HAL Id: tel-01124050https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01124050

Submitted on 6 Mar 2015

HAL is a multi-disciplinary open accessarchive for the deposit and dissemination of sci-entific research documents, whether they are pub-lished or not. The documents may come fromteaching and research institutions in France orabroad, or from public or private research centers.

L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, estdestinée au dépôt et à la diffusion de documentsscientifiques de niveau recherche, publiés ou non,émanant des établissements d’enseignement et derecherche français ou étrangers, des laboratoirespublics ou privés.

Impacts du design de vecteurs dérivés du VIH-1 et de lamachinerie de réparation de l’ADN sur l’expression

lentiviraleGwenola Manic

To cite this version:Gwenola Manic. Impacts du design de vecteurs dérivés du VIH-1 et de la machinerie de réparation del’ADN sur l’expression lentivirale. Biologie cellulaire. Université Paris Sud - Paris XI, 2012. Français.�NNT : 2012PA11T039�. �tel-01124050�

Université Paris XI

Ecole Doctorale de Cancérologie

Thèse de Doctorat

Pour obtenir le diplôme de

Docteur en Biologie Cellulaire et Moléculaire

Présentée par

Gwenola MANIC

Impacts du design de vecteurs dérivés du VIH-1 et de la

machinerie de réparation de l'ADN sur l'expression lentivirale

Thèse présentée et soutenue publiquement le 28 septembre 2012

Devant le jury constitué de

Pr. Christian AUCLAIR Président du jury

Pr. Javier PEREA Rapporteur

Dr. Stéphane BASMACIOGULLARI Rapporteur

Pr. Uriel HAZAN Examinateur

Dr. Stéphanie BURY-MONE Examinatrice

Dr. Jean-François MOUSCADET Directeur de thèse

A ILIO

&

A ma famille

REMERCIEMENTS

Je souhaiterai remercier chacune des personnes qui a contribué, à sa manière, de près ou

de loin, au sein du laboratoire ou à l’extérieur, à l’aboutissement de ce travail de thèse.

Je tiens à exprimer ma gratitude aux membres du jury pour l’honneur qu’ils m’ont fait en

acceptant d’évaluer mon travail de thèse ainsi que pour l’intérêt qu’ils y ont porté.

Je remercie tout particulièrement le Professeur Christian Auclair qui a accepté de présider

le jury de cette thèse et de m’accueillir une seconde fois au LBPA pour que j’y réalise ma thèse.

J’adresse mes sincères remerciements au Professeur Javier Perea et au Docteur Stéphane

Basmaciogullari pour leurs commentaires enrichissants dont a bénéficié ce mémoire ainsi que

pour leur gentillesse.

Je suis reconnaissante envers le Docteur Jean-François Mouscadet d’avoir accepté de

faire partie de mon jury de thèse malgré son départ du laboratoire. Je le remercie également de

m’avoir m’accueilli au sein de son équipe malgré ma situation délicate et pour son soutien

financier lors de ma première année de thèse.

Je tiens à remercier sincèrement le Docteur Stéphanie Bury-Moné pour son encadrement,

sa disponibilité, sa rigueur, son enthousiasme et ses idées, ainsi que pour les nombreuses

discussions scientifiques et personnelles que nous avons pu avoir tout au long de ces quatre

années de thèse.

Je remercie le Professeur Uriel Hazan pour ses nombreux conseils avisés.

Je tiens à remercier l’AFM d’avoir financé mes travaux de thèse, ainsi que les donateurs

de cette association qui contribuent au soutien des jeunes chercheurs.

Je remercie le Docteur Malcom Buckle pour son soutien financier aux projets initiés au

sein de l’équipe du Docteur Jean-François Mouscadet.

J’adresse mes remerciements au Docteur Yegor Vassetzky et aux membres du laboratoire

« Signalisation, noyaux et innovations en cancérologie » de l’institut Gustave Roussy pour leur

accueil et leur gentillesse lors de mon apprentissage de la technique FISH 3D. Je souhaite

remercier plus particulièrement le Docteur Andrey Pichugin pour m’avoir former aux bases de

cette technique avec autant de gentillesse, passion et de générosité.

Je tiens à remercier chaleureusement le Docteur Aurélie Maurin-Marlin de m’avoir

transmis son savoir-faire avec gentillesse et générosité, et de m’avoir appris les rudiments de la

vie au P3, et c’est peu dire…

Je remercie Fanny Laurent pour sa gentillesse, son humour et ses délicieux macarons…

Je remercie chacun des membres du laboratoire pour leur accueil, leur contribution à

l’aboutissement de ce travail et l’ambiance au quotidien, au P3 ou ailleurs. Merci à Manale,

Arzu, Gladys, Chiara, Elisa, Corinne, Xiao-Ju, Marie-Christine… Merci à Hervé pour son

humour et ses conseils incisifs. Merci à Fred, Olivier et Alex pour l’ambiance au P3 et leurs

nombreux conseils. Merci également à Sylvain pour ses conseils en qPCR. Je souhaite aussi

remercier Christine pour ses conseils avisés en Western-blot.

Un grand merci à Aurore et Victoria pour leur amitié et leur soutien…

Je tiens à remercier en particulier Soundasse pour son sourire, sa bonne humeur à toute

épreuve, son soutien et ses leçons de courage.

Je remercie Maria pour son soutien, sa gentillesse et ses précieux conseils scientifiques et

personnels, qui m’ont tant aidé... Merci également à Aména et Didier.

Je tiens à remercier Lorenzo pour ses talents d’écrivain et ses conseils avisés, qui ont

permis la publication de notre travail. Merci également à Nicole.

Je remercie mes amis : Rocco, Camille, Fred, Eugenia, Alfredo, il piccolo Alejandro,

Charlène, Adrien, Neri, Sylvia, Saverio, Nath, pour leur humour, leur soutien et les inoubliables

moments passés ensemble autour de délices des quatre coins du monde, rue Brillat Savarin ou au

bout du monde… En espérant qu’ils puissent se renouveler autant que possible…

Je tiens à remercier de tout cœur mes parents et mes frères, sans qui je n’aurai jamais

parcouru ce long chemin. Je les remercie pour leur soutien infaillible. Merci également à Sarah et

Carole…

Je remercie Ilio, qui m’a donné la force de débuter et poursuivre ma thèse. Je n’aurai pas

de mots suffisamment forts pour lui exprimer combien ma formation scientifique et mon bonheur

personnel lui doivent… A nous la dolce vita…

Enfin, je remercie celles et ceux que j’aurai oublié de nommer dans ces remerciements, et

les prie de m’en excuser.

RESUME

Une meilleure connaissance des déterminants viraux et cellulaires impliqués dans la

régulation de l’expression lentivirale est essentielle pour (i) maitriser l’expression d’un transgène

dans le cadre d’un transfert de gène et (ii) mieux comprendre l’absence/la perte de l’expression

du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) observé en cas de latence virale

après infection. Dans ce contexte, les facteurs cellulaires impliqués dans la reconnaissance et la

réparation des cassures de l'ADN, activés dès les étapes précoces du cycle viral, pourraient

participer au contrôle de l’expression rétrovirale.

Dans la première partie de cette étude, nous avons généré une collection de vecteurs

lentiviraux codant le transgène green fluorescent protein (gfp) avec des design variés : promoteur

du VIH-1 [long terminal repeat (LTRs)] ou d’origine hétérologue [e.g., promoteur viral CMV

(cytomegalovirus), ou humain PGK (phosphoglycerate kinase)], intégrase native ou mutée, LTRs

natifs ou self inactivating (SIN). En particulier, nous avons caractérisé l’impact de l’insertion de

différentes séquences hétérologues au sein des SIN-LTRs sur l’expression du transgène gfp au

cours du temps dans un contexte compétent ou déficient pour l’intégration. Nous avons mis en

évidence un phénomène de modulation du niveau d’expression du transgène (d’un facteur 0,3 à

1,8; comparé aux vecteurs sans insertion) qui est dépendant de la séquence insérée et de son

orientation. L’expression transgénique résulterait donc d’une balance coûts/bénéfices associés à

l’insertion d’éléments aux extrémités des vecteurs qui pourrait déterminer le niveau d’expression

du transgène à partir de vecteurs modifiés.

Dans la seconde partie, nous avons réalisé une analyse systématique et comparative de

l’expression lentivirale au sein des cellules humaines de carcinome de côlon HCT 116 déplétées

pour le complexe Ku. Ce complexe, qui est essentiel à la survie chez l’homme et est impliqué

dans les processus de réparation de l’ADN, a été identifié comme une cible anti-VIH potentielle.

Nous avons mis en évidence que la déplétion en Ku induit une diminution de l’expression

précoce du VIH-1 de façon spécifique du LTR et indépendante de Tat. Même si l’action de Ku

nécessite l’intégration du VIH-1, sa déplétion ne modifie pas l’efficacité d’intégration virale

mais agit plutôt au niveau transcriptionnel. Da façon importante, la réactivation de l’expression

du transgène après traitement par l’activateur de NF-κB (Nuclear Factor κB), le TNF tumor

necrosis factor ) ou un inhibiteur des déacétylases d’histones, la trichostatine A est favorisée

par la déplétion en Ku. A l’inverse, en présence d’un niveau normal en Ku, les cellules

exprimant le VIH-1 seraient contre-sélectionnées dans le temps. Ainsi, la déplétion en Ku

pourrait promouvoir l’établissement d’un état (reactivable) de latence transcriptionelle associé à

une moindre contre-sélection des cellules transduites.

Les résultats issus de ce travail de thèse démontrent que l’expression lentivirale varie en

fonction de nombreux paramètres, dont (i) le design des vecteurs, (ii) le type cellulaire transduit

et son fond génétique, et (iii) le temps écoulé depuis la transduction, reflétant ainsi des

interactions différentielles entre le vecteur et son hôte.

ABSTRACT

An improved knowledge of the viral and cellular determinants implicated in the

regulation of the lentiviral gene expression is crucial (i) for a better control of transgene

expression in strategies designed for gene transfer and (ii) for uncovering the mechanisms of

viral latency observed after infection with the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)

and accounting for the absence/loss of HIV-1 expression. Cellular factors involved in the

mechanism of detecting/repairing DNA lesions are largely activated during the initial steps of

viral cycle and, thus, may participate in the control of lentiviral expression.

In the first part of this study, we generated a set of lentiviral vectors encoding for the

transgene green fluorescent protein (gfp) with various design: the original promoter [long

terminal repeat (LTRs)] or of heterologuous origins (e.g., the viral cytomegalovirus, CMV or the

human phosphoglycerate kinase, PGK), wild-type or mutated integrase and wild-type or self

inactivating (SIN) LTRs. By taking advantage of these constructs, we characterized the impact

of the insertion of distinct heterologuous sequences within SIN-LTRs on the expression of gfp

over the time in conditions of proficiency or deficiency for the integration. We put in evidence a

phenomenon of modulation of the level of the transgene expression due to the insertion (by a

factor of 0.3 to 1.8, as compared to vectors without insert) that was dependant from the nature

and/or the orientation of the insert. We speculate that a balance between the costs and the

benefits associated to insertion at the extremities of lentiviral vectors may dictates the level

expression of transgene from this engineered construct.

In the second part, we performed a systematic and comparative analysis of the lentiviral

expression on human HCT 116 colon carcinoma cells depleted from the complex Ku. This

complex, which is essential for the survival in humans and has a described role in DNA repair

process, has been previously identified as a potential target against HIV-1. Here, we showed that

Ku depletion induced a decrease of the HIV-1 early expression in a fashion that was specific for

LTR and independent from Tat. Although Ku action needed HIV-1 integration to host genome,

its depletion did not modify the viral integration efficiency but rather acted at transcriptional

level. Importantly, the reactivation of transgene expression by administering either the NF-κB

(Nuclear Factor κB) activator, tumor necrosis factor (TNF ) or the histone deacetylase

inhibitor named trichostatin A was favored in a condition of Ku depletion. On the contrary, in

presence of normal level of Ku, cells expressing HIV-1 displayed a high level of counter-

selection over the time. Thus, our observations pleased to favor the hypothesis that Ku depletion

promotes the establishment of a state of (reactivable) transcriptional latency associated to a lesser

counter-selection of transduced cells.

Altogether, the results obtained during this thesis demonstrate that lentiviral expression

vary depending on (i) specific vector design, (ii) the transduced cell line and its genetic

backbone, and (iii) the time elapse from transduction, as a consequence of modified interactions

between the vector and its host.

1

TABLE DES MATIERES

TABLE DES MATIERES .................................................................................. 1

LISTE DES ABREVIATIONS .......................................................................... 5

INTRODUCTION ............................................................................................... 9

I/ LE VIRUS DE L’IMMUNODEFICIENCE HUMAINE DE TYPE I (VIH-1) .......................................... 10 A/ GENERALITES ............................................................................................................................................... 10

1/ Historique : découverte du virus de l’immunodéficience humaine ......................................................... 10 2/ Classification ........................................................................................................................................... 11 3/ Pathologies associées à l’infection rétrovirale ......................................................................................... 13

a/ Cancers................................................................................................................................................ 13 b/ Autres pathologies .............................................................................................................................. 13 c/ Le syndrome d’immunodéficience acquise ......................................................................................... 14 d/ Rétrovirus non-pathogènes ................................................................................................................. 15

4/ Organisation génétique du VIH-1 ............................................................................................................ 16 a/ Génome et protéines du VIH-1 ........................................................................................................... 16 b/ Epissages des ARNm du VIH-1 ......................................................................................................... 18 c/ Eléments cis au sein du génome du VIH-1 ......................................................................................... 19

5/ Structure du VIH-1 .................................................................................................................................. 20 B/ LES BASES DE LA MULTIPLICATION DU VIH-1 .............................................................................................. 21

1/ Entrée : adsorption et fusion .................................................................................................................... 22 2/ La particule virale au sein du cytoplasme de la cellule hôte .................................................................... 23

a/ Facteurs de restriction ......................................................................................................................... 23 b/ Décapsidation, transport/trafic cytoplasmique .................................................................................... 24 c/ Transcription inverse .......................................................................................................................... 25 d/ Formation du complexe de pré-intégration cytoplasmique ................................................................. 26

3/ La traversée active du cytoplasme au noyau : l’import nucléaire ............................................................ 27 4/ Les étapes nucléaires du cycle de multiplication du VIH-1 .................................................................... 28

a/ Formation du complexe de pré-intégration nucléaire.......................................................................... 28 b/ Processus d’intégration ....................................................................................................................... 28 c/ Sites préférentiels d’intégration du VIH-1 .......................................................................................... 30 d/ Autres espèces d’ADN viral générées ................................................................................................ 32

5/ Expression ............................................................................................................................................... 33 6/ Assemblage, bourgeonnement et maturation des particules virales ........................................................ 34 7/ Conséquences de l’infection par le VIH-1 ............................................................................................... 35

a/ Mort des cellules infectées .................................................................................................................. 35 b/ Echappement au système immunitaire des cellules infectées ............................................................. 35 c/ Latence des cellules infectées ............................................................................................................. 36

II/ VECTEURS LENTIVIRAUX : LES LENTIVIRUS COMME VECTEURS DE GENES ..................... 36 A/ INTERETS DES RETROVIRUS COMME VECTEURS DE GENES ............................................................................ 36

1/ Importance des vecteurs rétroviraux dans le transfert de gènes ............................................................... 36 2/ Propriétés des rétrovirus et conséquences dans le design de vecteurs dérivés ........................................ 37

a/ Avantages liés à l’utilisation des rétrovirus comme vecteurs de gènes .............................................. 37 b/ Limites liées à l’utilisation des rétrovirus comme vecteurs de gènes ................................................ 39

B/ LA CONVERSION D’UN LENTIVIRUS EN UN LENTIVECTEUR : DEVELOPPEMENT & DESIGN .............................. 42 1/ Evolution du concept du design de lentivecteurs ..................................................................................... 42 2/ Production de particules lentivirales ........................................................................................................ 43

a/ Principe ............................................................................................................................................... 43 b/ Cellules productrices .......................................................................................................................... 43 c/ Concentration et stockage ................................................................................................................... 44

2

d/ Titrations ............................................................................................................................................. 44 3/ Développement de différentes générations de vecteurs lentiviraux ......................................................... 45 4/ Vecteur de transfert minimal ................................................................................................................... 48 5/ Stratégies pour l’amélioration des vecteurs lentiviraux : contrôle et sécurité de l’expression trangénique

..................................................................................................................................................................... 50 a/ Ciblage de l’entrée du virus au sein de la cellule hôte ........................................................................ 50 b/ Utilisation de vecteurs déficients pour l’intégration ........................................................................... 50 c/ Ciblage de l’intégration du transgène ................................................................................................. 52 d/ Isoler spatialement la cassette d’expression........................................................................................ 52 e/ Restreindre l’expression transgénique !de façon spatio-temporelle .................................................... 53 f/ Améliorer la terminaison de transcription du transgène ...................................................................... 53

III/ L’EXPRESSION LENTIVIRALE ET SA REGULATION ..................................................................... 53 A/ ORGANISATION STRUCTURALE ET SPATIALE DE LA CHROMATINE CELLULAIRE ............................................ 53

1/ Organisation de la chromatine cellulaire ................................................................................................. 54 a/ Différents niveaux de condensation de la chromatine cellulaire ......................................................... 54 b/ Dynamique de la condensation de la chromatine cellulaire ................................................................ 54 c/ Dynamique de la localisation nucléaire de la chromatine cellulaire ................................................... 55

2/ Exemple de séquences structurantes de la chromatine : les insulateurs................................................... 55 B/ L’EXPRESSION DU VIH-1 .............................................................................................................................. 57

1/ Organisation du 5’LTR, promoteur du génome viral .............................................................................. 57 a/ Le 5’LTR, un promoteur-enhancer puissant et très optimisé.............................................................. 58 b/ Organisation nucléosomale du 5’LTR ................................................................................................ 58

2/ Expression du VIH-1 à partir du 5’LTR et régulations mises en jeu ....................................................... 59 a/ Expression du VIH-1 à partir du 5’LTR intégré ................................................................................. 59 b/ Régulation de l’expression du VIH-1 par des structures secondaires de l’ADN et/ou de l’ARN viral63

3/ Expression à partir de l’ADN viral non-intégré....................................................................................... 65 4/ La latence du VIH-1 ................................................................................................................................ 66

a/ Mise en évidence................................................................................................................................. 66 b/ Définition ............................................................................................................................................ 66 c/ La latence post-intégrative .................................................................................................................. 67

C/ L’EXPRESSION D’UN TRANSGENE AU SEIN D’UN LENTIVECTEUR MODIFIE ..................................................... 69 1/ Promoteurs eucaryotes et régulation différentielle de la transcription .................................................... 70

a/ Différents types de promoteurs eucaryotes ......................................................................................... 70 b/ Régulation épigénétique de l’initiation de la transcription ................................................................. 72

2/ L’expression d’un transgène à partir d’un promoteur interne d’origine humaine ................................... 74 a/ La kinase phosphoglycérate ................................................................................................................ 74 b/ Organisation du promoteur PGK ........................................................................................................ 74 c/ Régulation de l’expression à partir du promoteur PGK ...................................................................... 74

3/ L’expression d’un transgène à partir d’un promoteur interne d’origine virale ........................................ 75 a/ Le cytomégalovirus ............................................................................................................................. 75 b/ Organisation du promoteur CMV ....................................................................................................... 76 c/ Régulation de l’expression à partir du promoteur CMV ..................................................................... 77

IV/ ROLES DE LA MACHINERIE DE REPARATION DE L’ADN LORS DU CYCLE LENTIVIRAL 77 A/ STIMULATION DES VOIES DE REPONSE AUX DOMMAGES DE L’ADN LORS DE L’INFECTION RETROVIRALE .... 78

