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HUGO GER\IAIS
Étude moléculaire du champignon ph ?topa thogèoe It~oiiotrts ttwtteiitosus
Mimoire présent,
à la Frtcultii des itudes supt;ricurcs de I'u'niversitk Laml
pour l'obtention du yradc de maître ès scicnccs ( 41 .S~. )
Dipartement des sciences du bois cl de la forêt F:\CKI-TE DE FORESTERIE El" DE: tjEO\I:\ T[QCE
CS[VERSITE L:\L';\ L
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Résumé
1.c prtiscnt niinioire Je niaitrise rapports unc panic riss trivaux ctTrctuEs sur Ir
cl i i inipigon phytopaihogène ltzonorrts tonirrirosics. Le premier aspect de mon Ctude a
pan? sur 1s tasonomie des diffkrentes r spkes au sein du genre hiouorus. Cette Crude a
r t h x l i iiiic ddimitation tasinomique cntrc Ics espéces infectant des hôtes différents. De -
pliis. iiiic séparation t~xinomique importante a été obsenke entre les espitces infectant les
soiii t k s cr celles infectant les sspéces feuillues. Les séquences d'ADN générées Jans
ccrrc <itudc. ont permis de fabriquer des amorces spécifiques à 1'1. ~onietztosiis. Le second
:ispccl de nion ktudt. consistait h utiliser des marqueurs moléculaires de gènes codants
p w r Giudicr la génétique d'unc population d'f. ronwtrrosics dans une planration
d'2pincttc.s blanches situtic au nord-ouest de blontrkd. Cette Ztude. basCe sur I'utilisation
LIS ~ C U S &es rnitochondriaus et d'un $ne nucliaire. mt'ne j. croire que la propagation
thris I i i plantation cst principdenicnt effectui-r' par voic clonalc.
Louis Bernier
Directeur de recherche
This thrsis report represents a portion of Our studies on the phytopathogenic fungus
1izoilotrr.s roirzerrtosiu. In the first put of Our study we focus on the phylogenic
rslritionships within the genus Inonotiu. The study reveds tminomic differences between
spsçies infecting diffrrent hosts and identifies important phyiogenetic differences
obscmd brtwrrn sprcies infecting deciduous trees versus coniferous trees. Srquencing
data gtinrcitrd by this project were then used to design pnmers specific to I. tomrntosiis.
In the w ~ n d part of Our study. we used molecular markers from coding genes to study
rhc population structure of I. tomrntoa~s in a white spruce stand located northwest of
Montrcal. This study. which was based on the use of two mitochondrial markers and one
nuçlrx rnuker. suggested that the spread of I. tomenruslis within the plantation was
niostly clonal.
Hugo Germain
Cmdidrir
Louis Bernier
Directeur de recherche
Table des matières:
............................................................................................. 1' \ \ i \ i )\III. 1- 1- I!)IN I'lFI('\ T I O N 10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . [ ) i \ i I< ! i \ l i Io\ i:I . l l i j l ' t2i 1 1
................................................................................................................ II, 1 1 )!. r~' i \ i :! :(- 1 IOS I S C ' K ~ i l \ . ; . \ \ c ' i : LI! c ' t~ .wi3~c;? ;0x . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ......................................................... ib
...................................................................................................................... I\!i'.\c I i i.O\O\IIQClS l 7 ........................................................................... >l.\i<(.ii -1.1 ,us t ;~ i~ t : . r i~~ : t : s .................+.................. 13
................................................................................................... I . .I : I., ' 1 i \ ~ c > i . r : PCR r:.r SES DF.KIL.F.S 10 1 7 .......................................................................................................... ... ( i l - \ ! : 1 lur i. I1l.S POPIL \ iYONS -- 1 i I';! tl, J 1.1 L * - -
? ! . s : l q l i c , 2 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . I j l i ~ i I( II ~!<..\l>lllt. )U
[)1..\(;';()~.rf<: p c K A S S . ~ ~ ' FOR THE IDE'("I'IFIC.4TION OF ILYO:C'OTCL$ TOMEIVTOS&:S FR051 ( ' 1 '[..i'['Kk:.:èi OR FRllIT BODY. ......................................................................-........................................ 32
I )EWLOPPEJIEST D'A3IORCES DI.AGSOSTIQCES POC'R L'IDESTIFICATION DE ..................... I.'I.f'O.\'OTC'S fO.VE;VTOSL:S .i P.i\RTIR DE CULTURES OC DE C-LRPOPHORE. 33
> > . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ICl.\i \II. " ................................................................................................................... I \ I ici c . 1 . 1 0 ~ >4
* - \ > l1.1 ri:iii l i '; \ % r , MI:I '~IUDS ....................................................................................................... - -
B l o i r ~ q t ~ t l / n ~ i i r ~ ~ r t t ~ l . . .; j . . . . . . . . . . . . . . . ' 4 O ~ U . . . . . . . . . 35
( 'if i r l l r l q rlfld ~ c ~ y ~ c w i n g . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . j 3 t i ~ t 1 r d r r 1 - i F r i f - 4 r d t id p c p r . . . . . . . . 38
11 \ i \ .\S:\I \ . s i s .................................................................................................................................. 39 U1.4 t I rs ......................................................................................................... --.- 59 .................................
................................................................ I)l';<.I s';los .... ........................................................................ 47 [ - : 1 i - X . 4 r i Kt; r . l tET ! .................................................................. ............................-...................... 49 ..........
(; E: S E'I'IC \'XKI.ATIOX 1.i ISOSOTFS TOhlESTOSt'S U'ITHIS A WHITE SPRUCE I'l..A.\T.ATIOS REIvE.4LS IRRECCLAR ALLELIC C ~ ~ I P O S I T I O ~ ' FOR MITOCHONDRIAL .\Y D SLCLEXR GESES ....................................................................................................................... ....52
I.'EI'L'DE DE L.4 \'.ARIATiOS CESETIQLE CHEZ I.VO.YOTLS TO,%fE,VTOSUS DAYS C'SE 131.~V1' . .~T10S D*EPISETTE BLASCHE I3DIQf E U S E COMPOSITION ALLÉLIQLIE \SOK.\IXI-E CHEZ DES CESES SI*CLEXIRES ET 311-TOCHOSDRI.4VS ........................ ..,,... 53
Listc des tablcaus
I'hlcciu 1 : Liste des espécrs pouvant ;ire infect2es par I ' I rotmtirosiis (Tiré de Whitney.
............................................................................................................. 19") 13
I-;ibicliii 2 . Strriin idcntification. Genbrink accession nurnbsr and host for e x h spccie
uscd ........................................................................................................................... 36
[~ihleaii 3: Rdcrence nunibcr and ongin of the isolates icsted with it-ITS-IO'?-rand it-
................................................................................................................. ITS-'00-rc 4 1
T ~ h l c a ~ i 4: Frcqucncies of the di fferent genotypcs found in a Itio~rorus tonte)zrosiis
popiilation in ;t white sprucr. stand of western Quebec .............................................. 64
hb lc : iu 5 : .-4lli'Jic tiequencies for ML. SIS and beta-rubulin loci. found in a I ~ ~ o > i o r i ~ s
............................................ ro~1~~~zros1i.s population of Hamngton. Western Qusbcc 66
1-~hlcciii 6: GcnBank accession nuniber for the alleles squenced at ML, MS and beta-
........................................... ciihiilin loci. in the basidiomycete Itio,rartis ronrrtrrosiïs. 68
Liste des figures
Figiirc I : .\iiipliiication product obrainrd with the specific pnnirrs ITS-?O9t:ITS-700-rc
............................................................................... 311d n.ih ITS- 1 t: ITS4 (iiniwrsril) 43
Fipiirc 2 :Pli . lo~enctic rclationship m o n g the yenus Inonoius using P I i ~ ~ f f U i i u pUii as 3
outgroup ..................................................................................................................... 45 I:ig~irc 3: Illustration ol'llis pattern obsr.n,ed on the gels indicating r h t recornbination
. \i 2s [lot taking place ar thc bctli-tubulin locus ............................................................ 6 1 Figiirc 1: Craphicül rsprcscnration ofttie mitochondrial haplotypcs found in the
Hrirrinpton plantation ................................................................................................ 70 I-%yi.c. 5 : Phylogs~ieric relationship Iiniong the Hamnyton population ar thc brta-tubulin --- ............................................................................................................................ < t ' I l t ' ! J -
Introduction
1. 'itio>rorris rot~r~~~ltosirs (Fr.) Teng cst un basidioniycite causant
AL col;i~rc l i i i pied chez Ics soni tkes des foréis boria1t.s et sub-bordes de
la cane rouge
I 'Amérique du
'id. . - h i Q~ir'ùcs. Ir. champignon peut s'attaquer i plusieurs risineux mais i l affects
principdciiic'nt I'r'pinctte blanche (Picecl glriirc'i (Mosnch) VOS) et I'epinrtte noirc (Piceri
m i t - ~ u i i i (b1ill.j B.S.P.) . Cr champignon n'est pas le seul à causer des pourritures de
I;ICIIICS c tic% les csscnces cornnierciales qut'bt.coises mais i l est parmi Ics plus importants.
nec I'.-!~-niill~~ri~i spp et Hererohusicfiott wiIzosuni (Fr. :Fr) Bref.. Au Québec. on retrouve
i'i rot>i~~ttrostrs partout dans l'aire de distribution de I'Cpinette. I I est responsable de pertes
2conoiiiiqucs irks importantes dans les plantations d'épinettes. Le mode de propagation
LIc CC c1impiyon patho_rène. par contact racinaire, explique le hit que la maladie soit
plus tiiqiiçnic cii plantation qu'en foret naturelle; /ri promiscuit6 des racines d'arbres
.;cris~hlcs th imsc l'int-txtion de nouveaux arbres.
Lcs programmes de reboisement inrensif visant la rqknération de la forêt
ii;iiuri.llc ton[ nioditicr cic façon dramatique I'hétéroyéniite Je 13 torét quibécoise. Les
pi;intatioris .linsi criees seront des sites propices pour un chanipignon comme 1'1.
ionrcvitosirs. I I est possible que les déstabilisations écologiques engendrées par de telles
pratiques ibrescitircs aient des effets néfastcs sur la bio-diversité. On peut anticiper un
~ccroisscmcni de la prévalence de ce champignon pathogene qui va bénéficier du
pti~norii~iic.. La plantation d'epinette qu i est monomorphe en tout point ne peut que
t;ivoriscr 1'1 n k c r ion par I'l. iometriostis comparativement a la forêt naturelle d'épinette.
yiii Cnisrgc d'une for& mixte et présente une g x d e diversité. tant sur le plan de I'ige de 9
i ( i population que sur les essences que l'on y retrouve. De plus. le reboisement avec des
csscnccs sensibles i la maladie sur des stations déjà colonisées par ce poumdie assurera
Ic rticiintiai JCS populations du ravageur déjé installées et pourra. conduire 1 des infections
n1aSsii.i.s trcs r a p i h .
L'idriir i ticaiion Jc starions infsctics par l'I ru~rri~tos~rs cst rclativernent di lfici lc.
Ccllc-ci l i i t habitiicllement par l'obsrn-ation i I'automne de carpophores dans 13
p1;iritition. par lri prisence de carie dans le bois obscnés suite j. une coupe ou lors ci'un
ctiàblis 011 par Ir prilèvement d'une carotte dans la tige: ce sont tous des indicateurs
d'itikçtions très avancks . De plus. les cultures de I'I. ronie1,ioslcs sont identiques
niorphologiqiicmrnt i celles de I'I. /epporitiirs et quasi-identiques i celles du Phelli~riis
prw. &LIS ;~iitrcs cilün~pigi~ons pathogènes q u i infectent les rnémes hôtcs et qui causent
JCS s ~ ~ i n p t ~ n i c s sini11airc.s.
Lc d?vt.loppr.nient. depuis une quinzaine d'années. de mCthodes rnolCculaires
hiisccs sur I 'ADN rt pcrmeitant de génotyper les organismes de façon précisc 3 produit
iiiic niini-rr'wlution dans notre approche d'études ipid2miolo~iqur.s et Ccolo~iqucs. Les
oblscti tS de cc projet consistent donc 8 : 1 ) dtivelopper un test rapide et efficace i l'aide
il 'iiti niitrquwr rnolticulairc pcmettant de distinguer les rspt;ces 1. tor~re~rtoslrs. 1.
I C ~ ~ ~ W ~ Z L L S . i 't P. pijzi I'unc de l'autre: 2) étudier la bioloeie de 1'1. ronrorrosits. plus
pxticuliircnient la structure d'une popuhtion dans une plantntion. entre autres le mode de
iulonisciiion d'un site par celui-ci. Ceite étude nous permettra d'approfondir nos
i i ~ ~ i t ~ a i ~ s i l n c c ~ rclativement au mode de distribution de ce champignon sn plantation et
JI.\ rait pcrnicitrt. d'identifier cc champignon pathogtne de façon eficace.
CHAPITRE 1
GENÉRALITÉS ET TECHNIQUES D'ÉTUDE DE L'INONOTUS TOMENTOSUS.
Taxinomie et identification
L' i . f o r ? t a J f o . s i t s . l'agent respcinsablc de la cane rouge dvColaire du pied. est un
bssidioniyc~tr. de la famille des Polyporacies. il s'agit probablement de la famille de
ctilinipyotis les plus visibles en forêt car ils peuvent ètre obsemés peu importe la saison
ct produisent des liuctiîïcritions rnacroscopiques. Plusieurs Polyporackes forment sur les
xhrcs JCS structures assez caractéristiques. en forme de tablettes. qui sont faciles i
rccoiiiiiiitrc. ils poussent très souvent directement sur les arbres ct peuvent Ztre très
coriaces. Bicn quc ccmins polypores soient des comestibles de choix. la grande majorité
d'cntrc L'LIS sont non-comestibles (Lamoureux et Sicard. 1999). La frilctiticritton de 1'1.
f O / > l ~ ' ~ l f i ~ S l l J , contrciirc'nicnt a la majorité des polypores. pousse habituellement au sol
( Gii licrtsori cc Ryurden. 1993); i l s'agit d'ailleurs d'un cntére permettant dc Ic distinguer
dc 1'1 1cyiori~rir.s ( Fr) Gilbrrtson qui lui ressemble beaucoup mais qui est formé sur le
irotic. L'uliiinc critire morphologique qui permet de diffirencier Ics fnictifications de 1.
roi~i~wmsitr ci I. leporr~rirs est la forme de lcurs soies microscopiques forniées à l'intérieur
iIcs porcs : Ic: premier n'a que des soies droites alors que le second peut avoir des soies
coiirhtics ou droites dans le meme carpophore (Gosselin, 1944). Cependant. le tableau se
compliyuc lorsque l'on tente d'identifier 1'1. tomeritosils à partir dc cultures car celui-ci est
cn m i t point identique a 1'1. leporiniis (Whitney et Bohaychuk. 1977). Un autre
clisnipiyrion J e carie isolé de l'épinette, le P h e l l i i i i t s pirti (Brot. :Fr.) A. Ames (Nobles.
I M 5 ) ressernblc lui nussi en tout point à 1'1. ronientostu sauf que le premier peut produire
dcs çhlam~dosporss ( Hunt. 1996), ce qui peut rendre l'identification très difficile. .Afin de
soiiiiionnc: ce problime d'identification. Hunt a tenté de developper des méthodes
pcnriciiarit d'idcniitier ccs champignons. Ln milieu de culture diffkrentiel (Hunt. 1997).
uii anticorps monoclonal (Hunt. 1999) et I't-lcctrophorèse des protéines (Hunt. 1996) ont
5ti utilis2s niais n'oiit pas permis l'identification de cc paihogène.
Lc genre ltrotroiits renferme plusieurs autres cspkcçs qui sont aussi pathogènes.
