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HIDATIDOSIS HUMANA: OBSERVACIONES EN LA DETECCION DE

ANTICUERPOS IgG anti Echinococcus granulosus

Sitio Argentino de Producción Animal

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“The thing that makes science a distressing occupation is the

work of others”

André Lwoff, Premio Nobel de Fisiología o Medicina del año 1965


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FRANCOIS JACOB

Genetics of the bacterial cell Nobel Lecture, December ll, 1965 If I find myself here today, sharing with Andre Lwoff and Jacques Monod this

very great honor which is being bestowed upon us, it is undoubtedly because,

when I entered research in 1950, I was fortunate enough to arrive at the right

place at the right time. At the right place, because there, in the attics of the

Pasteur Institute, a new discipline was emerging in an atmosphere of

enthusiasm, lucid criticism, nonconformism, and friendship. At the right time,

because then biology was bubbling with activity, changing its ways of

thinking, discovering in microorganisms a new and simple material, and

drawing closer to physics and chemistry. A rare moment, in which

ignorance could become a virtue.


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Según V.C.W. Tsang (1981) el clásico aumento de la

actividad específica observado en la purificación

secuencial de una única actividad bioquímica no es

observado en el fraccionamiento secuencial de material

parasitario debido a la multiplicidad de actividades

antigénicas y a la pérdida de actividades antigénicas

durante el proceso de purificación.


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…may be the inclusion of host and parasite molecules in

stable molecular complexes …….All the former authors

separated host components completely before isolating

parasite antigens, and immunological reactions with these

resulting antigens were often less effective than those

performed with total hydatid fluid. Our data indicate that

the parasite antigens of hydatid fluid may be similar to host

antigens; thus, the elimination of host componentes could

lead to the loss of immunoreactive parasite substances...

Mario Pezzella,1984


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….in the present study, an ELISA was used that incorporated

crude E. granulosus hydatid cyst fluid rather than purified

antigen (antigen B or antigen 5) as used in previous studies.

Our rationale was that the broad diversity of antigens present in

crude hydatid cyst fluid might enhance detection of subclass

antibodies with different antigen specificities….

Lawn and others, 2004


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OBTENCIÓN DEL RECURSO BIOLÓGICO PARA LA

PRODUCCIÓN DE ANTÍGENOS

(a) (b)

Figura 1. Quistes hidatídicos en un pulmón ovino (a) y en un hígado ovino (b) que provienen de un animal recién faenado.

(a) (b)

Figura 2. Extracción de líquido hidatídico (a) y de membrana (b) de un quiste hidatídico localizado en pulmón ovino.


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Figura 3. Cosecha de protoescólices seleccionados por velocidad de sedimentación. La aspiración de líquido desde la superficie

comenzó dos minutos después de adicionar cuidadosamente a la parte superior el sedimento conteniendo los protoescólices no

seleccionados.

(a) (b)

Figura 4. Protoescólices seleccionados. Protoescólex evaginado (). Amplificación x 100 (a). Con mayor aumento (x 400) (b).


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CARACTERIZACIÓN DE FRACCIONES OBTENIDAS DE LÍQUIDO

HIDATÍDICO DE HUÉSPED OVINO POR ELECTROFORESIS EN GEL DE

POLIACRILAMIDA CON DODECIL SULFATO DE SODIO (SDS-PAGE)

A B C D E F G

kDa

46.9

103

34.1

28.5

20.2

81

kDa

103

81

34.1

28.5

20.2

46.9

.Análisis por SDS-PAGE 15% (A, B, C, y D) y SDS-PAGE 12% (E,

F y G).

Líneas A y E: marcadores de pesos moleculares. Línea B: LPLHB;

Línea C y F: LP y Líneas D y G: fracción enriquecida en antígeno B

obtenida a partir de LP. LPLHB: Antígeno LP obtenido a partir de

líquido hidatídico bovino (Pdo 0.05 M pH 5). LP: Antígeno obtenido

a partir de líquido hidatídico ovino (Pdo 0.05 M pH 5).