1/ Signalisation et réparation des dommages de l’ADN .............................................................................. 78 2/ L’infection rétrovirale, un stress exogène qui stimule la DDR ............................................................... 80

a/ Différents niveaux de stimulation de la DDR par l’infection rétrovirale ............................................ 80 b/ Implication des kinases de la DDR après infection par le VIH-1 ....................................................... 81 c/ Phosphorylation de H2AX après infection rétrovirale ........................................................................ 82

B/ INTERACTIONS DYNAMIQUES ENTRE CYCLE RETROVIRAL ET MACHINERIE DE REPARATION DE L’ADN........ 83 1/ Etat actuel des connaissances sur les interactions entre cycle rétroviral et machinerie de réparation de

l’ADN .......................................................................................................................................................... 83 2/ Implication des voies de réparation des cassures double-brins dans le cycle du VIH-1 .......................... 85

a/ Les voies de réparation des cassures double-brin ............................................................................... 86 b/ Interactions des voies NHEJ et HR avec les différentes étapes du cycle du VIH-1 ........................... 87

3/ Implication de la machinerie de réparation dans le cycle lentiviral et remodelage chromatinien ........... 91 C/ ROLES DU COMPLEXE KU DANS LE CYCLE RETROVIRAL ............................................................................... 92

1/ Le complexe Ku ...................................................................................................................................... 92

3

a/ Identification des protéines Ku70 et Ku80 .......................................................................................... 92 b/ Gènes codant le complexe Ku ............................................................................................................ 92 c/ Caractéristiques de l’hétérodimère Ku ................................................................................................ 93

2/ Rôles de Ku ............................................................................................................................................. 96 a/ Réparation ........................................................................................................................................... 96 b/ Télomères ........................................................................................................................................... 98 c/ Transcription ....................................................................................................................................... 98 d/ Interactions de Ku avec les virus ........................................................................................................ 99

3/ Rôles de Ku dans le cycle du VIH-1 ....................................................................................................... 99 a/ Etapes pré-intégratives ...................................................................................................................... 100 b/ Intégration et localisation.................................................................................................................. 100 c/ Expression ......................................................................................................................................... 101 d/ Comparaison à un autre senseur des lésions de l’ADN : PARP-1 .................................................... 102

PROBLEMATIQUE ....................................................................................... 104

RESULTATS ................................................................................................... 107

I/ IMPACTS DU DESIGN DE VECTEURS DERIVES DU VIH-1 SUR L’EXPRESSION LENTIVIRALE

............................................................................................................................................................................ 108 A/ Contexte de l’étude .................................................................................................................................... 108 B/ Article : ‘3’Self-Inactivating Long Terminal Repeat Inserts for the Modulation of Transgene Expression

from Lentiviral Vectors’ (publié dans le journal HUMAN GENE THERAPY Methods, 2012, Apr;23(2):84-

97) .................................................................................................................................................................. 110

II/ IMPACTS DE LA MACHINERIE DE REPARATION DE L’ADN SUR L’EXPRESSION

LENTIVIRALE ................................................................................................................................................. 133 A/ Contexte de l’étude .................................................................................................................................... 133 B/ Article : ‘Impact of the Ku complex on HIV-1 expression and consequence of its depletion in the

establisment of viral latency’ (soumis au journal RETROVIROLOGY) ....................................................... 135

III/ IMPACT DE LA MACHINERIE DE REPARATION DE L’ADN SUR L’EXPRESSION DE

VECTEURS LENTIVIRAUX CONTENANT L’INSULATEUR CHS4 AU SEIN DE LEURS SIN-LTRS

............................................................................................................................................................................ 170 A/Contexte de l’étude ..................................................................................................................................... 170 B/ Résultats (non-publiés) .............................................................................................................................. 171 C/ Discussion.................................................................................................................................................. 173

DISCUSSION ET PERSPECTIVES ............................................................. 175

I/ IMPACTS DES DETERMINANTS VIRAUX SUR L’EXPRESSION LENTIVIRALE ....................... 176 A/ Impacts des déterminants viraux sur l’expression du VIH-1 ..................................................................... 176

1/ Perte limitée des cellules transduites par le VIH-1 en absence de Vpr .................................................. 176 2/ Etat de latence du VIH-1 des cellules transduites par le VIH-1 en absence de Tat ............................... 176

B/ Modulation de l’expression lentivirale lors de l’insertion de séquences hétérologues au sein de vecteurs

dérivés du VIH-1 ............................................................................................................................................ 177 1/ Impacts de promoteurs internes sur l’expression d’un transgène intégré ou non .................................. 177

a/ Le promoteur CMV induit une expression variable qui tend à être éteinte ............................... 177 b/ Le promoteur PGK induit une expression homogène et stable ......................................................... 178

2/Modulation de l’expression transgénique lors de l’insertion de séquences hétérologues au sein des SIN-

LTRs .......................................................................................................................................................... 178 a/ L’insertion dans les SIN-LTRs influence peu les étapes pré-intégratives du cycle lentiviral ........... 178 b/ Impacts de l’insertion dans les SIN-LTRs sur l’expression transgénique......................................... 179 c/ Hypothèses proposées pour expliquer l’atténuation de l’expression du transgène associée à l’insertion

dans les SIN-LTRs ................................................................................................................................ 180 3/ Augmentation de l’expression du transgène grâce à l’insertion de cHS4 .............................................. 181

4

II/ IMPACTS DES DETERMINANTS CELLULAIRES SUR L’EXPRESSION LENTIVIRALE ......... 182 A/ Impacts du statut en Ku sur l’expression du VIH-1 .................................................................................. 182

1/ Impact positif du statut en Ku sur l’expression du VIH-1 à court-terme ............................................... 182 a/ La déplétion en Ku n’affecte pas les étapes pré-intégratives du cycle viral ...................................... 182 b/ Impact positif du statut de Ku sur la transcription du LTR du VIH-1 .............................................. 183 c/ Régulations mutuelles entre Ku et p53 et impact sur l’expression du VIH-1 ................................... 184

2/ Impact négatif du statut en Ku sur la latence du VIH-1 ........................................................................ 185 3/ Hypothèses de modes d’action de Ku .................................................................................................... 186

B/ Impact positif de la déplétion en Ku sur l’expression transgénique à partir d’un vecteur lentiviral insulé 187

CONCLUSIONS .............................................................................................. 189

BIBLIOGRAPHIE .......................................................................................... 192

5

LISTE DES ABREVIATIONS

AAV, Associated-Adenovirus Virus

ADNc, ADN complémentaire

ADNg, ADN génomique

ADNdb, ADN double-brin

ADNni, ADN non-intégré

ADNv, ADN viral

ALV, Avian Leukosis Virus

AP1, activator protein 1

APOBEC3G, apolipoprotein B mRNA-editing catalytic polypeptide 3

ARNi, ARN interférence

ARNm, ARN messager

ARN pol II, ARN polymérase II

ARNr, ARN ribosomaux

ARNsb, ARN simple -brin

ARNsh, ARN short hairpin, ou ARN en forme d’épingle à cheveux courte

ARNsi, ARN small interfering, ou petits ARN interférents

ARNsn, ARN small nuclea, ou petits ARN nucléaires

ARNv, ARN viral

ASV, Avian Sarcoma Virus

ATM, Ataxia Telangiectasia-Mutated

ATP, Adenosine tri-phosphate

ATR, ATM and Rad3-related

Att, attachment sites

BAF, Barrier-to-Autointegration Factor

Bp, paire de bases

BRCA1, BReast CAncer 1

3C, Chromosome conformation capture

CA, Capside

CBP, CREB-Binding Protein

Cdk9, Cyclin Dependant Kinase 9

cf., confer, se reporter à

CGI, CpG island, ou îlot CpG

ChIP, Chromatin ImmunoPrecipitation

CHO, Chinese Hamster Ovary

cHS4, chicken hypersensitive site-4

CMV, Cytomégalovirus.Abréviation désignant le promoteur immediate early du CMV (PCMV)

cPPT, Central PolyPurine Tract

CTCF, CCCTC-binding factor

CTD, carboxyl-terminal domain

6

CTS, central termination sequence

DDR, DNA damage response

DIS, Signal de dimérisation de l’ARNg

DNA-PK, DNA-Protein Kinase

DNA-PKcs, DNA-Protein Kinase catalytic subunit

DNase, Désoxyribonucléase

DNTP, desoxy A/T/C/G tri-phosphate

DSB, Double strand break, ou cassure double-brin

DSIF, 5,6-dichloro-1-β-ribofurosuyllbenzimidazole riboside-sentivity-inducing factor

e.g., exempli gratia, par exemple

EIAV, equine infectious anemia virus

Env, Enveloppe

ETS-1, E26 transformation-specific 1

FISH, Fluorescent In Situ Hybridation

Gag, group-specific antigen

GFP, Green Fluorescent Protein

GRV, gammarétroviral

HAART, Highly Active Antiretroviral Therapy

HAT, Histone Acétyl-Transférase

HCMV, Cytomégalovirus humain

HCT, Human Carcinoma Tissue

HDAC, Histone DésACétylase

HERV, Human Endogenous RetroVirus

HMGA1/2, High mobility group AT-hook 1/2

HR, Homologous Recombinaison

HS, hypersensitive sites

HTLV-1, Human T-cell Leukemia Virus 1

IBD, Integrase Binding Domain

IDLVs, vecteurs lentiviraux intégrase-déficients

i.e., id, c’est-à-dire

IE, immediate early

I Bα, inhibitor of NF- B α-subunit

IN, Intégrase

IN1, INtegrase Interactor 1 (ou hSNF5)

INR, initiateur de la transcription,

IRES, Internal Ribosome Entry Site

KARP-1, Ku86 Autoantigen Related Protein-1

Kb, kilobases

KDa, kilodaltons

KBS, Ku Binding Site

LEDGF/p75, Lens Epithelium-Derived Growth Factor p75 splice variant

7

LSF, late SV40 factor

LTR, Long terminal repeat

LV, lentiviral

m.o.i., multiplicity of infection

MA, Matrice

MFI, Mean Fluorescence Intensity ou intensité (moyenne) de fluorescence

(Mo-)MLV, (Moloney) Murine Leukemia Virus

NC, Nucléocapside

NELF, Negative Elongation Factor

Nef, Negative factor

NFAT, Nuclear Factor of Activated T-cells

NF-κB, Nuclear Factor κB

NHEJ, Non Homologous End Joining

NLS, Nuclear Localization Sequence

Nm, nanomètres

NRE1, Negative Regulatory Element 1

Nt, nucléotides

N-TEF, Negative transcription Elongation Factor

OCT-1, Octamere motif 1

P53, tumor suppressor p53

PARP-1, Polyadenosine diphosphate(ADP)-ribose polymerase-1

Pb, paires de bases

PBS, primer binding site

PCAF, p300/CREB-binding protein (CBP)-associated factor

PFV, Prototype/Primate Foamy Virus

PGK, PhosphoGlycerate Kinase. Abréviation désignant le promoteur du gène pgk (PPGK)

PIC, PreIntegration Complex ou complexe de pré-intégration

Poly(A), polyadénylation

PPT, PolyPurine Tract

PR, Protéase

P-TEFb, Positive Transcription Elongation Factor B

Q-PCR, Quantitative Polymerase Chain Reaction

Rev, regulator of virion

RRE, Rev responsive element

RSV, Rous sarcoma virus

RT, reverse transcriptase, ou transcriptase inverse

RTC, reverse transcription complex, ou complexe de transcription inverse

RT-Q-PCR, Real-time-Q-PCR

SA/SD, Site accepteur/donneur d’épissage

SCID, Severe Combined Immune Deficiency

SIDA, Syndrome d’ImmunoDéficience Acquise

8

SIN-LTRs, Self Inactivating LTR

SNF-5, Sucrose Non Fermenting

SP-1, SV40-promoter specific factor

SIV, simian immunodeficiency virus, du sooty mangabey (sm) ou chimpanzee (czp)

TAR, TransActivation Responsive element

Tat, transactivator of transcription

TFII(D, H), transcription factor II (D, H)

TNFα, Tumor Necrosis Factor

TBP, TATA-binding protein

TRIM5α, TRIpartite Motif protein 5α

TSA, Trichostatine A

TSS, transcription site start, ou site d’initiation de la transcription

UCOEs, ubiquitously acting chromatin opening elements

UNG2, Uracil DNA Glycosylase 2

USEs, upstream enhancer element

VDJ, Variable, Diversité, Jonction

VIH-1/2, Virus de l’immunnodéficience humaine de type 1/2

Vif, Virion infectivity factor

Vpr, viral protein R

vs., versus

VSV, virus de la Stomatite Vésiculeuse

VSV-G, glycoprotéine G d’enveloppe du VSV

WRN, WeRNer syndrom

WT, Wild Type

XLF, XRCC4 Like Factor

XRCC4/5/6, X-Ray Cross-Complementing group 4/5/6

XMRV, xenotropic murine leukemia virus-related virus

YY1, yin and yang 1

9

INTRODUCTION

10

I/ LE VIRUS DE L’IMMUNODEFICIENCE HUMAINE DE TYPE I

A/ GENERALITES

1/ Historique : découverte du virus de l’immunodéficience humaine

Le syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA) fut observé pour la première fois en

juin et juillet 1981 dans deux rapports successifs du Centers for Disease Control and

Prevention (CDC). Ceux-ci décrivaient des groupes de jeunes hommes homosexuels atteints

d’infections opportunistes (e.g., pneumonie à Pneumocystis jiroveci) et de sarcomes de

Kaposi à New York et en Californie. Cette pathologie était caractérisée par une profonde

déplétion des cellules de l’immunité associée à des affections jusque-là observées chez des

patients immunodéprimés. Des cas similaires furent alors décrits en Europe de l’ouest ainsi

que chez des patients hémophiles et/ou transfusés par voie sanguine. Cette maladie pouvait

ainsi toucher des personnes jusque-là saines tels des homosexuels de sexe masculin et des

toxicomanes (par voie intraveineuse) et impliquait une transmission sanguine ou sexuelle, ce

qui permit de suspecter l’implication d’un agent infectieux de type herpes virus (i.e.,

cytomégalovirus) ou rétrovirus. Le candidat putatif était alors le HTLV (Human T cell

Leukemia Virus) décrit par le Dr. Gallo et des chercheurs japonais (Gallo et al., 1983).

L’agent causal du SIDA fut découvert en 1983 par le groupe de Luc Montagnier de

l’Institut Pasteur (Barre-Sinoussi et al., 1983), récompensé avec Françoise Barré-Sinoussi par

le Prix Nobel de Médecine et Physiologie en 2008. Cependant, ce nouveau rétrovirus, alors

appelé LymphAdenopathy Virus (LAV), ne sera officiellement reconnu être la cause du SIDA

qu’en 1984 après la description du même virus par d’autres laboratoires internationaux (Gallo

et al., 1984; Levy et al., 1984; Popovic et al., 1984) prenant le nom de virus de

l’immunodéficience humaine (VIH) en 1986 (Coffin et al., 1986).

Il existe au moins deux types de VIH de type 1 (VIH-1) et 2 (VIH-2) qui diffèrent de

part leur séquence codante [e.g., Vpr (viral protein R) et Vpx (viral protein X)] et leur origine.

VIH-1 est la cause prédominante de l’épidémie de SIDA et a évolué à partir d’un virus, le

Simian immunodeficiency virus (SIV), qui a franchi la barrière des espèces des chimpanzés

(Pan troglodytes, SIVczp) à l’homme (Gao et al., 1999). VIH-2, découvert en 1986 (Clavel et

al., 1986), est retrouvé principalement en Afrique de l’Ouest et provient du SIV du singe

mangabey (dit enfumé, Cercocebus atys, du sooty mangabey, SIVsm) (Hirsch et al., 1989).

L’isolement du virus causal du SIDA a permis de mettre en œuvre des mesures de

prévention rationnelles ainsi que de débuter la recherche d’inhibiteurs viraux efficaces. La

11

première molécule anti-rétrovirale découverte fut l’azidothymidine (AZT, ou zidovudine) qui

est un inhibiteur efficace de la transcription inverse in vitro (Nakashima et al., 1986).

Cependant, le traitement n’avait cependant pas de bénéfice chez le patient à long terme du fait

de l’apparition de résistances [e.g., chez 30 à 80 % des patients traités (Clumeck, 1993)].

Seule une combinaison d’au moins trois inhibiteurs (qui ciblent plusieurs étapes du cycle

viral, cf., § I.B), appelée thérapie anti-rétrovirale HAART (Highly Active Antiretroviral

Therapy), permet depuis 1996 de traiter les patients infectés par le VIH en empêchant leur

immunodépression et les infections opportunistes consécutives souvent mortelles (Moir et al.,

2011). La HAART permet de maintenir la virémie à un taux faible (cf., § I.A.3.c) mais les

malades traités ne guérissent pas : le virus n’est pas éliminé car il est peu/pas exprimé au sein

de réservoirs cellulaires(Moir et al., 2011).

Les dernières données épidémiologiques sur l’épidémie de SIDA dans le monde

fournies par ONUSIDA estimaient à 33,3 millions de personnes vivant avec le VIH en 2009

dont 2,6 millions nouvellement infectées cette même année. Grâce à une plus large couverture

de l’HAART dans le monde (principalement dans les pays développés), le nombre de morts

lié à la maladie est en diminution, s’élevant encore malgré tout à 1,8 millions de personnes en

2009. La zone la plus touchée par l’épidémie (en termes de prévalence, nouvelles infections et

de mortalité) est l’Afrique sub-saharienne, principalement en Afrique du Sud et au Botswana

(Source : http://www.unaids.org/globalreport/Global_report_fr.htm, de ONUSIDA).

2/ Classification

La famille des Retroviridae regroupent des virus enveloppés infectant les Vertébrés

(groupe VI de la classification de Baltimore). Les rétrovirus possèdent un génome diploïde

composé d’ARN simple brin positif non fragmenté qui est coiffé et polyadénylé pouvant

mesurer de 7 (Avian Leukosis Virus, ALV) à 12,5 (Walleye Dermal Sarcoma Virus) kilobases

(kb). Leur nom, qui débute par Retro signifiant « à reculons », se réfère au fait que le cycle de

réplication des rétrovirus est composé des étapes de transcription inverse et d’intégration de

l’ADN complémentaire (ADNc) double brin formé lors de la transcription inverse. Ces étapes

sont respectivement catalysées par les protéines virales, transcriptase inverse (reverse

transcriptase, RT) et intégrase (IN), contenues dans la particule virale (Vogt, 1997).

Les Retroviridae sont divisés en deux sous-familles et sept genres, comme indiqué

dans le tableau 1, selon l’homologie de séquence de leur reverse transcriptase, ainsi que leur

morphologie (forme de la capside), le site d’assemblage de la capside (membrane plasmique

12

ou cytoplasme), et la présence/absence de gènes auxiliaires qui distingue les rétrovirus

simples des rétrovirus complexes.

Tableau 1 : Classification de La famille des Retroviridae (Source :

http://talk.ictvonline.org/files/ictv_documents/m/msl/1231.aspx, du International Committee

on Taxonomy of Viruses, ICTV).

Sous-familles Genres Prototype Espèces à tropisme humain

Structure

du

génome

Orthoretrovirinae

Alpharetrovirus Avian Leukosis Virus

(ALV) S

IMP

LE

S

Betaretrovirus Mouse Mammary

Tumor Virus

Gammaretrovirus Murine Leukemia

Virus (MLV)

Xenotropic Murine leukemia

virus-Related Virus (in vitro)

Epsilonretrovirus Walleye Dermal

Sarcoma Virus

CO

MP

LE

XE

S

Deltaretrovirus Bovine Leukemia

Virus

Human T cell Lymphotropic/

Leukemia/ Lymphoma Virus

HTLV-1, -2, -3 et -4

Lentivirus

Human

Immunodeficiency

Virus type-1 (HIV-1)

HIV-1 et HIV-2

Spumaretrovirinae Spumavirus Simian Foamy Virus Prototype/Primate foamy

virus

L’organisation génétique classique du génome des rétrovirus simples comprend les

gènes (group-specific antigen), pro/pol (polymerase) et env (envelop) ordonnés

successivement de façon invariante. Les rétrovirus complexes possèdent en plus un ou

plusieurs gènes auxiliaires codant des protéines dites régulatrices et/ou accessoires quand elles

sont dispensables à la multiplication du virus in vitro. Ces protéines sont impliquées dans la

régulation de la synthèse et maturation des ARN messagers (ARNm) ainsi que l’interaction

avec la cellule hôte (Vogt, 1997).

