend ein

lange Phase mit niedriger Krankheitsaktivität aufweisen.

b) Patienten, bei denen sich Krankheitsphasen mit Phasen der Remission abwechseln,

c) Patienten, mit initial lang anhaltender niedriger Krankheitsaktivität, die plötzlich einen

fulminanten akuten Schub entwickeln und

d) Patienten mit chronischer Krankheitsaktivität, bei denen praktisch keine Phase der Remission

nachzuweisen ist (Solberg et al. 2009).

Klinisch imponieren bei beiden Erkrankungen während eines aktiven Schubes z. T. ausgeprägte Diarrhoen,

teilweise mit Blutauflagerungen und häufigen Bauchschmerzen (Cho 2008). Beide Krankheitsentitäten

können mit extraintestinalen Symptomen einhergehen, wie Hauterscheinungen (z.B. Erythema nodosum

und Pyoderma gangränosum), rezidivierenden Arthritiden sowie Arthralgien und ophthalmologischen

Beteiligungen, wie beispielsweise Iritis, Uveitis und Episkleritis (Lennard-Jones und Lockhart-Mummery

1968, Schepper et al. 2008).

Zudem bestimmen komplizierende Begleiterkrankungen den individuellen Krankheitsverlauf

entscheidend mit. So kann es beim Morbus Crohn zu perianalen Manifestationen, wie Fistelbildung und

Abszessen, sowie zu Strikturen und Stenosen im gesamten Intestinaltrakt kommen. Bei der Colitis

ulcerosa tritt vereinzelt eine primär sklerosierende Cholangitis als weitere extraintestinale Manifestation

auf, zudem besteht ein erhöhtes Risiko für die Entstehung kolorektaler Neoplasien.

2.1.1 THERAPIE DER CHRONISCH-ENTZÜNDLICHEN DARMERKRANKUNGEN

Die Therapie der CED orientiert sich maßgeblich am klinischen Verlauf und besteht in erster Linie in einer

bedarfsadaptierten anti-inflammatorischen oder immunsuppressiven Therapie. Grundsätzlich ist in der

Therapie zwischen Ansätzen, die im akuten Schub eingesetzt werden und Remissions-erhaltenden

Strategien zu differenzieren. Zur Verfügung stehen 5-Aminosalicylsäure (5-ASA), topische (Budesonid) und

systemische Kortikosteroide, immunsuppressive Medikamente wie Azathioprin und Methotrexat (MTX),

sowie anti-TNF-Antikörper und sogenannte Reservemedikamente.

5-ASA wird vor allem für die Behandlung milder bis moderater Verläufe der Colitis ulcerosa eingesetzt,

kann sowohl topisch als auch systemisch appliziert werden und ist in der Akuttherapie wie auch der

Rezidivprophylaxe wirksam. Bei der Behandlung des Morbus Crohn kommen initial vor allem

Kortikosteroide (topisch wirksames Budesonid bei ileozoekalem Befall oder systemische Steroide wie

Prednisolon bei ausgedehnterem Befall oder hoher Erkrankungsaktivität) zum Einsatz (Podolsky 2002).

Systemische Steroide werden ebenso bei der höhergradig aktiven Colitis ulcerosa eingesetzt. Bei

- 11 - Rezidiven werden zur Prophylaxe eines erneuten Erkrankungsschubes unter anderem Azathioprin oder

Methotrexat genutzt. Bei Steroidrefraktarität wurde in den letzten Jahren eine Therapie mit Anti-TNF- -

Antikörpern (Infliximab oder Adalimumab) etabliert. Bei schweren Verläufen chronisch-entzündlicher

Darmerkrankungen und fehlendem Ansprechen auf die bisherige Therapie kommen im Weiteren

Reservemedikamente wie Cyclosporin, Tacrolimus oder Cyclophosphamid zum Einsatz (Baumgart et al.

2012). Nicht zuletzt stellt auch die chirurgische Intervention bei therapierefraktären Verläufen sowie bei

Komplikationen wie Stenosen oder Abszessen eine sinnvolle Therapie im Management der chronisch-

entzündlichen Darmerkrankungen dar.

2.2 ÄTIOLOGIE UND PATHOGENESE

Obwohl die Pathogenese der chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen nach wie vor nur unvollständig

verstanden wird, gehen aktuelle Konzepte davon aus, dass ein komplexes Zusammenspiel aus

genetischen Faktoren und Umwelteinflüssen die immunologische Dysregulation und die gastrointestinale

Barrierefunktion bestimmen (Danese und Fiocchi 2006, Hanauer 2006). So wurde konstatiert, dass die

Entstehung von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen im Wesentlichen von folgenden Faktoren

und Prozessen bestimmt werden (Kucharzik et al. 2006):

Genetische Faktoren

Umweltfaktoren

Dysregulation immunologischer Prozesse

Störungen der intestinalen Barriere

GENETISCHE FAKTOREN

Die Bedeutung der genetischen Faktoren wird durch eine erhöhte Prävalenz für eine CED unter den erst-

und zweitgradig Verwandten der Indexpatienten unterstrichen. Unterschiedliche Studien zeigten für 5-

10% der Patienten das Auftreten einer CED bei Verwandten 1. Grades (Orholm et al. 1991, Binder 1998).

Zwillingsstudien legen nicht nur ein erhöhtes Erkrankungsrisiko für monozygote Geschwister mit CED

nahe, sondern interessanterweise auch eine höhere genetische Penetranz für den Morbus Crohn. Die

Konkordanzrate erreicht bei M. Crohn bis über 50% und bei der Colitis ulcerosa bis zu 17% bei

monozygoten Zwillingen (Satsangi 2003).

Genom-weite Assoziationsstudien (GWAS) haben in den vergangenen Jahren eine Reihe an Genen

identifizieren können, die mit dem Morbus Crohn und der Colitis ulcerosa assoziiert sind (Barrett et al.

- 12 - 2008). Über verschiedene Pathomechanismen wird durch eine Vielzahl an Genen ein unter-schiedliches

Maß an Suszeptibilität vermittelt. Dabei lässt sich grundsätzlich zwischen Genen unterscheiden, die für

die angeborene Immunantwort relevant sind (z. B. NOD 2 (Card 15), ATG16L1, IRGM) und jenen, welche

bei der erworbenen Immunantwort eine Rolle spielen (sekretorische Phospholipase A2 - PLA2G2E, IL-10

oder Interferon-γ) (Matricon et al. 2010). Als erstes Suszeptibilitätsgen wurde NOD 2 (CARD 15) in der

perizentromerischen Region des Chromosom 16 identifiziert (Hugot et al. 2001, Ogura et al. 2001). Das

hierbei entstehende intrazelluläre Protein übernimmt eine zentrale Rolle in der Aktivierung von

Transkriptionsfaktoren, welche in die Inflammationsantwort involviert sind und eine Reihe unspezifischer

Entzündungsmediatoren produzieren (Satsangi 2003). Durch Mutationen in NOD 2 und ATG16L1, sowie

IRGM als Komponenten des Autophagie-Komplexes, kommt diesen durch eine veränderte Erkennung und

Verarbeitung bakterieller Strukturen und einer ineffektiven Autophagie (Entfernung intrazellulärer

Komponenten und Mikroben) eine zentrale Bedeutung in der Immunpathogenese des Morbus Crohn zu

(Cho 2008).

Eine Assoziation mit beiden Erkrankungsentitäten wurde interessanterweise bei einer Vielzahl von Genen

im Interleukin-23-Th17-Pathways gefunden (Duerr et al. 2006).

UMWELTFAKTOREN

Obwohl viele Studien gezeigt haben, dass verschiedene Gene in der Lage sind, die Suszeptibilität für die

chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen zu vermitteln, ist es unumstritten, dass die Ausbildung der

tatsächlichen Erkrankung maßgeblich durch verschiedene Umweltfaktoren begünstigt wird. In der Summe

kommt es zu einer Störung der intestinalen Barriere mit nachfolgender Überreaktion des mukosalen

Immunsystems und letztendlicher Ausprägung der Erkrankung.

Ein bedeutender Umweltfaktor scheint hierbei der Tabakkonsum zu sein. Verschiedene Studien haben die

negativen Einflüsse des Rauchens für ein erhöhtes Erkrankungsrisiko wie auch auf den klinischen Verlauf

des Morbus Crohn zeigen können (Lindberg et al. 1988, Krishnan et Korzenik 2002). In einer Meta-Analyse

von 2006 konnte nach Auswertung mehrerer Studien der letzten 20 Jahre ein signifikant erhöhtes Risiko

für Raucher und ehemalige Raucher gezeigt werden, an einem Morbus Crohn zu erkranken (Mahid et al.

2006). Interessanterweise stehen diesen Ergebnissen bei Morbus Crohn Erkenntnisse über protektive

Effekte des Rauchens bei Patienten mit Colitis ulcerosa entgegen (Lindberg et al. 1988, Hanauer 2006).

Die Ursachen für diese gegensätzlichen Ergebnisse sind jedoch noch ungeklärt. Neuere Studien

diskutieren jedoch ein verändertes Verhalten von Dickdarm und Dünndarm gegenüber der

Nikotinexposition. In der Kolonmukosa begünstigt Nikotin eine Reduktion proinflammatorischer Zytokine,

wohingegen es in der ilealen Mukosa zu einem Anstieg der proinflammatorischen Zytokine und einem

- 13 - Abfall der anti-inflammatorischen Mediatoren kommt (Karban et al. 2007). Unterstützt wird diese Theorie

durch Untersuchungen bei Patienten mit Morbus Crohn, welche unter Nikotinabusus ein erhöhtes Risiko

für eine Krankheitsexazerbation, jedoch einen selteneren Befall des Kolons aufweisen (Sher et al. 1999).

Dieses würde nahelegen, dass das Befallsmuster in Zusammenhang mit dem Nikotinabusus zu

interpretieren ist und weniger Ausdruck der Krankheitsentität selbst ist.

Auch Veränderungen der hygienischen Rahmenbedingungen wurden mit der Pathogenese chronisch-

entzündlicher Darmerkrankungen in Zusammenhang gebracht. Eine regelmäßige Exposition gegenüber

einem normalen Keimspektrum, sowie eher durchschnittlich hygienische Bedingungen erweisen sich als

protektiv gegenüber der Entwicklung einer CED. Bei Kindern, welche in einer weitläufigen, gut gereinigten

Wohnumgebung aufwachsen, kein Zimmer oder Bett mit anderen teilen müssen, haben ein deutlich

erhöhtes Risiko an einem Morbus Crohn zu erkranken (Krishnan et Korzenik 2002).

In der Reihe der Umweltfaktoren, welche die Pathogenese der CED beeinflussen, wurde ebenfalls

wiederkehrend die Rolle von Medikamenten, insbesondere von Nicht-steroidalen-Antiphlogistika (NSAR)

diskutiert. Die Ergebnisse hierzu sind nicht abschließend zu bewerten, es konnte jedoch in mehreren

Studien ein positiver Zusammenhang zwischen einer ansteigenden Inzidenz für CED und einem

regelmäßigen Gebrauch von NSAR nachgewiesen werden (Takeuchi et al. 2006, Ananthakrishnan et al.

2012). Man geht davon aus, dass der regelmäßige Gebrauch von NSAR zu einer Blockade protektiver

Prostaglandine führt, und es nachfolgend durch eine Veränderung der Cyclooxygenase – Aktivität zu

einem Integritätsverlust der intestinalen Barriere mit Alterierung der „tight junctions“ und steigender

Permeabilität für luminale Antigene kommt (Neumann et al. 2012).

Weitere determinierende Umweltfaktoren hinsichtlich der Inzidenz chronisch-entzündlicher

Darmerkrankungen wie Ernährungsgewohnheiten und berufliches Betätigungsfeld sind in der

Vergangenheit widersprüchlich diskutiert worden. So wird eine übermäßige Aufnahme von Fettsäuren,

sowie regelmäßiger Genuss von Fast-Food als potentieller Risikofaktor für die Entwicklung einer CED in

Betracht gezogen (Krishnan 2002, Sonnenberg 1990). Jedoch sind auch hier zum aktuellen Zeitpunkt keine

konsistenten Ergebnisse vorliegend.

Ungeklärt ist auch die Rolle der bakteriellen Kolonisation des Intestinums als determinierende Ursache

der Genese einer chronisch-entzündlichen Darmerkrankung. So wird eine Alterierung der intestinalen

Barriere durch diverse Pathogene diskutiert, welche nachfolgend in einem Individuum mit genetisch

erhöhter Suszeptibilität zur Entwicklung einer chronischen Inflammation führt (Kucharzik et al. 2006).

Unterstützt wird diese Hypothese durch Fallberichte, in denen sich bei Patienten nach

Auslandsaufenthalten mit sporadischer Enteritis oder nach Infektionen mit Salmonellen, Shigellen oder

Yersinien eine Colitis ulcerosa oder ein Morbus Crohn manifestiert hat. Des Weiteren wurden

- 14 - Mykobakterien und Listerien als kausales Agens für die Entstehung eines Morbus Crohn diskutiert. Zum

jetzigen Zeitpunkt kann jedoch keiner der mikrobiellen Organismen als ursächlich für die Genese einer

CED betrachtet werden (Greenstein 2003).

STÖRUNGEN IMMUNOLOGISCHER PROZESSE

Das Intestinum wird täglich verschiedenen Antigenen ausgesetzt, wovon ein Teil als apathogen und ein

Teil als potentiell pathogen einzustufen ist. Daher ist es essentiell für das intestinale Immunsystem,

sowohl eine Toleranz gegenüber harmlosen Antigenen zu entwickeln, um z. B. eine ausreichende

Nahrungsaufnahme zu gewährleisten, als auch einen suffizienten Abwehrmechanismus zum Schutz vor

pathologischen und toxischen Antigenen aufrecht zu erhalten. Der Magen-Darm-Trakt weist dazu ein

Immunsystem auf, das grundsätzlich in Bestandteile der angeborenen und der erworbenen Immunität

differenziert werden kann.