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UNIDADES DE ACTIVIDAD

ANTIGÉNICA CON LOS SIGUIENTES

SUEROS

RELACIÓN DE

REACTIVIDAD

CRUZADA

(T-N)/(E-N)

Fracción

Fase Sólida

E.g

(E)

Toxocara (T)

Normal

(N)

LP

Polysorp

421

11

1

0.024

B

Maxysorp

370

61

0.9

0.163

Pr

Maxysorp

246

1.8

0.9

0.004

LP: fracción enriquecida en antígeno 5 y en antígeno B. B: fracción enriquecida en antígeno B

obtenida a partir de la fracción LP. Pr: fracción derivada de protoescólices. E: suero humano

hidatídico (HAI Reactivo título 16384, WB Positivo, Arco 5 Positivo) próximo al límite superior del

rango dinámico. T: suero heterólogo de un paciente con prueba serológica anti antígeno purificado

de Toxocara reactivo. N: suero de una persona considerada sana. Unidades de actividad

antigénica: miliunidades Abs 630 nm/min.

Cuantificación de las reactividades antigénicas y reactividades

cruzadas de las fracciones LP, B y Pr mediante un ensayo Peroxidasa

IgG K-ELISA.


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(-) (+) LP

B 5

SCI

SC

Análisis antigénico de la fracción LP por inmunoelectroforesis frente a suero de

conejo inmunizado con la preparación LP. Canaleta SCI: suero de conejo

inmunizado con la fracción LP obtenido 21 días luego de la segunda dosis.

Canaleta SC: suero de conejo obtenido antes de la inmunización con la primer

dosis de LP. B y 5 indican los sistemas precipitantes considerados como

antígeno 5 – anti antígeno 5 y antígeno B –anti antígeno B. El arco más

catódico no esta identificado. (+) ánodo ó polo positivo. (-) cátodo ó polo

negativo.

Caracterización de la fracción LP por Inmunoelectroforesis


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0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 5 10 15 20 25

Antígeno LP. Concentración de Proteínas (ug/mL)

miliunid

ades A

bs 6

30 n

m/m

in

Lote 402

Lote 703

Lote 402

Lote 703

Ensayo Peroxidasa IgG K-ELISA: cuantificación de actividades antigénicas y comparación de

dos lotes de antígeno LP. Concentración suero humano hidatídico: 10 L/mL. Las magnitudes

(miliunidades Abs 630nm/min) se indican en la ordenada y las concentraciones de antígeno LP

(proteína) en g/mL en la abscisa. Nivel de reactividad cruzada (lote 703 y lote 402 ▲):

unidades de actividad antigénica determinada frente a un suero heterólogo (anti Toxocara

Reactivo) a una concentración de 10 L/mL.

ENSAYO PEROXIDASA IgG K-ELISA: RELACIÓN ENTRE LA VELOCIDAD

DE LA REACCIÓN Y LA CONCENTRACIÓN DE ANTÍGENO LP.

REPRODUCIBILIDAD LOTE A LOTE


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0

20

40

60

80

100

120

140

0 10 20 30 40 50

Antígeno B. Concentración de Proteínas (ug/mL)

miliu

nid

ade

s A

bs

63

0 n

m/m

in Suero JG

Suero MJ

Suero LV

Suero O

Ensayo Peroxidasa IgG K-ELISA. Relación entre las unidades de actividad

enzimática (miliunidades Abs 630 nm/min) indicadas en la ordenada y las

concentraciones de antígeno B (µg/mL) colocadas en la abscisa. Suero

hidatídico MJ. Suero hidatídico LV. Suero hidatídico JG y Suero no

hidatídico O.

ENSAYO PEROXIDASA IgG K-ELISA: RELACIÓN

ENTRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN Y LA

CONCENTRACIÓN DE ANTÍGENO B


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R2 = 0,997

R2 = 0,9996

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 2 4 6 8 10 12

uL de suero / mL

miliu

nid

ade

s A

bs

63

0 n

m/m

in

Suero BR

Suero CE

Suero TC

Ensayo Peroxidasa IgG K-ELISA para actividad anticuerpo anti antígeno LP.

Antígeno LP en el nivel de saturación. Relación entre las unidades de actividad

enzimática (miliunidades Abs 630nm/min) indicadas en la ordenada y las

actividades anticuerpo (diluciones de los sueros en µL/mL) colocadas en la

abscisa. Suero hidatídico BR (WB Positivo, arco 5 Positivo, HAI título Reactivo

2048). Suero hidatídico CE (WB Positivo, arco 5 Negativo, HAI título Reactivo

256). Suero no hidatídico TC con actividad anti cardiolipina.