Panii i sel le-ci notons : I 1~poritiies. 1. c~eric~rim-is (Bull. :Fr.) P . Karst. 1. glot?trrmts (Pk)
l lur r . r.1 I t-heridcs (Pcrs.} Bond et Sinser. De ces différentes espèces. seul 1'1. leporiticis
iiikcic u s s i Ics coniErrs et peut compiiitionner avec I ' l . ronietimsus au niveau de sa
riici:~ t.cologiqut.. L'I. kporirues cause des
I'I. [ o ~ ) ~ L ~ ~ ~ [ o s I ~ s niais est moins agessivc.
sti;inipignons ne peuvent Stre distingut's
syrnptornes semblables 3 ceux provoquks par .
Tel que rncntionnG précédemment. ces deux
l 'un de l'autre cn culture. Les trois autres
i.spi.çt.s prisentcn t dcs di ffirences notables par rapport i 1' 1. tontetirostes au niveau
i;coloyquc. sr lsitr idsntilication sur le plan des structures sexuées et en culture ne pose
p u dc problc'nie: elks tnfcctrnt les feuillus et aucune n'est considérée aussi qressive que
1'1 [o»ic*,itosir.s. Ces trois autres espèces. I. glonremties. I. ciiilcctfmx et I. rlrrdes.
plaçccs ici cri ordre d2croissant d'agressivité. sont toutes des chanipignons pathoyines. I.
t - l i ~ ~ ~ i ~ k s csi cl lis si;^ par cert3ins auteurs (Dai et al. 1997) dans un sous-genre ciiffkrent:
cllc prbscntc plusieurs difftircnces par rapport aux autres espéccs de cc genre. Notons.
cntrc iiiitrrls. la. formation d'hyplies très branchus et une agressivité moindre. Enfin I.
t-tidi~itir.r (Sowcrhy :Fies) Kanten. est un saprophyte du bois dur d'arbres feuillus.
Lcs symptômes. souvent absents. ne constituent pas un bon critère dans
i'iiicntitication dl: la maladie. Ces symptômes sont : une diminution de croissance
caracttiristir: par unc réduction de la distance intemodale. de petites aiguilles. la mon de la
coiironnc de bas cn haut. un jaunissement du feuillage et une resinose à la base du tronc
( \Vhitricy 1963).
Dis tribu tion et hôtes
* L ' I mroirosw est très largement répandu dans le monde. .-lu Québec. i l est
dispcrs? parmi l'aire de croissance de l'épinette. I[ se retrouve en Outaouais (Blais. 1996).
au Sud Jc la province (Boulet. 1994). sur la basse Côte-Nord (Herbier René-Pomerieau)
ct ; 1 ~ çcntrc dc la province prés de Shawinigan (Herbier René-Pomerleau). Ce poumdik
est LLUSSI trks prisent ailleurs au Canada (Hunt. 1998. Whitney, 1962. Whitney. 1977.
OucIicrit. cr 21.. 1971 ) mais ne s'y limite pas; on le retrouve aussi aux Etars-~nis
I J lycn. 1 9'0). en Inde (Bakshi. 197 1). et à divers endroits en Europe ( Lloyd. iclOS).
Bicn qu 'au Qutibcc les dommages soient le plus souwiit obsenés dans les
pla~irclr~oris d'ipiiictics blrinchrs (Picea gluitcu) ou noires (Piceci ruurimu ). i 1 hut noter
qiic tourcs Ics espciçcs d'épinettes canadiennes et plusieurs sspéces de pins peuvent Gtre
!II kctc 'cs (\Vliitney. 1 c177) (tableau I I .
I'ablcaii 1: Liste des espèces pouvant être infectées par 1' 1. torrrrrrtosrrs (Tiré de
Wii tncy . 1977).
Canada .-l CS ~ J L I M ~ S
P m t s ra1&~
[nde CL*(irzr.s ,ic.otfm-a
P I C ~ Y I snri.[hian<z
Europe PICLW h a L
l Plnus rtlrra
v
Eri ILI%. Whitney et Bohaychuk ont &value la sensibilité de différentes espèces
d'.irhrcs pouvant &rr. infectées par I ' I ronrmtosw et ont coniparc les degrés J'agressivi t i
Jc. i'l. rormNiirosrls ct de I'I leporiirirs. Les conclusions de ces traïaus. menk sur un total
dc atwc cspcccs de coriiRres. indiquent que parmi les kpinettcs. I'kpinettc blanche esr plus
j ~ i i ~ i b l ~ qiie I'ipiiicttc bleue et I'ipinette de Non+ge.
Mode d'infection
Wii tncy ( 1960. 196 1 . 1 962. 1963. 1966, 1977. 1997) est l'auteur des principales
ct~idcs concemani !a maladie cause par 1.1. rmietttosus. 11 3. détermine que la pénétration
Jans Ics r3ciiii.s SC Lit par contact racinaire. d'une racinc infcctkc ct d'une racine non-
inti.ct2c. Lacs poirirs cl'entrkc sont hobitucllt.rnent les points de contact entre deus racines.
Ics cliscoritinuitth de l'icorce, 1'r.nibranchement des racines secondaires (Lewis et
H;inscn. I W 2 ) ct la prisence de blessures de racines. D'ailleurs. les insectes du genre
Uiiuhrits ( LVarrcn. 1956. Whitney. 196 1 ) pcuvcnt causer des blessures racinaires et sonr
p;lrtOis .issocitis iius infections causées par I ' L tonretrrosi<s. Les racines de moins de 0.6
sni dc Ilirinic;rrc sont habituellsmenr infectées les premit:rcs. Le mycdiurn croît le long de
I'&xmx rxini i i rc avant de pénétrer le xylèmc. La progression du mycélium est ensuite
sonstnntc d'nnnL;c en a n n k i un rythme de 3-4 cmiinnée (Whitney, 1962). Les racines
p c u ~ ~ ~ t Ctrc inlfctics sur toute leur longueur et la coloration peut se retrouver dans la
tmc ' dc la souche. Suite à une coupe. le mycélium continue à croître de façon radiale et
pcut s t i rv i~x iusqu'i 30 ans de façon saprophyte dans les racines (Leivis et Hansen.
l O 1 : Tkacz ct Baker. 199 1 ). Cette proprieté de croitre de façon saprophyte peut avoir
Jcs cr~nsc'qcicnces dans les cas du reboisement car elle facilite grandement la colonisation
dcs noiiwaus ssniis. L'infection récente s r cara~térîse par la présence d'une coloration
hriin-roui!eitre b du bois. alors qu'il est possible d'observer des alvéoles blanches ( white
p o d w . s ) di: mycc'lium lors d'infections avancées. De plus. le niveau de dégradation
racin;iirc rie pcut 2tre directcmcnt reliC aus symptômes à la couronne. ce qui explique la
tiir'ficihti tic f4it-e une identification visuelle de l'infection basée sur la symptomatologie
( \ \ ' I I I tney. 1962). Les premikres infections artificielles réussies à partir de basidiospores
o n t Gtt; cffcctut;ès sur du matériel mort. soit : des blocs de bois et du bran de scie
( U'1iirnc.y. 1963). Les m a i s d'inoculation dircctc par des basidiospores. sur dcs racines,
Jcs rigcs avec Ccorct. ou du tissu \rivant. n'ayant que des blessures supcrficicllcs ou pas
dc hlcssurc du tout. ne rt'sultent jamais r.n une infection. Par contre. les blessures
prolandcs de 4.5 c m ct plus mènent ;i une infection (Whitney. 1966). Ces résiiltats
suggr'rcnt que l'ini;.ctiori doit rivoir lieu pnncipalernent par contact racinaire plut& que
par la gcnnination de basidiospores. Ccs résultats ne Fournissent cependant aucune
intbrni;ition sur 13 h p n dont I'inkction primaire, c'est-à-dire I'cippantion dc l'infection
iims iinc nouvcllc station. peut a\.oir lieu. Seiils les travaux de Lewis et Hansen ( 199 1).
hlisc's sur la complitibiliti végétative et I'élrctrophorése des proteines. indiquent que les
sporcs dc 1'I. rovréutosirs constituent uns importante source d'infrction. Merlrr et
a1.i N S S ) ont observé la présence de ronds de sorcières des hctitications de I.
io/>it l , i [r j .s i<s Vilin. rr>lgs). mais n'ont pas émis de conclusion sur la cause de ces
phtrionitincs.
Croissance du champignon
11 est possiblc de réaliser des cultures de I ' I tonie>ltosus i partir de bois infecté. de
hasidiosporc ou de tissus de carpophore (Whitney et Bohaychuk. 1975). Par contre, des
isolcniciits i partir du sol n'ont jamais ett; rcussis (Whitney. 1967). Différents milieux de
iiiltiirc psiivent Ctre utilisés mais le plus frtquemment employé est le iL1~1lt E.i-rrucr Agar
l"O. Ccpcndant. c'est sur ce milieu que Ir plus faible taux de chlamydospores de P. prrri
cst produit (Wiitncy et Bohaychuk. 1975). ce qui peut se révéler désavantageux dans le
C ~ S O l'on veut se semir de Iû culture pour I'identification des isolats. De façon générale.
on pcut dire que Iç champignon pousse tris lentement sur milieu artificiel. soit entre 4.6 ii - - . cm. O ssrnaincs sur . V d r Esrnict .-lgar 2 O.6 a' ZOGC. il produit des pigments pouvant
cilicr du beige pile au brun foncé et les shlarnydospores peuvent Ctre de rares à
nonibrcuscs dans les cultures de 3 semaines et plus (Nobles. 1958). Bien qu'il soit
possible de faire croître le champignon 1 des valeurs de pH variant entre 3.5 et 7. son pH
optimal de croissance se sirue 3 4.5 (Whitney. 1962). ce qui explique son absence en sol
alcalin. De plus. i l faut noter que 1'1. rontetrrosw a la capacité de faire diminuer le pH du
inilicu dans lequel i l pousse lorsqu'ii est cultivé en milieu liquide (Whitney, 1967). La
;mpirririirc uptinialc de croissance de ce champignon est de 20'C. sa liniitr supéricure
ctririt dc N T tnclusivt.rnent et sa iimite infiricure de 0°C inclusivsnient. P x ;lilleurs. Ie
siimipi~non pciit Ctre trr's polyniorphs en culture selon It. rissu dont i l provient (LVhitncy
ci Boti;iyctiuk. l L ) 7 j ) ou parce qu'il a été maintenu en milieu iiniliciel depuis longtemps
(\Vliirncy sr Bohayhuk. 1977). Bien que Ir nombre masimuni de spores soit obtenu i
partir dc ccirpophores ig&s de 3 semaines. ce sont Ics basidiospores de carpophores dc 4
iciiiiiiiics qui ont lc rnrilleur raus de germination (Whitney. 1906).
Impact économique
11 est rclativr.int.nt di ficile d'établir avec prt'cision la valeur rnonéraire du bois qui
s i pcrdu uiniiellcnient i cause dc la maladie causk par l'agent de la caric rougc
.ilv~ol;iirc. du picd. L'sstiniation du volume total de bois perdu annueilemsnt. suitc i une
dcstriiction par Ics rlivrigxrs. Grait de 107 millions de rnitrcs cubes entre 1977 ct 1981
i Stcmer ct Davidson. i 982). Cette estimation représente 61 '31 de la r2colte annuelle
rordc ct 30-47 "'0 dc 13 croissance annuelle totale (hiallet et Volney, I99S), représentant
m s i pris dc trois b i s plus que ce qui est perdu à cause des feus de lorèts pour une même
r d H l . I O . Lc complexe .-lrmdluria spp.. et I'I. tonrelztoszis sont p a m i les
sliiiscs de poumtiircs rxinitires les plus importantes (Mallet et Volney. 1998).
C'cpcndant. d o n mes connaissances. le pourcentage des pertes occasionnées par les
pourri turcs rricinaircs. plus particulièrement par 1'1. tonlerifosirs. versiis Ics autres
ctiainpignons pnthoyéncs n'cst pas disponible. Whitney et Groenewoud (1963) ont
~)bscn.L' une nionaIitG de 33-30 ?G sur 10 ans selon la plantation. La conclusion que ces
.ILiIcurs tircnt de ccs résultats veut que dans une plantation sévèrement infectée. très peu
ii'arhrcs aitcindronc une taille suffisante pour pouvoir ktre utilisés comme bois de sciage
i U'iiitncy. 1003). La diminution de croissance èst évaluée à ?7°4i10 ans pour un arbre
inlcctC (Lactinnce. 107s). Cria peut représenter une perte totale en volume très
importante sur le rcndement à maturité d'une plantation. L'accroissement de 13 surface
rlcs 5itc.s infectes pcut 2rre de pres de I j%/année (Myrcn et Patton. 1970). ce qui permet
~ t i pcithogkne de doohlcr la superficie infectée en moins de 10 ans.
Marqueurs génétiques
C'cnaines cspC;ct.s du monde vivant présentent des caractirisiiqucs
n~acroscopiqucs perniettant d'itudier les interactions entre lcurs gènes. Par escniplr.. ctiez
l'Art. tiuniain la prcscnce de personnes tirrint affectées par des handicaps IitirCditaircs
pcmict I'titude de certains gknes.
Daris It' cas des champignons diploïdes. certaines caraciéristiqucs cornnic la
ciipaciti; 3 utiliscr certains substrats et la couleur des colonies peuvent Ctrr utilistics en
ionihiiiaison avec cies croisr.mcnts ailn de détsmiiner la nature et parfois la position dcs
ccncs in~pliqiiCs. Pour cc Caire. la desccndancc des croisements est utilisie et la
sigrigation de la cciracttinstique ituditie au sein de la descendance informe
l'cxptirinicntatcur quant j. la dominance o u la ricrssiviti du gène ct d'autres
~;lra~tr;t-isriqucs. Dans lc cas de 1'1. to»~ortosiis. i l n'est pas possible d'cffcctuer des
croiscnicnts ut i-ro-o puisque le champignon produit des structures scsuics sç~ilerncnt
Jans son rnilicu naturel Iorsqu'il infecte un arbre. L'utilisation de techniques moléculaires
pcmettant d'amplifier des marqueurs génétiques est particulièrement indiquée pour cette
cspkcc. L'approche rnoliculrtire. utilisant des crirpophores d'une station infcctke. devrait
ioumir dcs riponses j. des questions qu'il ne serait pas possible d'aborder 3 l'aide des
nvithocics rraditionnelles utilisées en laboratoire.
Les rnrirqueurs d'ADN sont de courtes séquences du génome présentant du
polyrnorptiisrnc entre des individus ( Weaver et Hcndrick. 1989). Les premiers marqueurs
A avoir c'tC uti lises etaient basés sur des caraçtsres morphologiques. Ceux-ci pouvaient
Arc dc dcus types. soit monogénique ou polygi-nique. Les caractères monogéniques sont
sous I'inilusnce d'un seul ;ène et sont donc paf le fait méme très informatifs. car ils
procurent dc l'inhrmation par rapport à une séquence d'ADN donnée. Par contre. très peu
cit. locus 3. caractkrt's monogéniques sont obsen.ables et leur traits sont habituellement de
nature dominant ricessil. ce qui ne permet pas de détecter facilement la présence
d'hr't?rozypote au locus en question. Certains auires caractères. par exemple. la taille chez
I'tiomrnc. sont sous l'in tluence de plusieurs génes ( caractère polygénique). I l est dans ce
cas plus difficile de tirer des conchsion quant a un sène en particulier. Un marqueur qui
ii'csr pas dtiniinant rkcssifest par dshut co-dominant. Cn marqueur co-doniiiiant perniet
d 'ohssnn- Iü prcsrncc de plus f u n allde à un locus donne. II est donc possible griçe à
c m proprititC d r ditcrniincir dans une population la proportion d'honiozygutc ci
d ' i i c t ~ r o z ~ y t c . Ces proponions sont imponiintss et nécessaires lorsque I'on w u t
J2icmiiiisr qucllcs sont les forces volu ut ives exerçant leur influence sur une population.