Das angeborene Immunsystem des Gastrointestinaltraktes stellt die unspezifische rasche Immunantwort

des Körpers gegenüber mikrobiellen Keimen dar. In Zusammenhang mit den chronisch-entzündlichen

Darmerkrankungen wurde unter anderem die Struktur der extrazellulären Toll-like-Rezeptoren (TLR)

untersucht, welche u. a. von Epithelzellen und dendritischen Zellen exprimiert und im Rahmen der

Immunantwort für die Erkennung und Bindung pathogener molekularer Strukturen mikrobieller Keime

verantwortlich sind. Dadurch kommt diesen eine zentrale Rolle in der Aufrechterhaltung der intestinalen

Homöostase zu (Ordás et al. 2012). Im Rahmen einer funktionstüchtigen intestinalen Barriere werden vor

allem TLR 3 und TLR 5 exprimiert, wohingegen TLR 2 und TLR 4 nur wenig vorhanden sind (Cario et

Podolsky 2000). Bei Morbus Crohn- und Colitis ulcerosa-Patienten werden im Vergleich hierzu vermehrt

TLR 4 in den Zellen der Lamina propria exprimiert. Über verschiedene intrazelluläre

Signaltransduktionswege führen diese zu einer Aktivierung von NFκB und zu einer gesteigerten

Transkription proinflammatorischer Zytokine (Vamadevan et al. 2010). Jedoch bleibt auch hinsichtlich

einer alterierten Exprimierung der Toll-like-Rezeptoren und der Entstehung chronisch-entzündlicher

Darmerkrankungen noch ungeklärt, ob es sich hierbei um ein primäres oder sekundäres Geschehen

handelt (Shen et al. 2010).

Hinsichtlich des erworbenen Immunsystems können bei Individuen mit chronisch-entzündlicher

Darmerkrankung vermehrt immunkompetente Zellen in der Darmwand lokalisiert werden, wobei die

Mehrzahl CD4–positive Zellen darstellen. Diese T-Zellen produzieren nach Antigenpräsentation durch

dendritische Zellen in den Peyer’schen Plaques verschiedene Zytokine.

Die physiologische intestinale Homöostase ist durch ein Gleichgewicht zwischen Effektor-Zellen und

regulatorischen T-Zellen charakterisiert (Kucharzik et al. 2006). Bei CED kommt es zu einem

- 15 - Missverhältnis mit einem Anstieg der Population proinflammatorischer CD4-positiver Zellen und einer

Reduktion regulatorischer T-Zellen, was schließlich in einer mukosalen Inflammation resultiert. In der

Immunpathogenese der CED können zudem unterschiedliche CD4-T-Zellen differenziert werden, die

durch spezifische Zytokinmuster gekennzeichnet sind. Insbesondere werden Th1-, Th2- und Th17-Zellen

differenziert (siehe Abb. 1).

ABBILDUNG 1: DIFFERENZIERUNG NATIVER T-ZELLEN.

[CD – cluster of differentiation; Th – T-Helfer-Lymphozyt; IFNγ – Interferon gamma; IL – Interleukin, TGFβ – transforming growth factor] Quelle: Matricon et al. 2010. Immunopathogenesis of inflammatory bowel disease. Landes Bioscience. 299-309.

Eine überschießende Expression der Th2-Zellen erscheint zum jetzigen Zeitpunkt wesentlicher Bestandteil

einer veränderten Immunantwort bei der Colitis ulcerosa zu sein. Diese Zellen sezernieren vermehrt

Interleukin (IL)-5, IL-13 und TGF- (Targan et Carp 2005). Insbesondere IL-13 ist verantwortlich für eine

zytotoxische Wirkung gegenüber Epithelzellen durch Apoptoseinduktion und eine Alteration der „tight

junctions“ (Heller et al. 2005 / 2008).

Beim Morbus Crohn erscheint eher eine vermehrte Aktivierung der Th1– und Th17-Lymphozyten (Fujino

et al. 2003) bedeutsam zu sein. Hierbei kommt es zu einer vermehrten Ausschüttung

proinflammatorischer Zytokine wie IL-2, IL-12, IL-18, IL-23, TNF-α und Interferon–γ (Bamias et al. 2003,

Shih et al. 2008, Pappu et al. 2008).

- 16 -

INTESTINALE BARRIERE

Eine zentrale Rolle in der mukosalen Immunantwort des Darms spielt das intestinale Epithel (Abb. 2).

Diese Grenzfläche stellt die physikalische Barriere zwischen den luminal gelegenen Mikroben und dem

darmassoziierten lymphatischen Gewebe (GALT) dar. Sie besteht aus einem von Becherzellen

sezernierten protektiven Mukus, welcher den Kontakt zwischen bakteriellem Antigen und Epithel

reduziert, sowie den in der Mukosa lokalisierten Makrophagen, dendritischen Zellen, Paneth’ Zellen und

Neutrophilen. Diese stellen über Ausschüttung von Zytokinen und Chemokinen im Rahmen einer

Inflammation die wesentlichen Bestandteile des angeborenen Immunsystems dar. So sind die Paneth’

Zellen für die Sekretion antimikrobieller Peptide (Defensine) verantwortlich, welche unter anderem für

eine Regeneration und Reparaturmechanismen der intestinalen Barriere (siehe Abb. 2) mitverantwortlich

sind (Wehkamp et al. 2009). Bei Individuen insbesondere mit M. Crohn resultiert eine reduzierte Synthese

dieser Defensine und des protektiven Mukus in vermehrter epithelialer Schädigung mit nachfolgenden

Erosionen und Ulzerationen (Cadwell et al. 2008, Salzman et al. 2010). Im Besonderen wurde dabei die

Rolle von Mutationen in NOD2/CARD 15 evaluiert, welche mit einer signifikanten Verminderung der

Expression von Defensinen einhergingen (Wehkamp et al. 2004). Auch der Nachweis einer reduzierten

Expression von Mucin-Genen (MUC 1, MUC 19, PTGER4) bei Patienten mit Morbus Crohn, welche in

Genom-weiten Assoziationsstudien identifiziert wurden (Franke et al. 2010), unterstützt die Hypothese,

dass auf Grundlage einer insuffizienten Mukussekretion eine Schädigung der epithelialen Barriere bei

chronischen Inflammationsprozessen stattfindet (Buisine et al. 1999).

ABBILDUNG 2: WESENTLICHE MECHANISMEN DER INTESTINALEN BARRIERE.

Einer Invasion der Mukosa wird durch physikalische Abwehrmechanismen (Sekretion des Mukus durch Becherzellen; Epitheliale Barriere durch Epithelzellen)und epitheliale Immunzellen (Paneth’sche Zellen,

- 17 -

M-Zellen) entgegengewirkt. Die Erkennung von pathogenen bakteriellen Antigenen erfolgt durch TLR und NOD-Rezeptoren. Im Rahmen der erworbenen Immunität werden dendritischen Zellen und Lymphozyten und Zytokine aktiviert Vermittlung einer Inflammationsreaktion durch Ausschüttung weiterer Zytokine (Interleukin und TNF). Quelle: Matricon et al. 2010. Immunopathogenesis of inflammatory bowel disease. Landes Bioscience, 299-309.

Eine weitere kritische Rolle im System der intestinalen Barriere kommt den „intercellular junctions“ und

„tight junctions“ zu, welche den parazellulären Raum zwischen Epithelzellen abdichten und einen

Übertritt von luminalen Antigenen in die Zirkulation verhindern. Proinflammatorische Zytokine wie der

Tumor-Nekrosefaktor- und Interferon- können über eine Regulation der „tight junctions“ die

Permeabilität der epithelialen Barriere steigern. Eine solche Steigerung der intestinalen Permeabilität des

Epithelverbandes konnte bei Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen nachgewiesen

werden und könnte einen primären Funktionsdefekt der intestinalen Barriere als mögliche Ursache in der

Pathogenese der Erkrankung darstellen (Berkes et al. 2003, Nusrat et al. 2000).

2.2.1 ROLLE DER MIKROVASKULARISATION IN DER ÄTIOLOGIE UND PATHOGENESE DER CHRONISCH-ENTZÜNDLICHEN DARMERKRANKUNGEN

Unter physiologischen Bedingungen werden im Bereich des Jejunums und Ileums von den Ästen der

Arteria mesenterica superior in der Submukosa die Vasae rectae abgegeben, welche die intestinale

Lamina muscularis sowie die Mukosa versorgen. Die Gefäße der Lamina muscularis propria zeigen hierbei

einen losen Verbund kapillarer Gefäße mit willkürlicher Verzweigung. Im Bereich des Kolon, welches

sowohl von den Ästen der Arteria mesenterica superior, als auch der Arteria mesenterica inferior gespeist

wird, nimmt die Organisation des kapillaren Netzwerkes deutlich zu. Hier sind drei verschiedene

Endarterien (Aa. rectae) aufzufinden - Vasa longa, Vasa brevia und Vasa intermedia (Michels et al. 1965).

Eine regelmäßig arrangierte, gleichmäßige Struktur des Gefäßnetzes durchzieht im Kolon alle Schichten

der Darmwand (Carr et al. 1986). Dieses regelmäßige Netzwerk umgibt honigwabenartig die Lumina der

sekretorischen Krypten. Der physiologische, ex vivo gemessene Kapillardurchmesser liegt zwischen 4-

12 m (Skinner, O’Brien 1996, McLaren et al. 2002).

Anatomische Veränderungen der Gefäße bei CED wurden bereits in den 60er Jahren publiziert.

Mikroangiographische Studien bei Morbus Crohn-Patienten (Brahme 1966, Lunderquist 1967, Erikson et

al. 1970) demonstrierten eine reduzierte Anzahl versorgender intestinaler Gefäße, sowie eine strukturelle

Veränderung derselben im Sinne von Kalibersprüngen und einer vermehrten Gewundenheit. In Ergänzung

hierzu zeigten die Untersuchungen des Blutflusses (beispielsweise durch intraoperative Wash-out

Techniken) im betroffenen und gesunden Gewebe eine Reduktion der Perfusion im Bereich der Tela

submucosa und Lamina muscularis propria. Der Blutfluss in der Mukosa hingegen zeigte sich stabil (Hulten

et al. 1977). Diese Erkenntnisse waren insofern relevant, als sie Ergebnisse stützten, nach denen der

- 18 - Entstehung mukosaler Ulzerationen eine akute Entzündung der Tela submucosa vorausgeht (McGovern et

Goulston 1968).

Carr et al. beschrieben 1986 in mikroradiographischen Studien den Aufbau des intestinalen Gefäßnetzes

und seine Veränderungen bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen und untermauerten mit ihren

Ergebnissen die Hypothese, dass die intestinale Mikrozirkulation in der Pathogenese der CED von

Bedeutung sein könnte. So konnte eine vom Entzündungsgrad abhängige Hypervaskularisation der

mukosalen und submukosalen Gefäße bei der Colitis ulcerosa nachgewiesen werden. Bei einem

segmentalen Befallsmuster des Morbus Crohn zeigte sich jedoch eine deutliche Reduktion der benannten

Gefäße.

Neuere Erkenntnisse zeigten im Rahmen chronischer Inflammationsprozesse einen kritischen Verlust der

vasodilatatorischen Kapazität der Gefäße. Unbeeinträchtige Gefäße zeigen bei Acetylcholineinfluss über

NO-abhängige Mechanismen eine Vasodilatation. Die endotheliale Dysfunktion bei Patienten mit CED

resultiert in relevanter Vasokonstriktion und Hypoperfusion des intestinalen Gewebes, was wiederum die

Entstehung von Ulzerationen durch eine ischämische Stoffwechsellage fördern könnte (Hatoum et al.

2003, Papa et al. 2008). Wakefield und Mitarbeiter beschrieben 1991 bei Resektionspräparaten unter

Nutzung eines Rasterelektronen-Mikroskops ähnliche Veränderungen der mikrovaskularen

Gefäßarchitektur. Die Autoren fanden verengte fibrinoide Läsionen in den kleinen Arterien und

Arteriolen, welche die Mukosa befallener Schleimhautareale versorgten.

Auch nach diesen Ergebnissen ließ sich jedoch nicht eindeutig determinieren, ob die bisher beschriebenen

vaskulären Veränderungen primärer oder sekundärer Natur sind und wurden daher in der Literatur auch

verschieden interpretiert.

Pathophysiologisch ergibt sich aus der beschriebenen inflammatorischen Alteration der Gefäße ein

weiterer Baustein in der Pathogenese der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen. Durch eine

Verletzung des Endothels im Rahmen des Entzündungsprozesses kommt es auch zur Aktivierung von

Thrombozyten (Collins und Rampton 1997). Diese exprimieren vermehrt die Oberflächen-Marker P-

Selektin und CD40L (Danese et al. 2003). Darunter kommt es zu einer gesteigerten Aggregation von

Thrombozyten und unter anderem Bindung an P-Selektin Glykoprotein Ligand 1 (PSGL-1), welcher auf

Leukozyten und Endothelzellen exprimiert wird. Diese vermehrte Stimulation der Leukozyten führen

ihrerseits zur Aufrechterhaltung und weiteren Stimulation der Inflammationsreaktion (Danese et al. 2003,

Deban et al. 2008).

Diese Erkenntnisse untermauern, dass Morbus Crohn und Colitis ulcerosa Erkrankungsentitäten

darstellen, die mit einer Hyperkoagulabilität und rezidivierenden thrombembolischen Ereignissen

einhergehen können, welche in Folge zu ischämischen Verhältnissen in der intestinalen Mukosa führen.