ACTIVIDAD ANTICUERPO ANTI ANTÍGENO LP


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1 2 3 4 5 6 7 8

Ensayo Peroxidasa IgG K-ELISA: detección de actividad anticuerpo anti

antígeno LP. Antígeno LP en el nivel de saturación. Solución sustrato TMB-

H202. Pocillo 8: suero humano hidatídico Reactivo bajo; Pocillo 7: suero

humano hidatídico Reactivo alto; Pocillo 3: suero humano clasificado como

Reactivo; Pocillos 1, 2, 4, 5 y 6: sueros humanos clasificados como No

Reactivos.


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1 2 3 4 5 6 7 8

Ensayo Peroxidasa IgG K-ELISA: detección de actividad anticuerpo anti antígeno

Pr. Antígeno derivado de protoescólices (Pr) en el nivel de saturación. Solución

sustrato TMB-H202. Pocillo 1: suero humano hidatídico Reactivo bajo; Pocillo 2:

suero humano hidatídico Reactivo alto; Pocillo 6: suero humano clasificado como

Reactivo; Pocillos 3, 4, 5, 7 y 8: sueros humanos clasificados como No Reactivos.

ENSAYO PEROXIDASA IgG K-ELISA: RELACIÓN ENTRE

LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN Y LA ACTIVIDAD

ANTICUERPO ANTI ANTÍGENO Pr


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1 2 3 4 5 6 7 8

Ensayo Peroxidasa IgG K-ELISA: detección de actividad anticuerpo anti antígeno

B. Preparación enriquecida en antígeno B en el nivel de saturación. Solución

sustrato TMB-H202. Pocillo 8: suero humano hidatídico Reactivo bajo; Pocillo 7:

suero humano hidatídico Reactivo alto; Pocillos 1, 2, 3, 4, 5 y 6: sueros humanos

clasificados como No Reactivos.



ACTIVIDAD ANTICUERPO ANTI ANTÍGENO B


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REPRODUCIBILIDAD INTRA ENSAYO DE LA

TÉCNICA PEROXIDASA IgG ELISA APLICADA A LA

DETECCIÓN DE ACTIVIDAD ANTICUERPO ANTI

ANTÍGENO B, LP ó Pr

Unidades de Actividad

Suero Homólogo Suero Heterólogo Suero Sano

Ensayo Antígeno

miliu/min

Abs (X)

miliu

Abs (X) CV

miliu/min

Abs

miliu

Abs

miliu/min

Abs

miliu

Abs

K-ELISA B 4.35 7.0% 0.75 0.6 ELISA CPF B 168 2.7% 69 65

K-ELISA LP 104.9 2.1% 2 0.6

ELISA CPF LP 492 3.0% 63 58

K-ELISA Pr 81.7 4.0% 1.5 ND

ELISA CPF Pr 583 3.9% 63 ND

Valores de actividad obtenidos al aplicar el ensayo Peroxidasa IgG ELISA

a la detección de actividad anticuerpo en réplicas de un suero homólogo.

Unidades de actividad expresadas como miliuAbs/min ó miliuAbs. miliuAbs/min: miliunidades absorbancia a

630nm/min. miliuAbs: miliunidades absorbancia a 630 nm (lecturas de absorbancia a 630 nm x 1000). X: media

aritmética. CV: coeficiente de variación expresado en %. Suero homólogo: suero humano hidatídico.


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REPRODUCIBILIDAD INTER ENSAYO AL APLICAR LA

TÉCNICA PEROXIDASA IgG ELISA A LA DETECCIÓN DE

ACTIVIDAD ANTICUERPO ANTI ANTÍGENO LP

Ensayo Peroxidasa IgG K-ELISA. Reproducibilidad inter ensayo. Valores de actividad

(miliunidades Abs/min) corregidos y llevadas a la misma escala relativa.