L'utilisation des proiCines dans les annies 1960 n grandement modifié les itudss
dc gcnr'tiyuc des populations. Les protéines ou enzymes sont constituées de chaines
d ' x tdcs ;lrt11nf s cncodis par tes siquencss d'ADN de chaque individu. La gknitiquc
classiq~it. ditErc de 13 génétique rnoliculaire car elle permet la détection de mutants pour
1111 ccirricrtirc donn2. sans que I'on ait aucune notion. u prrori. du mecanisme molkculriire
sous-jriccnt. Par cxcmple. on peut ditecter la présence d'une colonie mutante jaune alors
q i~c I'lilltAc. sauvase cst blanc: à cc stade. i l est absolument impossible de dire i quel
cndroi t dans la nio1t;culc d'.\DX se trouve la mutation. La génétique niolPculairc prockdc
pr;itiquciiicnt i I'in\wsc. c'est-à-dire qu'slle permet de modifier et de manipuler la
~Gqucnce d'un $ne tout cn ignorant sa fonction (Snyder et Charnpnrss. 1997).
Lc pol yniorpliisrne est la présence de di fférences entre des séquences d 'ADN.
Tulis Ics facteurs pouvant causer des modifications au niveau des séquences d'ADN
pcuvcni Ctrç 13 cause de polymorphisme. Ces différences permettent de créer. dans une
populaiion. des yroupes d'individus qui se ressemblent sur le plan génotypique. I I est
donc possible d'utiliser les séquences de protéines ou d'ADN afin d'effectuer des itudes
pli ylogtiriit iques entre les gènes. Ces études utilisent les di fférences entre les séquences
pour &mer la distance cvoliitive entre les taxons. Par exemple. ieandroz et
cullabnrateurs ( 1997) ont Ctudii la variabilité génétique du genre Frn.rintrs (les frênes) au
riil-eau de l 'ADN ribosornique. dans le but de reconstruire la phÿlogénie de ce genre et
J'cn sornprcndre l'histoire bro-siogrriphique.
L'dcctrophorèsc des proriines ne permet cependant pas de détecter toutes Irs
modi tications d u génome car certaines mutations sont silencieuses. c'est-à-dire qu'elles ne
produisent pas de modification de la séquence des acides aminés dans les protéines. Les
I ] ~ c . w L c ' ~ I c ~ des sniyncs de restriction s n tout preniier lieu, et dc la tcchniquc PCR par la
siiitc. noils ont perniis d'uiilissr l'ADN pour divers types d'analyses. Les enzymes de
rcstrirtioii pcrnietteni de couper l'ADN à I'intirieur de sequenccs spkcifiques de 1-6
t1uclCotidt.s gCnEralemcnt. La technique RFLP ( & w i c r ~ ~ t z &ignzetzt ktigth
Po/i.r?rorpirisr~t) (Botstein et al. 1980) fut l'une des premières a erre utilisée et comme son - .
iioni I ' indi y LW. clle cst possible y r k e aux enzymes de restriction. Cette technique .
consistc i dtiçoupsr I'ADN génornique et ;i le faire migrer dans un gel. Les iiagrnents sont
iiinsi stipciris cn fonction de leur prosseUr. Les marqueurs RFLP sont utilisés en
conibinaison avec I'hy bndation Southem (Southem. 1975); i l s'agit d'hybrider un
tirigmnt d'.ADN connu à l'ADN ginornique digéré.
La technique PCR et ses dérivés
Par la suitc. la dticouïenc de la technique PCR (~oiynier~ise ÇIzmir Reuctiort)
[Ssiki ct al. I9Sj) nous a pemiis d'amplifier des millions de fois une séquence d'ADN
(zinc codant ou scqucnccs anonymes) donnée. La technique repose sur la capacitt' d'une
cnzyrnr thsrmostablc (Saiki et al.. 1983). la Tuuy polymérase. à copier un brin d'ADN en
son cornplhent. I l s'agit donc de dénaturer (par chauffage) l'ADN à amplifier. ajouter
Jcs frayiiicnts d'ADN apellés amorces. qui flanquent la région à amplifier en amont et en
aval. Ceux-ci sont hybndés à l'ADN en abaissant la température. et senrent d'amorces a
I'allongcment. de lcurs propres sequences. par ajout de dNTP (disoxyribonucléotide tri-
phosphate). Les amorces allongées par l'enzyme donnent naissance 1 deux nouveau brins
dl.-IDN. Ces trois ;.tapes répétées successivement. une trentaine de fois. mènent à la
synthkse d'un grand nombre de copies du fragment en question. cette réaction étant
csponcntiellc. I l Gut noter qu'il est possible de choisir la séquence des amorces si I'on
veut ampliîïcr dcs régions dtintCr& I I est possible de trouver des séquences spécifiques à
u n organisnic de sonc que I'on puisse détecter sa présence au sein d'un mélange d'ADN.
Lcs banques de données pubiiqurss, tel que GenBank
( !ittp:'. w~~~v.ncb~.nlm.nih.gov!Wcb/Genbank:inde.u.html). permettent maintenant
ii'riccédcr ii un trks grand nombre de sequences chez differents organismes, et même à des
esnomes coniplcts. -
L'dcc2s ;i scs s2quilnces pcmct 1s comparaison dc gènes cntre des millicrs
d ' c s p ~ c c s . Les diff2renct.s observries peuvent étre utilisirs. pour identifier une espèce ou
U I I iii~iit.idu particulier. Les yr'ncs dT.-\DS ribosomiqus (.\niicucci et al. IL19S; Bounou et
, i l . 10W; Hanielin et al.. 1905; Kini et al.. 1999) et le gène 13-tubulins (Royss et Thon.
1 l lL~ l l : O' Donne11 ei al.. 1W3b) ont Gte particulièrement utilisis ii la fois en identification
ci cn phylogtinic.
L a rcchniquc R A P D (Rnmlorn .impli)ed Po!i~twrpliic DiV.4) (Wrlsh ri
\lcClclI~nd. 1990. ii'illiams ci al. 1990) est un dirive de la technique PCR puisqu'elle
t h ~ p p d à l'iitilisation d'une soune amorce (9-10 bases plut& que deux amorces
d ';ipproxiniativcment 20 brises). La séquence aléatoirement choisie de l'amorce s'apparie
i di tkcnts cndroits du ginorne oii se trouvent des skqusnces complémentaires. Puisque
I'liiiiorcc. est courtc. plusieurs rigions d'ADN anonyrncs peuvent Stre amplifiées ;i la fois.
Cct tc rcclinique pcrnict donc unc analyse de type dominant recessif. c'cst-à-dire que l'on
iic p w r Jistiiiguer Ics hi-ttirozy~otrs. Par oppositioii. on dit que l'ancilyse est CO-
~ioniirirititc lorsque ccllc-ci pemct de différencier les individus hétérozygotes des
i ririil icius honiozygotés.
Les minisatellites ci les microsatellites sont de courtes skquenccs d'ADN rcpétées
dans Ic gtinonie. I I est possible d'utiliser les minisatsl~itcs et les microsatellites (Litt ct
Lut) , . IOSO) cvmmc les RAPD: i l s'agit d'utiliser de courtes amorces constituies de
itiociis rkpdks. ex: (GT),:. Unc migration dans un gel de haute resolution permet donc de
dt%mtiiner le nombre de ripétitions dans la séquence. I I est alors possible de détecter la
prtiscncc d'hktérozygotes. Cette technique. comme l'analyse W D , ne requiert pas de
connaissance L I priori sur I t . gi-nome i l'étude. ce gui est un avantage.
La technique SSCP ($ttglc-~trmrd Co>i/or+t~icrtio~i eolimorphism) (Onta. et d l . .
IOSO) pemet l'analyse CO-dominante de fragments PCR. Les produits PCR arnplifi5s
sont J2naturés t.1 placis sur sel d'acrylamide. La vitesse de leur migration dans la matnct.
cst tbnction de leur grosseur et de la conformation qu'ils adoptent. Puisque leur
conforniation est fonction de leur séquence. les fragments de différentes skquences
iiiigrilront j. des vitcsscs diffcrentes. I l sera donc possible d'obscnw deus bandes pour les
iionio~ygotes et quatre pour les hétérozygotes. soit chacun des brins d'ADN pour chacun
des dlt;lcs.
D'ciuires variantes de la rnéihodr. PCR existent. C r lles-ci permettent toutes de
+iic.rc.r iiri ccrtain nombre de fragnents. Lcur utilisation vane rilors en fonction de cc que .
l'on V L > L I ~ t i t r e de ccs tiagmcnts, du nombre Lie fragnicnt nicessaires et du type de
lilignicnts qui nous intkrcsse.
Génétique des populations
L'iin des grands principes i la base de toute la génrtique des populations est le
priiicipc de Hardy-Weinberg. En termes mathématiques. celui-ci implique que les
iiGqiicriccs gknotviques pour un gkne ayant deus alléles soient une fonction binomiale
dc Li ti2qiicncc alléliquc. Le principe de Hardy-Weinberg est particuiikrcrnent utile
piiisqii ' i 1 iitilisc les fie quences allé1 iques et non les fréquences ginotyiques. Le principe
dc Hardy-Weinberg suppose que les gamètes mâles et femelles se rencontrent ei
i'iiriisscnt dc hçon aléatoire pour Cornier un zygote. I l est donc possible de mesurer l'écart
p.ir rapport i I'iquilibre dans le cas où les gamètes mâles et knielles d'une population
ri'oiit pas dcs probabilités aléatoires de se rencontrer: i l s'agit donc d'écart d'héterozygotie.
iclins peuvent etre causés par plusieurs facteurs que l'on appelle forces (.volutives.
Lacs dil'fc;rcntcs forces évolutives sont les suivantes: la consanguinite, les mutations. la
J 2 r i w ~cnCi iquc . le flux génique et la sélection naturelle ( Weaver et Hendrick, 1989).
La consanguinité est la rencontre npn aléatoire de gamètes d'individus
giiic.tiqucm~nt rapprochés. Poussée a l'extrême, la consanguinité est l'autofenilisation.
Dans cc cas. un individu a. la capacité de se ficonder lui-même. ce qui provoque une
~liriiiriutioti de I'héterozyotie au sein de la population. II en résulte des lignées hautement
iii)!iioi> soies. L'inverse peut aussi se produire. Des gamètes d'individus génétiquement
proclics peuw-it avoir moins de chance de se rencontrer que s'ils le faisaient de façon
aiCatuir-c. C'est soiivent Ir. cas dans les populations Iiuniaineç où les nianagcs entre
iridii idiis de ni2nic hniille ne sont pas encouragés.
LCS mut3iions sont à la hssrs du polymorphisme ginétique et leur prisence est
iibsoluriicni nt;cc.ssairr. pour toute étude de genitiqus des populations. Cependant. les
iiiiitarioiis sorit dcç evinernents rares (cependant ce taus n'est pas uniforme dans tout le -
@noriic) ci lcur dfct par génération sera faible sur la fréquence aildique. -4 long tcme
p r ~ m r c . les niutations pourront mener à la Formation de nouveau nllèlcs et avoir un
ct'lci nujcur au nivcau des populations.
La di;riw jénitique peut aussi avoir un effet très important sur les frtiquences
~dldiq~ies dans lcs petites populations. Celle-ci est causCe par l'échantillonnage des alléles
3 clictyur gt;ntiration et pciit mener jusqu'i 13 tisation allélique ou la disparition d'allt;lrs.
D'aillciirs. ics esp6ccs en vois d'estinction constituent un bon exemple de dérive
g2ni.tiquc. Lc goulot d'itranglement causé par une baisse importante de la taille de la
popiiliition peut mcncr i un niveau d'homo~yyotic Clsvi..
Le flux génique est caracténsi par I'cntrie d'un nouvel allèle. en provenance de
I'csririeur. dans une population. L'exemple le plus simple consiste i imaginer une
popdation vivant sur une île et n'ayant Iiiicun contact avec l'extérieur. L'amvcc d'un
nouvcl indi1,idu portant de nouveaux alleles peut changer les fréquences aliiliques de la
population en quelques genérations.
La compréhension des effets de la sélection naturelle est basée sur la
coniprihension dc la notion de "fir~iess". Cdlr-ci peut être expliquée comme un t'acteur
confirant un avantagc ou un désavantage a un génotype particulier. Un a k l e conférant
un dc'sai.mtaye i un individu lorsqu'il est à l'état homozygote tendra a être éliminé. Ce
plic'nom~ne 3 pour effet : de mener ii I'dimination des allèles 'désavantageux'. de
conduire i la tisation alldique et de diminuer la variabilité rénétique dans la population.
On peut donc ciire que la selection naturelle agit contre l'homozygotie et en faveur de
I ' tiktProzygotic.
I l cst donc possible de mesurer les tiéquencrs alldiques et l'hktkrozygotie d'une
popiilatiori aliii d'cstinier quelles sont les principales forces évolutives ayant ou ayant ru
i i i i inipacr sur 13 population. Dc cette faqon i l sera possible de déterminer les
~iriiçiiir;itions i i-lad. 198s) de meme que les patrons de reproduction de I'espice Ctudiér.
Les dit'firtxits principes et tlitiories mentionnes plus haut sont utilisés de façon
roiitirii?rc Jins l'r'tudc de la ;&ni-tiy ue des populations chez di ffkrents organismes.
iris liurir Ics chanipignons patho$ncs des arbres. Les travaux de Horbrrg et al. ( 1995 ) sur
I . ~ ) r ? ! i i ~ p s i s p i t 1 1 d u (Swruiz :Fr.) Krirsi permirent, ~ r i c e 3 I'utilisation dcs RAPD.
~i ' t3; i luc.r 13 prkscncc de t lus senique existant entre des populations fongiques de
I ~ i i i l m & ct de Sut;&. Cne autrc ;itudc plus ricente du meme auteur (Hogberg ci al. 1999)
.i pc'niiis Jc. rcnixqucr i'nbscncc dc diffërenciation entre des populations de F. pirricokr
scpu-i'cs $O-raphiqucrnent par unc trc's grande distance. Trois sous-populatic'ns faisaient
p m c dc cetic citude; une en Lithuanie. une seconde en Russie et une troisiéme en Suède.
ILS ~nalyscs si-nctiqucs hrent effcctui-es sur ces sous-populations à partir de matériel
t i . ipl~ïd~ issu de carpophore. Toutes Ics sous-populations de mime quc la population
!oili lc s'a\.tirc'rc.nt Ptrc en équilibre avec les fréquences de Hardy - Weinberg attendues.
Or1 ne peur passer sous silence Ics travaux de Smith et ai. (1992) qui, i l'aide de
riiiiryucurs R.-\PD et WLP. évaluèrent i 1500 ans l'âge d'un genet d' ArniiZl<rriu htrlbosa
i Rxla i Ki lc et LVlitling. pesant selon leurs estimations plus de 10 000 kg.
a
Lcs ditfkrcntcs techniques molt.culaires mentionnées plus haut peuvent être
iirilistks pour une variété d'autres applications. Ces techniques peuvent, entre autres,
ptnmm-c dc dktscter la présence d'sspkces hybrides (Dawson et al.. 1996). de détecter la
pr?scricc dc vinis chez des souches de champignons (Hong et al.. 1999) ou Stre utilisées
LCS 111t3I1oCltls nlolCculaires perniettcnt d'Studicr 1c.s organismes ct d'obtenir une
t i ~ l c dc retmignsnients qu'il serait parfois impossible d'obtenir a l'aide de méthodes
corn criiioriiit'I1t's. Lkbjclctif de cette étude cst donc d'utiliser les techniques reccrnment
dc\cluppir 's cn biologie moléculaire sur Ic plan de la détection de mutations et de
1 '~na l )sc dc s iq~imcc nuclCotidiqucs afin d'açcroim les connaissances que nous avons
sur lcs populations cit. I'cspcce I. rontenrosiu et sur [es relations piiylogéntitiques entre les
di t't2rcntr.s cspC.ccs plithogines au sein du genre horiorils.