VIH-1 et VIH-2 sont les seuls lentivirus à tropisme humain (Tableau 1). Ils ont des

structures génétiques similaires mais peuvent avoir des variations de séquences importantes.

A titre d’exemple, deux souches de VIH-1 et VIH-2 [comparées dans (Motomura et al.,

2008)] contiennent seulement 55 % d’homologie de séquence pour le génome viral (dont

respectivement 54 %, 55 %, et 35 % pour leurs gènes gag, pol et env). Le type VIH-1 peut

être divisé en trois groupes majeurs, qui reflètent des événements indépendants de

transmission à partir de primates (non-humains) (Gao et al., 1999; Keele et al., 2006; Korber

et al., 2000). Le groupe M (major) a une distribution mondiale alors que les groupes O

13

(outlier) et N (non-M/non-O) sont localisés en Afrique de l’Ouest et centrale, proche de

l’habitat naturel du chimpanzé Pan troglodytes (Keele et al., 2006; Peeters et al., 1997).

Huit pour cent du génome humain provient de rétrovirus endogènes (Human

Endogenous RetroVirus, HERVs), le plus souvent dégénérés. Les HERVs sont répartis en 100

familles divisées en 3 classes : classe I, II ou III lorsqu’ils sont, respectivement, proches des

gamma-rétrovirus, beta-rétrovirus, ou spumavirus (Bannert and Kurth, 2004). Leurs

séquences ont contribué à l’évolution, mais sont source d’instabilité génétique et peuvent ainsi

avoir un impact (positif ou négatif) sur la physiologie cellulaire [e.g., placentation,

inflammation (Kurth and Bannert, 2010)].

3/ Pathologies associées à l’infection rétrovirale

a/ Cancers

Les rétrovirus furent découverts dès 1908 du fait de leur capacité oncogénique [i.e.,

ALV, identifié comme responsable de leucémie chez le poulet (Ellerman et Bang, 1908)]. De

plus, du fait de l’origine cellulaire des oncogènes viraux, les rétrovirus ont permis la

découverte de nombreux proto-oncogènes cellulaires [i.e., le RSV (Rous sarcoma virus),

après transduction de l’oncogène src (Rous, 1911)].

Cinq genres de rétrovirus, les alpha-, beta-, delta-, epsilon- et gamma-rétrovirus, ont

été décrits susceptibles de provoquer des cancers chez les organismes qu’ils infectent en

utilisant différents mécanismes moléculaires. Le processus de transformation cellulaire induit

par l’infection rétrovirale peut être rapide et polyclonale (e.g., sarcomes) lorsqu’il est du à la

transduction d’un oncogène viral [i.e., rétrovirus (défectifs) transducteurs; e.g., mos par le

Mo-MSV (Moloney Murine Sarcoma Virus), aidé par le Mo-MLV (Moloney Murine

Leukemia Virus) (Moloney, 1966)]. La tumorigénèse peut aussi être lente et clonale

lorsqu’elle résulte d’une transformation cellulaire indirecte après expression de protéines

virales [i.e., rétrovirus trans-activateurs; e.g., Tax de HTLV-1 (Tanaka et al., 1990)] ou

mutagénèse insertionnelle [i.e., rétrovirus cis-activateurs ; e.g., c-myc (Steffen, 1984)] au sein

de cellules hématopoïétiques (e.g., leucémies, lymphomes).

b/ Autres pathologies

Un certain nombre de rétrovirus, même simples, peuvent induire après infection des

maladies du système nerveux central [i.e., perte de la fonction neuronale; e.g.,

encéphalopathie spongiforme due au HTLV-1 (Gessain and Gout, 1992)] ou être la cause

14

d’immunodéficiences (différentes du SIDA) [e.g., atrophie du thymus chez la souris après

infection par Mo-MLV (Wong, 1990)].

Les lentivirus ont été isolés au sein de nombreuses espèces animales (e.g., moutons,

chevaux, singes) et, comme le préfixe « lenti » l’indique, induisent des pathologies à

évolution lente associées à une longue période d’incubation, à une réplication virale

persistante, des troubles neurologiques et la destruction des cellules hématopoïétiques ou

immunologiques, entrainant indirectement la croissance de néoplasmes [i.e., lymphomes,

sarcome de Kaposi; e.g., equine infectious anemia virus (Reagan et al., 1950)].

c/ Le syndrome d’immunodéficience acquise

VIH-1 et VIH-2 sont les seuls lentivirus à tropisme humain et causent tous deux la

maladie SIDA (avec des symptômes similaires) chez les personnes qu’ils infectent. VIH-1 est

hautement pathogène uniquement chez les humains (ce qui n’est pas le cas de son précurseur,

le SIVcpz, chez le chimpanzé) comparé à VIH-2, moins virulent, qui dérive du SIVsm (non-

pathogène chez le singe mangabey).

L’infection par le VIH-1 est caractérisée (dans les 7 à 21 jours qui suivent) par une

phase précoce d’« éclipse » (appelée syndrome VIH aigu) de réplication intense du virus,

principalement dans les lymphocytes T CD4+, en absence de réponse immunologique

(virémie plasmatique > 10 millions de copies/mL) associée à une déplétion importante de

lymphocytes T CD4+ dans le sang périphérique. Le virus est disséminé dans les tissus

lymphoïdes (i.e., associés à l’appareil digestif et ganglions lymphatiques) où sont notamment

constitués des réservoirs viraux (e.g., lymphocytes T CD4+ au repos). Dans les mois qui

suivent l’infection, commence une phase chronique, souvent asymptomatique, d’activation

immunitaire soutenue et de réplication virale persistante associée à une virémie en baisse qui

devient stable, atteignant les 10 000 copies/mL en absence de traitement. Après plusieurs

années (3 à 15 ans), la phase avancée de l’infection par le VIH est caractérisée par une

déplétion marquée en lymphocytes T CD4+ qui mène au développement des maladies

opportunistes caractéristiques du SIDA (i.e., infections et/ou cancers) [cf., revue (Moir et al.,

2011)].

Depuis le développement de la HAART, une prise en charge rapide des personnes

infectées par le VIH a considérablement réduit l’incidence des maladies opportunistes

caractéristiques du SIDA. Le traitement antirétroviral permet de contrôler la réplication virale

et de maintenir la virémie sous le seuil de détection à l’aide des méthodes standards (~1

15

copies/mL) après un an. Celle-ci chute en quatre phases qui correspondent à la perte de la

production virale à partir de différents réservoirs cellulaires aux durées de vie variables (Moir

et al., 2011). Cependant, le principal réservoir viral, les lymphocytes T CD4+ quiescents, a

une durée de vie illimitée sans activation cellulaire et représente actuellement un obstacle à

l’éradication du VIH-1 chez un patient traité par HAART (Pace et al., 2011). De plus, les

personnes infectées par le VIH-1 et traitées sur le long terme avec une HAART peuvent être

confrontées aux effets secondaires du traitement et/ou de l’infection, tel le risque de

développer des maladies cardiovasculaires (Moir et al., 2011). Il est à noter qu’un effet

secondaire majeur de la HAART est l’échappement viral caractérisé par l’émergence de virus

résistants qui induit un échec thérapeutique chez 7 à 15 % des patients traités (Cortez and

Maldarelli, 2011).

Le tableau clinique décrit ci-dessus est le plus fréquent (i.e., 70-80 % des cas).

Cependant, l’évolution de l’infection par le VIH-1 et la progression de la maladie SIDA

peuvent être influencées par des facteurs viraux et cellulaires. En particulier, le système

immunitaire de l’individu infecté permet de ralentir ou, au contraire, d’augmenter l’évolution

de l’infection. Il existe ainsi des individus infectés par le VIH-1 qui sont (i) des progresseurs

rapides ou (ii) des non-progresseurs à long-terme, dont (iii) des résistants (elite controllers),

en fonction de leurs caractéristiques génétiques et de l’évolution de l’infection. Les

progresseurs rapides représentent 10 % des personnes infectées par le VIH-1 alors que 5-15 %

appartiennent à la catégorie des non-progresseurs à long-terme (Sharma et al., 2011). Seul 1

% des individus sont résistants à l’infection par le VIH-1 grâce à différents mécanismes

(O'Connell et al., 2009). Ils peuvent, par exemple, possèder un haplotype des HLA (human

leukocyte antigen) de classe I (e.g., HLA-B57) qui favorise la réponse des lymphocytes T

cytotoxiques (en augmentant la présentation des épitopes du VIH-1) ou être hétérozygotes

pour le co-récepteur CCR5 muté (CCR5∆32) (qui rend les cellules cibles réfractaires à

l’infection) (O'Connell et al., 2009). L’importance de cette mutation de CCR5 a été très

illustrée avec l’annonce d’un premier patient très probablement « guéri » de son infection au

VIH après transplantation de cellules souches CCR5 32/ 32 (Allers et al., 2011).

d/ Rétrovirus non-pathogènes

Les spumavirus n’ont pas de rôle pathogène connu, quelque soit l’espèce de l’hôte

infecté. Il est à noter qu’il n’existe pas de spumavirus humain. L’homme peut cependant être

infecté accidentellement par un spumavirus de primate (non-humain), appelé

16

prototype/primate foamy virus (PFV), sans pour autant qu’une transmission horizontale soit

possible (Schweizer et al., 1997).

Il est à noter la description récente du XMRV (xenotropic murine leukemia virus-

related virus) initialement caractérisé comme un nouveau gammarétrovirus à tropisme

humain au sein de tumeurs de la prostate (Urisman et al., 2006). Il s’agit en réalité d’un virus

recombinant provenant d’une xénogreffe de cellules humaines tumorales de prostate au sein

de souris de laboratoire (Paprotka et al., 2011). Ce phénomène de recombinaison ne serait pas

rare puisqu’il a été évalué pouvant survenir avec une fréquence de 25 % (Zhang et al., 2011).

4/ Organisation génétique du VIH-1

a/ Génome et protéines du VIH-1

Une fois intégré au sein de la chromatine hôte, le génome du VIH-1 mesure environ

9,7 kb, est flanqué de LTRs (long terminal repeats) à chaque extrémité (Figure 1A) et permet

de coder 17 protéines différentes (Figure 1B, Tableau 2).

Figure 1 : Génome du VIH-1 sous forme de provirus et protéines synthétisées. (A) Le

VIH-1 sous forme provirale est bordé des LTRs et contient les gènes gag, pol et env. (B) Ils

codent les protéines structurales (MA, CA, p2, p7, p1, p6), enzymatiques (PR, RT, IN) et

d’enveloppe (SU, TM) après clivage de polyprotéines (Gag, Gag-Pol ou Env) médié par des

protéases virales ou cellulaires, comme indiqué. (A-B) Les gènes tat, rev, vif, vpr, vpu, nef

codent les protéines Tat, Rev, Vif, Vpr, Vpu, Nef [adaptée de (Peterlin and Trono, 2003)].

17

Les protéines structurales, enzymatiques et d’enveloppe, communes à tous les

rétrovirus, sont issues du clivage de polyprotéines codées par les gènes gag, pro/pol et env,

respectivement. Le génome du VIH-1 contient deux gènes supplémentaires, tat et rev, codant

chacun une protéine régulatrice pouvant se fixer aux ARNs: Tat (Transactivator of

transcription) et Rev (Regulator of virion gene expression), indispensables pour obtenir de

hauts niveaux de réplication virale. Enfin, le VIH-1 contient 4 gènes codant les protéines dites

accessoires: Vpr (Vpx pour le VIH-2, Viral protein R/X), Vpu (Viral protein U), Vif (Virion

infectivity factor) et Nef (Negative factor) [Figure 1, (Frankel and Young, 1998)].

Tableau 2 : Origine et fonctions des protéines du VIH-1 [adapté de (Frankel and Young,

1998; Pluta and Kacprzak, 2009)].

Gène/Origine Protéine Fonction(s)

Protéines structurales

gag/clivage de

la polyprotéine

Gag (Pr55)

médiée par PR

pendant la

maturation du

virion

Matrice (MA ;

p17)

Formation et import nucléaire du PIC (PreIntegration Complex), export du

complexe Gag-ARN dans le cytosol, attachement à la membrane, formation

des virions (oligomérisation de Gag et recrutement de Gag-Pol/Pr160 et Env)

Capside (CA ;

p24) Attachement à la membrane, formation de la capside

Nucléocapside

(NC ; p7)

Attachement à la membrane, formation de la capside et du PIC, attachement à

l’ARN, co-facteur de la RT, sélection de l’ARNg, packaging et dimérisation

pendant l’assemblage des virions.

P1 et P2 Régulation du taux de clivage, attachement à la membrane et formation des

virions

p6

Recrutement de Vpr au virion, motif PTAP impliqué dans les interactions

avec les protéines de l’hôte, attachement à la membrane et formation des

virions, interaction avec la machinerie ESCRT (Endosomal Sorting Complex

Required for Transport) qui facilite le bourgeonnement des particules virales

immatures

Enzymes

gag-pol/clivage

de la

polyprotéine

Gag-Pol

(Pr160) médiée

par PR pendant

la maturation

du virion

Transcriptase

inverse et

RNAase H (RT

hétérodimère

p66/p51)

Synthèse de l’ADNc viral et dégradation de l’ARN matrice

Protéase (PR ;

p10) Clivage de Pr160 et Pr55, maturation du virion

Intégrase (IN ;

p32) Import nucléaire du PIC, intégration de l’ADNc viral dans le génome hôte

Glycoprotéines d’enveloppe

env/clivage de

la polyprotéine

Env (gp160)

par des

protéases

cellulaires

Gp120 (SU) Interaction avec le récepteur de la cellule hôte CD4 et co-récepteurs

Gp41 (TM) Ancrage du complexe Gp120/Gp41 dans la membrane virale, fusion

membranaire avec la cellule hôte

Protéines régulatrices

18

tat Transactivateur

(Tat ; p14)

Initiation de la transactivation à partir du LTR viral, élongation de la

transcription, remodelage de la chromatine, régulation de l’apoptose,

modulateur de la réponse immune (dont la machinerie d’ARN interférence)

rev

Régulateur de

l’expression des

protéines virales

(Rev ; p19)

Stimulation de l’export nucléaire des ARNs du VIH non-et mono-épissés,

stimulation de la traduction des ARNs du VIH non-épissés

Protéines accessoires

nef Negative factor

(Nef ; p27)

Diminution de la régulation du récepteur CD4, diminution de la régulation du

CMH-I et -II, interférence du signal de transduction, augmentation de

l’infectivité (réarrangement du cytosquelette d’actine), impliquée dans la

formation de la synapse virologique

vif

Viral infectivity

factor (Vif ;

p23)

Inactivation de la réponse immunitaire de l’hôte par fixation de

l’apolipoprotéine B (APOBEC3) et de l’IRF3 (interferon regulatory factor)

vpr Viral protein R

(Vpr ; p15)

Import nucléaire du PIC, contrôle de la fidélité de la transcription inverse,

arrêt du cycle cellulaire (transition G2/M), induction de l’apoptose,

transactivation du LTR du HIV et des gènes cellulaires, modulation de la

réponse immunitaire de l’hôte, inhibition de l’épissage des pré-ARNm viraux

et cellulaires, stimulation de la signalisation des voies de réparation des

dommages de l’ADN

vpu Viral protein U

(Vpu ; p16)

Dégradation du récepteur CD4, relarguage des particules virales, régulation

de l’apoptose

b/ Epissages des ARNm du VIH-1

L’ensemble des protéines du VIH-1 est codé par plus de 40 ARNm synthétisés à partir

d’épissages alternatifs grâce à la présence de plusieurs sites donneurs/accepteurs d’épissage

(Figure 2). Chacune des protéines du VIH-1 peut donc être produite à partir d’un ou plusieurs

transcrits (Figure 2). Les transcrits codant les protéines précoces, le plus souvent régulatrices

(Tat, Rev et Nef) sont tous épissés, alors que ceux codant les protéines tardives, composants

structuraux et enzymatiques du virion et facteurs permettant d’augmenter l’infectivité, sont

mono-épissés ou ne le sont pas (Figure 2). Rev permet notamment de réguler la transition

entre les phases précoces et tardives de l’expression rétrovirale en favorisant le transport

d’ARNm non-épissés ou mono-épissés [(contenant le RRE (Rev response element)] du noyau

vers le cytoplasme [Figure 2, (Stoltzfus and Madsen, 2006)].

19

Figure 2 : Génome du VIH-1 sous forme provirale et les ARNm synthétisés. (A)

Représentation schématique du génome du VIH-1. (B-D) Les différents ARNm synthétisés

lors de la transcription du LTR sont représentés sous forme (B) non-épissée, (C) partiellement

ou (D) totalement épissée. Il est à noter la présence de différents sites donneurs (D1-4) et

accepteurs (A1-7) d’épissage sur la forme non-épissée de l’ARNm qui permettent de générer

de nombreux ARNm partiellement ou totalement épissés. Certains exemples d’ARNm

partiellement ou totalement épissés sont représentés ici (les sites D/A ainsi que les protéines

pour lesquels ces ARNm codent sont précisés) [adaptée de (Karn and Stoltzfus, 2012)].

c/ Eléments cis au sein du génome du VIH-1

Les éléments cis situés au sein du génome du VIH-1 (qui se superposent souvent avec

des séquences codantes) optimisent le transfert du génome viral (transcription inverse,

intégration, transcription, épissage) une fois la cellule hôte infectée ou sont impliqués dans la

production efficace de nouvelles particules virales infectieuses (Figure 3).

Figure 3 : Eléments cis présents au sein du génome du VIH-1. Les éléments cis du génome

du VIH-1 sont impliqués dans le transfert du génome viral, soient la transcription inverse

(PBS, cPPT/CTS, PPT), l’intégration (attL, attR), la transcription (U3, TAR, polyA) et

l’épissage (SA, SD) ainsi que dans la production de virions (RRE, DIS, ψ) [issue de (Pluta

and Kacprzak, 2009)]. Se reporter au tableau 3 pour les abréviations.

20

Les emplacements et fonctions des éléments cis du génome du VIH-1 sont détaillés

dans le tableau 3.

Tableau 3 : Emplacement et fonctions des éléments cis inclus dans le génome du VIH-1 sous

forme proviral (décrits du LTR 5’ au 3’).

Eléments cis Fonctions

LTR (long terminal repeat)

attL/R (attachment

sites Left/Right) Sites d’attachement pour l’intégration.

U3

Séquence unique non codante contenant les éléments promoteurs et amplificateurs de la

transcription du provirus (lorsqu’elle est placée en 5’, une fois dupliquée au sein du

provirus)

R Répétition directe à chaque extrémité qui contient un signal de polyadénylation (polyA,

arrêt de la transcription en 3’) et l’élément TAR.

U5

Région unique, non codante, riche en G/U qui est la première à être rétro-trancrite et

permet une reconnaissance efficace du signal polyA contenu dans R (lorsqu’elle est

placée en 3’, une fois dupliquée au sein du provirus).

5’ gag

PBS

(primer binding site)

Complémentaire de la séquence de l’ARNt. Permet l’initiation de la transcription

inverse.