UNIDADES DE ACTIVIDAD

E1 E2 E3 E4

Suero

miliu/min

Abs

miliu/min

Abs

miliu/min

Abs

miliu/min

Abs

Hid1 7.1 5.6 8.5 9.2

Hid2 13 12.6 14 16.5

Hid3 28 28.9 26 22

Hid4 212 224 189 208

N 0.6 0.9 1.6 2.2

Het 1.8 1.8 ND ND


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APLICACIÓN DE LA TÉCNICA DE INMUNOTRANSFERENCIA

(Western blot) AL ANÁLISIS DE LA RESPUESTA

ANTICUERPO BASADA EN LOS ANTÍGENOS RECONOCIDOS

Tiras 1, 2, 3, 4 y 5: sueros humanos hidatídicos provenientes de la consulta espontánea. Tiras 6, 7,

8, 9, 10 y 11: sueros humanos hidatídicos provenientes de estudios seroepidemiológicos. Tiras 12,

13 y 14: sueros humanos no hidatídicos con reactividad anti Toxocara. Las flechas señalan las

bandas de mayor especificidad (9, 16 y 26 kDa) y una no específica (60 kDa).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

14

60

26

16

9


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Técnica Positivos/Total Sensibilidad %

HAI 91/105 87

IgG K-ELISA Ag LP 103/106 97

IgG K-ELISA Ag B 94/106 89

IgG K-ELISA Ag Pr 98/106 92

IB 87/102 85

arco 5 39/102 38

Sensibilidades. Reacciones positivas obtenidas en sueros de

pacientes hidatídicos de la consulta espontánea con las

pruebas HAI, arco 5, IB y Peroxidasa IgG K-ELISA con el

antígeno LP (Ag LP) ó el antígeno Pr (Ag Pr) ó el antígeno B

(Ag B).

Sensibilidad: PVx100/(PV+FN). PV: positivo verdadero. FN: falso negativo


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(A) Imagen quística localizada en cerebro (QH) revelada por tomografía axial computada en el

niño QM de 8 años sintomático procedente de la localidad de Dolavon, Provincia de Chubut, con

pruebas serológicas negativas para detección de anticuerpos anti antígenos de Echinococcus

granulosus. (B) Quiste obtenido mediante procedimiento quirúrgico de aproximadamente 8 cm en

sentido horizontal y derivado al laboratorio donde se extrajo líquido y membrana. No se

observaron protoescólices.


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Quiste hidatídico localizado en el canal medular del paciente CC de 42 años sintomático con

residencia previa en los Departamentos Tehuelches y Gaiman de la Provincia de Chubut y con

prueba de inmunotransferencia positiva para la detección de anticuerpos anti antígenos de

Echinoccocus granulosus de 9, 16 y 26 kDa. Quiste obtenido mediante procedimiento quirúrgico y

derivado al laboratorio. Medida aproximada del quiste en sentido horizontal: 2.2 cm. Volumen de

líquido extraído: 1.8 ml. Se observaron protoescólices.


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Paciente masculino PT de 70 años procedente de la localidad de Paso de Indios. Quiste hidatídico

localizado en bazo de 5.5 cm obtenido mediante procedimiento quirúrgico (A) y derivado al

laboratorio donde luego de seccionarlo se constata la calcificación () y la ausencia de líquido

hidatídico (B).


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Ensayo IgG K-ELISA

Número de sueros con reacción positiva

Grupo no hidatídico Total Ag LP Ag Pr Ag B

Lupus Eritematoso 4 0 0 0

Filariasis 14 2 0 6

Toxoplasmosis 18 1 0 2

Sífilis 13 1 1 2

Artritis reumatoidea 1 0 0 0

Triquinosis 10 0 0 2

Toxocarosis 12 2 1 4

Chagas 23 2 0* 5*

Especificidad % 92 98 77

Especificidades. Número de reacciones positivas al aplicar la

técnica Peroxidasa IgG K-ELISA (Ensayo IgG K-ELISA) con el

antígeno LP (Ag LP) ó el antígeno Pr (Ag Pr) ó el antígeno B

(Ag B) a la detección de anticuerpos en un grupo de

personas no hidatídicas con otras infecciones o

enfermedades.

* Se analizaron 19 de los 23 sueros. Especificidad: VNx100 /(VN+FP). VN: Negativo Verdadero;

FP: Falso Positivo.