Bibliographie
.41iiicucci. .A.. Z~t~iibonélli, A.. Gioniaro, (3.. Potenza. L.. Stocchi. 1'. 1 W S .
Ideiiti ticiition o t' cctomycorrhizal hngi of the gsniis Tuber- by species-spocific ITS
pnnicrs. \ lu t . Eciil. 7 : 273-277
Blikshi. B.K.. 1 W . lndian Polyporaccae. Indian Counc. Agric. Rr's.. Xcw Dclhi.
2 4 6 ~ .
Bcmicr. L.. Hanielin. R.C.. Ouellrtrc. G.B. 1994. Cornparison of tibosomal D N X
I q h t and restriction polymorphisrns in Gwmrttrrll~i ~rhieriiiu and .-lscocu(r.r isolates.
.-\ppI. Environ. Microbiol. 60(4) : 1779- 1256
Blais. Rohcn. ! Y I G . Obsemaiion pr.rsonellc.
Boulet Bruno. IWJ. Rapport technique -1 19943236. Ministére des Ressources
nriturdtt.~ du Quibec. Qc, Canada
Botsiein. D.. Whiis. R.L.. Skoinick. 41.. Davis.. R. W. 1980 Construction o h genctic
iirikagc niap in man using restriction tiliyment lenght polymorphisrns. Am. I . Hum.
Gcricr. 32 : 3 14-33 1
Bouriciii. S.. Jiibaji-Hare. S. H.. Hogues. R.. Charest. P. M. 1999. Polyrnerase chain
rçlicticin- based iissay for speci tic dctcction of Rhi-ocroiiin solurti .AG-; isolaies.
'LIycol. Res. 103 : 1-3
D ~ I . L C . . Yicmcla. T.. Zang. M. 1997. Synopsis of the genus hiotroti,~
( Blisidtoniycetcs) sti)tsil I m in China. Mycotason. 65: 273-283
Dawon I.K.. Sirnons A.J.. Waugh R.. Powell W. 1996. Detection and pattern of
iiitcrspcçi fic hybridization bctween GIiricitii sepirrnr. .Mol Eco1 5( 1 ):S9-95
Ciilbenson. R.L.. Rpnrden, L.. 1993. European Polypores. Fungiflora, Oslo. Nonvay *
s s l i t ~ . R. IclJ1. Studies on Po(wicriu lepot-irilis and its relation to butt-rot of
spnicc. Dcp. Lands For.. Que. For. S m , . . Bull. No. lû
IIitniclin. R. C.. Ci. B. Ouellette and L. Bernier. 1993. Identification Gt-emeiiicl/ri
i i / v c ' i u z L ~ TXCS n. ih random ~irnplilied polymorphic DNA markers. Appt. Environ.
Slicrobiol. 5 9 : 1'33- 1745
IIarti. D. L. 19SS. .A primer of Popidaiion Genetics. 2' id. Sinauer.
tfcrb1t.r R e n i Pomcrlertu, Base de donnGes (S.D. ). Centre de Foresterie des
Liiircntidcs. Sènics Canadien des Forêts. Ste-Foy, Qc. Canada
Iloghcrg S. Stenlid J. Karlsson J.O. 1995. Genetic diffcrentiation in Fot~riropris
pciirc.ohi (Sctiu~lins: Fr.) Karst studird by means of arbi tnp pnnwd-PCR. Mol Ecol.
4 O ).0-5-s0.
Ihghcrg X. Holdenntxfrr O. Stenlid 1. 1099. Population stnicrure o f the uood decay -
1'iiiigiis fi)r?rrropsu pr~lrcolu. Heredity. S3.354-60.
i-luriz. Y.. Dovcr, S.L.. Cole.. T.E.. Brasier. C.41.. Buck. K.W. 1999. Multiple
iiiitochondrial viruscs in an isolate of the Dutch d m diseasc fungus Oplz~oronto itoiyo-
ili!rir. i'irology. 25S( 1 ) : 1 18- t 27
Hiinr. R.S.. 1996. Protein patterns distinguish among canadian isolates of Inot~orus
io/>irpttro.sir.s. 1. Ic.l>orrtiics and P. p i ~ i i . 41 ycologia SS( 3): Bj-4OI
t { u n t . R.S .. 1 997. Di fferential medium for Phéliltiris prtir 2nd hotzotits ronietirosrrs.
C',m. J Pathui. 19 : 507-309
Hiint. R.S.. 199s. First report of Itlo,rotlo ronrelifoszts. [h r cause of tomentosus
disclisc. tiom the Yukon temtory. Plant Dis. E 2 6 - 1
Iluiit. R.S.. 1999. Production of a pdyclonal antibody to Phdlimts pmi and
c.;.tiiiiiiritiori ol'its potential use in diagnostic assays. Eur. J. For. Path. 29 : 759-272
J c m d r o ~ S.. Roy -4.. Bousquet J.. 1997. Phylogeny and phylogeography of the
circunipolar yrnus Fruxiws (Oleaceae) based on internai transcribed spacer
sc'qiicnccs of nuclear nbosomal DNA. Mol Phylogenet Evol. ?:?JI -5 1.
Kiiii. S. H.. Czunovic. A., Breuil., C. 1999. Rapid deiection of Ophrosrorna ptcea and
O qir~*rc.irs in stained wood by PCR. .4ppl. Environ. Microbiol. 65 : 787-290
Lacliiincc. D.. 1978. The effect ofdecay on growth rate in a white spruce plantation.
For. Clircin. SJ( 1 ) : 20-23 *
L;tniourcus. Y.. Sicard. M.. 1999. Connaitre, cueilIir et cuisiner: les champignons
sciu\.ligcs du Qukbcc. Fidcs. 399pp.
Lc\r 15. K.J.. Hansen. M. H. 1991. Vegetativs cornpatibility groups and protein
clcctri~ptiorcsis indicate a role for basidiospores in spread of hotzortrs ronzenrosiu in
spriicr. fbrcst of Bi-itish Columbia. Can. J. Bot. 69 : 1756-1 763
L.w.is. K.J.. Hansen. E.M.. 1992. Survival of l~iottott<s totwtrtusLrs in stunips and
ziibscqumt infection of Young stands in nonh central British Colunihia. Can. J. Bot.
09: i -33- 1-03
L I . . L u . J . . IclS9. .A hypewariable microsatellite rcveaied by in ~ i t r o
ampli tication of a dinuclsotide repeat within the cardiac muscle x t i n gent.. .-\riiencan
Journal of Human Gsnetics. 44: 397-401
Lloyd. C. (3.. 1WS. Myc. 'lotes Polyporoid Issue 1 : 1
Ilsllctt. Ki.. Volney. W . I. -1.. 1998. [ntegratrd psst nianagement in western
C ; t n d i m b o r d forcsts. Forcstry chronicle 74 (4) : 597-005
I r l r . H.. Schulring, P.J.. Kamp. B.I.. 19SS. Itromrits ron1emm.s (Fr. Teng in
Ccnrriil British Columbia. In Procecdings of the 7Lh ~ntrernationctl Conkrcncc on Root
and Dui t Rots. Vernon ADN Victoria. B.C.. August 9-16. 19SS. ICFRO ~vork ins
p i i m S2.OG.01. Cditcd by D. Slorrison. Forrstry Canada. Pacitic Forcstry Center.
hctoria. B.C. pp. 531-562
Il\ rcn. D. T.. Patton. R. F.. I9ic). Establishment and spread of Po-ponrs rut?ietirosiis
I I I spruce plantation in Wisconsin. Can. J. Bot. 49: 1033- IO40
I lycn . D. T.. Patton. R. F.. 1971. Establishemeni and spread o i Polvp~at-rcs
rorri~~trtoslrr in pine and spruce plantations in Wisconsin. Can. J. Bot 49 : 1033- IO40
Kobles. M.K.. 19%. Cultural characters as a guide to the tasonorny of Polyporaceae.
C m . J . Bot. 36 : 553-926
Sublcs. M.K.. 1965. Identification of cultures of wood-inhabiting Hymenomycetes.
Cm. J . Bot. 43: 1097-1 102.
O'Donnell. K.. Cigçlnik. E.. Nirenberg, H.. 19983. Molecular systematics and
ph- logcography of the Gihhrreliil jqikoroi species cornplen. M ycologia 90 : 465-
-tL) 3. 9
O'Donncll. K . Kistler. H.C.. Cigelnik. E.. Ploetz. R.C.. 199Sb. bfultiple
CL olutionnary orïgins of the fungus causing Panama disease OF banana :Concordant
cvidence tioni nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proc. Natl. Acad. Sci.
[-'S.-{ 0 5 : ZOJJ-ZOcF9.
Oriia. M.. I~uliana. ii., Kanazawa. H ., Hayashi, Sekiya. T.. 1989. Dctection of
polyniorphisnis of human DNX by gel elrcrrophoresis as single-strand confomiation
polyiiorpliisnis. Proc. Natl. Acad. Sci. CSA. Sb. 2766-7770.
Oi~cllc~tc. G R . . Bard, G.. Cauchon. R.. 19'1. Self-strangulation of root: Points O C
cn tp o l' rocit-rot hng i in the Grand-blkrc u hite sprucs plantations. Phytoprotection
j 3 { 3 ) : 119-124
R o y . J . D.. Thon.. M. R.. 1999. Partial b-tubulinr gsne sequrncrs for rvolutionnary
studics in thc basidioinycotina. Mycoloyia. 'Il : 46s-174
Satki. R.K.. Schxf. S., Faloona, F.. hlullis.. K.B., Hom, G.T., Erlich. H A . Amheirn.
S.. 1'185. Enzymatic amplification of P-globin genomic seqiiences and restriction site
~n; i lys~s Ior diagosis of sickle ce11 anemia. Science. 230: 1350-1 354
Saiki. R.K.. Cclbnd. D.H.. Stoffcl. S.. Scharf. S.J.. Higuchi. R.. Hom. G.T.. Mullis.
K . B .. Eriicti. H.A.. l%S, Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a
thc.rniost~iblc DNA Polymerase. Science. 39:4S7-49 1
Sriii ili. 11. L.. Bnihn, J . N . Anderson. J.B.. 1992. The fungus .-Lndkirr<i hidbosci is
anion- thc I m p t and oldest living organisms. Mol. Ecol. 356: 42s-43 I
Snydcr. L.. Clianipness, W. 1997. Molecular senetic of Bacteria. .-\Sb1 Press. 50.1 p.
Sourlicrn. E. 41. 1975. Detection of specific sryuences amon% DNX fragments
sepciratcd by gel electrophoresis. Imol. Biol. OS : 303-5 17
Stcnicr. T.E.. Dwidson, AG.. 1982. Forest insèct and diseasc conditions in Canada.
\OS 1 . Environ. Can.. Can. For. Sen . Insect Dis. Survey. Ottawa. Ontario
Tkacz. B.I.I., Baker. FA., 199 1. Survival of Irro~totrls tontentoslu in spmce stumps
~ i i c r lwging. Plrint Dis. 75 : 758-790
U'cirrcn. G.L.. lclj6. Root injury to conifers in Canada by species of fibbiiis and
I&pon~o(vi. ( Coleoptera : Ctlrctriiorrihe). Fo?. Chron. 32 : 1 1 - 13
lVcciwr.R.S .. Hcndnck. P. W., 1989. Genetics. Second edition, WCB.
L\'clsii. J . . SlcClrlland. M.. 1990. Fingerprinting using PCR with arbitras pnmen.
Viiclcic ~ ic i c f rcscarch. 1s: 721 3-721 3
h i , R D . . 1 Stand-opéiiing diséasr: and the pathogsriicity of Po!,ponu
iot,ic,itosirs Fr. on ~ th i tc spnice (Plcerr gl~rirca) (Mocnch) Voss.). Ph.D. Thesis.
(?~iccn's Lhiversity.. Kingston. Ontario. OS pp.
t t ~ . RD. . 1961. Root ~rfounds and associatrd root rots of white spruce. For.
Chron. 37 AOI-411
\\'liitnr.>.. R.D.. 1062. Polipoms totwtrosirs Fr. as a major factor in stand opcniny -
ilizclisc of white spmcc. Crin. j. Bot. 40: 163 1-1658
I I , R D . 1O63. Ani ricial infection of srnall spmcc roots uith Pokponrs
rot)t~~riro.srts. Ptiytopath.53 :44 L -443
\\Ili tncy. R.D.. Grocnewoud. H.V.. 1963. The rate of dvance of stand-opening
discase over (i tcn-year penod in white spmcc at Candle iake. Saskatchswrin. For.
Chron. Scpt.: WS- 3 12
Wliitiic.>~. R.D.. 1966. Germination and inoculation tests witli basidiospores of
I'olipwus tut)i~vrrracts. Can. J . Bot. 44: 1333- 1 13.13
\\rliiiiic.v. R.D.. Bohaychuk. W P . . 197 j. Growth of Po&ponts tot~ienroszcs cultures
derivcd k o n ~ Iroin basidiospores. sporophore tissue. and decayed wood. Cm. J. Bot.
5 4: 2597-2002
Kithncv. R. D.. Bohaychuk. W. P.. 1976. Prithoyenicity of P o ~ p o n i s tonrentosits and
P n l ~ p t - u s I U I > Z C ~ I ~ O S ~ ~ S var .cIrc~t~~~t~cs on seedling of 1 1 conifer sprcies
1 t R. D . 1 977. Poiiporics tometirosiis root rot of coni fers. Depancrncni of
Fish~rics and Environnement.. Canadian Forest service., Sault Ste. Marie, Ontario..
Furestry Tectinicril report 1 S. 12 p.
\ihitnc),. R. D.. Bohaychuk. W.P.. 1977. Variation of Po(pmrs tontemostis in
cultural chsracteristics and pathosenecity on conifer seedlings. Can. J. Bot. 55:13S9-
13'15 *
t~\vhitiic>.. R.D.. 1997. Relationship between decayed roots and abovegound decay in
ttirec conifcrs in Ontario. Can. I. For. Res. 27: 12 17-1 22 1
lVilliarns. J.G.K.. RubeIik, AR- . Livak. K.J.. RafaIski. J.A.. Tingey. S.V., 1990. DY.\
pol ymorphisms ampl t fied by arbi trac- pnmers are useful as genetic rnarkers. Nucleic
ricid research. 1 S: 65: i -6535
CHAPITRE 2
( ' c ilicipitrc est rtiiligi en anglais. I I sera L-vrnturllement soumis i une revue scientifique.
Diagnostic PCR assay for t he identification of lnonotus fomentosus from cultures
or fruit body.
Hugo ijcrmainl. Gaston ~ a f l a m r n e ' , Louis ~rmier ' , Richard C. ~arne l in '
1 i b r i i r a l Rc.ssources Canada. Canadian Forest Ssn.içc. Laurentian Forestry Centre.
1055 du P.E.P.S.. Sainte-Foy. Quibec. Canada. G IL* 4C7: 2 ) Centre de recherche en
hioiogic hresti;lre. Cnivcrsiti Lavai. Citi universitaire. Quebec. Canada, G 1 K 7P-L.