DIS Signal de dimérisation de l’ARNg

SD Site donneur d’épissage

Ψ (Psi)

Ensemble de boucles d’ARN servant de signal d’encapsidation de l’ARNg viral. Tête

(leader) région transcrite non traduite présente à l’extrémité 5’ de tous les ARNm

viraux.

cPPT (pol)

PPT (nef)

CTS (pol)

La séquence appelée central polypurine tract-central termination sequence (cPPT-CTS)

est présente presque exclusivement au sein du génome des lentivirus. Le CTS, localisé

en aval du cPPT, est le site auquel la synthèse du brin + d’ADN viral se termine. La

présence de cPPT-CTS détermine une discontinuité dans le brin + complet d’ADN viral

qui forme une triple hélice appelée DNA flap (cf., § I.6.c) et exerce un effet positif sur

l’infectivité virale (Follenzi et al., 2000 ; Sirven et al., 2000), peut-être en favorisant la

rétro-transcription

RRE (env) Elément de réponse à Rev qui permet l’export nucléaire des ARNm partiellement ou

non-épissés

SA (rev) Site accepteur d’épissage

5/ Structure du VIH-1

Les particules virales du VIH-1 ont un diamètre de 80 à 120 nanomètres (nm) (Figure

4). Elles sont recouvertes d’une membrane lipidique contenant des complexes glycoprotéiques

constitués de trimères de protéines de surface (SU) Gp120 et transmembranaire (TM) Gp41

liés de façon non-covalente (Figure 4A, B). Pendant le bourgeonnement des virions à partir

de la cellule infectée, le virus peut aussi incorporer des protéines cellulaires (e.g., HLA de

classe I et II, cyclophyline A, protéines d’adhésion) (Figure 4A, B). Une matrice constituée

des protéines (MA) p17 est ancrée à la surface interne de l’enveloppe virale (Figure 4A, B).

A l’intérieur, se trouve la capside en forme de trapèze constituée de l’antigène (CA) p24

21

(Figure 4B). Cette dernière contient les deux brins d’ARNg associés à la nucléocapside

(constituée des protéines NC, p7) et aux ARNt (qui serviront d’amorce à la transcriptase

inverse) (Figure 4B). La capside contient également les protéines virales protéase,

transcriptase inverse, VPR et intégrase qui permettront d’assurer les étapes précoces du cycle

viral indispensables à l’expression, la multiplication et la persistance du virus (Figure 4B).

Cependant, la particule virales du VIH-1 ne prendra cette forme mature qu’après maturation

du virion lors de son bourgeonnement à la surface cellulaire après clivage des polyprotéines

Gag et Gag-Pol en MA/CA/NC et PR/RT/IN, respectivement (Pluta and Kacprzak, 2009)

(Figure 4B).

Figure 4 : Structures du VIH-1. Les panels A et B représentent schématiquement les

particules virales immatures (A) et matures (B) sur lesquelles sont annotées les protéines

virales (sous forme de précurseurs ou matures, respectivement) qui les composent ainsi que

les protéines cellulaires incorporées (HLA de classe I, II) (Source :

http://www.ictvdb.org/WIntkey/Images/ dg_HIV.jpg). Le panel C est une image 2D d’un

virion mature (de 100 nm de diamètre) prise par microscopie cryo-électronique (Liu et al.,

2010).

B/ LES BASES DE LA MULTIPLICATION DU VIH-1

Le cycle de multiplication du VIH-1 est composé des étapes précoces et tardives qui

ont lieu, respectivement, avant et après intégration de l’ADN viral (ADNv) au sein de la

chromatine de la cellule infectée (Figure 6). Certaines étapes du cycle du VIH-1 peuvent être

influencées, positivement ou négativement, par les protéines de la cellule infectée. Il a ainsi

été récemment identifié ~1400 gènes cellulaires essentiels à l’infection par le VIH-1 à l’aide

d’approches génomiques globales (mettant en œuvre l’interférence par les ARNs) (Brass et

A B

C

22

al., 2008; Espeseth et al., 2011; Genovesio et al., 2011; Konig et al., 2008; Rato et al., 2010;

Waninger et al., 2004; Zhou et al., 2008).

Figure 5 : Cycle de multiplication du VIH-1. (1) Le cycle de multiplication du VIH-1

débute par l’adsorption du virus à la surface cellulaire sur le récepteur CD4 et le co-récepteur

CCR5 et CXCR4. (2) Cette étape est suivie de la fusion des membranes virales et cellulaires

et (3) la décapsidation du core viral (4) dont le génome ARN est rétro-transcrit en un ADN

double-brin. (5) L’ADN viral linéaire, associé aux protéines cellulaires et virales au sein du

PIC, est importé au sein du noyau où il peut être dégradé, circularisé en épisomes à 1 ou 2-

LTRs ou (6) intégré au sein de la chromatine hôte. (7) L’ADN viral intégré est transcrit en

ARNm aux multiples épissages qui (8) sont exportés dans le cytoplame où (9) ils synthétisent

les protéines régulatrices (qui retournent jouer leur rôle dans le noyau) ou structurales et

accessoires qui participent à (10) l’assemblage de nouvelles particules virales. (11) Celles-ci

bourgeonnent à la membrane cellulaire et sont libérées sous forme immature. (12) La

maturation des virions a ensuite lieu grâce au clivage des polyprotéines grâce à la protéase

virale. Comme précisé, plusieurs étapes du cycle de multiplication du VIH-1 peuvent être

ciblées lors de la HAART. De plus, sont indiquées les étapes du cycle pouvant aboutir à

générer un état de latence pré-intégrative ou transcriptionnelle (étapes 3 à 6, ou transcription,

respectivement). Il est à noter que cette dernière peut être réactivée à l’aide de traitements

pharmacologiques (e.g., inhibiteurs des déacétylases d’histones) dont certaines sont

actuellement en essais cliniques [adaptée de (Engelman and Cherepanov, 2012)].

1/ Entrée : adsorption et fusion

L’attachement du VIH-1 à la surface cellulaire a lieu grâce au complexe d’enveloppe

Gp120-Gp41, essentiel à la reconnaissance du virus et à l’entrée au sein des cellules cibles

(Figure 5). Gp120 fixe une glycoprotéine monomérique transmembranaire, CD4 exprimé à la

23

surface cellulaire d’environ 60 % des lymphocytes T circulants, des lymphocytes T

précurseurs au sein de la moelle osseuse et du thymus, des monocytes et macrophages, des

cellules éosinophiles, des cellules dentritiques et des cellules microgliales du système nerveux

central. Une fois Gp120 fixée à la protéine CD4, l’enveloppe virale subit une modification

structurale lui permettant de se fixer à des récepteurs à chimiokines à la surface cellulaire [cf.,

revue (Peterlin and Trono, 2003)].

Les plus communs de ces co-récepteurs du VIH-1 sont CXCR4 et CCR5,

respectivement exprimés sur de nombreux types cellulaires ou uniquement sur les

monocytes/macrophages, les lymphocytes T activés et les cellules dendritiques. L’expression

différentielle de ces deux récepteurs à la surface des cellules cibles est le déterminant majeur

du tropisme du VIH-1. Ainsi, les souches du VIH-1 qui fixent préférentiellement le co-

récepteur CCR5 sont des virus à tropisme M (pour macrophage) ou R5. Les souches se fixant

préférentiellement à CXCR4 des lymphocytes T CD4+ primaires sont dites à tropisme T

(pour lymphocyte T) ou X4. Les souches du VIH pouvant se fixer sur les deux récepteurs sont

des virus X4R5 à tropisme dual [cf., revue (Peterlin and Trono, 2003)]. Il est à noter que ce

tropisme double du VIH-1 peut indiquer une évolution du tropisme chez le patient après

traitement à l’aide d’inhibiteurs de CCR5 (Mild et al., 2010).

La double fixation de Gp120 à CD4 et à un co-récepteur permet un attachement plus

stable du virus, ce qui induit la pénétration de Gp41 au sein de la membrane cellulaire. Cet

évènement rapproche les deux membranes qui fusionnent, permettant l’entrée de la capside

virale (Peterlin and Trono, 2003).

Il est à noter que le virus VIH-1 et les vecteurs qui en dérivent utilisés au cours de

notre étude sont pseudotypés à l’aide de la glycoprotéine G amphotrope d’enveloppe du virus

de la stomatite vésiculaire (VSV), ce qui nous permet de nous affranchir de la présence du

récepteur CD4 à la surface des types cellulaires utilisés. Mais, l’absence d’interaction du

vecteur avec ses récepteurs empêche l’activation de cascades de signalisation pouvant être

nécessaires à certaines étapes (notamment précoces) du cycle viral (Aiken, 1997; Yu et al.,

2009).

2/ La particule virale au sein du cytoplasme de la cellule hôte

a/ Facteurs de restriction

Les facteurs de restriction représentent le système de défense cellulaire anti-virale

intrinsèque, ou immunité intrinsèque. Ils ont la capacité de reconnaître directement des

24

composants viraux, de façon dépendante ou indépendante de leur activité cellulaire et d’agir à

différentes étapes du cycle de multiplication du VIH-1 (Tableau 4). Leur action résulte en un

blocage immédiat de la multiplication virale et peut aussi contribuer à la stimulation de

l’immunité innée (e.g., Tétherine). Ces acteurs de la défense anti-virale peuvent également

agir sur le cycle de multiplication d’autres (rétro)virus, comme indiqué dans le Tableau 4,

et/ou être spécifique de l’espèce de l’organisme infecté [e.g., TRIM5α (tripartite motif protein

5α); Tableau 4] [cf., revues (Wolf and Goff, 2008; Yan and Chen, 2012)].

Tableau 4 : Facteurs de restriction du VIH-1 [adapté de (Yan and Chen, 2012)].

Protéines Rôle cellulaire Virus ciblé(s)

(spécificité

d’espèce)

Fonction(s ) dans le cycle viral

APOBEC3G Déaminase des

cytidines

VIH-1, SIV,

EIAV, MLV,

spumavirus, virus

de l’hépatite B

Introduit des mutations au sein de l’ADN du VIH-1

(édite C en U dans le brin -). Inhibe la transcription

inverse et l’intégration du VIH-1. Action contrecarrée

par Vif.

TRIM5α Ubiquitine U3

ligase

VIH-1 (MR),

MLV (H)

Bloque la décapsidation du virus entrant. Promeut la

signalisation de l’immunité innée en reconnaissant la

capside rétrovirale.

Tétherine

VIH-1, MLV,

HTLV-1, virus

d’Ebola, KSHV

Bloque le relarguage des virus enveloppés. Action

contrecarrée par Vpu.

SAMHD1

Phosphohydrolase

(stimulée par

dGTP) VIH-1, VIH-2

Inhibe la réplication du VIH-1 dans les cellules

myéloïdes, probablement en régulant le stock de dNTP

cellulaires. Action contrecarrée par Vpx.

TREX1 3’ exonucléase VIH-1 Enlève l’ADN rétro-transcrit abortif cytoplasmique.

Inhibe les réponses de l’immunité innée contre le VIH-1

Abréviations : H, Homme ; MR, macaque rhésus ; APOBEC3G, apolipoprotein B mRNA-

editing catalytic polypeptide 3 ; TRIM5α, tripartite motif protein 5α ; SAMHD1, SAM

domain and HD domain 1 protein ; TREX1, three prime repair exonuclease 1 ; EIAV,

equine infectious anemia virus; HTLV-1, human T leukemia virus de type-1; KHSV, Kaposi’s

sarcoma–associated herpes S virus.

b/ Décapsidation, transport/trafic cytoplasmique

Il est généralement admis que la décapsidation du core viral a lieu, au moins

partiellement, dès l’entrée du virus dans le cytoplasme de la cellule infectée, libérant ainsi

l’ARN viral (ARNv) (Suzuki and Craigie, 2007). Ce réarrangement du core viral est associé

la maturation du complexe de transcription inverse (RTC, reverse transcription complex)

(composé de protéines virales et cellulaire) qui existe sous forme de complexe de pré-

initiation de la transcription inverse au sein des virions (Warrilow et al., 2009). Il a

notamment été observé qu’une synthèse d’ADNc limitée (à partir du complexe de pré-

25

initiation de transcription inverse) a toutefois au sein des particules virales avant infection

(Lori et al., 1992; Trono, 1992 ). Le RTC subit ensuite différentes stades de maturation

jusqu’à achèvement du processus de transcription inverse (Warrilow et al., 2009).

L’évolution des techniques d’analyses des étapes de pré-intégration du VHI-1, et en

particulier de la composition du RTC [illustré dans (Arhel, 2010)], permet actuellement de

proposer que le core viral puisse être décapsidé de façon concomitante au processus de

transcription inverse pendant le transport de la capside vers le noyau (grâce au réseau de

microtubules et d’actine) (McDonald et al., 2002; Nermut and Fassati, 2003). De façon

alternative, une autre hypothèse propose que le core viral ne soit désassemblé qu’une fois la

transcription inverse achevée (Arhel, 2010). La capside du VIH-1 serait ainsi une structure

perméable de maintien du RTC où une concentration importante de transcriptase inverse

autour de son substrat, l’ARNg, favoriserait la conversion ARN simple brin-ADN double brin

(ARNsb-ADNdb), elle-même facilitée par la fixation de NC. Le core viral favoriserait alors

l’import nucléaire (Arhel, 2010).

c/ Transcription inverse

La transcription inverse est une étape majeure du cycle rétroviral qui aboutit à la

duplication des LTRs. Ce processus a lieu en différentes étapes et permet la synthèse d’un

brin d’ADN db à partir d’un ARN sb grâce à l’action de la transcriptase inverse, comme décrit

dans la figure 6.

L’achèvement de la maturation du RTC et de la transcription inverse permettent de

générer le complexe de pré-integration (PIC) également considéré comme la forme la plus

mature du RTC (Warrilow et al., 2009).

26

Figure 6 : Les différentes étapes de la transcription inverse. Elle est initiée par la synthèse

du brin d’ADN (-) en 5’ du brin d’ARN (+) en utilisant un ARNtLys3 hôte qui fixe le site PBS.

La synthèse d’ADN s’arrête au R de l’extrémité 5’ avant qu’il n’y ait transfert du brin d’ADN

(-) néo-synthétisé sur la séquence R du même brin d’ARN ou du second. L’élongation du brin

d’ADN (-) se poursuit et est accompagnée de la digestion de la matrice d’ARN (par l’activité

RNaseH de la RT) à laquelle résistent partiellement les séquences PPT en position centrale

(cPPT) et en 3’ (3’PPT) qui servent de sites d’initiation à la synthèse du brin d’ARN (+). De

plus, la complémentarité des séquences PBS des brins d’ADN (+) et (-) permet le transfert du

brin d’ADN (+) et la synthèse complète du double brin d’ADN viral. Cependant, l’élongation

du brin d’ADN (+) à partir de 2 sites d’initiation permet de générer un déplacement du brin en

aval sur 100 nucléotides (nt), appelé DNA flap central qui se termine au CTS (Pluta and

Kacprzak, 2009) [adaptée de (Gotte et al., 2010)].

d/ Formation du complexe de pré-intégration cytoplasmique

Le PIC, complexe nucléoprotéique compétent pour l’intégration, contient l’ADNdb

viral compact associé à l’IN mais dépourvu de CA (i.e., décapsidation totale) et NC

(Bukrinsky et al., 1993; Farnet and Haseltine, 1991; Miller et al., 1997). La présence d’autres

protéines virales caryophiles MA, RT, PR et Vpr est débattue (Bukrinsky et al., 1993; Farnet

and Haseltine, 1991; Iordanskiy et al., 2006; Karageorgos et al., 1993; Miller et al., 1997).

Il a également été montré que certaines protéines cellulaires peuvent être associées au

PIC du VIH-1 in vitro et/ou ex vivo (Tableau 5). Cependant, la composition du PIC évolue

27

probablement en fonction de sa localisation, i.e., cytoplasme vs. noyau. Les protéines

cytoplasmiques du PIC pourraient néanmoins favoriser l’import nucléaire.

Tableau 5 : Protéines cellulaires identifiées comme interagissant avec l’intégrase et/ou le

PIC [issue de (Raghavendra et al., 2010)].

Protéines cellulaires Méthode d’identificationb

BAF (Barrier-to-Autointegration Factor) SS, BTD

Gémine 2 IP

HAT p300 (Histone Acetyl-Transferase p300) IP

HMGA1 (high mobility group AT-hook 1) SS

HSP60 (Heat shock protein 60) PD

Protéine EED (embryonic ectodermal

development) THS, PD

Importine 7 IP, PD (Zaitseva et al., 2009)

IN1 (Integrase interactor 1 ou hSNF5) THS, THS (Rain et al., 2009)

LEDGF/p75 (Lens Epithelium-Derived Growth

Factor p75 splice variant) IP, THS (Rain et al., 2009)

UNG2 (uracil DNA glycosylase 2) PD

NUP153 (nucleoporin 153 kDa) PD (Woodward et al., 2009)

TRN-SR2 (transportin-SR2 ou TNPO3) PD (Christ et al., 2008), THS (Rain et al., 2009)

VBP1 (Von Hippel-Lindau Binding protein 1) THS (Rain et al., 2009)

Ku80 PE (Li et al., 2001), THS et PD (Studamire and

Goff, 2008)

Np1l1, Rbbp4, An32a, An32e, Calréticuline,

Nemo, Nono, LEO1, DDX19A, STAU1, Hnrh-

1, Hnrh-3, PairB, Sf3b2, Sfrs3, Snut1, If4g,

Dynactine

BTD

aEn l’absence de précision, les résultats sont issus de (Raghavendra et al., 2010)].

bSS (salt stripped) : reconstitution de l’activité du PIC altérée par les fortes concentrations en

sels ; IP : immunoprécipitation de complexes formés au sein des cellules ; PD (pull down) :

co-précipitation in vitro ; THS (two hybrid system) : système double-hybride ; PE (PIC

extraction) : préparation de PIC et analyse des protéines par Western-blot ; BTD (biotinylated

target DNA) : identification par spectrométrie de masse des complexes associés à un ADN

cible biotinylé.

3/ La traversée active du cytoplasme au noyau : l’import nucléaire

Les lentivirus ont la capacité de se répliquer au sein de cellules quiescentes qui

implique le passage de la membrane nucléaire par le PIC. Le PIC du VIH-1 de 56 nm de

diamètre (Miller et al., 1997) est transporté activement au travers des pores nucléaires de

façon ATP(adénosine triphosphate)-dépendante (Bukrinsky et al., 1992). Ce processus

impliquerait, directement ou indirectement, les protéines virales et/ou cellulaires qui

28

constituent le PIC ainsi que la structure centrale particulière de l’ADNdb viral appelée DNA

flap (Suzuki and Craigie, 2007). Cependant, le rôle exact de ces facteurs, et notamment du

DNA flap, reste controversé (Suzuki and Craigie, 2007). Plus récemment, de nouveaux

partenaires de l’IN [TRN-SR2 (transportin-SR2), l’importine 7 et le composant du pore

nucléaire NUP153 (nucleoporin 153 kDa)], ont été identifiés comme participant au contrôle

de l’accès au noyau (Christ et al., 2008; Woodward et al., 2009; Zaitseva et al., 2009).

4/ Les étapes nucléaires du cycle de multiplication du VIH-1

a/ Formation du complexe de pré-intégration nucléaire

Une fois dans le noyau, le PIC incorpore des protéines nucléaires, dont LEDGF/p75

(Llano et al., 2004), HMGA1 (Miller et al., 1997), Ku (Chen and Engelman, 1998 ; Li et al.,

2001 ; Lin and Engelman, 2003; Studamire and Goff, 2008), BAF (Lin and Engelman, 2003)

et IN1 (Iordanskiy et al., 2006) (Tableau 5). LEDGF/p75 a un rôle connu dans l’intégration

de l’ADNv, comme développé dans le paragraphe iii/ de cette partie. Les autres protéines

citées ci-dessus pourraient également avoir un impact dans les étapes nucléaires du cycle du

VIH-1, i.e., intégration, localisation et expression.

b/ Processus d’intégration

Une fois dans le noyau, l’IN, associée à ses partenaires viraux et cellulaires du PIC,

circularise l’ADNdb viral et catalyse les deux premières étapes de la réaction d’intégration au

sein du génome hôte (Figure 7). Ces deux étapes permettent la maturation des extrémités 3’

de l’ADN viral (i.e., maturation en 3’) et le transfert de celui-ci au sein du génome humain

(i.e., transfert de brins) (détails de la réaction Figure 7). La troisième et dernière étape du

processus d’intégration est la réparation des lésions générées lors du transfert de l’ADNv dans

la chromatine de la cellule hôte par la machinerie de réparation de l’ADN (Figure 8).