- 19 - Hinweise hierfür ergaben tierexperimentelle Studien, bei welchen in kleinen Nagetieren gastrointestinale

Infarkte durch Mikroembolisationen verursacht wurden. Die durch ein multifokales Infarktgeschehen

verursachten Veränderungen der Darmwand wurden histologisch beurteilt und zeigten eine auffällige

Ähnlichkeit zu den erosiven und ulzerösen Läsionen eines vom Morbus Crohn betroffenen intestinalen

Abschnitts (Hudson et al. 1992, Osborne et al. 1993).

Unterstützt wird das Konzept der CED als thrombembolischer Erkrankung auch durch erhöhte Werte der

Gerinnungsfaktoren V und VIII, einer beschleunigten Thromboplastinzeit, sowie Verlust von Protein C und

S. Passend zu diesen Erkenntnissen zeigten Untersuchungen von Patienten mit Gerinnungsstörungen wie

einer Hämophilie oder dem von-Willebrand-Syndrom ein signifikant geringeres Risiko an einer chronisch-

entzündlichen Darmerkrankung zu erkranken (Thompson et al. 1995). Auch in mehreren Studien

untersuchte Therapien bei CED-Patienten mit thrombembolischen Komplikationen mit sowohl

unfraktioniertem, als auch niedermolekularem Heparin zeigten im Verlauf der Therapie eine deutliche

klinische Verbesserung der jeweiligen chronisch-entzündlichen Darmerkrankung (Koutroubakis 2000,

Evans et al. 1997, Folwaczny C et al. 1999).

Aktuelle Konzepte in der Pathogenese chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen in Zusammen-hang

mit Gefäßveränderungen fokussieren vermehrt auf den Prozess der Angiogenese. Die Anfänge dieser

Hypothese liegen bereits in Carrs oben genannter Studie von 1986. In dieser Untersuchung ging mit einer

höhergradigen Entzündung eine Hypervaskularisation der intestinalen Mukosa einher. Die Befunde von

Carr wurden in Anbetracht anderer Studien in den 80er Jahre kritisch diskutiert, welche eher eine

Verminderung der Durchblutung im betroffenen Areal zeigten (Thiede et al. 1982). Weiterführende

Untersuchungen, unter anderem mit endoskopischer Spektrophotometrie (Leung et al. 1989) erweiterten

diese Erkenntnisse und konnten später die morphologischen Veränderungen der Gefäße und ihre

Funktion im Sinne der Durchblutung nach chronischer und akuter Entzündung differenzieren (Appleyard

et al. 2002). Bei der akuten Inflammation bei einer Colitis ulcerosa im frühen Stadium ließ sich eine

deutliche gesteigerte Durchblutung mit erweiterten mukosalen Gefäßen nachweisen (Hulton et al. 1977,

Guslandi et al.1995, Kruschewski et al. 2001), wohingegen sich bei einer chronischen Entzündung mit

fibrösen Umbauprozessen des Gewebes obliterierte Gefäße darstellen ließen (Schäfer et al. 1992, Carr

1996).

In den Tierversuchen von McLaren und Mitarbeitern aus dem Jahr 2002, bei welchen chemisch im

Rahmen eines etablierten Modells durch Natrium-Dextransulfat (DSS) eine Colitis induziert wurde, zeigte

sich in den ersten Untersuchungen mittels in vivo verwendeter konfokaler Bildgebung ein Verlust der

physiologischen honigwabenartigen Struktur des Kapillarnetzwerkes der Kolonmukosa. Nicht nur war der

beschriebene regelmäßige Gefäßverbund mit progredienter Inflammation nicht mehr nachweisbar, es

- 20 - zeigten sich die Gefäße auch zunehmend torquiert und erweitert. In der Darstellung mit Fluorescein

zeigte sich eine deutlich erhöhte Permeabilität der Gefäße mit einer erhöhten Leckage des

Kontrastmittels in das umliegende Gewebe. In den tierexperimentellen Versuchen von Ravnic und

Mitarbeitern mit dem Modell der TBNS-induzierter Colitis (2007) ließ sich bei einer akuten Entzündung

nachweisen, dass mit einem deutlich erweiterten Gefäßdurchmesser und einem vermehrten Blutfluss

jedoch eine signifikante Verlangsamung der Flussgeschwindigkeit einhergeht. In einem anderen Model

einer chemisch induzierten Colitis zeigte sich initial eine deutliche Hyperämie (erhöhter kapillarer

Blutfluss), nach 3 Tagen war bei den Versuchstieren jedoch eine deutliche Reduktion des kapillaren

Blutflusses zu verzeichnen, welches morphologische Veränderungen der kapillaren Gefäße vermuten ließ

(Foitzik et al. 1999).

Diese und andere Ergebnisse legen nahe, dass mit fortschreitender Inflammation der intestinalen Mukosa

ein Prozess des „Vascular Remodeling“ stattfindet (Hatoum et Binon 2005), dessen erste Korrelate eine

Lumenerweiterung von Arteriolen und Kapillaren, eine erhöhte Permeabilität und eine Diapedese von

Leukozyten sind (Danese et Deban 2008). Durch eine im Verlauf des entzündlichen Prozesses

zunehmende Aktivierung des kapillaren Endothels kommt es zu einer vermehrten Freisetzung von

Mediatoren (z.B. Zell-Adhäsionsmoleküle CAM), die die Adhärenz von Leukozyten fördern (Hatoum et

Binon 2005, Granger 1997, Papa et al. 2008). Eine in der Folge zunehmende Endothelproliferation steigert

die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine (z.B. TNF- , IL–6, IL–8) und Wachstumsfaktoren wie dem

vascular endothelial growth factor (VEGF), welche eine Neovaskularisierung initiieren (Koutroubakis et al.

2006, Chidlow JH et al. 2007). Wo vorher ein regelmäßiges kapillares Netzwerk die intestinale

Schleimhaut versorgte, zeigt sich in der Folge bei akuter Inflammation ein unorganisiertes Netz

multipler funktionseingeschränkter Gefäße, welche ihrerseits durch eine gesteigerte Zytokinproduktion

die Inflammation verstärken (Laroux und Grisham 2001).

Danese und Mitarbeiter haben 2006 in einer Studie zur Neoangiogenese bei CED zeigen können, dass bei

beiden Entitäten im Rahmen akuter Inflammationsprozesse eine gesteigerte Vaskularisierung in Mukosa

und Submukosa nachweisbar ist. Im entzündeten Areal zeigte sich eine vermehrte Präsenz

angiogenetischer Integrine, insbesondere αvβ3. Interessanterweise sind diese nur im Bereich einer

aktiven Inflammation an das Gefäßendothel gebunden nachweisbar. In benachbarten nicht-entzündeten

Darmabschnitten waren weder die genannten Mediatoren noch eine gesteigerte Gefäßdichte als Korrelat

einer Angiogenese nachweisbar. Es bestätigt sich eine Korrelation des Ausmaßes des Entzündungsprozess

und der Angiogenese (Majno et al. 2000, Bagli et al. 2004, Danese 2006).

Unter den verschiedenen Hypothesen zur Genese einer pathologisch veränderten Mikrovaskularisation

des Intestinums wurde auch eine Atrophie der Tunica media in den mukosal und submukosal gelegenen

- 21 - Gefäßen des Kolons als pathogenetisch bedeutsam für die CED diskutiert. Diese Befunde legten bei

erhöhtem Gefäßwiderstand in den weiter proximal gelegenen Gefäßen eine nachfolgende Ischämie im

untersuchten Gebiet nahe und lieferte weitere Hinweise für eine Störung der Mikrozirkulation als

bedeutsamem Faktor in der Ätiopathogenese der beiden inflammatorischen Darmerkrankungen

(Gibbons und Dzau 1994, Funayama et al. 1999). Unvollständig beantwortet bleibt jedoch trotz aller

Erkenntnisse über die alterierte Mikrovaskularisation der intestinalen Mukosa, welche Rolle diese bislang

identifizierten Prozesse im chronischen Verlauf der Erkrankung spielen und welche morphologischen

Alterationen der kapillaren Gefäßstruktur bei klinischer Remission darstellbar sind.

Zusammenfassend zeigt sich, dass durch Inflammation getriggert mehrere Kaskaden im mukosalen

Endothelverband ablaufen, welche parallel oder in Folge zu einer vermehrten Freisetzung

proinflammatorischer Zytokine und Sekretion von Mediatoren führen, welche sekundär eine Veränderung

der Gefäßarchitektur bewirken. Hierbei steht bei akuten Entzündungsprozessen eine Hypervaskularisation

und Angiogenese im Vordergrund. Die Veränderungen für chronische Entzündungsprozesse erscheinen

schwieriger zu evaluieren und auch die dort beschriebenen anatomischen Veränderungen bleiben

uneindeutig. Dem Verlust der vasodilatatorischen Kapazität der kleinen Gefäße kommt hier für

ischämische Prozesse eine entscheidende Rolle zu. Eine sowohl primäre, als auch sekundäre Genese der

Gefäßveränderungen wird in der Literatur unter anderem für das Konzept von thrombembolischen und in

der Folge ischämischen Ereignissen diskutiert.

2.3 GEFÄßDARSTELLUNG MITTELS KONFOKALER LASERENDOSKOPIE

Die Darstellung der Gefäße basierte bisher vor allem auf makroskopischen Beurteilungen am

anatomischen Präparat oder während eines Operationsverfahrens, das einen Zugang zur Mukosa

erlaubte, sowie der mikroskopischen Beurteilung histologische Präparate. In Ergänzung zur

konventionellen histologischen Beurteilung wurden insbesondere die Immunhistochemie zur Darstellung

definierter Antigenstrukturen eingesetzt. Die Darstellung dieser molekularen Strukturen in histologischen

Gewebeschnitten wurde mit Hilfe von gegen diese Antigene gerichteten Antikörpern erreicht. So sind

beispielsweise Anti-CD31 oder Anti-Faktor VIII bewährte Immunfärbungen zur Darstellung von

Gefäßstrukturen. (Vermeulen et al. 1996, Danese et al. 2006).

Die ersten in-vivo Darstellungen zellulärer Strukturen auf mikroskopischer Ebene resultierten aus

entscheidenden Weiterentwicklungen endoskopischer Verfahren. Nach der Etablierung der

Chromoendoskopie, bei der der Farbstoff durch einen Sprühkatheter auf die mukosale Oberfläche

- 22 - aufgebracht wird, wurde die Methode des Narrow-band Imagings (NBI) entwickelt, die auch als virtuelle

Chromoendoskopie bezeichnet wird. Es handelt sich hierbei um eine optische Technologie, welche bei

laufender Koloskopie eine verbesserte Mukosadarstellung einschließlich der kapillaren Gefäßstruktur

ermöglicht. Bei der NBI-Technik werden durch einen Farbfilter Lichtmaxima bei einer Wellenlänge von

415 nm (blau) und 540 nm (grün) generiert und somit der relative Anteil des blauen Lichts erhöht und der

des roten Lichts reduziert, um die Absorption des Hämoglobins zu berücksichtigen. Die Methode des

Narrow-Band Imagings kann aufgrund der Absorption von rotem und Reflektion von blauem Licht ein

deutlich detaillierteres Bild der Mukosaoberfläche und insbesondere des Kapillarnetzes liefern (Machida

2004).

Eine Histologie-ähnliche Darstellung in-vivo ermöglicht erst seit einigen Jahren die konfokale

Laserendoskopie. Aktuell gibt es zwei Systeme, die als konfokale Laserendoskope in der Klinik eingesetzt

werden. Zum einen wird ein Endoskop (hergestellt von Pentax, Tokyo, Japan) verwandt, bei welchem die

konfokale Einheit direkt in das distale Ende des Endoskops integriert ist (eCLE), und zum anderen eine

CLE-Sonde (hergestellt von Cellvizio, Mauna Kea Technologies, Paris), welche durch den Arbeitskanal

eines konventionellen Endoskops vorgeschoben und auf die Mukosa aufgesetzt wird.

Die konfokale Laserendoskopie ist in den letzten Jahren in der Diagnostik verschiedener Erkrankungen des

Gastrointestinaltraktes eingesetzt worden und zeigte vor allem in den Untersuchungen zu kolorektalen

Neoplasien, dass die in vivo Diagnostik durch erfahrene Untersucher eine hohe Korrelation zu den

histologischen Ergebnissen erreicht (Kiesslich et al. 2004). Hinsichtlich des oberen Gastrointestinaltraktes

hat die konfokale Laserendoskopie vor allem in der Diagnostik des Barret-Ösophagus an Bedeutung

gewonnen (Goetz et al. 2006, Dunbar et al. 2009). Hier kommt dem Verfahren vor allem zur frühzeitigen

Detektion prämaligner Neoplasien bei regelmäßigen Kontrollendoskopien eine gewisse Rolle zu.

In den vergangenen Jahren wurden bereits verschiedene endomikroskopische Klassifikationen/Aktivitäts-

Scores für chronisch-entzündliche Darmerkrankungen vorgeschlagen. So wurden Veränderungen der

Kryptenarchitektur mit der Entzündungsaktivität bei Patienten mit Colitis ulcerosa korreliert (Li et al.

2009). Erst kürzlich wurde der Crohn’s Disease Endomicroscopic Activity Score (CDEAS) vorgestellt,

welcher eine veränderte Kryptarchitektur, Mikroerosionen der Schleimhaut, eine vermehrte

Vaskularisation und entzündliche Infiltrate der Lamina propria als Entzündungskorrelat bewertet

(Neumann et al. 2012). Durch die intravenöse Gabe des für die Untersuchung erforderlichen

Kontrastmittels Fluorescein lassen sich besonders die vaskulären Strukturen sehr gut darstellen. Jedoch

wurden die Veränderungen der mukosalen Gefäßarchitektur bei CED-Patienten noch nicht detailliert

untersucht.