Summary
Spcc 1 tic PCR primers wcrç developed for the intemal transcnbed spacçr (ITS) region of
itic ri1S.A gcnc of Iriotroti<s tonrrtitoszrs. the causai agent of the tomeniosus root rot of
itjriit.~rs. PCR amplification was carricd out successfully from DNA cxtracted from fruit
hodv or culrures. No cross-rciiction was obsewed with DNA of several other species of
ilic same p u s . with Phellirtus ptttt or with white spmce (Picea glatrco). The primers
w r c dcsignrd io di fferentiate I. tonreniostls from Inotioizis leporinus. which is
iii~~rphulogically identical in culture and Phelliriiis pitrr S. lum. which is very sirnilar.
Ph! logcrictiî analysis of the ITS region for ~ i s specirs of Irionotz<s suggests that
di ~,crscnt spccics rcquirinç di fferent scological niches evolved Ji fferently. It appean that
~ii~.crgcnt cvolution of an ancrstor inkcting different scological niches ied to a speciation
pmccss. \\.hich conferred specificity to either conifcrous or deciduous species.
Developpemsnt d'amorces diagnostiques pour I'iden tification de I'lnonotus
tomenlosus à partir de cultures ou de carpophore.
Résumé
Dcs iiiriorccs PCR spécifiques ont i té développées pour la rkgion ITS ( ~ m m d
~~.: i t , .~~, , . ihr~d sp ico - ) de l'.ADN nbosomique de 1'0ro)zotris ronretztosiis. l'agent causal di: la
csric rousc rilvt'olairc du pied chez les coniferes. L'amplification PCR est possible i
prinir ci'.-\DY extrait de cultures ou de carpophores. .Aucune réaction croiste n'a i t t ;
~ h s ~ r v c c conrrc d'îutrts sspkccs du mcme genre et contre P h d h i t s prrii ou i't'pinetts
blanc hc ( PKLU girrltcc~ ). Les amorces ont itrit mises au point pour distinguer I. tonzeritosirs
tic / I,;r>o)-i~~iis ct dr: P. prnr qu i sont très semblables en culture. Cnc analyse
pli! loyi;tictiqur. des sc'quencrs ITS indique une évolution divergente cntrc les c.spt;ces
ii;ii iscint dcs nichcs 6coloyiques di fférentes.
Introduction
The piithoycnic Fungus Irzo~or~ls rotwirtosirs (Fr.) Teng infects sevrral 'iortli
-\mcricciri conifcrous species (Whitney. 1977). Tlir root aiid butt rot caused by ttiis
tüt iys is responsibls for major sconomic losses. paniculariy in white spnicr stands. The
s! riiploriis rcsultins from an infection of I. [onierirosrrs are very sirnilar to those cciused by
! !L'POJ-IIIIIS ( Fr) Gilbertson and Pllriiirilts prrii ( Brot. :Fr.) .A. Xrnt-s, other pathogsnic
i i in r i that cciust. root rot disease to white spnice. Growing the hngi in pure culture docs
riot hcilitats identification since I. tottientoscts and I. leporirztrs are indistinguishable from
cadi othcr in culture (Whitney and Bohaychuk. 1977). I. romentosus and P. pini arc also
.ilriiost idmticcil in culturt.: howevrr. P. pi,,, sometimes produces chlarnydospore-like
jtructiircs in culture. ~ n d has thicker setal-like hyphae (Nobles. 195s). Differential culture
nicdiii <Hunt . 1097). polyclonal antibodies (Hunt. 10W) or protcin slectroplioresis (Hunt.
! W O ) do not rtllo\v clcar idcntitication and diffcrcnt~iitton o i I. ronieritosrts and I.
I ~ ~ p o r i ~ i r i s . Thc cstcnsivc damage caused by /. roniertrosirs justifies the development of a
rcliriblc. cspedicrit and user friendly diagnostic test.
The polymçrase chain rcaction (PCR) (Saiki and al.. 19S5) and analysis of
rmdorti mpliiied polymorphic DNA (RAPD) (Willianis and al.. 1990). which have been
i i sd cstcnsivcly in DNA identification. offers tlic opponunity to selectively arnplily
DY:\ iiorn an oryanism. The interna1 tnnscrïbed spacer region (ITS) is in the ribosomal
D L \ genes. I t is located on each side of the highly conserved 5.8s region between the
i ivo Iaqc nuclcar ribosornal subunits. The ITS region shows a high level of intersprcific
pulyriiorphisrn and miiltiple copies are present in the cells making it amplifiable [rom
riiiriute iirnounts ofD'i.L\ (Gardes and Bruns. 1993). Thesr features make the iTS region a a
g u d candidats for designing specific primer pairs. ILS regions have been used
c\[cnsively in identification of Forest fungi (Kim and al.. 1999), pathogens of crops
i Rounou and al.. 1999). edible mushrooms (Amicucci and al.. 199s) and for phylosenetic
xidysis ( Rous and al.. 1999).
Tlic objcstivcs of thc prsscnt study were to : 1) drvelop a set of PCR pri~icrs
ipccilic t i , the ITS region of I. rotmtirostc and 2 ) study the phylogenetic relationships
miong scwrd specics of ttic gcnus I~iotiorlrs to determine if the morphological similiirity
bci~rccn I. ro»retztosl<s and I. leporiti~ts is retlscied at the rnolecular 1wr.l.
Ma terials and methods
Biologiciil riiaterid
Tlic toiloti iris q m 5 t . s were uscd: 1. ~ O I ? ~ L ' ~ Z I O S I I S . I. ieporitii~s. I. C I ~ I I C I ~ U I - z s ( Bull. :Fr.) P.
Kiirsl. 1. ~ I O I ~ I ~ ~ - L I I ~ I S (P.K.) Murr., I. r d i m t s (Sowrby : Fries ) Karsten and I. rliedes
( P m . 1 Bond and Sifiger. Two strains of I. tottietzrosiis rvcre used : one originated from a
t n i i t bud) collected in a white sprucs plantation of western Quebec. whcreas the second
onc \vas a pure culturc from Bntish Columbia (culture : 05-10-07. B.C.. Canada). Al1
niaterid t i sd LUS diploid. The strain uscd, the main host on which the basidiocarp can
ibund aici thc GcnBank accession number arc found in table 1 for cach specic used.
D A isolation
DL\ \vas atracted directly liom fruit body tissue or mycelium using a modified version
oi'tlic nicthod dcscribed by Zolan and Pukkila ( 1986). Approxiniatcly 5 mg of fruit body
tissue N ris trikcn froni the sporocarp using a scalpel and piaced in a 1.5 ml Eppendorf
~ 1 . For niycdiiim. 3 w e k old cultures w r e filtered on a double laycr of Whatman 2
tiltcr pciper which had prcviously bcen rinsed twice with distillcd watrr. and placed in
I .S ml Eppendorf vial. Approximatcly the same quantity of diatoniaceous eanh (Sigma
Clicmicd Co.. St-Louis. MO. US.) and 100 ul of extraction buffer (100 miM Tris-HCI
pH '1.5. 2" ,, CT.-\B. 1.4 hl NaCl. I % polycrhylene glycol 6000. 20 miM EDTA and 0.25%
I)-2-niercaptorthanol) w r e added and the mixture was ground for 3 minutes using
disposab l c Kontes pes t le ( V WR-Canlab. Toronto. ON. Canada). Three hundred pl of
extraction but'fcr \vas added and the tubes were incubated at 65 'C for one hour. Samples
~ e r c é ~ ~ r x t c l f using 490 pl phenol:chlorofom:isoarnyl alcohol (25:Z-k l ) , vorteseci and
sentntiigcd at I 0 000 S J for O minutes. The upper phase was transferred in a l .j ml
Eppcndort't-ial and DNA was precipitated using 7.5 M amonium acetate and 600 i l cold
'PabIctiu 2: Strain identification, Genbank accession number and host for each
spccie uscd.
Spccic 1 Strain Host on \\.hich i t w;is round. GenBank acc.7 ;
. - 1 1 - t s QB - S c .-lccr sp. AFZ4796S
ir crc dao ps rhn i id uaing universal primcrs ITS-I F and ITS-4 to escludc amplification
t>ilurc duc to poor DS.\ quality.
Data analysis
Phylogcneric analysis \vas used to drterminr if rnolecuiar data would support ihr
niorpliologiçd triformation indicatinj iliat I ronre~irosits and /. Irpor~rrrix arc closely
r-ci~iicd. --\ pl~cnogrini u ~ s infered uith P h U P ( LVisconsin Package Version 10.0, Genrtic
(3iiputr.r Group i GCG). Madison. W. C7.S.1 using maximum parsiniony analysis and
h r m ç h siippon ucis calculated using a bootstrap (500) method. P. p r ~ Kas used as an
ouigoup to provide rooting of the trce. Sequences were manually edited and îlignrd
usin2 CliistalW I S . This alignment \vas use therealter to design the pnmers specific to I
r t ~ m ~ ~ i t o s i ~ ~ ancf to d r w t ht. phenogram.
Results
l'lic D S A cstraction protocol. describcd by Zolan and Pukkila. u s successful for
al1 species anri tissues uscd in this study.
D M ampli tications using the universal primers (ITS-1 F. ITS-4). werc successful
ibr the D N A cstractcd Iiom the fruit body or cultures and resulted in o PCR produci of
approsini;itcly SOO bp. Lcngth polyrnorphism c m be observed in figure 1 between the
di ifkrcnt spccics of lrrotroiils ampli fied th the universal primers. These pnmers were
icstcd rigainst 10 pure cultures from diffcrent locations in Canada and in the CS.
(Rcntmccster. R.. CS. Depanement of .Agriculture. Forest Service. WI. U.S.). .Al1
speci niens. cul turcs or carpophores. previously identified as I. tonzeiz~oszls. tested positive a
(tlihlc 1). fdsc ricgative were not obscwed. The ampiification with the universal primer
rcsiiltcd in iiniplification of a PCR product for nll the species used in this study.
Elcctrophorcsis of the PCR products jenerated with specific ptimen (it-ITS-209-
i: it-LTS-NO-rc) revealed a 491 bp aniplification product for the two strains of I.
roi~iC~irosiis and no xnplification product for any of the other species (figure 1) . This
ri.;iiIi indicares lhat this protocol can bc used to idcntiQ specirnens from fmit body.
inLiking the tiriir consiinitnp step. oE gro~vin= the fungus on a petri dish unnscessary.
Thc phcnvgrrim inkred from the ahgrnent indicates that I. ronitJ~~roszts and I.
iqwr!triw arc hoth on a branch strongly supportcd by the bootstrap value. and cipan froni
al! uiiicr spcocs. Trçc lcngth and consistrncy indices arcre 115 and O . S l j S . respectively
f i g ~ ~ r c : 21.
I X ~ l e a u 3: Reference number and origin of the isolates tested rvith it-ITS-209-f and
i t - t TS-700-rc
1 I jud- 1 5 56 1 Ontario i Bud- 1-03 -.A I Ontario j Llii~t- 1 S4S 1 Ontario
~ i rp- I O ~ C I : 1 - j p I Ontario 1 197 f ] Picert glnucn 1 - 1 i ~ p - 1 0 ~ 1 ~ 1 -.r I Ontario I 1971 1 ~ t c d t t giurrcer 1 - f
194s
194s 194s
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197 1 1971
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Prceu yl~zrlccr -
; I L - ~ I W 1
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Piceu y liz uclt Prcve<i gkzucn P~CCCLZ gloucu Picca E T ~ I I I C L I
r ; \ t . i~i -549- r i SIinnesota 1'2-2-R ! Ont3rio
; l)-?-i< 1 Ontario
- - - -
1923 1968
i 063
P I C ~ ~ I niaricrrrct P I C ~ gluuc<j PICL'CI Y ~ ~ ~ U C L I
Quebec Quebec
s t 1 - ~ 5 - 0 - I Onmrio / F!)OOOS? -5p Colorado
.. - -
' l 1 1 -W l Que bec 1 \f:-W 1 I Qucbec i
1969 1945
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1999 1999
/ \ 1 ~ - 9 9 : \1-!-00
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Picélu yIuuca Picca glultca
i 999
1999
Qucbec Qusbec
P m i s ~~~~~~~~r Picctj mgdtnntrrr
PICLJU ~ ~ i u ~ ~ c i t Picru gierttc<r
- -
4
1999 1999
Plcrn giuitctt 1 - Prcen gltrrica 1 -
Figure 1 : .Amplification product obtained with the specific primers ITS-209VITS-
700-rc and with ITS-l f/ ITS4 (universal)
1 .mes 1. I 1. Gibco Brl 100 pb DNA ladder. Lanes 2- 10 show amplification with speci fîc 9
pririicrs. Lanes 12-20 show amplification with universal primers. Each lane contained
DY.-! tioni: llrnes 2. 12 I. iornentostis (culture. 05-10-07. BC): lane 3. 13 rornertiostts
i iriii t ho& Oc): lans 4. 14 I. feponti~~s; lanc 5. 15 I. cuticdrrris: lane 6. 16 1.
.;rhtmv-,irics: lanc 7 . 1 7 I- rcrdiattis;, lane S, 1 Y I. rlreacft?: . lane 9. 1 9 Phellinrts pini;. Ime
l i 1 . 3 1 tiegtive control.
Figure ? : Phylogenetic relationship among the genus honotus using Plreiiiitr<spitri
as a outgroup
.A rootcd irce using niasimum parsimon? analys14 of [TS 1. 5,s S and ITS 2 DN.4
scquenccs rcveded that 105 characiers werr parsimony-in formative. Branch lengths were
drriu n proportional to the number of changes. Buotstrap values are indicated on branches.
Thc Hornop llisy index = 0.1542
Deciduous spec1t.s
Outgroup
Discussion
Tlic root rot caused by I. ro/~lerirosiu is arnong the most important root rot that
aitkct soniferous specics of the nonhem hemisphere. The symptonis caused by the
iiingus are not spccific to tliis fungus. rherefore these cannot bc usrd to diagnose a i.
iot,~~~utoslrs inlecrion. The srvual stage of the fungus, whrn the fmit body is produce. can
providc niatcrial for identification of the fungus but i t is very sphemeral, and nevcr occur
;it clic sanie tirne froni one year to anothcr and may not occur at all. III rlitro cultures of the
!unyiis arc r.stri.rncly siniilar to other root rot pathogcns cultures making identification
tloni crilturcs vttw difficult. For these reasons, a rnolecular technique was used to help
i d s n t i i y n g ;l f u n y that is vcry hard to idcntify using traditional methoci.
Thc PCR cxperimcnt revcalcd ttiat the set of primers dcsigned for 1. ronrurrosrrs
1s spccitic to ihis species. Arnplitication was positive for I. rorwiroscu h m the
pro\.inces ot' Bntish Columbia and Qucbec. This indicates thnt both cultured tissue or
tn i i r body tissue from different o n ~ i n s a n be arnplified using these prirners. No cross-
rcxtion \\-as obscrvcd usinr this PCR reaction with any of the other species of Inortotiis.
or tvitli P. pltrr. or their host. Piceci gluiiccr wood samples (data not shown). Positive
control tcst with universal ITS allowcd the exclusion of PCR hilure due to poor DNA.
The pliylogrnetic trcr slaborated is well supportcd by ecological data.
Pliylogcnctic annlysis indicated the presence of two different groups within the genus
i l l f ~ i i ~ . . ro~?letitosirs and I leporiuirs make one clade. which is supported by a
hootstrap \.;ilus of 100. and the other is composrd of 1. rudiunis. I. gfonzerci~irs. 1. rhendes
cind I c.irriczliu>-rs. All these species have the ability to cause white roi decay, which is a
chiirilc~crized by a degradation of the lignin of the tree. Ecological data and
niurpiiologicril criteria aiso support the fact that forneriroszis and I. leporims are
scparated liom al1 other taxa within this genus: both are pathogenic funsi of coniferous
spccics a.ticrcas dl four other specics are associated io deciduous tree species (Gilbertson
and R>rvarden. 1'336). Even thougti the? share a common ancestor with the other species.