L’implication de cette dernière dans le cycle de multiplication du VIH-1 sera décrite dans le

chapitre IV de cette thèse.

29

Figure 7 : La réaction d’intégration de l’ADN viral au sein de la chromatine hôte. Le

précurseur de l’intégration est une molécule d’ADNc viral (ADNv) à bouts francs associé à

l’IN au sein du PIC. (1) La première réaction, appelée maturation en 3’ (3’ processing),

consiste en un clivage par l’intégrase des 2 nucléotides terminaux de l’ADNv (qui crée des

extrémités 3’ simple brin CA). Les groupements –OH 3’ des extrémités 3’ simple brin CA de

l’ADNv vont ensuite attaquer les liaisons phosphodiesters des brins opposés (séparées par 5

bases) de l’ADN hôte. (2) Cette trans-estérification, deuxième étape du processus

d’intégration également catalysée par l’intégrase, est appelée transfert de brins (strand

transfer). (3) La troisième étape implique la machinerie de réparation de l’ADN qui répare les

cassures générées (gap repair) lors de l’intégration et coupent les extrémités 5’ qui dépassent

de l’ADNv, ce qui créée une duplication des séquences d’ADN de l’hôte entourant le provirus

[adaptée de (Poeschla, 2008)].

Il est à noter que la première réaction du processus d’intégration a lieu au sein du PIC

avant l’entrée au noyau. Le processus d’intégration se déroule également au sein du PIC en

interaction avec les partenaires cellulaires de l’IN. L’un d’entre eux, i.e., LEGDF/p75,

influence le positionnement du PIC au sein de la chromatine en interagissant à la fois avec

l’IN et certaines séquences de l’ADN hôte cible (Ciuffi, 2008) (Figure 8). Il n’est pas exclut

que d’autres protéines cellulaires du PIC puissent également influencer le devenir du PIC, i.e.,

Ku, comme développé dans le chapitre IV de cette thèse.

30

Figure 8: Le processus d’intégration de l’ADN viral dans le génome cellulaire dépend de

l’intégrase et des protéines cellulaires du PIC. (1) Le processus d’intégration dépend de

l’intégrase, qui est associée aux autres protéines virales et cellulaires au sein du PIC

(représenté par un ovale gris) et à l’ADNv (ligne rouge en gras, les ronds rouges représentent

les extrémités 5’ de l’ADN). (2) La première étape permet de générer les extrémités simple-

brin de l’ADN. (3) Le recrutement du PIC au niveau du site d’intégration de l’ADN cible est

facilité grâce à l’intervention d’une protéine ou complexe protéique pouvant se fixer à la

chromatine (i.e., LEDGF/p75). (4) L’IN peut alors simultanément créer des cassures au

niveau de l’ADN cible [entre 5 paires de bases (bp)] et les fixer aux extrémités 3’ de l’ADNv,

(5) en laissant un intermédiaire d’intégration avec des bases non-appariées à chacune des

jonctions entre ADNs viral et cible. (6) La machinerie de réparation de l’ADN de la cellule

hôte permet la synthèse des nucléotides manquants, (7) ce qui résulte en une duplication des 5

bp qui flanquent l’ADN proviral [adaptée de (Ciuffi, 2008)].

c/ Sites préférentiels d’intégration du VIH-1

Des analyses génomiques des sites d’intégration des lentivirus, dont le VIH-1 et les

vecteurs dérivés, ont mis en évidence son intégration préférentielle au sein des unités de

transcription actives (Bushman et al., 2005; Hacker et al., 2006; Mitchell et al., 2004;

Schroder et al., 2002; Wang et al., 2007), plus accessibles aux complexes d’intégration

(Figure 9).

31

Figure 9 : Régulation de l’intégration par l’accessibilité de l’ADN. L’ADN empaqueté au

sein des nucléosomes est relativement inaccessible aux complexes d’intégration. L’exposition

de séquences cibles lors de la décompaction de la chromatine promeut ainsi l’intégration

[issue de (Bushman et al., 2005)].

Celles-ci contiennent des sites de reconnaissance pour des co-facteurs cellulaires

associés à l’IN, tel LEDGF/p75 qui est en outre nécessaire (mais pas essentiel) pour obtenir

une intégration et une réplication efficace (Ciuffi et al., 2005; Shun et al., 2007). En effet,

LEDGF/p75 permet le recrutement du PIC au sein de la chromatine hôte grâce à sa capacité à

fixer directement l’IN du VIH-1 en C-terminal [via son domaine IBD (integrase binding

domain)] et la chromatine en N-terminal [via son domaine PWWP (Pro-Trp-Trp-Pro) et une

paire de crochets A/T] (Llano et al., 2006). LEDGF/p75 fixe aussi spécifiquement l’IN

d’autres lentivirus (i.e., VIH-2, EIAV), ce qui leur confère une distribution des sites

d’intégration semblable à celle du VIH-1 (Hacker et al., 2006; Hematti et al., 2004; Kang et

al., 2006; MacNeil et al., 2006). En absence de LEDGF/p75, l’intégration du génome

lentiviral ainsi que sa préférence pour les gènes transcriptionellement actifs sont fortement

réduites (Ciuffi, 2008). La distribution des sites d’intégration ressemble alors à celle des

gammarétrovirus (Wu et al., 2003), i.e., à proximité et au sein des promoteurs ainsi que dans

les îlots CpG (Mitchell et al., 2004). Les spumavirus ont la même préférence d’intégration que

les gammarétrovirus, dans une proportion cependant moins importante (Nowrouzi et al.,

2006; Trobridge et al., 2006).

32

d/ Autres espèces d’ADN viral générées

L’ADNv intégré, appelé provirus, représente cependant uniquement 5 à 10 % de

l’ADNv total contenu dans une cellule infectée (Brussel and Sonigo, 2004). La vaste majorité

de l’ADNv est donc sous forme non-intégrée. La forme la plus abondante d’ADNv est sous

forme linéaire extrachromosomal, produit direct de la transcription inverse de l’ARNv et

substrat du processus d’intégration (Figure 10). Les autres formes d’ADNv non-intégré sont

circulaires et générées à partir de l’ADNv linéaire grâce à différents mécanismes. Ils peuvent

être produits par auto-intégration (i.e., « attaque » des brins d’ADNv par les extrémités issus

du 3’processing) sous forme d’auto-intégrants tronqués ou réarrangés, et représenter jusqu’à

20 % de l’ADNv après infection par le Mo-MLV (Shoemaker et al., 1981) (Figure 10).

D’autres espèces virales circulaires, contenant un ou deux LTRs (respectivement, 30 et 5 %

de l’ADNv total) sont formées par recombinaison homologue (i.e., cercles à 1-LTR) et/ou

intervention de protéines respectivement impliquées dans les voies de réparation de l’ADN

par recombinaison homologue ou non-homologue [cf., revue (Sloan and Wainberg, 2011) et §

IV.B.1-2] (Figure 10).

Ces différentes espèces virales ont des durées de vie variables. La quantité d’ADN

linéaire diminue rapidement s’il n’est pas intégré (durées de demi-vie estimées à 1–2 jours)

(Zhou et al., 2005), alors que les cercles à 1- et 2-LTRs s’accumulent dans le noyau à des

temps plus tardifs de l’infection et sont éliminés lors des divisions cellulaires. Ces derniers,

qui étaient considérées jusqu’à peu comme des produits finis issus d’évènements abortifs

(Brown et al., 1989), peuvent exprimer les protéines précoces du VIH-1 (i.e., Nef, Tat et Rev)

et ainsi participer à la réplication du VIH-1 (Gelderblom et al., 2008; Kelly et al., 2008) [cf.,

revue (Sloan and Wainberg, 2011) et § III.B.3]. De plus, il est actuellement proposé que les

cercles à 2-LTRs soient des intermédiaires tardifs dans le processus d’intégration médié par le

clivage de la jonction 2-LTR via l’IN (Delelis et al., 2007), ce qui permettrait la persistance de

l’infection en présence d’inhibiteurs de l’intégrase.

33

Figure 10 : Les différentes formes d’ADN viral au sein du noyau. Différentes formes

d’ADNv sont générées à partir d’ADNv linéaire extra-chromosomale, espèce virale

majoritaire, via différents processus. Celui-ci peut être intégré, ou circularisé par

recombinaison, auto-intégration ou intervention de la machinerie de réparation de l’ADN (qui

peut aussi intervenir dans la dégradation de l’ADN linéaire. Ces mécanismes permettent de

générer des formes d’ADNv réarrangées/tronquées, ou des cercles à 1-LTR/ 2-LTRs,

respectivement [adaptée de (Sloan and Wainberg, 2011)].

5/ Expression

L’ADNv se comporte, une fois intégré, comme n’importe quel gène cellulaire. Les

LTRs qui bordent en 5’ et 3’ le provirus définissent respectivement l’initiation et la

terminaison de transcription. L’initiation de la transcription à partir du 5’LTR est régulée par

la présence/absence de facteurs de transcription cellulaires qui positionnent l’ARN

polymérase II (ARN pol II) et les protéines de la machinerie cellulaire de transcription

associées. Cependant, une fois la transcription initiée, ce sont principalement les protéines

virales précoces, Tat et Rev, qui permettent d’atteindre de hauts niveaux d’expression en

stimulant la transcription, et l’export des ARNm non- et mono-épissés, respectivement. Une

fois au sein du cytoplasme, les ARNm viraux sont pris en charge par la machinerie cellulaire

de traduction et traduits en protéines correspondantes [cf., revue (Karn and Stoltzfus, 2012)].

Un paragraphe sur l’expression du VIH-1 sera développé dans le chapitre III de cette thèse.

34

6/ Assemblage, bourgeonnement et maturation des particules virales

Les poly/protéines structurales et enzymatiques virales migrent jusqu’au lieu

d’assemblage des particules virales en étant stabilisées par le cytosquelette d’actine et de

microtubules (Jolly and Sattentau, 2007). Le lieu d’assemblage prédominant des particules

virales pour les différents types cellulaires infectés est la membrane plasmique (Sundquist and

Krausslich, 2012).

En effet, dans les lymphocytes T, le VIH s’assemble et bourgeonne au niveau de

microdomaines de la membrane plasmique, appelés radeaux lipidiques, plateformes

d’interactions protéines-lipides. La polyprotéine Gag/Pr55 joue un rôle central dans

l’assemblage du virus puisqu’elle suffit à la production de particules non-infectieuses en

l’absence d’autres protéines virales (Gheysen et al., 1989). En particulier, le dimère ARNg est

transporté jusqu’à la membrane plasmique en étant complexé à Gag via son domaine NC qui

permet son assemblage au sein de la particule virale (Martin-Serrano and Neil, 2011). De

plus, le domaine MA de Gag lui permet de cibler et de se fixer la membrane plasmique (Saad

et al., 2006), ce qui favorise l’oligomérisation de Gag (Ono et al., 2007) qui recrute Gag-

Pol/Pr160 et Env. Le bourgeonnement des particules virales immatures est médiée par le

domaine C-terminal de Gag, p6, qui interagit avec des composants de la machinerie ESCRT

(Endosomal Sorting Complex Required for Transport), facilitant ainsi la dissociation de la

membrane plasmique.

Dans les macrophages, l’amélioration des techniques de microscopie a permis de

montrer récemment que le VIH s’assemble et bourgeonne au niveau d’invaginations de la

membrane plasmique accessibles à la surface (Sundquist and Krausslich, 2012). Ce

mécanisme avait initialement laisser supposer que les particules virales de VIH-1

bourgeonnait dans des endosomes ou de structures similaires à des corps multivésiculaires,

puis étaient relarguées des cellules par exocytose (Kramer et al., 2005; Nguyen et al., 2003).

Les particules virales sont libérées des cellules productrices sous forme immature.

Leur maturation, qui a lieu rapidement après bourgeonnement, repose sur une cascade de

réactions de clivage des polyprotéines Gag et Gag-Pro/Pol en protéines matures Gag et

Pro/Pol. Le virus mature et infectieux qui en résulte est alors capable d’initier un autre cycle

d’infection dans une nouvelle cellule cible. Il a également été observé que les particules

virales matures pouvaient être transmises de façon efficace via la formation d’une synapse

virologique créée par l’interaction Env-CD4 entre cellule infectée et non-infectée

(Puigdomenech et al., 2008; Sato et al., 1992). Cette structure est stable et maintenue par le

35

recrutement de molécules d’adhésion et des réarrangements du cytosquelette d’actine sans

qu’il y ait fusion cellulaire. L’assemblage des particules virales et leur relarguage deviennent

polarisés au niveau de la zone de contact, et les virions sont transférés au sein de l’espace

intercellulaire avant d’entrer dans la cellule non-infectée (Martin-Serrano and Neil, 2011).

7/ Conséquences de l’infection par le VIH-1

En fonction du contexte cellulaire et des interactions virus/hôte, l’infection peut

aboutir à la mort des cellules infectées, souvent associée à une production virale importante,

ou à une latence, avec peu ou pas d’expression virale.

a/ Mort des cellules infectées

L’infection in vivo par le VIH-1 des lymphocytes T CD4+ résulte majoritairement en

une apoptose massive des cellules infectées médiée par les protéines virales et/ou de l’hôte en

fonction du stade d’infection dans lequel se trouve la cellule infectée et aboutit à une profonde

déplétion en lymphocytes T en absence de HAART (Cummins and Badley, 2010). Les

cellules infectées peuvent être détruites par le système immunitaire inné lors de la phase aigue

d’infection (Cossarizza, 2008). La mort de cellules non-infectées par apoptose peut également

être induite par leurs voisines infectées (i.e., effet bystander) après stimulation par de facteurs

immunitaires cellulaires ou viraux membranaires et/ou solubles lors de la phase chronique

d’infection (Cossarizza, 2008). D’autres formes de mort ont été décrites (i.e., nécrose,

autophagie) (Cossarizza, 2008). La mort des cellules infectées peut survenir avant qu’il n’y ait

production virale (e.g., système immunitaire compétent chez les individus non-progresseurs,

quantité létale/non-réparable de dommages de l’ADN; cf., § IV.A.2) ainsi qu’au sein des

autres types cellulaires CD4+ [e.g., macrophages; cf., revue (Cummins and Badley, 2010)].

b/ Echappement au système immunitaire des cellules infectées

Les cellules infectées par le VIH-1 peuvent cependant échapper au système

immunitaire en charge de les éliminer grâce à la mise en œuvre de différentes stratégies.

Parmi celles-ci, Nef, localisée au sein de la membrane plasmique, interfère avec la migration

et la persistance des molécules CMH de classe I à la surface cellulaire normalement en charge

de présenter les peptides viraux nécessaires à la reconnaissance par des lymphocytes T

cytotoxiques spécifiques. L’entrée en latence du provirus au sein des lymphocytes T CD4+ au

repos peut aussi être considérée comme un échappement au système immunitaire puisqu’il

permet la constitution de réservoirs viraux [cf., revue (Peterlin and Trono, 2003)].

36

c/ Latence des cellules infectées

De la même façon qu’il existe deux phases, précoce et tardive, dans le cycle de

réplication du VIH, deux types de latence ont été décrites et sont appelées pré-intégrative ou

transcriptionnelle en fonction de si elles ont lieu, respectivement, avant ou après intégration

du génome viral. L’entrée en latence du virus dépend du type cellulaire infecté et de son état

physiologique. Par exemple, un défaut en dNTP (desoxy A/T/C/G tri-phosphate) au sein de la

cellule (i.e., lymphocytes T CD4+ quiescents) induit une transcription inverse incomplète, ce

qui correspond à de la latence pré-intégrative. Par contre, un défaut en facteurs de

transcription [i.e., NF-κB (nuclear factor kappa B)] au sein de la cellule (i.e., lymphocytes T

CD4+ au repos) empêche l’expression virale et induit une latence transcriptionnelle. Les

différentes formes de latence du VHI-1, et en particulier, la latence transcriptionnelle, seront

décrites dans le chapitre III de cette thèse.

II/ VECTEURS LENTIVIRAUX :

LES LENTIVIRUS COMME VECTEURS DE GENES

A/ INTERETS DES RETROVIRUS COMME VECTEURS DE GENES

1/ Importance des vecteurs rétroviraux dans le transfert de gènes

Le transfert de gène basé sur les rétrovirus repose sur le remplacement des gènes

viraux par des gènes d’intérêt, pouvant être transférés à des taux importants grâce à une

machinerie rétrovirale minimale, dans le cadre d’applications en thérapie génique mais aussi

comme outils en recherche fondamentale.

Le concept d’utilisation des rétrovirus comme vecteurs de gènes a émergé dans le

début des années 1980 avec la création du premier vecteur gammarétroviral basé sur le Mo-

MLV (Tabin et al., 1982). Le développement des premiers lentivecteurs a ensuite été mis au

point rapidement après la découverte du VIH-1 dès 1990 et a considérablement bénéficié des

avancées déjà acquises dans les recherches sur les vecteurs d’origine gammarétrovirale ainsi

que sur les autres familles de virus (Page et al., 1990). Grâce à ce développement précoce, les

vecteurs rétroviraux ont été les premiers vecteurs viraux à entrer en essais cliniques en 1989

(Rosenberg et al., 1990). Ils ne représentent cependant en 2012 plus que ~23 % (toutes

origines confondues) des vecteurs utilisés en thérapie génique (Figure 11). Le concept de

thérapie génique est de traiter des maladies par le transfert de matériel génétique. Ainsi, les

37

vecteurs rétroviraux sont particulièrement adaptés au traitement par transfert de gène des

maladies monogéniques pour lesquelles, en théorie, le remplacement stable du gène

défectueux/muté homozygote récessif pourrait suffire à traiter la pathologie. Cependant, si les

vecteurs rétroviraux sont des outils génétiques de premier choix du fait de leur capacité à

s’intégrer stablement dans le génome de leur hôte, la sécurité du transfert de gène doit être

garantie, surtout lorsqu’il est à visée thérapeutique, en empêchant notamment la mutagenèse

insertionnelle et/ou la production de particules virales.

A l’heure actuelle, la plupart des vecteurs rétroviraux utilisés dérive des lentivirus

(VIH), gammarétrovirus (Mo-MLV) et, de façon plus minoritaire, des spumavirus (PFV).

Figure 11 : Vecteurs viraux et non-viraux utilisés en essais cliniques de thérapie génique

en 2012 (Source : http://www.abedia.com/wiley/vectors.php, des Editions Wiley).