- 23 -

3. ZIELE DER ARBEIT

In der Pathogenese der chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) geht man nach aktuellem

Kenntnisstand von einer multifaktoriellen Genese aus, welche gestörte immunologischen Prozesse mit

einer Funktionsstörung der intestinalen Barriere bei genetischer Prädisposition der Patienten adressieren.

Pathologisch-histologisch lassen sich beim Morbus Crohn und der Colitis ulcerosa Veränderungen in der

Mukosa nachweisen. Eine entscheidende Rolle für eine intakte Mukosa besitzt die Perfusion der

Schleimhaut, die über das mukosale Kapillarnetz vermittelt wird.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, mithilfe der konfokalen Laserendomikroskopie bei Patienten mit

Morbus Crohn und Colitis ulcerosa im Vergleich zu einer Patientengruppe ohne gastrointestinale

Erkrankungen in vivo die mukosale Mikrovaskularisation darzustellen und diese sowohl qualitativ als auch

quantitativ zu beschreiben.

Hypothesen:

Bei Patienten mit Morbus Crohn und Colitis ulcerosa lässt sich eine Störung des mukosalen

Kapillarnetzes im Vergleich zu Patienten ohne gastrointestinale Erkrankungen feststellen.

1. Qualitativ sind folgende Veränderungen zu erfassen:

a. eine Störung des Gefäßmusters durch Verlust des honigwabenartigen

Kapillarnetzes

b. eine Störung des Gefäßzusammenhanges mit kürzeren und vermehrt

fragmentierten Gefäßen

c. eine Störung des Gefäßverlaufs mit vermehrten Aufweitungen und

Kalibersprüngen innerhalb der Gefäße, sowie zunehmender Gewundenheit

2. Quantitativ sind folgende Veränderungen zu erfassen:

a. eine Abnahme der Gefäßdichte

b. eine Reduktion der Gefäßlänge

c. eine größere Varianz des Gefäßdurchmessers

3. Die Ergebnisse der subjektiven Einschätzung werden durch mathematisch analysierte

Ergebnisse, die eine Quantifizierung der Veränderungen der intestinalen

Mikrozirkulation ermöglichen bestätigt.

- 24 - Für die Beantwortung dieser Hypothesen soll zur Erfassung der qualitativen Veränderungen der

Gefäßstruktur eine visuelle Evaluation der Bilddateien erfolgen. Die Bewertung erfolgt dabei unter

Verwendung eines neu entwickelten Scores, der die Parameter Gefäßmuster, Gefäßverlauf und

Gefäßzusammenhang bewertet und Aufschluss über die veränderte Mikrozirkulation bei Patienten mit

chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen geben soll.

Des Weiteren wurde durch eine in der Klinik beschäftigte Mathematikerin ein mathematischer

Algorithmus entwickelt, der in den gespeicherten cLE-Bildern die Gefäße detektiert und eine quantitative

Bewertung des Gefäßdurchmessers, der Gefäßlänge und der Gefäßdichte in einem gegebenen Areal

ermöglicht.

- 25 -

4. METHODIK

4.1 PATIENTEN

Im Rahmen dieser Arbeit wurden insgesamt 39 Patienten mittels konfokaler Laserendoskopie in der

Zentralen Endoskopie der Klinik für Innere Medizin IV des Universitätsklinikums Jena untersucht. Die

Untersuchungen fanden ihm Rahmen der regelmäßigen Betreuung bei Patienten mit chronisch-

entzündlichen Darmerkrankungen, sowie bei Vorsorge- und Kontrollkoloskopien hinsichtlich kolorektaler

Adenome bei Patienten statt, die nicht an einer CED erkrankt waren. Die Patienten waren zum Zeitpunkt

der Untersuchung alle nüchtern und mittels einer oralen Darmspülung für die Koloskopie vorbereitet.

20 Teilnehmer unserer Untersuchungen waren in der Klinik betreute Patienten, welche an einer

chronisch-entzündlichen Darmerkrankung erkrankt waren (10 Patienten mit C. ulcerosa, 10 Patienten mit

M. Crohn). 19 weitere Patienten gehörten der Kontrollgruppe an. Es wurden insgesamt 23 Frauen und 16

Männer untersucht (Median: 54 Jahre; Bereich: 24-54 Jahre; siehe bitte auch Tab. 2). Das

Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission des Universitätsklinikum Jena genehmigt und alle

Patienten haben schriftlich in die Durchführung der Untersuchung eingewilligt.

TABELLE 2: PATIENTENCHARAKTERISTIKA

Anzahl

Männer Frauen Alter Jahre Median (Min/Max)

Morbus Crohn 10 3 7 41 (24 / 51)

Colitis Ulcerosa 10 8 2 48 (21 / 76)

Kontrollgruppe 19 5 14 73 (47 / 84)

Alle Patienten mit einer chronisch-entzündlichen Darmerkrankung waren in den letzten Jahren mittels

verschiedener Therapien behandelt worden und befanden sich zum Zeitpunkt der Untersuchung mittels

konfokaler Laserendoskopie im Stadium der klinischen Remission. Im Folgenden werden Medikation und

Befallsmuster der Erkrankung tabellarisch dargestellt.

- 26 - TABELLE 3: BISHERIGE MEDIKAMENTÖSE THERAPIE DER PATIENTEN MIT CED

5 ASA / SASP Azathioprin Prednisolon Methotrexat Tacrolimus

Anti-TNF α-Antikörper

Morbus Crohn 5 10 9 3 0 5

Colitis Ulcerosa 10 4 9 1 2 3

TABELLE 4: KRANKHEITSCHARAKTERISTIKA DER MORBUS CROHN-PATIENTEN

Ileitis Ileocolitis Colitis

Erkrankungsdauer Jahre

Median (min/max)

Morbus Crohn 0 9 1 6 8/12

(5/12 / 23)

TABELLE 5: KRANKHEITSCHARAKTERISTIKA DER COLITIS ULCEROSA-PATIENTEN

Proctosigmoiditis Linksseiten-

Colitis Pancolitis

Erkrankungsdauer Jahre Median (min/max)

Colitis ulcerosa 5 0 5 23/12

(16/12 / 24)

4.2 DAS LASERENDOSKOP MIT KONFOKALER EINHEIT

Die konfokale Bildgebung im Rahmen der durchgeführten Koloskopien erfolgte mittels eines PENTAX

Endoskops (EC3870), bei welchem ein konventionelles Endoskop, wie es standardmäßig im täglichen

Patientenkontakt genutzt wird, mit einer zusätzlichen konfokalen Einheit unter Verwendung eines Argon

Lasers ausgestattet ist. Dies ermöglicht zusätzlich zur Videoendoskopie eine in-vivo-Darstellung eines

histologischen Befundes auf einem zweiten Monitor. Der Durchmesser des Endoskops beträgt 12,8 mm.

In der distalen Einheit befinden sich ein Luft- und Wasserzulauf, ein 2,8 mm-Arbeitskanal, sowie die

integrierte konfokale Einheit. Die Bedienung des konfokalen Mikroskops wird über zwei weitere Knöpfe

im Handstück des Endoskops gewährleistet (siehe Abb. 3).

- 27 -

ABBILDUNG 3: DARSTELLUNG DES DISTALEN ENDES, SOWIE HANDSTÜCKES EINES KONFOKALEN LASERENDOSKOPS

A: Etwas vorgelagert im distalen Ende des Endoskops ist das konfokale Mikroskop integriert B: Zwei zusätzliche Knöpfe am Handstück zur Bedienung

Für die endomikroskopische Bildgebung ist die intravenöse Applikation des Fluorezenzfarbstoffes

Fluorescein (5 ml Fluorescein Alcon 10%®, Alcon Pharma GmbH, Freiburg) erforderlich. Der Argon-Laser

regt während der Laserendoskopie mittels Licht einer Wellenlänge von 488 nm den Farbstoff an, der

Licht einer Wellenlänge von 510-580nm emittiert, das detektiert über eine fiberoptische Faser an den

Detektor geleitet wird (Abb. 4). Die Bilder werden dann mit einer Abtastrate von 0,8 (1024 x 1024 pixel)

oder 1,6 Bildern/s (1024 x 512 pixel) gewonnen (Abb. 5 und 6). Die optische Schichtstärke des

untersuchten Gewebes beträgt 7 μm, die laterale Auflösung 0,7 μm. Das Sichtfeld hat eine Größe von

500x500 μm und die Eindringtiefe ins Gewebe beträgt bis zu 250 μm.

ABBILDUNG 4: SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DER BILDGEBUNG MITTELS KONFOKALER LASERENDOMIKROSKOPIE

- 28 -

.

Kolonwand korrespondierende konfokale Abbildungen

ABBILDUNG 5: ORIENTIERUNG DER BILDEBENE IM RAHMEN DER KONFOKALEN LASERENDOMIKROSKOPIE

ABBILDUNG 6: BEISPIELAUFNAHMEN MIT KONFOKALER ENDOMIKROSKOPIE

Dargestellt sind Mukosaausschnitte von Kontrollpatienten. Es zeigen sich regelmäßig nebeneinander angeordnete Krypten mit dem umgebenden honigwabenartigen Kapillarnetz.

4.3 UNTERSUCHUNGSABLAUF

Die Vorbereitung der Patienten zur Koloskopie erfolgte mit einer Macrogol-Elektrolyt-Lösung (Klean-

Prep®, Norgine GmbH, Marburg). Zu Beginn der Untersuchung erfolgte eine Analgosedierung mit

Midazolam (Dormicum®; Roche Pharma AG; Grenzach-Wyhlen) und Pethidin (Dolantin®, Sanofi-Aventis

Deutschland GmbH, Frankfurt). Bei der Untersuchung wurde das Laserendoskop bis ins terminale Ileum

oder Zökum vorgeschoben. Während langsamen Rückzuges wurden alle Teile des Kolons makroskopisch

begutachtet und nach intravenöser Applikation von Fluorescein erfolgte im Bereich des Sigmas die

Endomikroskopie und Erstellung der konfokalen Bilder. Dazu wurde das distale Ende des Laserendoskops

vorsichtig auf der Kolonmukosa platziert. Um Bewegungsartefakte zu reduzieren erfolgte dabei ein

- 29 - leichtes Ansaugen des benachbarten Schleimhautgewebes mittels des Arbeitskanals. Während und nach

der Anflutungsphase des intravenös applizierten Kontrastmittels wurden die endomikroskopischen Bilder

erstellt. Die Beurteilung der Mukosa mittels cLE im Sigma erfolgte dabei in einem Areal, welches nicht

akut-entzündlich verändert war, aber anamnestisch bzw. gemäß den Vorbefunden von der Erkrankung

betroffen war.

Im Nachgang der Untersuchung wurden alle gewonnenen Bilder betrachtet und aus den die gesamte

Mukosa umfassenden Bildern jene extrahiert, die die Gefäße in der Submukosa erfassten. Diese wurden

in einem zweiten Schritt nach ihrer Güte klassifiziert und wie folgt bewertet: „good“ (Keine

Bewegungsartefakte, einzelne Zellen können im Bild voneinander unterschieden werden), „average“ (Es

sind einzelne Bewegungsartefakte sichtbar, die Gewebe- und Gefäßstruktur ist jedoch nach wie vor gut

differenzierbar) und „poor“ (die entstandenen Artefakte erlauben keine sichere Beurteilung). Es wurden

nur Bilder der beiden erst genannten Kategorien in die Analyse eingeschlossen. Es wurden insgesamt

5352 Bilder mittels konfokaler Laserendoskopie aufgenommen und bewertet, von denen das jeweils

beste Bild der mukosalen Gefäßstruktur pro Patient in die qualitative und quantitative Bewertung

aufgenommen wurde.

4.4 BILDAUSWERTUNG

4.4.1 "VASCULARITY SCORE"

Um die mittels konfokaler Laserendomikroskopie gewonnenen Bilder nach definierten Kriterien zu

beschreiben und besser vergleichbar zu machen, entwickelten wir einen Bewertungsmaßstab für Gefäße,

den sog. "Vascularity Score". Dieser integriert verschiedene Eigenschaften der Gefäßarchitektur, die sich

bei chronisch-entzündlichen Prozessen verändern (siehe Tab. 6). Dies ermöglicht eine semi-quantitative

Auswertung subjektiver Beobachtungen der Gefäßveränderungen sowie eine Korrelation zu den

Ergebnissen des "Vessel Detection"-Algorithmus.

Zwei unabhängige Untersucher (Juliane Groß, Dr. Carsten Schmidt) beurteilten geblindet dieselben Bilder

hinsichtlich des Vorhandenseins des Gefäßmusters, des Gefäßzusammenhangs und des Gefäßverlaufes.

- 30 - TABELLE 6: "VASCULARITY SCORE"

Gefäßmuster Gefäßzusammenhang Gefäßverlauf

2 Punkte Regelmäßiges, honigwabenartiges Muster

2 Punkte mehrheitlich zusammenhängend

2 Punkte geradlinig bis geschwungen

1 Punkt unregelmäßiges Muster 1 Punkt teilweise zusammenhängend

1 Punkt leicht gewunden, einzelne Aufweitungen

0 Punkte Verlust jeglichen Musters 0 Punkte nicht zusammenhängend oder fragmentiert

0 Punkte stark gewunden, knotige Aufweitungen

Bei der Erhebung des "Vascularity Score" handelt es sich somit um eine subjektive, auf Erfahrung

basierende Evaluierung der Bilder durch unabhängige Untersucher, die anhand der 3 genannten Kriterien

und deren Ausprägungen einen Punktwert erteilten. Es ergibt sich demnach eine maximale Punktzahl von

6 Punkten, welche mit einem anhand des Bildes subjektiv als gesund einzuordnenden Patienten

entspricht, sowie eine minimale Punktzahl von 0, die eine dem Bild entsprechend hohe Pathologie

charakterisiert. Aus den Bewertungen beider Untersucher wurde der Mittelwert gebildet.