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Técnica Positivos/Total Sensibilidad %

HAI 52/69 75

K-ELISA Ag LP 59/70 84

K-ELISA Ag B 51/70 73

K-ELISA Ag Pr 55/70 79

IB 46/70 66

arco 5 15/70 21

Sensibilidades. Reacciones positivas obtenidas en los

sueros de 70 pacientes hidatídicos asintomáticos con las

pruebas HAI, arco 5, IB y Peroxidasa IgG K-ELISA con el

antígeno LP (K-ELISA LP) ó el antígeno Pr (K-ELISA Pr) ó el

antígeno B (K-ELISA B).


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Actividad IgG4 en sueros de pacientes hidatídicos de la

consulta frente a las preparaciones antigénicas LP, B y

Pr.

LP: preparación obtenida de líquido hidatídico de huésped intermediario

ovino enriquecida en antígeno 5 y en antígeno B.

B: preparación obtenida de líquido hidatídico de huésped intermediario

ovino enriquecida en antígeno B.

Pr: preparación obtenida de protoescólices de E. granulosus de huésped

intermediario ovino.


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Información previa considerada y objetivos:

......Phosphocoline (PC), an immunodominant molecule present on a

wide range of organisms, evoke antibody responses that lead to false-

positive reactions in routine serological assays. Human essentially do no

response to PC in the IgG4 subclass...(LaL R.B. and E.A. Ottensen, J.

Infect. Dis. 1988:1034-1037)

Objetivo: aumento de la especificidad por detección de actividad IgG4


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.....because it has previously been hyphothesized that all antibody responses of

the IgG4 subclass reflect chronic antigenic stimulation...(Lal R.B. and E.A.

Ottensen, J. Infect. Dis. 1988:1034-1037)

.... IgG4 is an important diagnostic parameter for clinically expressed cystic

echinococcosis in human...(Shambesh M.K. et al. Acta Tropica 64–1997-,53-63)

Objetivo: mediante la detección de actividad anticuerpo IgG4, respecto a la

actividad anticuerpo IgG, sortear la limitante relacionada con actividad anticuerpo

residual.

...Wen and Craig (1994) using immunoblot showed that antigen B

subunits bound predominantly IgG4 antibodies...(Craig P.S.

Compendium on Cystic Echinococcosis, 1997:85-118)

Objetivo: comparar los reactividades IgG4 detectadas con los ensayos

IgG4 K-ELISA Ag LP, IgG4 K-ELISA Ag B e IgG4 K-ELISA Ag Pr y

analizar la correspondencia entre los resultados de cada IgG4 K-ELISA

con los patrones de reactividad obtenidos con la técnica de

inmunotransferencia IgG-IB.


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Reacciones positivas (reactivas) obtenidas en sueros de

pacientes hidatídicos de la consulta con las pruebas IgG

K-ELISA Ag LP, IgG4 K-ELISA Ag Pr, IgG4 K-ELISA Ag B

e IB.

Técnica Positivos/Total

IgG K-ELISA Ag LP 25/25

IgG4 K-ELISA Ag LP 18/24

IgG4 K-ELISA Ag B 17/25

IgG4 K-ELISA Ag Pr 19/25

IB 18/22


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Técnica de Inmunotransferencia IB aplicada al análisis

de sueros de pacientes hidatídicos de la consulta


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Ejemplos de resultados obtenidos:

Tiras que satisfacen el criterio de positividad: 1, 3, 5 y 6?: La flecha señala la banda de mayor especificidad (aprox. 9 kDa).

Tiras que no satisfacen el criterio de positividad: 2 y 4. Línea PM: estándares de pesos moleculares aproximados (kDa).

Tiras IgG4 K-ELISA Ag LP IgG4 K-ELISA Ag B IgG4 K-ELISA Ag Pr

1 + + +

2 - - -

3 + + +

4 + + +

5 - - -

6 + - -

61.0

47.8

35.9

24.5

18.7

13.9

5.9


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Quistes Hidatídicos en Hígado y

Pulmón Bovino de un animal

faenado en un frigorífico del Valle

Inferior del Río Chubut con

verificación de la presencia de

protoescólices.


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Hígado Bovino


39 de 45

Pulmón Bovino


40 de 45

Cosecha de Protoescólices


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“arenilla hidatídica”


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Verificación de la presencia de protoescólices mediante

observación microscópica (200x).


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Williams, Pérez Esandi, and Oriol, 1971


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hidatidosis humana: observaciones en la … · hidatidosis humana: observaciones en la deteccion de...

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