2/ Propriétés des rétrovirus et conséquences pour le design de vecteurs dérivés

Ce paragraphe décrit les propriétés des rétrovirus ainsi que les avantages et

inconvénients qu’ils confèrent aux vecteurs rétroviraux. Les aspects concernant l’amélioration

du design de vecteurs (acquises et en cours d’exploration) seront développés ultérieurement

(cf., § II.B.1).

a/ Avantages liés à l’utilisation des rétrovirus comme vecteurs de gènes

i/ Intégration de l’ADN viral dans la chromatine hôte

Comme souligné ci-dessus, les vecteurs rétroviraux ont la capacité de pouvoir

s’intégrer stablement au sein du génome des cellules qu’ils infectent. Cette propriété unique

chez les virus assure l’expression à long terme du transgène au sein des cellules transduites et

de leur descendance. Cependant, le site d’intégration de l’ADNv ne peut être ciblé au sein de

38

la chromatine, ce qui est un inconvénient majeur pouvant être contourné grâce à l’utilisation

de vecteurs rétroviraux non-intégratifs (aspects développés dans les § I.B.4 et II.A.2).

ii/ La transcription inverse de l’ARN viral et duplication des LTRs

L’organisation génétique même des rétrovirus facilite le design des vecteurs qui en

dérivent puisque le transgène se trouvera bordé de deux LTRs après transcription inverse (qui

les dupliquent) et intégration au sein du génome hôte (cf., § I.6.c). La délétion au sein des

LTRs des vecteurs de transfert de troisième génération (aspect développé dans le § II.3.c)

permet l’inclusion de promoteurs, insulateurs, ou séquences régulatrices de l’expression qui

seront donc systématiquement dupliqués lors de la transcription inverse. Cependant, la

transcriptase inverse des rétrovirus a un taux d’erreurs important [excepté chez les spumavirus

(Rinke et al., 2002)]. Cette source de variabilité génétique chez les rétrovirus peut leur

conférer un avantage sélectif mais aussi provoquer des mutations du transgène.

iii/ Import nucléaire des lentivirus

Grâce à leur capacité d’import de l’ADNv au noyau, les vecteurs dérivés des lentivirus

sont les seuls parmi les rétrovirus à pouvoir transduire à la fois des cellules se divisant et

quiescentes, notamment les cellules souches et progénitrices (Reiser et al., 1996), les

hépatocytes primaires (Pfeifer et al., 2001), les neurones (Naldini et al., 1996a), les monocytes

et les macrophages (Weinberg et al., 1991). Cette capacité unique permet d’élargir

considérablement le tropisme de cellules/tissus disponibles pour le transfert de gènes dans le

cas de vecteurs pseudotypés, ce qui a favorisé l’utilisation de lentivecteurs au détriment des

vecteurs d’origine gammarétrovirale.

iv/ Pseudotypage des vecteurs rétroviraux

L’utilisation d’enveloppes hétérologues pour la production des vecteurs rétroviraux

sans pour autant modifier les caractéristiques des particules virales a été un développement

initial majeur acquis dès 1990 pour les lentivecteurs (Page et al., 1990). Le pseudotypage

représente un avantage considérable pour ne pas être limité dans le choix des cellules à

transduire et/ou cibler un type cellulaire donné. De plus, l’utilisation d’une glycoprotéine

d’enveloppe amphotrope (i.e., capable de se répliquer dans différents hôtes) stable [e.g.,

glycoprotéine G du VSV, VSV-G] permet une concentration par ultracentrifugation des

surnageants viraux et leur stockage à long terme (Burns et al., 1993).

39

v/ Immunogénicité faible lié au transfert de gènes

Les rétrovecteurs (gammarétrovecteurs et lentivecteurs) peuvent déclencher une

réaction immunitaire innée et adaptative dirigée contre les particules virales, les cellules

transduites et/ou le produit du gène transduit par le vecteur in vivo (Matrai et al., 2010).

L’immunogénicité des particules rétrovirales est cependant relativement faible si elle

comparée à celle provoquée par la transduction d’autres systèmes viraux [e.g., vecteurs

adénoviraux et adeno-associated virus (AAV)] et est dépendante du design du vecteur, de la

voie d’administration et du dosage de l’injection (Nayak and Herzog, 2010).

Le design actuel des vecteurs lentiviraux (non-réplicatifs) permet également de ne pas

transduire de séquences codantes complètes de protéines virales, ce qui empêche donc

l’expression de protéines virales au sein de l’hôte après transduction (cf., § II.3.d).

b/ Limites liées à l’utilisation des rétrovirus comme vecteurs de gènes

Un certain nombre de limites existe dans le transfert de gène mettant en œuvre les

vecteurs lentiviraux qui, bien qu’ayant (au moins en partie) été dépassées, contribue

aujourd’hui à réduire l’utilisation des vecteurs lentiviraux en thérapie génique.

i/ Intégration non-ciblée du trangène

L’intégration non-ciblée des rétrovirus au sein du génome de la cellule hôte peut

provoquer un phénomène de mutagénèse insertionnelle (Figure 12). Celui-ci est caractérié

par différents mécanismes dont l’inactivation d’un gène cellulaire et/ou des modifications de

l’expression des gènes avoisinant le site d’intégration. Ces dernières impliquent l’activation

de proto-oncogènes, l’interférence entre promoteurs, ou encore la transcription au-dela du site

de terminaison au sein des gènes hôtes voisins (Nowrouzi et al., 2011). Notamment, il a été

récemment décrit que l’intégration d’un transgène au sein de régions transcrites pouvaient

induire des épissages aberrants de transcrits chimériques (Moiani et al., 2012). La génération

d’une mutagénèse insertionnelle peut aboutir à une dominance clonale voire à une oncogenèse

insertionnelle (Pauwels et al., 2009). Un exemple historique est l’activation insertionelle du

gène LMO2 (LIM domain only 2, connu comme proto-oncogène) par l’enhancer LTR observé

après introduction de vecteurs gammarétroviraux, qui a contribué à la leucémogénèse chez

cinq patients traités par thérapie génique dans le cas de déficit immunitaire combiné sévère lié

à l'X (SCID-X1) dans deux essais cliniques indépendants (Fischer et al., 2011; Hacein-Bey-

Abina et al., 2008; Hacein-Bey-Abina et al., 2003; Howe et al., 2008).

40

Les rétrovirus ont des profils d’intégration différents au sein du génome hôte (cf., §

I.B.6). Les préférences de sites d’intégration peuvent ainsi influencer la génotoxicité

potentielle des vecteurs (Cattoglio et al., 2007; Nienhuis et al., 2006) et seraient le reflet

d’interactions différentielles entre les protéines de l’hôte (i.e., LEDGF/p75 dans le cas des

lentivirus; cf., § I.B.6) et la machinerie d’intégration virale (Lewinski and Bushman, 2005).

Les lentivirus possèdent donc un profil d’intégration relativement plus sûr que celui des

gammarétrovirus (même si l’insertion d’un lentivecteur peut toucher un gène hétérozygote

et/ou suppresseur de tumeur) (Pauwels et al., 2009).

Le déterminant majeur de la génotoxicité potentielle du vecteur intégré reste le LTR

dont l’inactivation (i.e., self-inactivating, SIN) augmente considérablement la sécurité du

vecteur transduit, même lorsqu’il est d’origine gammarétrovirale (Montini et al., 2009)

(aspect développé dans le § II.B.1).

ii/ Variations de l’expression du transgène

L’altération de l’expression d’un transgène est désignée sous le terme de

silencing. Cependant, ce terme général regroupe différents phénomènes pouvant affecter

l’expression d’un transgène après transduction rétrovirale (Figure 12) (Ellis, 2005). Il peut y

avoir une absence d’expression virale immédiatement après transduction, que nous appelerons

silencing par la suite (Figure 12). De plus, le site d’intégration peut impacter positivement ou

négativement sur l’expression transgénique. Cet effet de position peut éventuellement

conduire à de la variégation qui se caractérise par des différences d’expression au sein d’une

population portant le provirus à un même locus (Figure 12). Enfin, l’extinction correspond à

la diminution progressive de l’expression au cours du temps d’un provirus initialement

exprimé (Ellis, 2005).

41

Figure 12 : Conséquences de l’intégration non-ciblée du vecteur sur l’expression

transgénique. L’intégration non-ciblée du vecteur a deux impacts majeurs sur son efficacité.

(Gauche) La structure chromatinienne à proximité du vecteur intégré peut influencer

l’expression du transgène, négativement ou positivement. Elle induit ainsi un silencing de

l’expression et/ou une variégation due à l’effet de position (aussi appelée effet de position du

chromosome). (Droite) Les séquences du vecteur peuvent aussi influencer l’expression des

gènes hôtes, ce qui augmente le risque de mutagénèse insertionnelle et parfois l’activation de

proto-oncogènes (aussi appelée génotoxicité médiée par le vecteur) [issue de (Emery, 2011)].

Ainsi, l’expression du transgène peut éventuellement être perdue par silencing et/ou

extinction après transduction. Il est donc indispensable de la contrôler grâce au choix des

promoteurs et l’utilisation de séquences modulatrices de l’expression (e.g., insulateurs,

aspects développés dans le § II.B.5) [cf., revue (Emery, 2011)].

iii/ Génération de particules virale recombinantes

Lors de la production de rétrovecteurs incapables de se répliquer, il existe un risque de

potentiellement générer et propager un vecteur compétent pour la réplication par

recombinaison homologue entre des séquences virales se chevauchant (Bastone and Lochelt,

2004). Ce risque diminue grâce à la séparation des régions codantes pour les protéines

structurales des éléments cis associés au gène d’intérêt permettant son transfert (qui augmente

de fait le nombre de recombinaisons nécessaires à la génération de vecteurs recombinants).

De plus, l’absence de chevauchement entre séquences virales diminue également le risque de

mobilisation. La mobilisation est un phénomène de rescue de la réplication virale à partir de

gènes rétroviraux endogènes (i.e., HERV) ou exogènes lors de thérapie génique effectués sur

des patients porteurs du VIH-1 (Levine et al., 2006) [cf., revue (Pauwels et al., 2009)].

42

iv/ Limites des rétrovecteurs comparés aux autres systèmes

La taille de l’insert (e.g., transgène, séquence modulatrice, promoteur interne) pouvant

être introduit au sein des rétrovecteurs est limitée (10 kb) comparée à celle de vecteurs dérivés

du virus de l’Herpès simplex (150 kb) ou du virus de la vaccine (50 kb) (Warnock et al.,

2011).

Le titre viral maximal obtenu lors de la production de lentivecteurs est faible (i.e., ~107

génomes viraux/mL) et difficilement transposable à une production industrielle s’il est

comparé à celui obtenu lors d’une production de AAVs (i.e., ~1012

génomes viraux/mL)

(Warnock et al., 2011). De plus, il ne peut actuellement pas être amélioré grâce à l’utilisation

de lignées d’encapsidation qui exprimeraient stablement les (glyco)protéines d’enveloppe

(i.e., toxicité) ou d’assemblage (cf., § II.B.5) (Schweizer and Merten, 2010).

B/ LA CONVERSION D’UN LENTIVIRUS EN UN LENTIVECTEUR :

DEVELOPPEMENT & DESIGN

1/ Evolution du concept du design de lentivecteurs

Les premiers vecteurs dérivés du VIH-1 furent décrits dès 1990. Ils étaient simplement

basés sur la séparation des séquences codants les protéines structurales et enzymatiques du

VIH-1 du gène codant l’enveloppe du virus (pouvant aussi être hétérologue) (Helseth et al.,

1990; Page et al., 1990) et ouvraient la voie au pseudotypage des lentivecteurs, déjà existant

chez les gammarétrovecteurs, et à l’élargissement de leur tropisme cellulaire.

Le concept du design de vecteurs a ensuite évolué afin d’améliorer l’efficacité et la

sécurité des vecteurs en prévenant tout risque de produire des vecteurs recombinants et/ou de

mutagenèse insertionnelle en thérapie génique, comme décrit précédemment (cf., § II.A.2).

Ces inconvénients seraient également dommageables en recherche puisqu’ils pourraient

aboutir à des biais dus à des évènements de recombinaison (e.g., étude de virus non-

réplicatifs) et/ou à un changement d’expression au sein des cellules transduites (e.g.,

transformation cellulaire).

Le développement de rétrovecteurs était principalement basé sur le concept de

séparation en différents plasmides des séquences agissant en cis essentielles au transfert du

génome viral (fournies par le vecteur de transfert/navette) et des éléments trans qui codent les

protéines virales nécessaires à la formation des particules virales et à leur infectivité (fournis

43

par les vecteurs d’assemblage et d’enveloppe) (Pluta and Kacprzak, 2009). Ce concept, acquis

dans le développement des gammarétrovecteurs, a pour but d’augmenter le nombre de

recombinaisons homologues nécessaire à la formation d’une particule virale (i) recombinante

et/ou (ii) issue de la mobilisation de séquences virales déjà présentes (i.e., individus infectés,

HERVs), tout en diminuant les homologies des séquences des différents plasmides

nécessaires à la production de virions (Pauwels et al., 2009).

L’évolution dans la construction de vecteurs rétroviraux les plus sûrs et performants

possibles s’est ensuite caractérisée par le développement successif de différentes générations

de navettes avec l’élimination de séquences homologues et/ou ajout de séquences

hétérologues pouvant être issues d’autres virus (e.g., tropisme, éléments cis améliorant

l’infectivité) (Pauwels et al., 2009; Pluta and Kacprzak, 2009 ).

2/ Production de particules lentivirales

a/ Principe

Le protocole de production de particules virales est mis en œuvre à l’aide d’une

transfection plasmidique au phosphate de calcium (Chen and Okayama, 1987) ou utilisant des

transfectants commerciaux. Au moins trois plasmides codant l’enveloppe, le transgène ou les

protéines structurales et enzymatiques sont transfectés de façon transitoire au sein de cellules

productrices qui produisent ainsi des particules virales (Figure 13-haut).

b/ Cellules productrices

La lignée cellulaire HEK (Human Embryonic Kidney) 293T est utilisée principalement

pour la production de particules virales car la présence de l’antigène T de SV40 (Simian Virus

40) lui confère une croissance cellulaire et une efficacité de production virale supérieure à

celles des HEK 293 dans les mêmes conditions (Merten et al., 2011). L’utilisation d’autres

types cellulaires humains ou de primates (e.g., HeLa, COS-7) réduit également le taux de

production virale, à l’exception des cellules COS-1 (Schweizer and Merten, 2010). De façon

alternative, des lignées d’encapsidation exprimant stablement ou de façon inductible

l’enveloppe (e.g., VSV-G) et/ou les protéines structurales et enzymatiques ont été testées afin

de substituer la transfection de plusieurs plasmides qui réduit l’efficacité de production virale

(Schweizer and Merten, 2010). Cependant, bien que cette pratique ait été réussie pour la

production rétrovirale (i.e., lignée Phoenix) (Coroadinha et al., 2010), elle n’a pas pour le

44

moment pas été fructueuse pour la production lentivirale du fait de la toxicité des protéines

exogènes exprimées (e.g., VSV-G) (Schweizer and Merten, 2010).

c/ Concentration et stockage

Les surnageants viraux pseudotypés à l’aide de glycoprotéines d’enveloppe peuvent

être concentrés par différentes techniques qui permettent d’augmenter significativement le

titre viral des préparations (Kutner et al., 2009). La concentration des productions virales peut

se faire par ultracentrifugation (~105 g pendant 1-4h à 4°C), centrifugation à haute vitesse sur

un temps long (~104 g pendant 8-12h à 4°C), précipitation au phosphate de

calcium/polyéthylène glycol ou filtration centrifuge (Sakuma et al., 2012). Il est à noter que

l’efficacité de concentration des surnageants viraux peut être affectée par la présence de

sérums dans le milieu de culture, notamment en cas de centrifugation à haute vitesse ou de

filtration centrifuge (Sakuma et al., 2012). Les productions virales ainsi concentrées peuvent

ensuite être aliquotées et stockées à -80°C pour une conservation à long terme.

d/ Titrations

Figure 13 : De la transfection de plasmides à l’intégration d’un vecteur self-inactivating

(SIN) au sein de la chromatine de la cellule infectée. (Haut) Représentation schématique de

la méthode de production de particules virales réalisée à l’aide d’une tri-transfection

plasmidique. Les virions (contenant deux brins d’ARNg, Milieu) ainsi générés sont ensuite

transduits (Bas) au sein des cellules cibles au sein desquelles l’ARN viral est rétro-transcrit en

un ADN qui s’intègre sous la forme de provirus. Il est à noter que la délétion de la séquence

U3 du 3’LTR de l’ARN viral est dupliquée lors de la transcription inverse en ADN [adaptée

de (Pluta and Kacprzak, 2009)].

45

Avant transduction des virions (contenant deux brins d’ARNg, Figure 13-milieu) au

sein de lignées cellulaires ou cellules primaires cibles (Figure 13-bas), les surnageants viraux

concentrés doivent être titrés à l’aide de différentes méthodes pouvant être complémentaires.

Les composants des particules virales peuvent être mesurés en déterminant la concentration

de la protéine p24 (par test Elisa), l’activité de la transcriptase inverse, ou le nombre de copies

du génome viral (par RT-Q-PCR, Real-time-Quantitative Polymerase Chain Reaction)

(Sakuma et al., 2012). Le nombre de copies d’ADNv (intégré ou non) et/ou l’expression du

transgène des cellules infectées peuvent également être mesurés par Q-PCR ou

cytofluorométrie, respectivement (Sakuma et al., 2012).

3/ Développement de différentes générations de vecteurs lentiviraux

La première génération de vecteurs était basée sur la production virale à partir de trois

plasmides dont les fonctions d’assemblage étaient fournies par un plasmide codant Env (ou

une enveloppe hétérologue, e.g., VSV-G) et un plasmide d’assemblage (packaging) exprimant

toutes les autres protéines virales (Figure 14-haut). L’expression à partir de ces deux

plasmides était sous le contrôle d’un promoteur viral (e.g., CMV, RSV) et d’un signal de

polyadénylation [poly(A)] hétérologue (e.g., SV40, insuline) (Naldini et al., 1996a; Naldini et

al., 1996b). Le vecteur de transfert était composé d’une cassette d’expression encadrée par

deux LTRs natifs et portant les séquences nécessaires à l’export des ARN viraux au sein des

cellules productrices (RRE, SA et SD, également présentes dans le plasmide d’assemblage), à

l’assemblage du génome (Ψ) et à la transcription inverse (PBS, cPPT/CTS, PPT), comme

identifié par Parolin et al. (Parolin et al., 1994) (description de ces éléments, cf., § I.A.4).

La suppression des gènes viraux accessoires (vif, vpr, vpu et nef), importants pour la

virulence et la pathogénéicité du VIH-1, du plasmide d’assemblage a ensuite permis de

produire les vecteurs de deuxième génération (Zufferey et al., 1997) (Figure 14-milieu). La

troisième génération fut créée en éliminant le gène tat du premier plasmide d’assemblage et

en apportant Rev à l’aide d’un second plasmide d’assemblage (Dull et al., 1998; Kim et al.,

1998) (Figure 14-bas). Ce système de production lentivirale a permis d’augmenter la

biosécurité des vecteurs générés grâce à la diminution des chevauchements entre régions

codantes pour les composants viraux nécessaires à l’assemblage des particules virales et à

l’élimination de tat.

46

Figure 14 : Représentation schématique des différentes générations de vecteurs dérivés

du VIH-1. (Haut) La première génération de vecteurs dérivés du VIH-1 inclut toutes les

protéines virales, excepté la protéine Env, sur un plasmide d’assemblage. VSV-G est fournit

par un plasmide différent, dit d’enveloppe. Le plasmide navette dérivé du VIH-1 contient les

LTRs natifs et le transgène sous contrôle d’un promoteur viral fort, le CMV. (Milieu) La

deuxième génération de vecteurs basés sur le VIH-1 a été générée en excluant toutes les

protéines accessoires du plasmide d’assemblage. L’expression de la glycoprotéine

d’enveloppe et du transgène ont été fournis par deux plasmides différents identiques à ceux

décrits dans le panel du haut. (Bas) La troisième génération de vecteurs dérivés du VIH-1

nécessite quatre plasmides différents. En plus des trois plasmides [i.e., plasmides (i)

d’assemblage, (ii) codant l’enveloppe et (iii) navette], la protéine Rev est fournit par un

plasmide supplémentaire. Le plasmide navette a également été modifié en éliminant

complètement la région U3 du 5’LTR remplacée par un promoteur viral fort (i.e., RSV ou

CMV) et partiellement la région U3 du 3’LTR [issue de (Sakuma et al., 2012)].