4.4.2 "VESSEL DETECTION"

Für die Auswertung des per konfokaler Laserendoskopie gewonnenen Bildmaterials wurde in

Zusammenarbeit mit einer Informatikerin und Mitarbeiterin (Frau Leistritz) der Abteilung Innere Medizin

IV (Gastroenterologie, Hepatologie und Infektiologie) des Universitätsklinikums Jena auf Basis der

Software MATLAB (R2007b) das Programm „"Vessel Detection"“ entwickelt, welches semiautomatisch in

der Lage ist, innerhalb der Bilder mit Kontrastmittel durchflossene Gefäße zu detektieren und quantitativ

zu bewerten. Der grundlegende Ansatz für den entwickelten Algorithmus liegt in der Detektion von

Gefäßkanten durch eine Wasserscheidensegmentierung. Ziel ist es dabei einen kontinuierlichen

Gefäßverlauf darstellen zu können.

ABBILDUNG 7: PRINZIP DER WASSERSCHEIDENSEGMENTIERUNG

Der Graph des Grauwertbildes wird geflutet, danach werden die Kammlinien bei denen sich zwei Regionen vereinen als Wasserscheiden identifiziert. Quelle: www.mathematik.uni-ulm.de/Stefan Sugg

- 31 -

Da eine Flutung des Grauwertbildes (siehe Abb. 7) zu einer Übersegmentierung führt, wurde zusätzlich

mit dem Prinzip von Helligkeitspunkten („seed points“) gearbeitet. Hierbei wird mathematisch ein

Punkt/Segment hinterlegt, das mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit einem Gefäß zuzuordnen ist. Daran

anknüpfend kann die weitere Gefäßstruktur iterativ aufgebaut ("region growing") werden. Das

automatische „Wachstum“ eines Gefäßstückes stoppt, wenn keine geeigneten Segmente mehr gefunden

werden. Die Enden eines akzeptierten Gefäßstückes, werden zu neuen Saatkörnern. Auf diese Weise

gelingt eine Anpassung des Schwellenwertes an die lokale Umgebung, da die Intensität des letzten

Saatpunktes nicht mehr der des ursprünglich hellsten Punktes entspricht. Da die automatische Analyse

durch Saatpunkte je nach Bildqualität unterschiedlich ist, werden alle Bilder im Anschluss an die

automatische Gefäßdetektion im selben Programm manuell nachbearbeitet (Abb. 8). Hierbei wird durch

eine weitere Auswahl von Saatpunkten und weitere Identifizierung von Gefäßabschnitten versucht alle im

Bild subjektiv erkennbaren Gefäße zu markieren. Es ist ebenfalls möglich, subjektiv als falsch erkannte

Areale zu demarkieren und somit die Anzahl falsch identifizierter Segmente weitgehend zu minimieren.

ABBILDUNG 8: AUTOMATISCHE GEFÄßANALYSE MITTELS "VESSEL DETECTION" UND NACH MANUELLER

NACHBEARBEITUNG

Nach Abschluss der Gefäßerkennung werden folgende Parameter durch den neuen Algorithmus

automatisch berechnet: "region of interest" (ROI) [μm²], "vessel area" (VA) [μm²], "area index"(AI),

"vessel length" (LENG) [μm], "length index" (LI) und "vessel diameter" (VD) [μm] (siehe Tab. 7 und Abb. 9).

- 32 - TABELLE 7: "VESSEL DETECTION"-PARAMETER

region of interest

(ROI)

entspricht dem manuell ausgewählten Bereich innerhalb des

Originalbildes, welcher zur Berechnung der Parameter herangezogen

wird. Dies ermöglicht, z.B. unscharfe Randbereiche und Artefakte zu

eliminieren.

vessel area [μm²] beschreibt die vom Gefäß bedeckte Fläche innerhalb einer Region

area index gibt den Wert der vessel area im Verhältnis zur ursprünglich zur

Berechnung herangezogenen ROI an

vessel length [μm] entspricht der kumulativen Gefäßlänge einer Region

Length index gibt die kumulative Gefäßlänge im Verhältnis zu der zur Berechnung

herangezogenen ROI an

Vessel diameter [μm] entspricht dem mittleren Gefäßdurchmesser.

ABBILDUNG 9: ERGEBNISPLOT DES "VESSEL DETECTION"-ALGORITHMUS

Legende: Original – OriginalBild; ROI – Region of interest (entspricht in diesem Ergebnisplot dem Originalbild); automatisch – von "Vessel Detection" detektierte Gefäße; visualized vessel - nach manueller Nachbearbeitung detektierte Gefäße; results - berechnete Parameter

- 33 -

4.5 STATISTISCHE AUSWERTUNG

Die ungepaarten, nicht normalverteilten Stichproben wurden mithilfe des parameterfreien

Testverfahrens nach Mann-Whitney verglichen, im Fall einer Normalverteilung erfolgte der Vergleich

mittels des T-Tests. Zur Abschätzung, ob die untersuchte Menge normalverteilt oder nicht normalverteilt

war, wurde der Kolmogorov-Smirnov-Test verwendet. Es wurden Mittelwert (MW), Standardabweichung

(standard deviation, SD), Minimum (Min), Maximum (Max) und Median (Med) berechnet.

Es wurden weiterhin Korrelationen innerhalb der beiden Untersuchungsverfahren ("Vessel Detection",

"Vascularity Score"), sowie zwischen ihnen erhoben, um zu eruieren, ob die berechnete Analyse mittels

"Vessel Detection" in Zusammenhang mit den Punktwerten des "Vascularity Scores" steht. Hierbei kam

der Maßkorrelationskoeffizient nach Spearman bei nicht normal verteilten Variablen zum Einsatz. Die

Interrater-Reliabilität bei der Erstellung des "Vascularity Scores" wurde mittels Cohens Kappa bestimmt.

Als statistisch signifikant wurden alle Testergebnisse bezeichnet, deren p < 0,05 war. Für die statistischen

Berechnungen wurden die Statistik- und Tabellenkalkulationssoftware SPSS® [SPSS Inc., Chicago, Illinois,

USA] und Excel® [Microsoft, Redmont, Washington, USA)] inklusive des Statistik-Add Ins WinSTAT ®

verwendet.

- 34 -

5. ERGEBNISSE

5.1 AUSWERTUNG DES BILDMATERIALS MIT DEM "VASCULARITY SCORE"

Die mittels CLE erhaltenen Bilder wurden visuell durch zwei Untersucher (unabhängig voneinander)

beurteilt und es wurde der beschriebene Score ermittelt, welcher den Grad der gestörten

Mikrozirkulation der Kolonmukosa beim untersuchten Patientenkollektiv angibt. Im Folgenden sind die

Ergebnisse für die einzelnen Parameter des Gesamtscores sowie der einzelnen Parameter des "Vascularity

Scores" dargestellt.

5.1.1 GESAMTSCORE

Betrachtet man die Parameter des "Vascularity Scores" zusammengefasst, zeigen sich für jede der

möglichen Vergleiche signifikante Unterschiede. Für die Gesamtheit der Gruppe der CED-Patienten zeigt

sich ein signifikant reduzierter Punktwert im Vergleich zur Kontrollgruppe (Punktwert für CED-Patienten

[Median] 2 Pkt.) / Punktwert für KG [Median] 4 Pkt. / p < 0,01). Auch für die Gruppe der Patienten mit

Colitis ulcerosa und M. Crohn (Punktwert für MC-Patienten [Median] 2,25 Pkt. / Punktwert für CU-

Patienten [Median] 1,5 Pkt. / Punktwert für KG [Median] 4 Pkt. / jeweils p < 0,01) ergibt sich ein im

Vergleich zum Kontrollkollektiv erniedrigter Gesamtscore (siehe Abb. 10).

Für den Gesamtscore zeigt sich jedoch zusätzlich auch ein relevanter Unterschied im Vergleich der beiden

Erkrankungsgruppen. So weisen Patienten mit einer C. ulcerosa nicht nur dem Kontrollkollektiv gegenüber

einen signifikant niedrigeren Score auf, sondern auch gegenüber der Gruppe der Patienten mit M. Crohn

(Punktwert für MC-Patienten [Median] 2,25 Pkt. / Punktwert für CU-Patienten [Median] 1,5 Pkt. / p =

0,01). Die Interraterreliabilität für den Gesamtscore beträgt κ = 0,54.

Korreliert man die verschiedenen Parameter des Scores miteinander, so bestätigen sich deutliche

Zusammenhänge. Ein Verlust des honigwabenartigen Gefäßmusters, ein fragmentierter

Gefäßzusammenhang, ein deutlich veränderter Gefäßverlauf wie auch der Gesamtscore zeigen eine

hochsignifikante Korrelation mit jeweils allen anderen benannten Parametern (für alle möglichen

Korrelationen p < 0,01).

- 35 -

ABBILDUNG 10: VERTEILUNG DER PUNKTWERTE FÜR DEN "VASCULARITY SCORE"

5.1.2 GEFÄßMUSTER

Für die Gesamtgruppe der CED-Patienten ergibt sich ein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe

hinsichtlich der Gefäßstruktur (siehe Abb. 11). So zeigte sich bei Patienten mit einer chronisch-

entzündlichen Darmerkrankung wesentlich häufiger ein Verlust der Honigwabenstruktur als beim

Kontrollkollektiv (Punktwert für CED-Patienten [Median] 1 Pkt. / Punktwert für KG [Median] 1,5 Pkt. / p <

0,01).

Bei getrennter Betrachtung der beiden Krankheitsentitäten zeigt sich, dass dieses Ergebnis maßgeblich

aus den Veränderungen bei Patienten mit einer Colitis ulcerosa resultiert, welche im Bezug auf die

Kontrollgruppe einen signifikanten Verlust der Gefäßstruktur zeigen (Punktwert für CU-Patienten

[Median] 0 Pkt. / p < 0,01). Für die Gruppe der Patienten mit einem M. Crohn konnte diese Signifikanz im

Vergleich zum Kontrollkollektiv nicht gezeigt werden (Punktwert für MC-Patienten [Median] 1 Pkt. / p =

0,08). Im direkten Vergleich der beiden Erkrankungsgruppen bestätigt sich entsprechend, dass die

Patienten mit C. ulcerosa einen signifikanten Verlust des honigwabenartigen Gefäßmusters aufweisen (p =

0,02). Die Interraterreliabilität für diesen Anteil des Scores beträgt κ = 0,88.

- 36 -

ABBILDUNG 11: VERTEILUNG DER PUNKTWERTE FÜR DAS GEFÄßMUSTER

5.1.3 GEFÄßZUSAMMENHANG

Sowohl die gesamte Gruppe der CED-Patienten (Punktwert für CED-Patienten [Median] 0,5 Pkt. / p <

0,01), als auch separat betrachtet die Gruppe der Patienten mit Colitis ulcerosa (Punktwert für CU-

Patienten [Median] 0 Pkt. / p < 0,01) und das Kollektiv der Patienten mit M. Crohn (Punktwert für MC-

Patienten [Median] 0,75 Pkt. / p = 0,01) zeigen im Vergleich zur Kontrollgruppe (Punktwert für KG

[Median] 1 Pkt.) signifikant deutlicher fragmentierte Gefäßabschnitte und damit einen geringeren

Gefäßzusammenhang (siehe Abb. 12). Beim Vergleich der Patienten mit einer C. ulcerosa und einem M.

Crohn zeigt sich kein signifikanter Unterschied hinsichtlich des Gefäßzusammenhanges (p = 0,28). Die

Interraterreliabilität für den Gefäßzusammenhang beträgt κ = 0,75.

- 37 -

ABBILDUNG 12: VERTEILUNG DER PUNKTWERTE FÜR DEN GEFÄßZUSAMMENHANG

5.1.4 GEFÄßVERLAUF

Die Unterschiede hinsichtlich des Gefäßzusammenhanges bestätigen sich auch für den Gefäßverlauf

(siehe Abb. 13). Patienten mit einer chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen weisen einen signifikant

alterierten Gefäßverlauf auf, der sich als geschlängelt, torquiert und von knotigen Aufweitungen und

Kalibersprüngen charakterisiert, darstellt (Punktwert für CED-Patienten [Median] 0,75 Pkt. / Punktwert

für KG [Median] 1,5 Pkt. / p < 0,01). Diese Veränderung lässt sich auch bei der separaten Bewertung der

beiden Erkrankungsgruppen im Vergleich zu dem Kontrollkollektiv bestätigen (Punktwert für CU-

Patienten [Median] 0,5 Pkt. / p < 0,01; Punktwert für MC-Patienten [Median] 1 Pkt. / p = 0,02). Es zeigt

sich wiederum kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Gruppen chronisch-entzündlicher

Darmerkrankungen (p = 0,75). Die Interraterreliabilität für den Gefäßverlauf beträgt κ = 0,60.

- 38 -

ABBILDUNG 13: VERTEILUNG DER PUNKTWERTE FÜR DEN GEFÄßVERLAUF

5.2 EVALUATION DURCH DEN "VESSEL DETECTION"-ALGORITHMUS

In der Analyse mittels "Vessel Detection" wurden die Gefäßparameter Gefäßdichte ("vessel area"),

Gefäßdichtenindex ("area index"), Gefäßlänge ("vessel length"), Gefäßlängenindex ("length index") und

Gefäßdurchmesser ("vessel diameter") bestimmt. Eine Übersicht der Ergebnisse ist in Tabelle 8

dargestellt.