1. roi~riror~is and 1. leporinus cvol~xd differently. This enablçd them to occupy 3
JilTcrciit ccoloijcül niche. 1. t-ii&irirs is also ecologically riiffercnt from al1 othcr taxa
iricliidsd n.ithin this cinalysis. It is the only truly saprophytic fungus of deciduous trees. I t
w I I m a c k trscs only when the tissue is dead. and will oftrn colonise wood \\.hm
rlccriidliiion is already w l l undenva? (Gilbsnson and Ryvarden. 1986). Its main role is
io r c q clc woody material of deciduous trres like birches and sldçrs. The ottier three
jpccics u.itliin rh i s cl;ide. I- glonrrturrrs. I t-izedrs. and I. ctrticirlru-is cause heanwood .
dcca!- of dsciduous trecs and cause progressive elimination of old trecs (Boulet. 1995).
Of those itircr decciy fungi, I. gloniemtw is the most agyressive. particulxly on maple
aiid bcccii. I cilricitlm-is is an opponunist decay fungus of living hardwood. rnainl y elms.
\vlic.rcas I . )-lz~udcs is panicularly aygressivr on asprns. The sporocarps o l I t-lieudes
Iiaw (i granular core \vit11 highly branched hyphae (sclerids). This. however. is not
piirrailcicd by diSferrncrs in the molecular sequences analyzed in Our study. This
chciracicristic is not ençountered in other sprcies of this renrra. Based on morpholopical
widciicc. this fiingus is sometimes classified in a different sub-genus (Dai et al.. 1997).
Tlic grotiping of I. cl<riculat-is and I. rlrccides could be the only arnbipuity between
c c o l o $ d and ntolecular data of this phylogenetic tres. The analysis olanothcr locus or
ihc an;ilysis of a different character could help in resolving this ambiguity.
I'lic jpccitic primers devcloped in this study will allow reliable. sensitive and
cspcdicni identification of I. tonie>itosus cultures or fruit bodies. This rnolecular
idctiti ticaiion process ( DNA extraction. amplification and revelation ) can be completed
wit t i in 1 days. It leads to unarnbi~uous results and provides a valuable identification test
for phyropathologists. The phylogenetic results indicate that the genus Inonofus is
iiioriupti~~lr.tiç. Ecological niches appear to have played a major role in the speciation and
c\.olution proccss of these fungi. Evolutioo of a? ancestor inrecting different ecological
niclics appcars to have led to a speciation process. which conferred specificity to either
corii t-crocs or deciduous species.
Litera ture cited
.An~iciicci. 4.. Zrtnlbonelli. A.. Giornriro. G., Potenza, L.. Stocchi, V. 199s.
Ideiit i rication of ectornycorrhizal hngi of the genus T~ibet- by species-sprcific ITS
prinws. hIoI. Ecol. 7 : 273-277
Boiilct. B . 9 Impact Jc la cane des arbres et stratégie d'iniewention dans le
niilicii forestier. L'.Aubèlle. L 1 1 : 1 - 1 Z
Bounou. S.. labaji-Hare. S. H.. Hogucs. R.. Charest, P. .M. 1900. Polymerase chain
rsrtction-based assay for specific detection of Rlrizocto~iici sokini .4G-3 isolaies.
\1>.col. Rcs. 103 : 1-8
Dai. Y.-C.. Xiemela. T.. Zring. M. 1997. Synopsis of rht. genus Orotiotzis
( Basidioniycctcs) setlm k m in China. Mycotason. 6 5 : 273-283
Gxdcs. M.. Bruns. T. D. 9 . ITS primers with cnhiincc sprcificity for
hasidioiti~cctes-application io the identification of mycorrhizae and mst. Mol. Ecol.
1: 1 1 3 4 1s. Gilhcnson. R. L.. Ryvarden. L. 1986. North Amencan Polypores. Vol. 1 :
.-\bortiporus -Lindtncria. Fungiflora. Oslo. Xonvay. 133 p.
Hunt. R.S.. 1996. Protein patterns disttnguish among canadian isolates of Irzonotos
:ourcritr>sits. /. leporimrs and P. pifri. b1ycolo;ia SS(3):395-402
Hunt. US.. 1007. Differential mediuni for Phellinus pilit and Oiottottis tonrenfosus.
Clin. J . frithol. 19 : 307-309
!Hunt. R.S.. 1999. Production of a polyclonal aniibody to Phcllinus pitri and
cxaniiiia\ion of its potential use in diagnostic rissays. Eur. J. For. Path. 29 : 259-772
Kini. S. H.. Uzunovic. A.. Breuil.. C. 1999. Rapid detection of Ophiosrorna picea and
O. q w m t s in stainrd wood by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 65 : 337-290
Soblcs. JI .K. 1958. Cultural chxiiciers as a guide to the taxononiy of Polyporaceac.
C m . Bot. X : 883-926
Rous C.. Sejalon-Dslrnas N.. btanins M.. Parguey-Leduc A.. Dargent R.. Becard Ci.
IOc19. Ph>-lorençtic relationships between European and Chinesc truffles based on
p;irsiiiiuny anci distance andysis of ITS ~cqustices. FENS Mcrobid Lett.
1 SO( 2 1: 14--55.
Saki. R. K.. Schrtrf: S., Faloona. F.. blullis.. K. B.. Hom, G. T.. Erlicti. H. A..
nt S.. 19Sj. Enzymatic aniplitication cd P-~Iobin yenomic ssyuences and
rcstricrion site analysis for diagnosis of sickle ceIl ansrnia. Science. 330: 1350-1 354
\!'hi tiicy. R. D.. 1977. Po!\ponis ronie~trr~stsus root rot of conifers. Depanement of
Fisiicrics and Environnement., Canadian Forest senice.. Sault Ste. blliric. Ontario..
Fc~rcstry Technical report 19, 12 p.
Wliitney. R. D.. Bohaychuk, W.P.. 1977. Variation of Pobportrs to~~remmrs in
culturril charxttxistics and pathogenccity on conifer seedlings. C m . J . Bot. 5 5 : 1 3 9 -
131s
\\'ill~;inis. J.G.K.. Rubelik. AR. . Livak. K.J.. Rafalski. J..\.. Tinrey. S.\.'.. 1990. D M
polyiurphisnis aniplified by arbitrary primcrs are useful as grnetic niarkers. Yuclsic
.-'\cd Rcscrircli. 1 S: 653 1-6535
f i l m . M E . . Piikkila. P.J. 1956. Inhentancc of DNX methylatiun in Copr~ms
( - r r i i 7 r - c : m . 1101. CeII. BioI. 6( 1 ) : 195-200
CHAPITRE 3
Cc cliiipiw cst rr'digk en anylais. Il sera éventuellement soumis it iinc revue scientifique.
Genetic variation in lnonotus tomentosus within a white spruce plantation reveals
irregular allelic composition for mitochondrial and nuclear genes.
. 1 IHu-o Gcni~iiin . Gaston ~atlarnrne', Louis ~ernier', Richard C. ~a rne l i n ' .
Slir~irul Rcsuurctx Canada. Canadian Forest Service. Laurentian F o r e s e Centre. 1 055 du
P.E.P.S. . Sainte-Foy. Québec GlV 4C7. Canada: 2) Centre de rechcrchc en biologie
ti~rcstic'rc. Cni\,crsitG Laval. Saintc-Foy. Québec. G 1 K 7P1. Canada.
Abstract
Thc gcnctic diversity of the forest pathogen Itrorrottcs ronzetttosus was rvaluated
i o r ttircc coding genes; the large and small mitochondrial ribosomal subunit and the P- iiibulin ycnc. DY.-\ was estractcd direcrly from 315 carpophores taken from a white
spnicc (PicLw giiritcci) stand and the position of each carpophores \vas plotted on a map
iising .-\rçVicn. Wc used SSCP (single-strand conformation polymorphism) analysis to
citiributc allclcs to eacti carpophore and the rnap was redrawn with the jenotypes of each
carpophores and their position. The P-tubulin genr showed a high level of polymorphism
cornparcd wtti iIic niitochondrial genes. The objective of this study was to perform an
Lwtoçorrs!ntiori rin;ilysis in order to determine the pathway of propagation of this fungus.
r\briormlilit). in the allelic composition at the P-tubulin loci did not allow this type of
mrilysis. .-4lthough auto-correlation analysis could not be perfomcd. visual inspection of
ihe üllelic Jistribution tvithin the plantation does suggest clonal propagation of the fungi.
L'étude de la variation génétique chez lnonotus tomentosus dans une plantation
d'épinette blanche indique une composition allélique anormale chez des gènes
nucléaires et mitochondriaux.
Résumé
L a clivcrsitti senétique du champignon pathogène des soniferrs honorlrs
ioi~izrrloszts 3 c'te C\.aluCr pour trois gèncs codsnts. la petite et la gosse sous-unité
rihosoniiquc rnitochondriale et le @ne P-tubuline. L 'ADN fut extrait directement à partir
dc 3 1 S carpophores rccoltés dans une plantation d'épinettes blanches (Piceci y h t c u ) . La
position dc çIi;tcun des carpophores a eté notes et ceux-ci ont Cté placés sur une carte à
1';iidc du logici4 .r\rcVit.w. La technique SSCP a été utilisée pour I'identification des
~ l l c ' l c s de cliacun des carpophores et la localisation de chacun des génotypes est
rcpcrtoric'c. sur 13. c91-t~. Le gène P-tubuiinc a montré un niveau de polymorphisme ileve
dors que lcs 2 $ncs rnirochondriauv utilisis ont montré un faible niveau de
polymorphisme. L'objectif de cette étude était d'effectuer une analyse d'autocorrélation
spritiale pcrmcttant de déterminer le mode de propaqtion du champignon. Cependant la
priscncc d'anormalitCs dans la composition allélique au locus P-tubuline n'a pas permis
dc rrialiscr cette analyse. Bien que cette dernière n'ait pas été effectuée. l'inspection
~ . i s u c l l c du patron de distribution des penoiypes dans la plantation semble indiquer un
mode de propay ntion clonal.
Introduction
Fungal iorest pathogens are irnponnnt components of forest ccosystenis. Forest
p;it t io~u~s. siidi 3s Hrterohosiciion mtiosiou (Fr. :Fr) Bref. and .-lruziilumi spp. and
/.rot?r~vrcos~s ( F r . ) Teng. c m cause severe disturbances that affect ceveral parameters in
rhc toresr siicli as spccies diversitics and forest yield. Other wood decay funyi play a
bcneticid rolc ol' recyciing.
1. ro~~~e~rtosirs is a basidiomycete which causes root-rot disease. In Nonh ;\mericri.
i t is capciblc df i n tècting a wide variety of conikrous specics. but important dama, ucs arc
riiostly rcponcd on the senus Picea (Whitney. 1977). Since th<: prcsencc of fniitiny
tidics 1s oticn cplicrncral and syniptoms crin be very ambiguous. or confused with abiotic
stress. discrise incidence and severity are often evaluated only once the disease is well
cstsblislicd or uhsn trees are harvested. This is panicalarly important Cor a trec crop that
rcquires at l e s t 5 0 y e m until rnaturity. Knowiedge of the presence of an inrestation
ioçiis in a plantation bcfore or at the beginning of the plantation could provide betier
sill-ici~lttiral çontrol of this disease. in particular if spatial infonnation on the presence of
tIic pathogcn 1s availablc. Sincc spmcr and othrr conifers are favored species t'or
rciorcstarion in Canada and othrr countries of the northern hrmisphere. incidence of this
discrisr. could increase significantly in the future.
Cnderstanding the undrrlying rnechanism of dispersal o f this fungus may provide
important inforniation in controiling the propagation of the disease. One of the main
questions ttiat 1s iinanswered is whether or not'sites are already pre-colonized by the
Îung~is. or u-hcther the fungus invades a site Following reforestation with the susceptible
host-spccies. In the former case. a desirable control strategy would consist oldetermining
nliether sites arc considered infcsted or not and if so. to plant tree species that are less
siiscr.ptible. In ttis latter case, since the site as such is not infested. control methods wodd
hwe ro relu upon silvicultural approaches.
SOIIK O( the bsst studied b ; l s i i o n c t s are root rot fun$ such as .-Irrrtilhi~r spp.
aiJ / l L ~ r ~ * ~ ~ o / ~ ~ ~ s ~ ~ i i o r 1 ~ I ~ I ~ o s ~ . Colonisation of sites by different individuals followed by
j ~ \ l ~ ; t l and iisesual reproduction l a d s to thc forniarion of gmcts. Thrse senets mnsd in
iizc koni ii icw centimetres in Locccruru s p p (Gherbi et al.. 1999) to several kilornetres in
. - l r id i~ imr golleo (Smith et al.. 1992) to. The s i x and spatial distribution of these genrts
c m dcpeiid on the dispersal pattern of thc fun jus and the tirne since establishment on the -
site Eacti p i e t is potrntially genetically different and could react differently with its
ciiuronnwr:t or have dilferent virulence or host adaptation ctiaracteristics. In an c.xtrcme
:SC whcrc ;i massive new invasion took place rccrntly via basidiospore germination. one
w u l d c\pcct to îïnd a large numbcr of small geneticülly different gcnets. In the case of
ai old inicstation. one would expect lower numbers of lar_oe genets.
Tiic study of the relationship betwcen genctic vanability and physical distance O C
~ I I C S C gcncts n u y be vev inforniativc to determine the genetic sinicture and (Garbolrtto
ci :il . I OW) thc dispersal pattern of a panicullir fungus ( Lewis et Hansen. 199 1). Auto-
corrclation nnalysis. which allows to establish the relationship between the genetic
disicincc and the physical distance between individuals. is vcry useful to determine the
dispcrsnl pattern (Gherbi et al.. 1999). Genet clusterin% or random dispersai of the p e t s
\vittiin (t stcirid rnay indicatr clonai or sporal distribution rcspectively.
Ft.w studies have addressed these issues in I. tonwrttosrn. In one study in western
Snnli :\rncnca. protein profiles were studied in populations of 1. tontentoszcs. The large
ii~i.i.rsity of the profiles was interpretcd to be an indication that basidiospores played an
irnponcini role in site invasion in this fungus (Lewis et Hansen. 1991). However. the
spatial p3ttc.m was not cleariy established and thy genetic hcntability and repetability of
protriin profiles is difficult to establish.
The goal of this study was to investigate the spatial genetic diversity of 1.
!oi>izirtosrrs in a white spnicc plantation. In order to euluate genetic polymorphism
wttiin the population. DNA sequence polyrnorphisms were assayed using PCR
(polymerase c h a i reaction) of one nuclear (P-tubulin) and two mitochondrial genes. the
ni!~oçiiondrial ribosoiiial small sub-unit ( M S ) and the niitociiondrial large ribosonial sub-
iinit. Population ssqurncr polymorphisrns were detcrmined by SSCP (single-strand
con forniaiion polpmorphisrn), followiny by systernatic sequrncing o l the most largrly
rc.prcscntcd allclcs . The analysis of SSCP is a very sensitive method based on singlc
jtriiiid confoniiation (Oritci et al.. 19St)). This technique allows the detrction of point
mutations alid [lie codominant analysis of molscuiar markers. The use of this detedon
iiicrtiod ~ i l o w s scarching polymorphism in coding gencs. which is niuch less frequent
tlim pol!morphisrn in non-coding seyuences (Hanl. 1988). Thrre coding gcnss were
iound to bc polymorphic. Two of these three senr are mitochondnal. one is nuclcar.