Une stratégie majeure pour l’amélioration de la sécurité des vecteurs lentiviraux a

impliqué la délétion des éléments promoteur et enhancer localisés dans la région U3 du

3’LTR du vecteur de transfert (Dull et al., 1998; Iwakuma et al., 1999; Miyoshi et al., 1998;

Zufferey et al., 1998), déjà appliquée avec succès aux gammarétrovecteurs (Yu et al., 1986)

(Figure 14-bas). La région U3 du LTR contient des éléments, dont une TATA-box et des

sites de fixation pour SP-1 (SV40-promoter specific factor 1), NF- B (Nuclear Factor κB) et

NFAT (nuclear factor of activated T cells), essentiels à l’activité du promoteur 5’LTR du

47

VIH-1 (pour plus de détails, cf., § III.B.1). L’activité promotrice du 5’LTR du vecteur navette

permet (i) la production d’ARN viral suffisante pour une encapsidation efficace et leur

transfert au sein de particules virales et (ii) l’expression du vecteur navette intégré au sein des

cellules transduites (Figure 13-milieu). La délétion partielle de la région U3 du 3’LTR est

dupliquée dans le 5’LTR du vecteur intégré (Figure 13-milieu) dont l’activité promotrice est

considérablement réduite (de 90 %). Les LTRs (et les vecteurs) ainsi générés sont appelés SIN

(self-inactivating). Toutefois, le promoteur/enhancer remplacant le 5’LTR doit être

constitutivement actif et suffisamment fort pour assurer une production virale efficace en

absence de Tat [e.g., CMV ou promoteur/enhancer chimère RSV-HIV du pRRL.SIN.hPGK-

gfp, éliminé lors de la transcription inverse (Dull et al., 1998)] (Figure 14-milieu).

Les caractéristiques des différentes générations de vecteurs dérivés du VIH-1 sont

analysées dans le tableau 6.

Tableau 6 : Comparaison des systèmes de productions lentivirales. Il est à noter que le

niveau de sécurité lié à l’utilisation des vecteurs lentiviraux in vivo est variable en fonction

des expériences menées, d’un niveau de sécurité 1 pour le maintien d’animaux inoculés à un

niveau 3 pour les animaux greffés avec des cellules humaines transduites. RCL, replication

competent lentivector [adaptée de (Pauwels et al., 2009)].

Première génération Deuxième génération Troisième génération

Nombre de plasmides

transfectés 3 3 4

Délétion dans le

3’LTR (SIN) Non Non Oui

Nombre de plasmides

d’assemblage

(contenant les gènes

du VHI-1)

1 1 2

Gènes accessoires

(vif, vpr, vpu, nef) Tous présents Tous absents Tous absents

Séquences codantes

les protéines

Tat et Rev

Présentes sur un même

plasmide d’assemblage

Présentes sur un même

plasmide d’assemblage

Tat est absente, Rev

est codé par un

plasmide d’assemblage

indépendant

Nombre de

recombinaisons pour

former un RCL

2 3

4, entre plasmides sans

homologie et trans-

complémentation de la

délétion SIN

Niveau de sécurité

in vitro 3 2 1

48

D’autres systèmes de productions lentivirales disponibles dans le commerce ont été

générés à partir des connaissances issues de l’étude des vecteurs de deuxième et troisième

générations. Ils sont notamment basés sur l’utilisation de vecteurs navette non-SIN [Lenti-

X™ (Kappes and Wu, 2001)] ou SIN [Translentiviral™ (Kappes and Wu, 2001)] et d’au

moins trois plasmides d’assemblage qui séparent les gènes gag de pol (Wu et al., 2000,

Kappes, 2001 #504) ainsi que l’expression de la protéase (Westerman et al., 2007), ce qui

limite le chevauchement entre séquences du VIH-1. Toutefois, les efficacités de production

sont mises à l’épreuve par le nombre de plasmides nécessaires pour produire la totalité des

gènes viraux complémentaires (réduites à partir de quatre plasmides transfectés). La création

de vecteurs hybrides associant les composants d’assemblage d’un vecteur de transfert dérivé

du VIH-1 à ceux d’un second virus [SIV (White et al., 1999) ou chimères VIH-1/VIH-2

(Sachdeva et al., 2007)] a également été testé afin de réduire la probabilité de recombinaison

homologue.

4/ Vecteur de transfert minimal

Le « squelette » du vecteur de transfert ne doit contenir qu’un minimum de séquences

virales, ce qui diminue les homologies de séquences tout en permettant l’introduction d’un

insert, i.e., transgène et/ou éléments régulateurs (e.g., insulateurs), de taille importante si

nécessaire.

Figure 15 : Eléments cis essentiels du vecteur navette. Les position et fonction de chacun

des éléments cis sont annotées. Ces séquences peuvent être homologues (décrites dans le §

I.A.4) ou hétérologues (i.e., promoteur interne CMV, WPRE, décrits dans le § II.B.4). WPRE,

WHV (woodchuck hepatitis virus) PRE (post-transcriptional regulatory element) [issue de

(Sakuma et al., 2012)].

49

Cependant, un certain nombre d’éléments cis homologues (décrits dans le § I.A.4) ou

hétérologues doivent être présents au sein du vecteur de transfert pour assurer (i) une

production virale optimale, (ii) un transfert efficace du transgène et (iii) une expression

performante et sûre (Figure 15). Ces trois critères, essentiels au design d’un vecteur efficace,

doivent donc être pris en compte pour assurer un compromis entre la taille du vecteur (dont

l’augmentation trop importante peut diminuer le titre viral) et son efficacité. Ces éléments cis

peuvent provenir du VIH-1 s’ils sont essentiels aux trois paramètres cités ci-dessus (ce qui a

pu conduire à leur ré-insertion, i.e., cPPT) ou être remplacés/améliorés par des séquences

hétérologues (Figure 15, Tableau 7).

Tableau 7 : Exemples d’élément cis essentiels à un vecteur minimal basé sur le VIH-1.

Eléments cis

essentiels Origine Fonctions (références)

cPPT VIH-1

Présence de la séquence cPPT-CTS indispensable à l’obtention d’une bonne

efficacité de transduction in vitro et in vivo, qui est fortement stimuler (> 10 fois)

[comparé aux vecteurs ne le contenant pas (Follenzi et al., 2000; Park and Kay,

2001; Sirven et al., 2000; Van Maele et al., 2003)].

RRE VIH-1

Permet l’assemblage de l’ARN (Parolin et al., 1994). Réduction significative du

titre viral en son absence [de 5 fois comparé aux systèmes contenant Rev/RRE,

(Kotsopoulou et al., 2000)]. Indépendance vis-à-vis de Rev/RRE possible grâce à

l’insertion de plusieurs séquences du CTE (constitutive transport element) du

MPMV (Mason-Pfizer monkey virus) (Bray et al., 1994; Oh et al., 2007) dans le

vecteur de transfert et/ou le plasmide d’assemblage, pour obtenir des titres viraux

équivalents à ceux des systèmes contenant Rev/RRE (Srinivasakumar et al.,

1997).

WPRE WHV

Augmente la quantité d’ARN non-épissés (Zufferey et al., 1999), ce qui permet

d’améliorer la performance du transfert de gène (expression du transgène dans les

cellules transduites, titre viral) (Oh et al., 2007; Schambach et al., 2007). Contient

le gène x tronqué impliqué dans l’oncogénese (Kingsman et al., 2005) sous forme

mutée (Zanta-Boussif et al., 2009).

Malgré tous les efforts fournis pour obtenir un design de vecteurs sûrs et performants,

un certain nombre de challenges reste encore à accomplir afin, notamment, de sécuriser

l’expression du transgène, en ciblant par exemple son intégration ou l’isolant de façon spatio-

temporelle. Toutefois, toutes les connaissances sur la biologie des (rétro)virus ne sont pas

acquises et il est actuellement impossible d’anticiper tous les problèmes qui pourront se poser

après modification du design de vecteur. De plus, il est essentiel d’avoir une meilleure

connaissance des interactions vecteur/hôte afin de pouvoir également anticiper les problèmes

posés par les interactions du vecteur avec son hôte dans un contexte pathologique.

50

5/ Stratégies pour l’amélioration des vecteurs lentiviraux : contrôle et sécurité de

l’expression trangénique

a/ Ciblage de l’entrée du virus au sein de la cellule hôte

Un pseudotypage optimal des lentivecteurs permet de cibler spécifiquement les

cellules à transduire afin de limiter la toxicité due à une transduction cellulaire non-

appropriée. L’utilisation de l’enveloppe VSV-G, historique pour le pseudotypage des

gammarétrovecteurs et lentivecteurs, est non-spécifique (i.e., enveloppe amphotrope), peut

être cytotoxique et ne permet pas la transduction efficace des cellules quiescentes [du à un

défaut de stimulation des étapes précoces, e.g., transcription inverse (Serafini et al., 2004)].

Une entrée sélective des lentivecteurs nécessite alors un pseudotypage exploitant le tropisme

naturel d’autres virus, à l’aide de glycoprotéines d’enveloppes d’autres rétrovirus [e.g.,

glycoprotéines H et F du virus de la rougeole qui assure l’activation transitoire des cellules B

quiescentes (Frecha et al., 2009)] ou d’autres virus enveloppés [e.g., enveloppe neurotropique

du virus de la rage (Federici et al., 2009)]. Le pseudotypage peut aussi être créé

artificiellement (génétiquement et/ou chimiquement) en utilisant des enveloppes

recombinantes/chimères pour le ciblage de molécules de surface cellulaires particulières

[domaines de glycoprotéines virales fusionnés entre eux (Zhang et al., 2004) ou avec des

domaines d’interactions, e.g., ligands (Froelich et al., 2009) ou anticorps (Ziegler et al.,

2008)]. Un pseudotypage alternatif à l’enveloppe VSV-G pourrait cependant générer des

vecteurs plus fragiles/instables (Strang et al., 2004).

b/ Utilisation de vecteurs déficients pour l’intégration

Une stratégie alternative pour éviter les effets négatifs de l’intégration repose sur

l’utilisation de lentivecteurs non-intégratifs (NILVs), aussi appelés lentivecteurs défectifs

pour l’intégration (IDLVs).

Ces vecteurs lentiviraux ne peuvent intégrer leur génome au sein de la chromatine hôte

du fait de mutation(s) introduite(s) dans l’IN (Figure 16-gauche). L’IN a trois domaines

fonctionnels (i.e., core catalytique et extrémités C- et N-terminales, Figure 16-gauche) et les

mutations générées se sont pas toutes égales. En effet, elles peuvent affecter uniquement

l’intégration mais aussi les autres rôles de l’IN dans le cycle du VIH-1 (i.e., mutations de

classe I et II, respectivement) (Figure 16-droite). La génération d’IDLVs met en œuvre des

mutations de classe I, en particulier au sein du core catalytique de l’IN (e.g., résidus D116,

D64, E152) (Figure 16-gauche). Ces mutations de l’IN peuvent être accompagnées de

51

modifications des sites att du LTR (Figure 16-droite) et/ou substituées par le traitement des

cellules transduites avec des inhibiteurs de l’intégration (i.e., raltégravir) [cf., revue (Banasik

and McCray, 2010)].

En absence d’intégration, les espèces d’ADN virales majoritaires sont les cercles à 1-

et 2-LTRs qui, comme décrit dans le paragraphe I.B.4, sont normalement issus d’une

intégration abortive (Figure 16-droite) et peuvent être le support d’une expression virale. Ces

épisomes étant stables, ils peuvent se maintenir et garantir une expression transitoire ou stable

au sein de cellules transduites différenciées ou quiescentes, respectivement, ces dernières

étant les cibles préférées des transductions par des lentivecteurs (Poon and Chen, 2003; Saenz

et al., 2004). Les cercles à 1- et 2-LTRs permettent uniquement une expression transitoire

dans les cellules en division desquelles ils sont éliminés par dilution. Cependant,

l’introduction d’éléments/signaux de maintien [i.e., SAR/MAR (scaffold/matrix-attached

region), origine de réplication du SV40] au sein des formes circulaires d’ADNv permettrait de

les maintenir dans les cellules qui prolifèrent (Baiker et al., 2000 ; Glover et al., 2005; Vargas

et al., 2004 ) [cf., revue (Wanisch and Yanez-Munoz, 2009)].

Figure 16 : Mutations de l’IN et conséquences sur les étapes du processus d’intégration.

(Gauche) Représentation schématique des trois domaines de l’IN et des mutations (indiquées

par des flèches) permettant de l’inactiver dans le cadre des approches IDLV. Les mutations

affectant l’activité catalytique de l’IN sont indiquées en gras. Les mutations affectant la

fixation de l’ADN sont soulignées. Les autres mutations sont en italique. (Droite) Les

conséquences des différentes mutations affectant les étapes du processus d’intégration

(détaillé dans la figure 7) sont indiquées [adaptée de (Banasik and McCray, 2010)].

52

Dans ce contexte, une approche associant IDLVs et ZFNs (zinc-finger nucleases), qui

reconnaissent et clivent un site génomique unique (Miller et al., 2007), a permis de générer

une correction génique parfaite (par recombinaison homologue) en ciblant un site d’insertion

du transgène au sein de cellules différenciées et souches (Lombardo et al., 2007). Un design

expérimental similaire associant IDLVs et méganucléases (nucléases, sauvages ou

génétiquement modifiées, de l’ADN qui reconnaissent des séquences rares) a mis en évidence

une intégration site-spécifique pouvant être multiple (Izmiryan et al., 2011)

Toutefois, la transduction d’IDLVs peut induire une intégration résiduelle d’ADNv au

sein des cellules transduites à un taux généralement très bas (proche de celui observé après

transfection plasmidique) de façon intégrase-dépendante et/ou -indépendante. Cependant, des

évènements d’intégration, même rares, peuvent conduire à une mutagenèse insertionelle in

vivo [cf., revue (Wanisch and Yanez-Munoz, 2009)].

c/ Ciblage de l’intégration du transgène

Des tentatives de ciblage de l’intégration lentivirale ont été mises en œuvre à l’aide

d’IN génétiquement modifiées fusionnées à des méganucléases (Grizot et al., 2010) ou

encore, en modifiant les partenaires cellulaires de l’IN [i.e., LEDGF/p75 (Ciuffi et al., 2006;

Ferris et al., 2010)], sans succès véritable pour le moment.

d/ Isoler spatialement la cassette d’expression

L’utilisation d’éléments génétiques (structurants, i.e., insulateurs et S/MARs) était une

stratégie prometteuse pour rendre les vecteurs plus sûrs en isolant l’expression à partir d’un

transgène intégré dans l’espace et en la rendant ainsi indépendante du contexte chromatinien

hôte (cf., § II.A.2). Les insulateurs agissent comme des frontières génétiques au sein de la

chromatine en empêchant les interactions promoteur/enhancer (fonction enhancer blocker)

et/ou bloquant la propagation de l’hétérochromatine (fonction barrière) [cf., § III.A.2 et revue

(Emery, 2011)]. Les S/MARs permettent d’ancrer la chromatine à la membrane nucléaire,

l’isolant ainsi géographiquement (Heng et al., 2004). Ces éléments peuvent être introduits

dans la séquence U3 délétée ou en amont et aval du transgène au sein de vecteurs SIN.

Cependant, l’utilisation de lentivecteurs SIN contenant des insulateurs chromatiniens

pourrait ne pas résoudre le problème de mutagénèse insertionnelle. Ainsi, un cas de

dominance clonale a été détecté chez un des patients d’un essai clinique soignant la β-

thalassémie et utilisant des cellules souches hématopoiétiques transduites par un vecteur SIN

53

dérivé du VIH-1 contenant l’insulateur cHS4 (chicken hypersensitive site-4) (Cavazzana-

Calvo et al., 2010). La dominance clonale résulte de l’intégration du vecteur dans le gène

HMGA2 (high mobility group AT-hook 2), dont l’activation transcriptionnelle est associée à

des tumeurs bénignes et malignes (Cavazzana-Calvo et al., 2010).

e/ Restreindre l’expression transgénique de façon spatio-temporelle

Les premiers promoteurs à être utilisés dans un contexte gammarétroviral étaient

d’origine virale (e.g., issus des virus CMV, SV40) ou humaine (e.g., issu du gène codant la

phosphoglycérate kinase, PGK). Cependant, ces promoteurs induisent respectivement une

expression importante ou faible en fonction de leurs caractéristiques (cf., § III.C), et ne

permettent une expression régulée. La régulation de l’expression peut se faire dans l’espace

(au niveau d’un organisme) grâce à l’utilisation de promoteurs tissu-spécifique (e.g.,

neurones, hépatocytes, etc), ou dans le temps via des promoteurs régulés au cours du

développement ou inductibles (i.e., avec l’ajout/absence d’agents pharmacologiques). Ces

promoteurs peuvent être introduits comme les éléments décrits dans le paragraphe précédent

au sein des LTRs ou directement dans le vecteur [cf., revue (Pluta and Kacprzak, 2009)]. Il est

à noter que l’introduction d’inserts dans les LTRs est une pratique courante dans le design de

vecteurs dont l’impact réel n’a cependant jamais été clairement décrit.

f/ Améliorer la terminaison de transcription du transgène

L’amélioration de la terminaison de transcription peut à la fois améliorer l’expression

du transgène et la biosécurité du vecteur en diminuant notamment la fréquence de

transcription au-delà du site de terminaison [due à la délétion dans U3 d’enhancer du signal

de polyadénylation (Zaiss et al., 2002)]. Des séquences hétérologues augmentant la

terminaison de la transcription ont ainsi été apportées dans le vecteur de transfert. Il s’agit

d’éléments qui favorisent la reconnaissance du signal de poly(A) [e.g., USE (upstream

enhancer elements) dérivé du SV40 (Schambach et al., 2007)].

III/ L’EXPRESSION LENTIVIRALE ET SA REGULATION

A/ ORGANISATION STRUCTURALE ET SPATIALE DE LA CHROMATINE

CELLULAIRE

L’ADN du VIH-1 s’intègre préférentiellement dans les gènes hôtes

transcriptionnellement actifs qui seraient plus accessibles au sein de la chromatine (aspects

54

développés dans le § I.B.4). L’organisation de la chromatine pourrait ainsi influencer le

devenir des différentes espèces d’ADN virales.

1/ Organisation de la chromatine cellulaire

a/ Différents niveaux de condensation de la chromatine cellulaire

L’ADN génomique (ADNg) est empaqueté de façon hiérarchisée sous forme de

chromatine pour pouvoir être contenu dans le noyau. L’unité structurale et fonctionnelle

répétée qui constitue la chromatine est le nucléosome, constitué de 146 bp d’ADN enroulées

autour d’un octamère d’histones (i.e., 2 molécules de H2A, H2B, H3 et H4) (Luger et al.,

1997). Cette fibre d’un diamètre de 11 nm, appelée ‘beads-on-a-string’, représente le premier

niveau d’organisation chromatinienne (Luger et al., 1997). La fixation d’une histone linker

(H1 ou H5) sur cette fibre la condense en une structure de 30 nm de diamètre, second niveau

d’organisation de la chromatine (Robinson et al., 2006).

Des niveaux supérieurs de condensation chromatinienne existent et sont caractérisés

par des interactions intra-chromosome (e.g., entre enhancer et promoteur) et/ou inter-

chromosome (e.g., insulateurs et chromatine) pouvant impliquer la formation de boucles

chromatiniennes (i.e., chromatin looping) de stabilité variable (Deng and Blobel, 2010; Li and

Reinberg, 2011).

b/ Dynamique de la condensation de la chromatine cellulaire

La dynamique de la condensation de la chromatine est critique dans la régulation de

l’expression génique puisqu’elle détermine l’accès à l’ADN aux protéines qui s’y fixent de

façon spatio-temporelle. La compaction de la chromatine peut être modulée grâce à un certain

nombre de mécanismes, dont l’incorporation de variants d’histone (e.g., H2A.Z), les

modifications post-traductionelles covalentes des queues d’histones (e.g., par acétylation,

méthylation), la méthylation de l’ADN (associée, le plus souvent, à une inactivation de la

transcription), et la fixation de protéines architecturales non-histone (e.g., complexes de

remodelage ATP-dépendant) (Kim et al., 2009). Ces modifications réversibles des protéines

et/ou de l’ADN au sein de la chromatine sont appelées épigénétiques car elles n’affectent pas

la séquence de l’ADN mais sont transmissibles au cours des divisions cellulaires. Un exemple

caractéristique est l’hypoacétylation des histones catalysée par des enzymes spécialisées, les

déacétylases d’histones (HDACs) et corrélée à une répression transcriptionnelle, alors que

55

leur hyperacétylation par les acétyltransférases d’histones (HATs) induit une activation de la

transcription (Li et al., 2007).

c/ Dynamique de la localisation nucléaire de la chromatine cellulaire

Au sein du noyau, on distingue l’euchromatine qui correspond à des régions du

génome décondensées généralement associées à des gènes transcriptionellement actifs, de

l’hétérochromatine, qui se réfère à des zones très condensées transcriptionnellement inactives

[sous une forme facultative (réversible) ou constitutive] (Huisinga et al., 2006). Euchromatine

et hétérochromatine sont respectivement localisées au centre et à la périphérie du noyau.