TABELLE 8: DARSTELLUNG DER GEFÄßDICHTE, GEFÄßLÄNGE UND DURCHMESSER [MEDIAN, MIN/MAX]

M. Crohn Colitis ulcerosa Kontrollgruppe Median (min/max) Median (min/max) Median (min/max)

vessel area [μm² x 103]

33,8 19,1 / 46,4 30,2 22,8 / 47,3 38,6 23,0 / 57,9

"area index" 0,165 0,118 / 0,222 0,183 0,110 / 0,335 0,200 0,140 / 0,331

vessel length [μm]

3178 2000 / 3989 2768 1657 / 4603 3618 2039 / 5833

"length index" 0,015 0,012 / 0,023 0,017 0,011 / 0,035 0,020 0,014 / 0,032

vessel diameter [μm]

11,05 9,7 / 13,5 11,0 10,1 / 13,6 10,8 9,1 / 11,9

- 39 -

5.2.1 VESSEL AREA UND "AREA INDEX"

Da der Gefäßdichteindex ("area index") die von Gefäß bedeckte Fläche im Verhältnis zur ROI angibt,

welche bei verschieden guter Bildqualität divergieren kann, ist der Index der validere Parameter und soll

daher primär in unsere weiteren Betrachtungen eingehen. Dargestellt sind die Ergebnisse für beide

Parameter in Tabelle 7. Es zeigt sich, dass die Mukosa der gesamten Gruppe der Patienten mit einer CED

einen geringeren Gefäßdichteindex aufweist als die des Kontrollkollektivs ("area index" für CED-Patienten

[Median] 0,170/ "area index" für KG [Median] 0,200 / p = 0,03). Signifikant niedriger ist dieser Index bei

getrennter Betrachtung der beiden Erkrankungsgruppen jedoch nur bei den M. Crohn-Patienten ("area

index" für MC-Patienten [Median] 0,165 / p < 0,01). Für die Gruppe der Patienten mit C. ulcerosa ergab

sich kein signifikanter Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe ("area index" für CU-Patienten

[Median] 0,183 /p = 1,00). Auch beim Vergleich des Gefäßdichteindex zwischen Patienten mit M. Crohn

und C. ulcerosa ergab sich kein signifikanter Unterschied (p = 0,22). Darstellung der Ergebnisse in

Abbildung 14.

ABBILDUNG 14: BOX-PLOT-DARSTELLUNG DES "AREA INDEX" BEI PATIENTEN MIT M. CROHN, C. ULCEROSA UND DER KONTROLLGRUPPE

- 40 -

5.2.2 VESSEL LENGTH UND LENGTH INDEX

Wie auch bei der Berechnung des Gefäßdichteindex ("area index") zeigt sich der Index der Gefäßlänge

("lenght index") bezogen auf die ROI als validerer Parameter und wird hier primär betrachtet. Für die

Gesamtgruppe der CED-Patienten zeigt sich im Vergleich zur Kontrollgruppe ein signifikant reduzierter

Gefäßlängenindex ("lenght index" für CED-Patienten [Median] 0,016 / "lenght index" für KG [Median]

0,020 / p = 0,04). Die kumulative Gefäßlänge ("vessel length") weist einen Trend zu einer geringeren

Gefäßlänge auf ("vessel length" für CED-Patienten [Median] 3037,1 μm / p = 0,05). Allerdings zeigt sich

bei der näheren Betrachtung des Gefäßlängenindex, dass nur bei Patienten mit einem M. Crohn ein

signifikant reduzierter Index dargestellt werden kann ("lenght index" für MC-Patienten [Median] 0,015 / p

< 0,01), nicht aber bei Patienten mit einer C. ulcerosa ("lenght index" für CU-Patienten [Median] 0,017 / p

= 0,54; jeweils im Vergleich zur Kontrollguppe). Hinsichtlich des Vergleiches innerhalb der Gruppe der

CED-Patienten zeigt sich kein signifikanter Unterschied in der Gefäßlänge ("length index"; p = 0,35). Die

Ergebnisse sind in Abbildung 15 dargestellt.

ABBILDUNG 15: BOX-PLOT-DARSTELLUNG DES "LENGHT INDEX" BEI PATIENTEN MIT M. CROHN, C. ULCEROSA UND DER KONTROLLGRUPPE

- 41 -

5.2.3 VESSEL DIAMETER

Für den Gefäßdurchmesser ergaben sich weder für eine der CED-Gruppen im Vergleich zur Kontroll-

gruppe, noch für die Gesamtheit der CED Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikante

Unterschiede ("vessel diameter" für CED-Patienten [Median] 11,05 μm / "vessel diameter" für KG

[Median] 10,8 μm / p = 0,33; "vessel diameter" für CU-Patienten [Median] 11 μm / "vessel diameter" für

KG [Median] 10,8 μm / p = 0,31; "vessel diameter" für MC-Patienten [Median] 11,05 μm / "vessel

diameter" für KG [Median] 10,8 μm / p = 0,57). Die Ergebnisse sind in Abbildung 16 aufgezeigt. Auch beim

Vergleich des Gefäßdurchmessers bei Patienten mit M. Crohn und mit C. ulcerosa ergeben sich keine

signifikanten Unterschiede (p = 0,48). Auffällig war jedoch, dass die Varianz der Gefäßdurchmesser (Δ) bei

den Patienten mit M. Crohn und C. ulcerosa deutlich größer erschien, als die der Kontrollgruppe (Δ =

3,8μm bei MC; Δ = 3,5 μm bei CU; Δ = 2,8μm bei KG). Statistisch ließ sich dies jedoch leider nicht

signifikant belegen (für MC gegenüber KG: p = 0,66 / für CU gegenüber KG: p = 0,28).

ABBILDUNG 16: BOX-PLOT-DARSTELLUNG DES GEFÄßDURCHMESSERS BEI PATIENTEN MIT M. CROHN, C. ULCEROSA UND DER KONTROLLGRUPPE

- 42 -

5.2.4 KORRELATIONEN INNERHALB "VESSEL DETECTION"

Bei der Betrachtung der Korrelation einzelner Parametern des "Vessel Detection"-Algorithmus zeigte sich,

dass ein geringerer Gefäßdichteindex ("area index") mit einem verminderten Gefäßlängenindex ("length

index") korreliert (p < 0,01). Hinsichtlich des Gefäßdurchmessers ("vessel diameter") ergaben sich jedoch

keine signifikanten Korrelationen mit den Parametern der Gefäßdichte (p = 0,33) oder Gefäßlänge (p =

0,33).

5.3 KORRELATION VON "VASCULARITY SCORE" UND "VESSEL DETECTION"-ALGORITHMUS

Zur weiteren Evaluation erfolgte die Gegenüberstellung der Ergebnisse der mathematischen Analyse von

Gefäßstrukturen mittels des "Vessel Detection"-Algorithmus und der visuellen Auswertung mithilfe des

von uns entwickelten Gefäß-Scores ("Vascularity Score"). Es zeigt sich dabei, dass der Verlust der

Gefäßstruktur signifikant mit einer geringeren Gefäßdichte ("area index") korreliert (p = 0,03). Ein

Korrelationskoeffizienten von r = 0,347 weist dabei auf einen mittelgradigen Zusammenhang der

Parameter hin. Ein ebenfalls mittelgradiger Zusammenhang der Gesamtpunktzahl des "Vascularity

Scores", der Einzelwerte der Gefäßstruktur und des Gefäßzusammenhanges bestehen mit der Gefäßlänge

("vessel length"), welche durch das "Vessel Detection"-Programm quantifiziert wurde (p ≤ 0,01). Zudem

besteht eine signifikante Korrelation zwischen dem Gesamtscore des "Vascularity Scores", der

Gefäßstruktur und dem Gefäßzusammenhang mit der Gefäßfläche ("vessel area"), die durch den "Vessel

Detection"-Algorithmus gemessen wurde (p ≤ 0,01). Die Korrelationen drücken damit einen Verlust an

Gefäßlänge und Gefäßdichte aus, welche in hohem Maße mit einer Zunahme der Fragmentierung von

Gefäßen, sowie einer Zunahme von Kalibersprüngen einhergehen. Dieses drückt sich auch in der oben

genannten Korrelation mit dem Gesamtscore aus. Die Korrelationskoeffizienten sind mit r = 0,43 bis r =

0,51 gut. Die detaillierten Ergebnisse sind in Tabelle 9 dargestellt.

- 43 - TABELLE 9: KORRELATIONEN ZWISCHEN "VASCULARITY SCORE" UND "VESSEL DETECTION"- ALGORITHMUS IM GESAMTKOLLEKTIV DER UNTERSUCHTEN PATIENTEN

"vessel detection"

vessel area

area index

vessel length

length index

Durch-messer

"Vas

cula

rity

Sco

re"

Gesamtscore r = 0,46

(p < 0,01) r = 0,30

(p = 0,07) r = 0,47

(p < 0,01) r = 0,27

(p = 0,10) r = -0,19 (p = 0,24)

Gefäßstruktur r = 0,51

(p < 0,01) r = 0,35

(p = 0,03) r = 0,48

(p < 0,01) r = 0,30

(p = 0,06) r = -0,07 (p = 0,69)

Gefäßzusammenhang r = 0,43

(p = 0,01) r = 0,30

(p = 0,06) r = 0,42

(p = 0,01) r = 0,25

(p = 0,12) r = -0,11 (p = 0,52)

Gefäßverlauf r = 0,24

(p = 0,14) r = 0,11

(p = 0,51)

r = 0,29 (p =

0,08)

r = 0,11 (p = 0,52)

r = -0,28 (p = 0,08)

Betrachtet man die Korrelationen der genannten Parameter des "Vascularity Scores" und der Auswertung

mittels "Vessel Detection" innerhalb einer Patientengruppe, ergeben sich vor allem für die Gruppe der M.

Crohn-Patienten signifikante Zusammenhänge. Innerhalb dieser Gruppe bestätigt sich der Zusammenhang

zwischen dem "Vascularity Score" und einem Großteil der Parameter des "Vessel Detection"-Programms.

So gehen der Verlust der Gefäßlänge ("length index" und "vessel length") und der Gefäßdichte ("area

index") signifikant mit einem niedrigeren Punktwert des Gesamtscores einher (Gefäßlänge und

"Vascularity Score": r = 0,69; p = 0,03; Gefäßlängenindex und "Vascularity Score": r = 0,65; p = 0,04;

Gefäßdichte ("area index") und "Vascularity Score": r = 0,66; p = 0,04). Auch zeigt sich eine signifikante

Korrelation zwischen einem abnehmenden Gefäßzusammen-hang im Sinne höherer Fragmentierung des

Kapillarnetzes und einer Verkürzung der Gefäßlänge (r = 0,64; p = 0,05) sowie dem Gefäßlängenindex (r =

0,70; p = 0,02). Die detaillierten Daten sind der Tabelle 10 zu entnehmen.

- 44 - TABELLE 10: KORRELATIONEN ZWISCHEN "VASCULARITY SCORE" UND "VESSEL DETECTION"- ALGORITHMUS

BEI PATIENTEN MIT M. CROHN

"vessel detection"

vessel area

area index

vessel length

length index

Durch-messer

"Vas

cula

rity

Sco

re"


(p = 0,21) r = 0,66

(p = 0,04) r = 0,69

(p = 0,03) r = 0,65

(p = 0,04)

r = -0,05 (p =

0,87)


(p = 0,18) r = 0,62

(p = 0,06) r = 0,62

(p = 0,06) r = 0,52

(p = 0,12) r = 0,36

(p = 0,30)


(p = 0,27) r = 0,52

(p = 0,12) r = 0,64

(p = 0,05) r = 0,70

(p = 0,02) r = -0,43 (p = 0,21)

Gefäßverlauf r = -0,27

(p = 0,44)

r = 0,19 (p = 0,61)

r = 0,00 (p = 1,00)

r = 0,11 (p = 0,76)

r = -0,06 (p = 0,87)

In der Gruppe der Patienten mit C. ulcerosa ergibt sich lediglich eine Korrelation zwischen dem

Gesamtscore des "Vascularity Scores" und dem Gefäßdurchmesser (r = 0,64; p = 0,05). Zudem besteht

eine Korrelation zwischen dem Gefäßzusammenhang und dem Gefäßdurchmesser, dessen Abnahme mit

einer Zunahme der Fragmentierung und Verkürzung der Gefäße einhergeht (r=0,67; p = 0,04).

In der Gesamtgruppe der CED-Patienten ergeben sich hingegen keine signifikanten Korrelationen

zwischen den beschriebenen Parametern. Die detaillierten Daten sind in den Tabellen 11 und 12

dargestellt.

TABELLE 11: KORRELATIONEN ZWISCHEN "VASCULARITY SCORE" UND "VESSEL DETECTION"- ALGORITHMUS BEI PATIENTEN MIT C. ULCEROSA

"vessel detection"

vessel area

area index

vessel length

length index

Durch-messer

"Vas

cula

rity

Sco

re"


(p = 0,13) r = -0,50

(p = 0,89) r = 0,17

(p = 0,64) r = -0,27

(p = 0,45) r = 0,64

(p = 0,05)


(p = 0,27) r = 0,27

(p = 0,45) r = 0,08

(p = 0,82) r = 0,01

(p = 0,97) r = 0,25

(p = 0,48)


(p = 0,46) r = -0,36

(p = 0,31) r = 0,14

(p = 0,70) r = -0,39

(p = 0,27) r = 0,67

(p = 0,04)


(p = 0,46) r = -0,17

(p = 0,63)

r = -0,03 (p =

0,94)

r = -0,31 (p = 0,39)

r = 0,54 (p = 0,10)

- 45 - TABELLE 12: KORRELATIONEN ZWISCHEN "VASCULARITY SCORE" UND "VESSEL DETECTION"-ALGORITHMUS

BEI ALLEN CED-PATIENTEN

"vessel detection"

vessel area

area index

vessel length

length index

Durch-messer

"Vas

cula

rity

Sco

re" Gesamtscore

r = 0,41 (p = 0,07)

r = 0,03 (p = 0,89)

r = 0,38 (p = 0,10)

r = -0,03 (p = 0,90)

r = 0,10 (p = 0,67)


(p = 0,27) r = 0,21

(p = 0,36) r = 0,37

(p = 0,11) r = 0,12

(p = 0,62) r = 0,17

(p = 0,49)


(p = 0,12) r = -0,01

(p = 0,96) r = 0,35

(p = 0,13) r = -0,03

(p = 0,90) r = 0,08

(p = 0,74)


(p = 0,85) r = -0,15

(p = 0,53) r = 0,00

(p = 1,00) r = -0,23

(p = 0,33) r = 0,13

(p = 0,58)

Zusammenfassend finden wir eine signifikante Korrelation des Gesamtscores des "Vascularity Scores" mit

der mathematisch analysierten Gefäßlänge, sowie der Gefäßdichte. Dieser Zusammenhang stellt sich

insbesondere über die Gesamtheit des Studienkollektivs dar. Weitere signifikante Korrelationen ergeben

sich insbesondere in der Gruppe der Patienten mit M. Crohn, die zwischen einem Großteil der

mathematisch analysierten Parameter des "Vessel Detection"-Algorithmus und dem Gesamt-score des

"Vascularity Scores" bestehen.