Jl i t~~hcindrial gcnss are always found in the haploid state in fungi since the mitochondria
.ire iissunid to be transmitted by only one parent. This characteristic resuits in the fact
ttiiit ; i l1 individual appciirs to b r homozygous at al1 mitochondrial loci. Thus. the use of a
niiclcar mrirkcr lvas justifièd since it aIlowed the detection o r individuals in the
t i e tc t ro /~~~ous stats. and would complernent the information obtained with the
rnitoctiondrial markers.
Materials and methods
Fruiting bodics of l ronzetirosics were collected from the gound of a 40 years old
ivhite spruce (P. yluiicci) plantation ai the faIl of 1997. This stand is located in
Hrirrington. which is aprrosimately 150 km North-West of Montreal. Qc. Canada. The
sitc \vas convened from a mixea furest to a white spnice plantation. The stand was
di\.idc.d in 14 sections and fmiting bodies wrre sarnpled in each section. Fmitinj bodies
wcre indi~.idiially packed in paper bags and the X, Y coordinates of each fmiting body
w r c notcd ai the nearest meter. These coordinat& wrre plottrd on a map using ArcView
3.1. ( ES RI. Rrdlands. CA. US.). .A second sampling of 45 inviduals was done in the fail
of 19ClS; h i t i n g bodies w r e taken froni the infection centres localised in 1997. Fruit
bodics ircrc k p t in their hags ai air tcniperature during transportation. They were stored
indi~.iJually ai -70°C in brown paper bass. In 1997, 315 fmitins bodies were analysed
and JO n.t.rc analysed in 1999.
D\ :\ ~ ~ 3 . 5 cstracted directly from thiting body tissue usiny a niodi fied version of
.i prciicicol describcd by Zolan and Pukkila ( 1486). Approsirnately 5 mg of tissue was
rakcn iioiti elicii carpophore using a scalpel and placed in a I . h l Eppendorf vial.
.+\pprosiiiicitc.ly thc same quantity of diatoniaceous rarth (Sigma Chcmical Co.. St-Louis.
MO. C.S.) 2nd 100 pl o f extraction buffcr (100 rnM Tris-HCI pH 9.5. 7% CTAB. 1.4 M
h C I . 1% pdycthylene glycol 6000, 20 rnM EDTA and 0. 25 ?/n P-2-rnrrcaptorthanoi)
w r c iiddsd and the mixture was ground for 3 minutes using disposable Kontcs pestlcs
il 'KU-Canlsib. Toronto, ON. Canada). Thrce hundred microliters o r cstrriction buffer
u s sddcd 2nd itis tubes uére incubated at 65 'C for I h. Samplcs wcre cstracted using
-i( H )pl ptisliol: cliloroforni: isoamyl alcohol ( 2 j : X 1 ). vonexcd and centnfuged at 10 O00
S 2 tbr 10 niinutes. The upper phase was transtked in 3 1 .j ml Eppsndorf viai and DNA
1x1s prccipiriiied using 7.5 M ammonium acetatc and 600 ul cold isopropanol and placed
at -20°C for I h. DNA was pelleted by centrifugation at 10 000 S y for 10 min and was
i t d i c d t\.rth S I 0 L L I 70% ethanol. Pellet ivas dried in a Spoed-vac for 10 min and
rcsuspcndcd in 31 ul Tris-EDTA pH S ( 10 mhl Tris-HCI, pHS. 1 rnM EDTA). Result of
DN.4 cstrcicticln \vas verified through migration in 0.8% agarose gel. DKA w ï s diluted
I :!O ancf storeci rtt - L O T
PCR pririiers
Tlic PCR products generated using a senes of PCR primers were screened for
SSCP polyniorpliism. The first set of PCR primers found suitable for the analysis was
11 L Y ( CTCGGCAMTTATCCTC.AT.\.AG) and M L 6
i C.-\GT--\G.A.-\(;CTGCC.I\TT4GGGTC) (White and al.. 1990) coding for the large
niiiochorrdriril ribosomal sub-unit. The second set of prirncr rvas MS 1
( C.4GCAGTC.-\.-\G.A,.ITATT.AGTCA.ATG) and hl S Z (GCGG.4TTATCG44A-
TTX.4.4TA.K) ( White and al., 1990) coding for the small mitochondrial ribosornal sub-
unit. The third set of pnmen. it-BT-l j-f (GGAGCCAGCAGTACCGTG) and it-BT-490-
rc (CCTG;\.-\GT.ATGCGTTAGC) i\ as dcsigned froni P-tubulin szquenczs obtainsd from
m p l i tication and sequencing with universril pnmers BT- 1 a
(TTCC'CCCGTCTCC.KTTCTTCATG) and BT- 1 b
i G.ACG.AG.ATCGTTC.ATGTTGA..i\CTC) (Glass and Donaldson, 1995). The
iticniioc~cling conditions for pnmers MLj1ML6. and .LlSl!MS2 were: 36 cycles of 30
';CC 21 97'C. 30 scc at 5j°C. 1 min at '2°C; the reriction uas preceded by a 3 min -
~ii.ii;iruriirioii itcp at 9J'C and followrd by a 10 min slongation stsp at the end. .Annzaling
icriipr'r;lriirc \vas adj usted at 50°C for primers it-BT- 1 5 fiit-BT-49Orc and BT- 1 ai BT- l b.
.-\niph iiciition products neere separated on an agarose gel ( 1 .Y%) in I X TAE (TRIS
tccratc-EDT.4). stainsd in ethidium brornide and visualised under an CV lamp.
DS:\ cinipli fications and preparation of samples for SSCP analysis
D U was amplifird in 3 25 pl volume containmg I O mM Tns-HCl. 50 mM KCI.
1 .i r t i l l llgCIi: pH 8.3. 50 pM of each dNTPs (d.\TP. dCTP. dTTp. dGTP). 1 uM of
c;icti priniers and 1 L of Tcq polymcrase (Boehnnler Gmbh. Manheirn. Grrmany). Five
pl ai' PCR products were added to 3 pl of formamide buffer (0.05% bromophenol blue.
~ . i i Y ' , cyan01 in formamide) in a Safc-Lock Eppendorf 1.5 ml microfuge tube. Tubes
\\cri. pl:iccd in boiling water for 3 minutes and quickly chilled on ice. Six pI of this
prcidiict u s lorideci on the SSCP gel.
SSC P gel and rlectrophoresis parameten
\IDE Hydrolink (Mandel Scienrific. Guelph. ON. Canada) gel was used. Gel
strcnptli \vas 0 . 5 S MDE and 0.6 X TBE (Tns-Boratc-EDTA). Five ml of MDE was
.idd~d to 2.1 ml of TBE buffcr 5 X and 17.6 ml of deionised water. Then, 120 pl o f 4
.ininionium persulfate 10 on and 9.33 pI of TEMED w r c mixed with the first solution
~ n d tiw gcl was câst using 3 peristaltic pump (Bio-Rad. Mississauga, ON, Canada) and
kcpt still for polymerisation for l h ot room temperature. The gel was coated with
tk lhond Pag film membrane ( Pharmacia Biotrch. Uppsala. Swrden).
Horizontal migrations were perfomed in a hlultiphor 2 Pharmücia slectroplioresis
iinii i .-\riicrsliani Phamiscia. Biotech. Uppsala. Swcdcn). Kerosenc was placed bctn-eçn
tlic iiiigration s ~ p p o n and coatinj membrane for higher trmpcrature uniformity. The
coiltitlg nicnibranr makcs handling sasisr dunny the staining procedure. Migation \vas
c m i d out in 0.6 S TBE buffer. under constant temperature and pocvcr. Electrophoresis
u s carricd out at 3W (start 9 rnA; 270 V, end 7 mA; 340V) at 10°C for 15 h for PCR
pruduct ~cncriltcd with prirners it-BT- 15 f-it-BT-190rc. Products ycnerated with pnmers
\ I L S \ I L O tvt'rt' rtxolveil at ?CI; (stan S m.\, 2 2 0 V, end 6 , j mA, Z6W) at 10°C fior
I S II. wticrclis products yencrated with primers 4IS I and MS 2 were resolved under the
s m c conditions as D-tubulin product excepted for temperature which was 4.0°C. Gels
w r t . silver stained with Bio-Rad Silver Stain Kit according to the manufacturer's
instriiçtions.
.-\llcIcs w r e scored nianually. PCR products obtained with pnmers it-BT-l 5f and
11-BT-4Wrc uere sloned using the vector pCR 2.1 according to the manufacturer's
instructiori (Invitrogen. Carlsbad. CA. US.). Each clone was placed on SSCP before
scqumcing in ordcr to malie sure that the propcr Fragment would be sequenced. The
clorics nVcrs wqucncrd using it-BT- 15 f on an AB1 373 automatic scquencer ( Applied
Hiosystcni. Fostcr City. CA. US.). PCR products generated with ML S!ML 6 and
US 1 >fS 2 tvcrc dircctly sequenced on an j73. Al1 sequences were deposited in
GcriBrink (triblc 3).
Results
9
.A total of 70 alleles were observed at the P-tubulin locus. All sequences were
dcposited in GcnBank (Table 3). Ail 3 1 S individuals appeared to be hetrrozygous. On the
cd. tliis phenomcnon appeared as a pattern of four bands for each individual. Xo
rcçomhiriaiion 01' an? of the four band patterns was observed. Ho~vever. there was
competç linkagc bctwen the alleles. for esample allele "a" was always found with "b"
1io.L.r with '-c" or "d" (figure 1). This allslic distribution could be explaineci either by the
pwscncc ~ f t \ v o P-tubulin loci. boih of which are homozyyus.
Figure 3: Illustration of the pattern obskrved on the gels indicating that
recomhination was not taking place ai the beta-tubulin locus
.-\llcics c i iind I j w r e afways found in association wi th each othcr. ir 1vi.1~ never found with
( 7 cir c i ;incf 1 ice versa.
- i wo riiitocliondrirtl alleles were hund at each of the two mitochondriaI loci in the
ti;irririgton plantation. resulting in thrrr niitochondnal haplotypes. Gcnotypic and alldic
ticqiicnçies arc shown in tables 1 and 2 . respectiveiy. As can be obsenzd in tablc I some
m ~ i p l c s sliiircd thci sanie P-tubulin haplutype but dilfercd in their niitochondrial - l i q lotypc. ~ n d lice versa.
TIic spatial distribution of the carpophores and their mitochondrial haplotypr.
gcriot).pc.s is shown (fi;. 2). The clona1 nature o l the fungus is cleariy seen as identical
tiiiplorypcs c m bc idcntitied in clusters in the plantation.
Tableau 4: Frequencies of the different genot!.pes found in a Irioirotirs tortieritosirs
population in a white spruce stand of western Quebec
'Thc genotypr is represented by letters. The first letter corresponds to the mitochondnd
hiiplotypc rit the small sub-unit locus. The second ierter rekrs to the mitochondnal large
u h - u n i t lociis. The third and lounh letter relcrs to the P-tubulin loci. A total of 31s
irilfiuduiils w r e testcd.
--
Gr notypes and t heir tiequencies
Genotyprl Frequcnc y
b b i j 1 O.S6?6
-. I
a a k l 9.5 OO/o
Tahlcau 5: Allelic frcquencies for ML, MS and beta-tubulin loci, found in a
Iiiuirofirs torn~~iitusirs population of Harrington. Western Quebec
1';ihltlau 6: GenBank accession number for the alleles sequenced at ML, M S and
hcta-tubulin Ioci. in the basidiomycete Itrotiotus tonrrntosus.
Xlitochondrirrl sniall subunit
Figure 1: Graphical representation of the Rlitochondrial haplotypes round in the
if arrington plantation
Mitochondnal haplûtype :
% a :
" b :
Cloiiin- and sequencing o i the single strands within a pattern allowed us ro
itc~cniiiiic [tic coiiibination of bands belonging to cach hetsrozygots individual. In ordcr
icr culii;ii<: if [lie 'heterozygote' obssned on the gel cculd in hc t br a double-
tionio/>*gote. pti>logenetic analyscs w r e prrfonned. This hypothesis assunies that sach
indi~idiilil would c a r y two differcnt copies of the samc gcnc. Thr sight sequences
obi;iiiicd N crc nianually edited and aligned using Clustalw (Wisconsin Package Version
1o.0. Gcnctic Cornputer Group (GCG). Madison. Wisc. CS.). Scqucnces were highly
ccinscncd and only 15 polymorphic sites were found. Phylogenetic analysis was done
iisirig PACP (GCG). it neirhbor-pining trec was inferred for the P-tubulin locus using the
Siiiiiira 7 - p a r a n 1 t ~ r option and niidpoint rooting. Branch support was cvalurited by 250-
hootstr;ip. Tito-ii~iridred and fifi): bootstrap werc used to rcduçcd thc compu[inr tirne.
siricc hootstriiping 1s ii randorn statistical resampling of the data set. using a higher
nunihcr of hootstraps w u l d not lead to si_enificantly diffèrent rcsults. Two different
cliidcs w r e o b s m cd Cor this gcnr ( fisure 3).
Tlit. \xiial inspection of the jenotypes within the plantation does suggrst that
clonai distribuiioii ts the prevalent mode of distribution of the tùngus within the stand.
Soniti cliistcr of gcnotypes u-cre ïound to be very tightly grouped while others wouid
coi cr 3 lx, w r arca.
Figure 5 : Phylogenetic relationship nrnong the Harrington population at the beta-
tubulin gcnc
Vciglibor-joinir~g tiee infercd from 8-tubulin ssqusnce using Kimura '-parameters
iiiodcl. Results of the 250 bootstraps indicate branch support. midpoint rooting was usrd.
1:igiirc ! ph y l o g c t ic relat tonship arnong the Harrmgton population at the P-rubulin çenr.
\cibor-jolnrng trcc in kr rd tiom 0-tubulinc sequence using Kirnura ?-parameter rnodcl. Results of
rlic 2 5 0 bi~o~straps indicarc. brrinch support. midpoint roorinz wris uscd.
Discussion
The large nuniber of alleics o b s c n d . 7i) aliclss at the p-tubulin loci and two at
cacii niitoçliondnal loci. is very in fornative. One would espect a old invasion ro rssult in
a siiidt nunibrr of large jenet whereas a reccnt invasion would result in large number of
jniall zcricts. The large number of alleles and gcnotypes encountzrcd in this stand does
stiggcs[ J rccent invasion by the pathogen.
.At the rnitochoncirial level only tuu alleles were found at each locus (both
sonsisrcd of point mutations) suggestinj that mutation rate would be relatively constant
snioriy [tic t\vo mitochondnal loci used in this study. Only three mitochondrial
Iiaplotypcs w r e observed. which suggests that mitochondrial recombination is not
~wxiring mithin this plantation. The finding o i the missing haplotypr would sugzest thnt
niitochoricind rccornbination is occuring. This situation has been observeb in other forest
plitliogcris (Srivills and al., 1996, Sriville and al.. 19%)
Ttic mutation rate at the nuclear locus Kas much higher than observed at tlic
rnitochondnrtl loci. Twenty alleles were found rit the P-tubulin locus, al1 alleles differed
by point niutcitions. no indei or other kind o l mutaiions events was observed. These
resiilts w u l d suggest that the types of mutational wents ocurring at the mitochondrial
lind nuclcar genornc are similar.
Mhat W ~ S thou~ht to be a single P-tubulin locus appears to be two P-tubulin loci.