- 46 -

6. DISKUSSION

6.1 VORBETRACHTUNGEN

Die konfokale Laserendoskopie hat sich in den vergangenen Jahren zunehmend als geeignete

Untersuchungsmethode zur in-vivo histologischen Darstellung während einer endoskopischen

Untersuchung etabliert. Schwächen dieses Verfahrens bestehen jedoch darin, dass die Methode eine

flache Lernkurve besitzt und die Interpretation der erhaltenen Bilder einer sehr hohen

“Interobservervarianz” unterliegt, also stark vom Untersucher und dessen Erfahrungshintergrund

abhängig ist. Die Bewertung der mittels CLE gewonnenen Informationen ist zudem rein deskriptiver

Natur; eine quantitative Bewertung der dargestellten Strukturen ist bisher nicht möglich gewesen. Mit

unseren Untersuchungen streben wir an, diese vorrangig subjektiven Bewertungsmaßstäbe durch

objektiv erfassbare Daten zu ergänzen, um eine Untersucher-unabhängige Auswertung der gewonnenen

Abbildung mukosaler Strukturen, insbesondere der Kapillaren, zu ermöglichen. Im Speziellen sollte dieses

für die Gefäßarchitektur bei chronischen Entzündungsprozessen erarbeitet und evaluiert werden.

Viele Studien der letzten Jahrzehnte haben die Bedeutung des kapillaren Netzwerkes und seiner

Veränderungen im Rahmen akuter und chronischer Inflammationsprozesse evaluiert. Dem vaskulären

Endothel kommt durch seine Aktivierung im Rahmen von Entzündung mit Ausschüttung

proinflammatorischer Zytokine und Adhäsionsmediatoren eine zentrale Rolle im Inflammationsprozess zu

(Danese et al. 2003). Andere Studien zeigten, dass Mikroembolisationen und ein multifokales

Infarktgeschehen des kapillaren Gefäßnetzwerkes in der intestinalen Mukosa typische Läsionen

verursacht, wie sie bei CED-Patienten nachzuweisen sind und legten damit eine thrombembolische

Komponente in der Pathogenese der Erkrankung nahe. Unter der Annahme, dass Störungen der

Mikrozirkulation im intestinalen Kapillarnetz eine kritische Rolle in der Ätiopathogenese der CED spielen,

erschien es uns wichtig, Gefäßalterationen detaillierter zu beschreiben. Bisherige Studien haben hierbei

vor allem auf akute Inflammationsprozesse bei M. Crohn und C. ulcerosa fokussiert.

Ziel der Arbeit war es deshalb, mikrovaskuläre Veränderungen bei Patienten mit chronisch-entzündlichen

Darmerkrankungen zu erfassen, welche trotz Vorliegen einer klinischen Remission auf mukosaler Ebene

endomikroskopisch nachweisbar sind. Wir stellten die Hypothese auf, dass sich im Rahmen chronischer

Inflammationsprozesse folgende Veränderungen des kapillaren Netzwerkes nachweisen lassen:

- ein Verlust des honigwabenartigen Gefäßmusters

- eine Zunehmende Fragmentierung und Verkürzung der Gefäße

- 47 -

- eine Veränderung des Gefäßverlaufs mit einer zunehmenden Torquierung und knotigen

Aufweitungen im Sinne vermehrter Kalibersprünge

Gemäß unserer Hypothese müssten sich dann bei den benannten subjektiv beschriebenen

Veränderungen folgende Unterschiede bei CED-Patienten objektiv detektieren lassen:

- eine Abnahme der Gefäßdichte

- eine Abnahme der Gefäßlänge

- eine größere Varianz der Gefäßdurchmesser

Um eine möglichst umfassende Evaluation der intestinalen Mikrozirkulation vorzunehmen, erfolgten

sowohl eine subjektive Beschreibung der vaskulären Veränderungen als auch eine nachfolgende objektive

Auswertung mittels eines mathematischen Algorithmus.

6.2 ERGEBNISSE DER EVALUATION MIT DEM "VASCULARITY SCORE" UND DEM "VESSEL

DETECTION"-ALGORITHMUS

Die anhand subjektiver Beobachtungen zu vermutenden Gefäßalterationen bei CED-Patienten im Rahmen

chronischer Entzündungsprozesse ließen sich durch den ebenfalls auf einer subjektiven Einschätzung

beruhenden "Vascularity Score" quantitativ erfassen und bestätigen. Für die Gruppe der CED–Patienten

konnten im Vergleich zum Kontrollkollektiv signifikant kürzere, fragmentiertere Gefäße

(Gefäßzusammenhang), ein Verlust der Gefäßarchitektur als Netzwerk (Gefäßmuster), sowie torquierte,

teils knotig aufgeweitete Gefäße (Gefäßverlauf) nachgewiesen werden. Dieses drückt sich neben der

Beurteilung der einzelnen Parameter auch in einem gegenüber dem Kontrollkollektiv signifikant

niedrigeren Gesamtscore aus. Insbesondere bestätigten sich diese Ergebnisse weitestgehend auch bei

differenzierter Betrachtung beider Erkrankungsentitäten, also für die Gruppe der Patienten mit C.

ulcerosa bzw. M. Crohn. Zu betonen ist, dass die Betrachtung der Bilder durch beide Untersucher

„geblindet“ erfolgte, d. h. in Unkenntnis der Grunderkrankung. Durch diesen Ansatz sollten subjektive

Einflüsse durch Kenntnis der Erkrankung ausgeschlossen werden. Es konnte durch diesen Ansatz jedoch

nicht ausgeschlossen werden, dass bei einem pathologischen ersten Parameter auch die folgenden

Parameter „kritischer“ betrachtet wurden und so tendenziell niedriger Werte für den Gesamtscore

generiert wurden. Diese Möglichkeit könnte zur höheren Korrelation der Parameter untereinander

beigetragen haben.

- 48 - Bei der Evaluation der intestinalen Mikrozirkulation mittels des "Vessel Detection"-Algorithmus ließen

sich für die Gruppe der CED-Patienten ebenfalls signifikante Unterschiede im Sinne einer veränderten

Gefäßstruktur nachweisen. Die Gefäßdichte, sowie die Gefäßlänge waren zudem bei erkrankten Patienten

im Vergleich zum Kontrollkollektiv signifikant erniedrigt. Bei getrennter Betrachtung beider Erkrankungen

waren die pathologischen Veränderungen vor allem bei Patienten mit M. Crohn nachweisbar. Hinsichtlich

des Gefäßdurchmessers waren jedoch keine signifikanten Unterschiede zu erheben. Es ließ sich eine

Tendenz zu einer größeren Varianz des Gefäßdurchmessers im Sinne wechselnder Kaliber bei CED-

Patienten vermuten, diese war statistisch jedoch weder für Patienten mit M. Crohn (p = 0,66) noch für

Patienten mit C. ulcerosa (p = 0,28) signifikant zu belegen.

Bei der Bewertung des durch den Algorithmus quantifizierten Gefäßdurchmessers ist nicht

auszuschließen, dass die pathologischen Gefäße bei CED-Patienten „falsch“ groß gemessen wurden.

Endotheliale Störungen gehen mit einer gesteigerten Permeabilität einher, die zu einem raschen Austritt

des Kontrastmittels in die unmittelbar angrenzenden Gewebe der Gefäße führt. Dieses Phänomen zeigte

sich unter anderem in ähnlichen Versuchsansätzen bei tierexperimentellen Modellen der Sepsis (A.

Stallmach), sowie in der persönlichen Beobachtung bei Kontrastmitteluntersuchungen im entzündeten

Gewebe. Durch das dem „Vessel Detection“-Algorithmus zugrunde liegende Prinzip der

Wasserscheidensegmentierung würden für die Gefäße somit zu große Durchmesser gemessen werden.

Dies erklärt möglicherweise die fehlenden Unterschiede zwischen CED-Patienten und dem

Kontrollkollektiv.

Wesentliche Ergebnisse zeigen sich auch in der Korrelation beider Verfahren. So lässt sich bezogen auf das

gesamte Studienkollektiv nachweisen, dass die im "Vascularity Score" erfassten Gefäßveränderungen

signifikant mit den Ergebnissen des "Vessel Detection"-Algorithmus korrelieren. Bezugnehmend auf

unsere Fragestellung lassen sich folgende Ergebnisse zusammenfassen:

1) Es lassen sich qualitative und quantitative Veränderungen der Gefäßstruktur bei chronischen

Entzündungsprozessen von CED-Patienten erfassen.

2) Mittels eines mathematischen Algorithmus ist es uns gelungen, die qualitativ beschriebenen

Veränderungen zu bestätigen und diese zu objektivieren.

3) Wir können die Daten der Literatur zu Alterationen der intestinalen Mikrozirkulation durch unsere

in vivo erhobenen Ergebnisse teilweise bestätigen.

- 49 -

6.3 DISKUSSION DER ERGEBNISSE VOR DEM HINTERGRUND DER AKTUELLEN LITERATUR

Die publizierten Ergebnisse der letzten drei Jahrzehnte, welche vor allem im Rahmen angiographischer

Studien zu Gefäßveränderungen bei Patienten mit CED erhoben wurden, dokumentieren aus anatomisch-

pathologischer Sicht hauptsächlich drei wesentliche Veränderungen:

- Verlust der Gefäßarchitektur im Sinne eines regelmäßigen Kapillarnetzes (McLaren et al. 2002)

- Gefäßerweiterungen- und Obliteration in raschem Wechsel mit verstärkter Gefäßwindung

(McGarrity et al. 1987; Erikson et al. 1970; Knutson et al. 1968) Brahme 1966 , Wakefield et al.

1989, Hatoum 2005).

- Zunahme der Gefäßdichte bei aktiven Entzündungsprozessen (Hulten et al. 1977, Guslandi et al.

1995), sowie Abnahme im Rahmen chronischer Entzündungsprozesse (Schäfer et al. 1992, Foitzik

et al. 1999).

Entscheidend für die verschiedenen Ausprägungen der Gefäßalterationen in diesen Studien erscheint die

Inflammation selbst zu sein. Neben dem Verlust der regelmäßige (honigwabenartigen) Struktur des

kapillaren Gefäßnetzwerkes, werden charakteristische Gefäßveränderungen wie Endothelproliferation,

Hypervaskularisation und eine Zunahme der Gefäßdichte vor allem im Rahmen akuter

Entzündungsprozessen, beobachtet (Ravnic 2007, Danese und Deban 2008). Mehrere Studien belegten,

dass sich an die Phase der Hypervaskularisierung eine veränderte Gefäßarchitektur im Sinne torquierter,

kaliberwechselnder Gefäße, sowie eine Obliteration der Gefäße mit Gefäßverschlüssen und Abbrüchen

anschließt (Brahme et al. 1966, Schäfer et al. 1992), welche in einer verminderten Perfusion im

betroffenen Gewebe resultiert (Thornton et Solomon 2002). Bei Vaskulitiden, welche unter anderem auch

krankheitsbegleitend mit CED auftreten, wurden ähnliche Veränderungen beobachtet. Dazu zählen in der

Literatur beschrieben z.B. die nekrotisierende Vaskulitis der Haut (Basler 1980), Iritiden, seltenere retinale

Vaskulitiden (Ruby und Jampol 1990) oder auch in einzelnen Fällen zerebrale Thrombosen und

Vaskulitiden (Nelson et al. 1986, Carmona et al. 2000).

Da vergleichbare Gefäßalterationen ebenfalls in der Mukosa von Patienten mit M. Crohn beschrieben

worden, legen sie eine vaskulitische Entstehungskomponente für diese Erkrankung nahe (Thornton und

Salomon 2002). Angiographische Studien zeigten in der frühen Erkrankungsphase des Morbus Crohn

erweiterte Gefäßdurchmesser, welche abrupt abbrechen oder schmaler werden, sowie bei

fortgeschrittener Erkrankung normal bis verengte Gefäßlumina (Lunderquist et Knutsson 1967).

Funayama et al haben 1999 anlehnend an diese frühen angiographischen Untersuchungen die Dicke der

arteriellen Tunica media untersucht und konnten anlehnend an die bisherigen Untersuchungen eine

- 50 - Atrophie der Media im fortgeschrittenen Krankheitsprozess darstellen. Dies wird als Ausdruck eines

vaskulären „Remodeling“ verstanden, bei welchem im Rahmen chronischer Inflammation aufgrund eines

abnehmenden Blutflusses und intravaskulären Druckes ein Umbauprozess der Gefäßstruktur

stattgefunden hat (Funayama 1999). Im Weiteren wurden diese Veränderungen in Abhängigkeit der

Lokalisation im gastrointestinalen Gefäßnetzwerk untersucht. Dabei fanden sich signifikante

Veränderungen im Bereich der submukosalen Arterien der Darmwand, jedoch kaum Veränderungen im

Bereich der größeren mesenterialen Gefäße. Dies lässt darauf schließen, dass die für die Erkrankung als

ursächlich angenommenen Veränderungen im Bereich der tiefen Submukosa stattfinden und durch die

Minderperfusion die Entstehung von Läsionen bis hin zu Ulzerationen beim M. Crohn begünstigt wird

(Funayama et al. 1999, Wakefield et al. 1991). In unseren Untersuchungen konnten diese Ergebnisse für

die Gruppe der Patienten mit M. Crohn bestätigt werden. Mit dem Vessel Detection Algorithmus ließen

sich Gefäßveränderungen, wie sie nach dem oben benannten „Remodeling“ zu erwarten sind (Bacaner

1966, Danese et al. 2006, Funayama et al. 1999) nachweisen. Für C. ulcerosa-Patienten waren im

Vergleich mit der Kontrollgruppe wie auch den MC-Patienten keine signifikanten Unterschiede

hinsichtlich Gefäßlänge und Gefäßdichte nachweisbar. Eine mögliche Erklärung für diese

unterschiedlichen Ergebnisse bietet das anatomische Befallsmuster beider Erkrankungen. Bei der Colitis

ulcerosa steht ein auf die Mukosa limitierter Befall im Vordergrund, beim Morbus Crohn hingegen

bestehen ein transmurale Befall unter Mitbeteiligung der genannten tiefer liegenden Gewebeschichten

(Submukosa, Muskularis) mit einer Alteration des dortigen Gefäßnetzes. Diese morphologischen

Unterschiede der Gefäßarchitektur sind kongruent zu der in der Literatur beschriebenen

unterschiedlichen Ätiopathogenese beider Erkrankungen.

Für die Colitis ulcerosa wurde primär das morphologische Korrelat der Hypervaskularisation aufgrund

akuter inflammatorischer Prozesse beschrieben (Carr et al. 1986, Koutroubakis et al. 2006).

Ausführlichere Untersuchungen zu mikrovaskulären Veränderungen bei Colitis ulcerosa finden sich in der

Literatur jedoch bisher kaum. Unsere Ergebnisse zeigen jedoch auch bei Patienten mit C. ulcerosa im

Stadium der klinischen Remission in vivo-histologische Korrelate chronischer Inflammationsprozesse. Die

beschrieben Veränderungen weisen dabei auf einen anderen, von M. Crohn verschiedenen

inflammatorischen Prozess hin, da sich morphologisch die jeweiligen Gefäßveränderungen unterscheiden.

Der Gefäßdurchmesser, welcher sich in unseren Untersuchungen nicht signifikant zwischen der Gruppe

der CED-Patienten und der Kontrollgruppe unterschied, zeigte Hinweise auf eine größeren Varianz

innerhalb einer Patientengruppe gegenüber der Kontrollgruppe. Diese Varianz ließ sich subjektiv durch

den "Vascularity Score" (im Sinne vermehrter Kaliberwechsel und Gefäßwindungen) wie auch

mathematisch (Δ) objektiv erfassen, war jedoch leider nicht statistisch signifikant. Die Zusammenfassung

beider Untersuchungsverfahren zeigt dennoch einen pathologischen Befund auf und legt nahe, dass sich

- 51 - in der chronischen Phase einer Entzündung Gefäßveränderungen im Sinne eines häufig wechselnden

Kalibers der Kapillaren darstellen lassen. Da bisherige Studien Auffälligkeiten des Gefäßdurchmessers

zumeist nur hinsichtlich einer deutlichen Kaliberzunahme bei aktiver Inflammation beschreiben (McLaren

et al. 2001), können wir die bisherigen Erkenntnisse zur Gefäßarchitektur bei subklinischer und

chronischer Entzündung erweitern und wechselnde Gefäßkaliber als pathologisches Korrelat nachweisen.

Zusammenfassend legen die bisher diskutierten Ergebnisse unter Berücksichtigung des

Untersuchungszeitpunktes eine deutliche Inkongruenz zwischen der klinischen Krankheitsaktivität und

dem endomikroskopischen Korrelat nahe: Unsere Patienten zeigten trotz einer klinischen Remission und

dem makroskopischen Befund einer mukosalen Heilung endomikroskopisch auf vaskulärer Ebene Zeichen

einer chronischen Inflammation.

Modigliani und Mitarbeiter evaluierten bereits 1990 in einer Studie 142 Patienten mit einem akuten

Schub eines Morbus Crohn, die sie ein zweites Mal nach einer medikamentösen Therapie untersuchten.

Hierbei wurde sehr deutlich, dass der klinische Befund einer Remission nicht mit einer endoskopischen

oder gar histologischen Remission übereinstimmen muss (Modigliani et al. 1990). Die Ungleichheit

zwischen klinischem und histologischem Befund adressiert die zentrale Frage nach der Ursache. Stellen

die observierten und analysierten Alterationen der Gefäße eine primäre Veränderung dar, welche den

Inflammationsprozess initiieren? Oder sind die Veränderungen des kapillaren Netzwerkes eine sekundäre

Folge der primären Inflammation?

Unter Annahme einer primären Veränderung der Gefäße im Rahmen der Pathogenese sind die

Veränderungen der Gefäße, wie wir sie gefunden haben und sie in der Literatur teilweise beschrieben

wurden, nicht zeitlich begrenzt, sondern stellen ein immer nachzuweisendes Korrelat der

Grunderkrankung dar. Als sekundäre Folge einer Inflammation stellen die Gefäßveränderungen eher

Residuen dar, welche sich je nach Ausmaß der Entzündung in einem Stadium der Heilung oder

Exazerbation befinden. Damit könnte den von uns erhobenen Ergebnissen vor allem für den Prozess des

„mucosal healing“ – welcher ein mögliches Zielkonzept in der Behandlung von CED-Patienten darstellt –

eine wichtige Rolle zukommen.

6.4 KLINISCHE BEDEUTUNG DER ERGEBNISSE

Nach aktuellen Konzepten kann man davon ausgehen, dass eine Störung der intestinalen Barriere zu

einem erheblichen Teil auch durch Veränderungen des mukosalen Kapillarnetzes verursacht wird.

- 52 - Orientiert an der pathologischen Bedeutung der Störung der intestinalen Barriere stellt die „mukosale

Heilung“ in aktuellen Untersuchungen ein mögliches Therapieziel, sowie einen wichtigen End- und

Vergleichspunkt klinischer Studien dar (Neurath und Travis 2012). So zeigen verschiedene Studien, dass

eine komplett abgeheilte Mukosa mit einem deutlich niedrigen Rezidivrisiko der Patienten einhergeht

(Rutgeerts et al. 2006, Schnitzler et al. 2009). Die norwegische IBSEN-Studie demonstrierte bei

fortgeschrittenem „mucosal healing“ beispielsweise einen signifikanten Zusammenhang mit einem

geringeren Risiko einer Kolektomie, sowie der selteneren Notwendigkeit zukünftiger Steroidtherapien

(Frøslie KF et al. 2007). Anlehnend an diese Erkenntnisse könnte das Ausmaß der kapillaren Störung in der

Mukosa bei subklinischer Entzündungsreaktion damit im umgekehrten Sinne ein klinisches Korrelat für ein

mögliches Rezidivrisiko bei CED-Patienten darstellen.

Für eine detaillierte Evaluation der Mukosa im Rahmen von Entzündungsprozessen haben wir und andere

gezeigt, dass die Berücksichtigung von Kapillarstrukturen essentiell ist. Anlehnend an das Konzept des

„mucosal healing“ könnte der objektiven Erfassung und Charakterisierung von Gefäßveränderungen

damit eine weitere prädiktive Bedeutung zukommen.

Die Alteration der kapillären Gefäßarchitektur wird in einem aktuellen endomikroskopischen Score für

Patienten mit einer Colitis ulcerosa orientierend als „none, mild-to-moderate und severe“ in die

Evaluation der Mukosa einbezogen (Li et al. 2010). Die subjektiv beschriebenen Veränderungen des

mukosalen Kapillarnetzes beinhalteten den Verlust des honigwabenartigen Gefäßmusters, eine bei

zunehmender Inflammation deutliche Vermehrung der Kapillaren im Sinne einer erhöhten Gefäßdichte,

sowie vermehrt gekrümmte Gefäße, ein erweiterter Gefäßdurchmesser und eine erhöhte Leckage des

Kontrastmittels in das umliegende Gewebe (Kiesslich et al. 2004). Neuere Untersuchungen schlagen nun

auch einen endomikroskopischen Score für die Aktivität des Morbus Crohn vor (CDEAS). Auch hier geht

die Vaskularisierung in die Beurteilung des Scores ein (Neumann et al. 2012).

Mit einem zukünftig verbesserten Algorithmus, welcher die automatische Detektion von Gefäßen

verfeinert und die manuelle Nachbearbeitung reduziert, könnte zukünftig eine noch genauere und

belastbarere Korrelation mit den visuellen Ergebnissen der Untersucher ermöglicht werden. An die Stelle

einer Lernkurve des Untersuchers für eine optimalere subjektive Auswertung sollte ein solches objektives

Verfahren treten, mit welchem sich Parameter von Gefäßalterationen erheben lassen, die dann auch im

klinischen Alltag, beispielsweise ergänzend zur Evaluation des oben erörterten endoskopischen Aspekts

eines „mucosal healing“, verwertbar sind.

Zusammenfassend lässt sich konstatieren, dass wir Kriterien definiert haben, die die veränderte

Gefäßarchitektur in der klinischen Remission bei offenbar aber noch bestehender, subklinischer Aktivität

der Erkrankung beschreiben. Diese haben wir einerseits subjektiv beschrieben und durch den "Vascularity

- 53 - Score" ordinal skaliert. Mittels des "Vessel Detection"-Algorithmus konnten wir die Ergebnisse bestätigten

und mit den genannten Parametern quantifizieren. Somit konnten wir nicht nur unsere initial

aufgestellten Hypothesen zu den Gefäßveränderungen bei CED-Patienten bestätigen, sondern stellen

auch erstmals ein Verfahren vor, das eine objektive Bewertung der mukosalen Gefäße erlaubt. Weitere

Studien sollten jetzt die Gefäßveränderungen verschiedener Aktivitätsstadien der chronisch-

entzündlichen Darmerkrankungen evaluieren, um ein vollständiges Profil der Veränderungen der

intestinalen Mikrozirkulation im Rahmen von akuter und chronischer Inflammationen, klinischer

Remission und Heilung zu erstellen. Ein weitere wichtige Studie müsste die Frage adressieren, ob durch

die detaillierte Erfassung der mukosalen Gefäße bei Patienten mit CED Aussagen zum weiteren klinischen

Verlauf, insbesondere zur Rezidivneigung möglich sind.

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8. ANHANG

8.1 DANKSAGUNG

Die vorliegende Arbeit wurde an der Klinik für Innere Medizin IV, Abt. Gastroenterologie, Hepatologie und

Infektiologie der Friedrich-Schiller-Universität Jena angefertigt.

Mein Dank gilt Herrn Prof. Dr. med. A. Stallmach, Direktor der der Klinik für Innere Medizin IV des

Universitätsklinikums Jena für die Übergabe des Promotionsthemas, sowie für die hilfreiche

Unterstützung und die wertvollen Anregungen bei der Erstellung der Arbeit.

Insbesondere danke ich Herrn PD Dr. med. C. Schmidt, welcher die Untersuchungen der Patienten

durchgeführt hat, mir bei der Patientenselektion zur Seite stand und mich vor allem während des

gesamten Prozesses in der Erstellung der Dissertation mit fachlichem und menschlichem Rat unterstützt

hat.

Des Weiteren gilt mein Dank den Schwestern der gastroenterologischen Ambulanz für die freundliche

Hilfe bei der Bereitstellung von Patientenakten.

Bei Frau S. Leistritz, ehem. Wissenschaftliche Mitarbeiterin an der Klinik für Innere Medizin IV möchte ich

mich für die Erstellung und geduldige Einweisung in das "Vessel Detection"-Programm bedanken, ohne

welches unsere Untersuchungen nicht möglich gewesen wären.

Weiterhin möchte ich Katharina für das nötige und kritische Korrekturlesen danken, sowie meiner Familie,

als auch meinem Kollegen- und Freundeskreis, die durch ihre Motivation nicht unerheblich zum Abschluss

dieser Arbeit beigetragen haben.

Mein herzlichster Dank geht an meinen Mann Gunnar, der mich stets ermutigte und motivierte und mir

mit viel Liebe und Geduld zur Seite stand.

- 71 -

8.2 EHRENWÖRTLICHE ERKLÄRUNG

Hiermit erkläre ich, Juliane Groß, geb. 01.05.1984, dass mir die Promotionsordnung der Medizinischen

Fakultät der Friedrich-Schiller-Universität bekannt ist, ich die Dissertation selbst angefertigt habe und alle

von mir benutzten Hilfsmittel, persönlichen Mitteilungen und Quellen in meiner Arbeit angegeben sind,

mich folgende Personen bei der Auswahl und Auswertung des Materials, sowie bei der Herstellung des

Manuskripts unterstützt haben: Prof. Dr. A. Stallmach, PD Dr. C. Schmidt,

die Hilfe eines Promotionsberaters nicht in Anspruch genommen wurde und dass Dritte weder

unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen von mir für Arbeiten erhalten haben, die im

Zusammenhang mit dem Inhalt der Dissertation stehen,

dass ich die Dissertation noch nicht als Prüfungsarbeit für eine staatliche oder andere wissenschaftliche

Prüfung eingereicht habe und

dass ich die gleich, eine in wesentlichen Teilen ähnliche oder eine andere Abhandlung nicht bei einer

anderen Hochschule als Dissertation eingereicht habe.

Leer, 06.03.2013

eine evaluation der intestinalen mikrozirkulation bei ... · intermediär, 2= normal), so dass...

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