Thc duplication of p-tubulin loci has been obserkd before (Tsai et al. 1994). .Absolutely
rio reconibination was been observed in our sampliny. at these nvo loci. This result could
indiccitc ttictt ihese loci are in tandem repeat or that negative seleciive pressure acts
;lgainst thc recombinant. The previous studies indicatinp the occurrence of more than one
c u p ) o i rhc 0-tubulin gene did not alloa. to draw conclusion regarding the position of
these copies within the genorne. If one would accept the hypothesis that these two genes
rlrc i n ta~idt'tn repcat. ihen anoilisr problsrn anses: tlis lack of hstsrozygotrs. Tlir hct thai
the cntirc piipularion is homozygous at these two P-tubulin loci rrrould indicate that no
riiconibinatioii ( sesud reproduction) occurs within the population. This obsenarion in a
tcintpolar biisidiomycrte would seem rather unlikely. since sexual reproduction can only
occur bctwiien gsnstically different individuals.
In drcfcr ro bc able to draw ri reliable conclusion from an auto-correlation andysis
on r!iis diitli set. one W O L I ~ ~ have to know the real nature of lhcse two P-tubulin loci. Are
t l i t x gcncs linked or not to onc another ? Are thesr txo loci. both functional copies of
the Il-tubulin gcne. Bccriuse rhese questions cannot be answered using our results. the
;i~i!o-corrcllition analysis \vas not psrfotmed. However. visual inspection of the
distribution of the genotypes within the plantation secn~ed to suggest that primary
irifcction wiis the rcsult of spore sennination followed by wgetative growth.
Litera ture cited
Girbolcito. M.. Cobb. F.W.. Bruns. T.D.. Otrosina. W.J.. Popenuck. T.. Slaughter, G.
1909. Gcnrtic structure of Hererobasidiori umoszrtri in white fir monality center in
Mi fornia. Phytopathology. S9:546-554
Glierbi H. Delriruelle C. Selosse M. Manin F.. 1999. High genctic diversity in a
pcipiilatton of the cctomycorrhizal basidiomyccte Lriccciriu m i e r ~ ~ r i u u in a 150-yrar-
old bccch forest. Moi Ecoi. 8: 2OO3-2Ol3.
Glass. S. L.. and Donaldson. G. C.. 1995. Developement of primer sets designed for
lise \vit11 PCR to arnplify conserved genes from filamentous riscomycrtes. Xppl.
E:rii,iron. 'Llicrobiol.. 6 1 : 1323-1 330
k n l . D.L. 1988. .A primer o f Population Genetics. 2' id. Sinauer Associates, Inc.
Siinderimi. blriss.. USA
I.c\i 1s. K.J.. Hansen, .M. H. 1991. Vrgetativs compatibility groups and protein
clcctrophoresis indicate a role for basidiospores in spread of Irrottorirs tonrenrosics in
jpruce toresr of British Columbia. Can. J. Bot. 69 : 17%- 1763
Oriiii. hl.. Iwahana. H.. Kanazawa H .. Hayashi. Sekiya. T.. 1989. Detection of
pol~morpliisrns of human DNA by gel clectrophoresis as single-strand conformation
polynorphisms. Proc. Natl. Acad. Sci. CSA. 56, 2766-2770.
SLi\ iilc. B. I.. Yoell. H.. Anderson. J. B. 1996. Genetic eschange and recombination
in popiilations of root-infecting fungus .4rnlillurru gallini. Mol. Ecol.. 5 1485-497
Saullc. B.J.. Kholi, Y., Anderson, J.B., 1998. MtDNA recombination in a natural
ppula~ion. Proc. 'latl. Acad. Sci. USA, 95 : 133 1 - 1335
Sriiiili. ML.. Bruhn. LN.. Anderson. I,B.. v92. The funyus .-lrnlillaria btilboscl is
mm- the largest and oldest living organisms. Mol. Ecol. 356: 428-33 1
1's;ii. H.-F.. et al. 1994. Evolutionary diversification of fungal endophytes of tall
kscuc g r a s by hybridization ~ v i t h Epichloe species. Proc. Siitl- Acad. Sci. USA.
1 542-2546
Khitr. T.J.. and 31.. 1990. Amplification and direct sequcncin~ o l fungal ribosomal
RS.4 gcnes for pliylogenetics. in PCR protocols : -4 juide to meihods and
applications. YI. Innis. Editor. Acadrmic Press : Sm Diego. p. 3 15-32?
Mliitncy. R.D.. 1977. P&ponis ronierrrostis root rot of coni fers. Departement of
Fisherics anci Environnement.. Canadian Forest Service., Sault S te. Maris, Ontario..
Forest- Teclinical report 1 S. Il p.
Zolan. ME.. Pukkila. P.J.. 1986. Inhrritançe of D N h rnethylation in Coprtritis
C W Z L ~ ~ L ~ ~ L S . \ I d . Cell. Biol. 6 : 195-200
Discussion et conclusions générales
Nos travails siir le diagnostic rnoli.culaire du champignon pathogène I.
rotwirroszrs nous permettent maintenant d'identifier à partir de son tissu végétatif ou à
partu des carpopliorcs ce champignon. Cette capacirti de pouvoir identifier le champignon -
3 partir d'tkhantillons environnementaux sans rivoir à faire de cultures ;i des
rtipercussions ividrntes. par exemple pour d?teminer si un site est infect6 ou non. Pour
I'idcntificatiiin de carpophores il est préférable d'utiliser des spécimens frais sur pied. La
qualit? dc l 'ADN obteiitie était suffisammeni bonne pour qu'il n'y ait pas d'interfirence
J U riii.eau Je la riaction PCR. Ce protocole a i t k appliqué à d'autres espkces du senre
Iiiotioriu- c l i l'espèce Plreflu~tis prtzi. et i l est donc possible de différencier avec succ;ls. [.
rorw~tro.stts dc ses cspkces saurs.
L'cirnplification de l'ADN de différenrcs espkcrs du genre 1tzorzom a l'aide
d'aniorces dont les siquences avaient préalablement été publiées a permis la fabrication
J'aniorces spécifiques qui permettent l'amplification sélective de l'ADN de i'l.
tovrerrrostts. Cette rkalisation ne constitue pas un fait d'importance en biologie
rriol~culairc puisque la même chose avait déjà i té rkalise pour plusieurs autres espèces. de
gcrircs sanés. Cependant. au niveau mycolojique et sylvicole l'impact de cette
d k ~ o u v ~ n e peut avoir des répercussions importantes. La réalisation du test, c'est-i-dire
dc la recoltc d'un spccimen jusqu'à son identification peut désormais se Faire en moins de
14 hcures. Cela constitue une amélioration substantielle. si l'on compare avec la culture
dit champignon qui a elle seule ne permet pas à coup sûr d'identifier le champignon et
prend un minimum de trois semaines. De plus! ['optimisation de l'extraction d'ADN
directenient à partir de bois infecté permettrait d'appliquer dans les centres de
iransfomation du bois au dans les plantations sur des arbres vivants.
Toutes les siquences générees ont ensuite été utilisées dans une titude
phylogénktique entre différentes espèces au sein du genre ho~iotzis. Les séquences ont été
comparées entre elles afin de déterminer lesquelles présentaient le plus de similitudes.
Lcs ~ ~ I I c I L ~ ~ ~ L ~ ~ ~ s dr: CL'S risultilts indiquent que les espèces I. iorwiirosrrs ct I. lepori~iiis
sont $nit iqucnient rapproc htirs et constituent un groupe distinct des autres cspéces du
gmrc. .Au pllin Ccologique. i l s'agit des deux seules espèccs du genre à avoir la capacité
d'inkctcr les conikrcs. Toutes les autres espéces du yçnrr sont associies aux rsprces
t~~iilliics. Ccpcndant. i. t-mhurirs. qui est isolé des espèces infectant les feuillus. au nivcau
pliylogCnCtique. est Ir: seul i Ztrc un saprophyte et non un parasite. Il est donc apparent .
qiic les espciccs du genre I)ro~iotiu se sont spécialisis sur lcurs hôtes et qu'il est probable
qiic l'on retroiivc un parallèle entre lëvolution des espices d'ltiottotiis et celles de leurs
Iiiitcs. Cepsndant. une telle itude demanderait un nombre beaucoup plus grand
d'csp2cr.s. L'analyse phyloghtitique n'apporte donc rien de nouveau au niveau pratique.
p~iisyu'cllc ne fait que supporter les obsenations ico1ogiqur.s. Il est néiinmoins
intcrcssant de reniarqucr que les différences observées sur le plan écologique se
retrouvent sur lc plan rnolt'culaire. et cela dans un groupe de gènes qui n'est en rien
inipliq~ii daris la digradation du substrat. et qui n'a rien à voir avec la niche t:cologique
oççiiptc. Ceta pourrait indiqiicr que In divergence entre les espèccs est des plus anciennes
puisqui. lcs autres gfncs de l'organisme ont continué i évoluer de façon divergente et
rctlktc ces mémcs différences. De plus, cette analyse suggère que la même approche
p~iissc. Ctrc utiliske pour des espèces dont les niches écolo~iques sont inconnues afin
ci'ci'kctucr des regroupements ciicologiques.
Lc sccond volet de I'itude consistait à itudier le mécanisme de propagation du
ctianipignon. Ce mécanisme peur etre soit sporal ou clona1 ou mixte. Dans le cas d'une
propagation strictement sporale on s'attend 1 ce que tous les différents génotypes trouvés
soieni distnbiiL's aléatoirement dans la plantation et qu'on retrouve différentes
combinaisons d'alléles. Dans le cas d'un mode d~ propagation clonal on s'attend à avoir
un gCnotypc unique pour tous les carpophores. Dans le cas d'un système mixte on
s'attcnd i avoir plusieurs petits foyers de carpophores identiques. Dans le but de
dtk-miner les génotypes. nous avons utilise deux marqueurs mitochondnaun et un
marqueur nucikaire. Les marqueurs mitochondnaus sont toujours présents à l'etat
tiaploïde chez les champipnons puisqu'ils sont transmis par un seul des parents. et
pcmicttent unc analyse simple. Les gènes nucléaires peuvent être observés à l'état
diploïde. et coniportent donc 1 allèles identiques ou différents. Tous les allèles
i t i i toc h a n d i a u s et les allèles nuclCaires retrouvés dans les proportions les plus
iniponantcs ont i t t i sequencés.
Xous connaissons très peu de choses sur la biologie et I'épidémiologie de ce
dixtipignon. pourtant un pathogène d'une espkce ligneuse commercialement importante.
S o m 3pproslic. qui consistait à cartographier chaque carpophores pour pouvoir relier le -
cr'iiotypc 2 1s localisation dans la plantation. nous donne une base de donnies puissante - des s~qutxices au niveau des populations. L'une des hypothèses que nous avons testées
CS: que le champignon se reproduit de façon strictement clonale localement. comme c'est
Ic. 53s pour d'autres basidiomycètes comnie I 'millaire (Ar»iillrrnc~ hlilbos(r) (Smith et
. i l . 1092) . 'iotre Aude nous a permis de rejeter cette hypothCsc.. I I semble plutôt que la
piyulai ion d ' I iorw~itosus itudiCe ait dinvé de spores sssutks suivi de propagation
v2-ciaiivr. En effet. la présence de plusieurs allèles diffircnts au gkne nucléaire de P- riibiilinc cntrc les différents genets est compatible avcc cette hypothèse. En plus. nous
dwns obsrn.C la présence de mitochondries difirentes chez des individus possédant Ir
rnPnic giriot ype nucléaire. Cette observation laisse croire qu'une anastomose a pu se
prodii i rc entrc des hyphes haploïdes possédant di ffcren te combinaisons d'allèles
riiii 1cairc.s ct mi toc hondriaus. Par contre. notre étude niontrc clairement que la
rcpr~duçtion. nprk colonisation. est asexués. En effet. nous avons observé que les
slirpoptiores possédant une composition génétique identique sont généralement regroupés
spiiti~lcnicnt. Cependant. ces genets sont assez restreints si on les compare a ceux de
1'~miillairc qui couvraient plusieurs kilomètres carrés (Smith ct ai.. 1992). Les plus gros
ccncts qui: rious avons observés dans la plantation avaient un diarnktre de 20 mètres. Si
l'on cstirnt. que la croissance radiale du champignon est de 20 centimètres par armée,
coiiiriic c'est le cas pour Pliellimis iveirii (Nelson et Hartrnan. 1975). qui est
gCrii;iiqusnient très proche d'l. [ontenrosia. ont peut estimer la colonisation du site à
~ppro\-mativement 70 u s . Or i l se trouve que ce site quc ce site a été converti en
pliinta~wn d'ipinstte i l y a environ 50 ans ce qui suggère que l'infection au moment
iiiCnic ou avant que les semis n'aient Gte plantés. La préscnce d'un grand nombre de
c?iiot~pes indique qu'il s'agit d'une infection relativement récente. La compétition - intraspt'cifique entre les senets provoque une diminution du nombre genets avec le temps
( Hanscn r.1 Hanielin. 1999). Un des aspects appliqués de notre meilleure connaissance du
processus dc dispersion est de savoir qus le site étudii a été colonisé ;le ~lovo par des
bssidiosporcs. et que la propagation secondaire s'est faite de façon végétative. Unc
conclusion similliirc avait Cté rendue par Lewis et Hansen (1991) en utilisant les profils
protiiqucs.
Lnc analyse phylogénétique a ensuite Cté eflectuie pour le gkne nuclkaire chez
Iqucl lin graiid nombre d'alléle (20) a été trouvé. Cette analyse a révélC la présence de
deus clades pour le gène nucléaire. C'est-à-dire qu'il semble y avoir deux onginrs
dii'ftircntcs pour ce gène dans ce< organisme. indiquant qu'il y aurait présence de deux
gt5ir.s rrks sr.mblab1t.s chez cet organisme. De plus, aucune recombinaison n'a 6ti
obscn.ti entre ces deux génes. L'absence de recombinaison est très surprenante et
wgyirc qu'il existe une pression de sélection négative contre les recombinants ou que les
dciis girics soient placés trks prks l 'un de l'autre. Si les deux gènes sont effectivement
p i ~ i c & ir5s p r k l'un de l'autre. les Cvénemsnts de recombinaison sont alors très rares et i l
csi alors possible que nous n'ayons obsewé aucun de ces rvénemcnts car notre
population cst trop petite ( 3 1 S individus).
.-\fin dc risoudre I'ambiguïtti au niveau du gène P-tubuline. i l serait possible de
procidcr j. unc analyse Southem en utilisant le fragment PCR comme sonde et en
digirant l'ADN génomique à l'aide d'une enzyme de restriction coupant l'ADN en un
scul sitc. C C site Ctant situé dans l'extrémité 3' de la séquence. L'analyse d'un deuxième
riiarqucur nucléaire permettrait peut-ktre de mieux comprendre les résultats obtenus avec
Ic locus P-tubuline evou d'effectuer l'analyse d'quto-corrélation spatiale qu'il n'a pas été
possible d'effectuer i cause du manque d'information sur la nature du gène f3-tubuline
unon. cl ic7 notre champi,
Bibliographie
1 . Haiiscn. E. et R. C. Hamelin, 1999. Population structure of basidiornycetes, in
Srructiirc and dynarnics of fungal populations. J . .J. Worrall. Editor. . Kluwcr
--!cacit.iiii Publislier: Dordrecht, The Netherlands.
2. Lcivis. K. J.. Hmscn. M. H. 1991. Vegrtativs cornpatibility groups and protein
clsctrophorcsis iiidicate a role for basidiospores in spread of Ino~torzis ro»xe>itosus in
spnicc torest of British Columbia. Can. J. Bot. 69 : 1756- 1765
. Sclsori. E . E.. ct Hanman. T. 1975. Estirnating spread of Poria i t w i i in a high-
clcvrition. rnissd conifer stand. Journal of Forestry. 73: 131 - 142
4. Sniitli. 41. L.. Bnihn. J. N.. Anderson. J. B.. 1992. The fungus .4rnri[/uricr btrlhosci is
m o n g rlie Ilirgest and oldest living organisms. Molecular Ecology 3%: 428-43 1