Cependant, l’euchromatine est aussi retrouvée associée à la périphérie nucléaire, en particulier

aux pores nucléaires (Geyer et al., 2011).

L’organisation spatiale des chromosomes au sein du noyau a une fonction régulatrice

essentielle pour l’activation transcriptionnelle. L’initiation de la transcription implique une

dynamique de la chromatine qui peut être un mouvement vers des zones du noyau favorables

à la transcription, au niveau notamment de corps nucléaires contenant la machinerie

nécessaire à l’expression génique (i.e., transcriptional factories) (Li and Reinberg, 2011).

2/ Exemple de séquences structurantes de la chromatine : les insulateurs

L’architecture génomique et la régulation des gènes nécessitent des séquences d’ADN

particulières, les insulateurs, qui empêchent des interactions inappropriées entre domaines

chromatiniens adjacents en participant à la formation et/ou au maintien de frontières

physiques et fonctionnelles au sein du génome (Vogelmann et al., 2011).

Deux classes majeures d’insulateurs ont été identifiées des levures à l’homme: (i) les

insulateurs enhancer blockers établissent des domaines qui séparent enhancers (et parfois

silencer) et promoteurs et bloquent ainsi leur interaction, et (ii) les insulateurs barrières

préviennent le silencing des gènes euchromatiniens en créant une barrière contre la

propagation de l’hétérochromatine avoisinante, susceptible de donner lieu à de la variégation

d’expression (Vogelmann et al., 2011) (Figure 17).

L’insulateur le mieux caractérisé chez les Vertébrés à ce jour dérive du site 4

hypersensible à la DNase du LCR (locus control region) du cluster de gènes codants la β-

globine chez le poulet (appelé cHS4) et est un des rares insulateurs à posséder les deux

propriétés décrites ci-dessus (Emery, 2011).

56

Figure 17 : Propriétés des insulateurs. (Gauche) Les insulateurs « barrières » empêchent la

propagation des régions d’hétérochromatine à l’euchromatine avoisinante en les séparent

physiquement. (Droite) Les insulateurs enhancer-bloqueurs se positionnent en double-copie

entre un enhancer et un promoteur et empêchent tout contact entre ces deux éléments [adaptée

de (Emery, 2011)].

Les protéines qui fixent les insulateurs sont essentielles à leur activité. Chez les

Vertébrés, seul le facteur CTCF (CCCTC-binding factor) a été caractérisé comme protéine

insulatrice. Cependant, des homologues de protéines insulatrices caractérisées chez la

drosophile et la levure ont été récemment identifiés chez l’homme (Vogelmann et al., 2011).

CTCF est notamment responsable de l’activité enhancer blocker de l’insulateur cSH4

(Recillas-Targa et al., 2002). Chaque protéine insulatrice interagit avec un réseau unique de

partenaires (composants de la machinerie de transcription, impliqués dans le remodelage de la

chromatine, participant aux modifications d’histones et à l’architecture nucléaire) qui est

souvent défini par le contexte chromatinien et la localisation génétique de l’insulateur, ainsi

que par la phase du cycle cellulaire et le type cellulaire (Gaszner and Felsenfeld, 2006;

Vogelmann et al., 2011).

Les insulateurs peuvent : (i) favoriser l’accessibilité à la chromatine, e.g., en

interagissant/recrutant avec des facteurs de transcription ou de remodelage pour modifier les

nucléosomes/histones avoisinants et/ou en prévenant la méthylation de l’ADN ; (ii) permettre

l’établissement d’interactions sur de longues distances entre éléments éloignés et/ou le

clustering de nombreux insulateurs en ‘bodies’ ; (iii) plus généralement, les insulateurs

pourraient être impliqués dans le cloisonnement de la chromatine en interphase pour réguler

notamment l’état d’activation des gènes grâce au positionnement de la chromatine [cf., revues

(Gaszner and Felsenfeld, 2006; Vogelmann et al., 2011)].

Nous avons décrit dans ce paragraphe le génome de la cellule infectée comme un

paysage de domaines intra- et inter-chromosomiques régulés de façon complexe au sein

duquel l’ADNv peut s’intégrer et/ou s’exprimer.

57

B/ L’EXPRESSION DU VIH-1

Parmi les différentes étapes du cycle de réplication du VIH-1, son expression (après

intégration) est le principal déterminant du taux de réplication virale qui mène à la

progression de la maladie SIDA (Imai and Ochiai, 2011). De plus, l’expression du VIH-1 est

dépendante de divers facteurs cellulaires et viraux qui l’initient et la maintiennent en agissant

sur le 5’LTR du provirus (Coiras et al., 2009). Notamment, la transcription du VIH-1 est

finement régulée au niveau des étapes d’initiation et d’élongation (Karn, 2011). Ainsi, en

fonction du contexte cellulaire, l’expression du VIH-1 peut être effective, ou soumise au

silencing/latence.

1/ Organisation du 5’LTR, promoteur du génome viral

Figure 18 : Organisation du 5'LTR (et de la région leader) du VIH-1. Représentations

schématiques (A) des sites de fixation des principaux facteurs de transcription localisés dans

le 5'LTR et au début de la région leader du VIH-1 et (B) de l’organisation nucléosomale de

cette région. (A) Les régions U3, R, U5 et leader sont indiquées. Le nucléotide 1 (nt1) marque

le début de U3 dans le 5'LTR. Le site d’initiation de la transcription (TSS, ou séquence

initiatrice) correspond à la jonction entre U3 et R. Le promoteur du VIH-1 est, en outre,

constitué des trois sites de fixation à SP-1 et de la TATA-box, représentée comme site de

fixation à TBP. (B) Les sites hypersensibles au traitement à la DNase I (hypersensitives sites,

HS) n°2, 3 et 4 ainsi que la position des nucléosomes 0 et 1 (nuc-0 et -1) sont indiqués (cf.,

texte pour les correspondances) [adaptée de (Colin and Van Lint, 2009)].

Une fois intégré dans le génome hôte, Le VIH-1 sous forme provirale se comporte

comme un gène cellulaire avec, à ses extrémités 5’ et 3’, deux LTRs où débute et se termine

la transcription, respectivement (Jones and Peterlin, 1994). Ces éléments aux séquences

58

identiques, jouent différents rôles: le 5’LTR fonctionne comme un promoteur-enhancer

(Figure 18) alors que le 3’LTR contient le site (i.e., la région R) où les transcrits viraux sont

polyadénylés (Karn and Stoltzfus, 2012).

a/ Le 5’LTR, un promoteur-enhancer puissant et très optimisé

Le 5’LTR du VIH-1, constitué d’un promoteur et d’une région enhancer, contient de

multiples éléments de régulation en amont et aval du site d’initiation de la transcription

(transcription start site, TSS) qui servent de sites de fixation aux facteurs cellulaires

d’initiation de la transcription (Figure 18A).

En particulier, la région U3 contient le promoteur composé de trois sites de fixation

(en tandem) au facteur de transcription ubiquitaire SP-1 (Jones et al., 1986), une TATA-box [-

20 à -35 en amont du TSS, (Olsen and Rosen, 1992)] et une séquence initiatrice (Rittner et al.,

1995) (Figure 18A). En conséquence, le 5’LTR est un promoteur extrêmement efficace

capable de supporter de hauts niveaux de transcription, bien plus que le promoteur CMV

(Karn and Stoltzfus, 2012).

Le 5’LTR (et le début de la séquence leader en aval) possède également une région

enhancer unique, qui participe à la régulation de l’initiation de la transcription du VIH-1 et

contient de nombreux sites de fixation à divers facteurs de transcription, dont deux sites de

fixation à NF- B (Nabel and Baltimore, 1987), et des motifs permettant la fixation de NFAT

et ETS-1 (E26 transformation-specific 1) (Colin and Van Lint, 2009) (Figure 18A). Ces

activateurs permettent la réplication virale à un taux important au sein des cellules T activées

et des macrophages différenciés (Colin and Van Lint, 2009). Cependant, seuls NF- B et SP-1

sont indispensables à la réplication du VIH-1 (Perkins et al., 1993; Sune and Garcia-Blanco,

1995). De plus, d’autres sites de fixation ont été identifiés pour NFAT, AP-1 (activating

protein-1), SP-1 et IRF (interferon-responsive factor) en aval du TSS dans la région U5 du

5'LTR et le début de la séquence leader en aval (el Kharroubi and Verdin, 1994 ; Van Lint et

al., 1997; Verdin, 1991) (Figure 18A). Ces sites de fixation peuvent fonctionner

indépendamment de, ou en concert avec, les autres séquences du 5'LTR pour activer la

transcription du VIH-1 (Van Lint et al., 1997).

b/ Organisation nucléosomale du 5’LTR

Après intégration du VIH-1 au sein du génome, en fonction du contexte cellulaire, une

structure chromatinienne condensée peut se former au niveau du 5’LTR. Ainsi, dans des

59

conditions basales (i.e., en absence d’activation de la transcription), deux nucléosomes

appelés nuc-0 et nuc-1 sont positionnés de façon précise au niveau du 5’LTR. Ils rendent

inaccessible le TSS mais délimitent deux régions dépourvues de nucléosomes correspondant à

la région promoteur-enhancer [identifiées comme hypersensibles au traitement à la DNase ;

i.e., hypersensitive sites (HS)-2 et 3] et à la région régulatrice en aval du TSS (i.e., HS4)

(Verdin et al., 1993) (Figure 18B). De plus, la région en aval du 5’LTR contient trois autres

nucléosomes appelés nuc-2, nuc-3 et nuc-4 (Verdin et al., 1993). Ainsi, la structure de la

chromatine peut restreindre réversiblement l’accès du LTR ainsi que celui du génome, ce qui

contribue à réguler la transcription du VIH-1 (i.e., initiation et élongation). Cependant, le

remodelage des nucléosomes associé à l’expression du VIH-1 à partir du 5’LTR peuvent avoir

lieu après activation cellulaire (e.g., disponibilité en facteurs de transcription ; i.e.,

remodelage du nuc-1 grâce à NFAT qui se fixe à la frontière 3’ du nuc-1) ou traitement

pharmacologique [e.g., utilisation du TNF-α qui permet le recrutement de NF- B au niveau

du LTR (Verdin et al., 1993)].

2/ Expression du VIH-1 à partir du 5’LTR et régulations mises en jeu

L’activité du provirus est grandement influencée par le statut métabolique et l’état

d’activation dans lequel se trouve la cellule hôte. Dans un contexte cellulaire propice à la

réplication du VIH-1, comme au sein des lymphocytes T CD4 activés, l’expression du VIH-1

peut être régulée à différentes étapes en fonction de la présence/absence de facteurs de

transcriptions et/ou protéines virales. Ces différentes étapes sont : (i) l’initiation de la

transcription et (ii) son élongation ainsi que (iii) la maturation/export des ARNv transcrits.

a/ Expression du VIH-1 à partir du 5’LTR intégré

i/ L’initiation de la transcription du VIH-1

L’activation de la cellule T CD4+ permet la translocation au sein de son noyau de

facteurs de transcription indispensables à l’initiation de la transcription du VIH-1 grâce à leur

fixation sur le 5’LTR en conformation accessible. C’est le cas de NF- B, sous forme

hétérodimérique p50/p65, libéré de son inhibiteur I Bα (inhibitor of NF- B α-subunit)

cytoplamisque (Nabel and Baltimore, 1987), et de NFAT (Okamura et al., 2000). NFAT

interagit au sein du 5'LTR au niveau de sites qui chevauchent les sites de fixation de NF-κB

dans U3, ce qui suggère des fixations mutuellement exclusives de ces deux facteurs (Cron et

al., 2000) (Figures 18A et 19).

60

Ainsi, la transcription est initiée par la présence, au sein du promoteur-enhancer

5’LTR, de facteurs de transcription ubiquitaires (e.g., SP-1) et inductibles (après

activation/différenciation cellulaire, e.g., NF- B sous forme p50/p65) qui permettent le

recrutement de TFIID (transcription factor II D), dont la sous-unité TBP (TATA-binding

protein) fixe la TATA-box, et du complexe de pré-initiation de la transcription, dont l’ARN

pol II. L’initiation n’est en réalité effective que lorsque TFIIH (aussi appelé XPB), qui

possède des activités ATPase/hélicase/kinase, phosphoryle de l’extrémité CTD (carboxyl-

terminal domain) de l’ARN pol II et permet ainsi l’ouverture de l’ADN et la libération du

complexe de pré-initiation de la transcription du promoteur (Karn and Stoltzfus, 2012). Ce

complexe devient alors complexe d’élongation précoce de la transcription.

Figure 19: Initiation de la transcription au sein du 5’LTR. La fixation des facteurs de

transcription cellulaires (TFs), dont NFAT, NF‑κB (la fixation de ces TFs étant mutuellement

exclusives), SP-1 et AP-1, associés avec la machinerie transcriptionnelle basale au niveau du

5’LTR forme le complexe de pré-initiation de la transcription. Le recrutement de ces

différents partenaires est possible grâce à l’accessibilité accrue du 5’LTR médiée par les

HATs qui acétylent (Ac) les queues d’histones (H3, H4). L'initiation de la transcription est

effective lors de la phosphorylation de l’extrémité CTD de l’ARN polymérase II (RNAPII) et

la libération du promoteur par le complexe d’élongation précoce. Celui-ci est cependant

bloqué en absence de Tat et associé aux facteurs répresseurs DSIF et NELF [adaptée de

(Coiras et al., 2009)].

ii/ Elongation de la transcription du VIH-1

En absence de Tat, la transcription est initiée mais bloquée à proximité du promoteur à

une étape d’élongation précoce (Figure 20A). Cette pause du complexe d’élongation est un

61

mécanisme de régulation de la transcription des gènes eucaryotes nécessitant une réponse

rapide. Dans le cas du VIH-1, elle est due à la présence de N-TEF [negative transcription

elongation factor, composé de NELF (negative elongation factor) et DSIF (DRB-sensitive

inducing factor)] qui fixe l’ARN pol II hypophosphorylée (Ping and Rana, 2001), ainsi qu’à

un environnement chromatinien condensé (Figure 20A). Ainsi, de courts transcrits de 59 nt

s’accumulent dans le cytoplasme (Kao et al., 1987).

Figure 20: Mécanisme d’activation de l’élongation de la transcription par Tat. (A) En

absence de Tat, la transcription à partir du 5'LTR produit principalement de courts ARNm

contenant la structure TAR à leur extrémité 5’. N-TEF, composé de NELF et DSIF, fixe

l’ARN pol II (RNAPII) hypophosphorylée et empêche l’élongation de la transcription. (B)

Une fois synthétisée, Tat migre au noyau, fixe l’ARN tige-boucle TAR, et active l’élongation

virale en recrutant pTEFb, composé de Cdk9 et CyclT1. Ce recrutement est augmenté par

l’acétylation de Tat par PCAF sur la lysine (K) 28, localisée dans le domaine de

transactivation de la protéine virale. Cdk9 phosphoryle le domaine CTD de l’ARN pol II, ce

qui augmente sa processivité et permet la dissociation de N-TEF. De plus, l’acétylation de Tat

sur la K50 par p300 et Gcn5 promeut le relarguage de pTEFb, la dissociation de Tat/TAR et

son transfert au sein du complexe d’élongation de la transcription. Tat y recrute PCAF et le

complexe de remodelage ATP-dépendant SWI/SNF, qui expulse le nucléosome 1 (nuc-1). (C)

A la fin du processus d’élongation, la déacétylation de Tat par la SIRT1 permet sa

dissociation de l’ARN pol II et PCAF, et son recyclage pour initier un nouveau cycle

d’activation transcriptionelle [issue de (Colin and Van Lint, 2009), cf., texte pour les

abréviations du nom des protéines].

Cependant, de rares transcrits complets peuvent permettre la synthèse de quelques

molécules de Tat suffisantes pour stimuler l’élongation de la transcription. Tat se fixe alors

sur l’élément ARN TAR en tige-boucle présent à l’extrémité 5’ de tous les transcripts viraux

naissants (Dingwall et al., 1990) et recrute au niveau de son domaine N-terminal P-TEFb

(positive transcription elongation factor b), composé la cycline T1 et de la kinase Cdk9

(cyclin-dependent kinase 9) (Figure 20B) (Garber et al., 1998), jusque-là séquestré par le

complexe 7SK snRNP (small nuclear ribonucleoprotein). Ce recrutement est augmenté par

62

l’acétylation de Tat par PCAF [p300/CREB-binding protein (CBP)-associated factor] sur la

lysine (K) 28 (Kiernan et al., 1999). De plus, Cdk9 phosphoryle le CTD (sur la sérine 2) de

l’ARN pol II (Zhou et al., 2000), et N-TEF, permettant la dissociation de ce dernier et

d’augmenter la processivité de l’ARN pol II (Fujinaga et al., 2004). L’élongation de la

transcription est aussi stimulée par l’interaction de la sous-unité p65 de NF-κB avec pTEFb

(Barboric et al., 2001) et Cdk7/TFIIH (Kim et al., 2006), qui phosphoryle la sérine 5 du CTD

de l’ARN pol II (Zhou et al., 2000) avant de quitter le complexe d’élongation. L’acétylation

de Tat sur la K50 par p300 et Gcn5 (general control of amino acid synthesis protein 5)

favorise la libération de pTEFb, la dissociation de Tat sur TAR, et son transfert ultérieur au

sein du complexe d’élongation de l’ARN pol II (Kaehlcke et al., 2003). Tat peut ensuite

recruter PCAF, qui joue un rôle dans le remodelage de la chromatine après activation

transcriptionnelle. A la fin du processus d’élongation, la déacetylation de Tat par SIRT1

(sirtuin 1), une HDAC (de classe III), permet sa dissociation du complexe ARN pol II-PCAF,

et son recyclage pour initier un nouveau cycle d’activation transcriptionnelle (Pagans et al.,

2005) (Figure 20C). Cette fonction pourrait être importante lorsque la quantité de Tat est un

facteur limitant, notamment dans les phases précoces de l’infection (Colin and Van Lint,

2009).

iv/ La terminaison et maturation des pré-mARNs

L’élongation efficace des transcrits viraux permet la synthèse de pré-mARNs qui sont

coiffés en 5’, maturés en 3’ et polyadénylés comme les transcrits primaires eucaryotes (Karn

and Stoltzfus, 2012). Le clivage en 3’ précède la polyadénylation et a lieu en un site

polyadénylé [poly(A)] positionné de façon précise. Cependant, dans le cas du VIH-1, ces

séquences, qui sont dupliquées dans les régions R des LTRs 5’ et 3’, ne sont reconnus qu’en

3’ notamment grâce à la présence d’un élément USE et de la structure secondaire du site

poly(A) particulièrement propice au clivage en 3’ (Karn and Stoltzfus, 2012).

Les ARNm du VIH-1 peuvent arborer plus de 40 épissages alternatifs différents (dus à

la présence de plusieurs sites donneurs/accepteurs d’épissage ; aspect développé dans le §

I.A.3) (Karn and Stoltzfus, 2012).

Enfin, Tat pourrait aussi être impliqué dans les processus de maturation des pré-

mARNs, i.e., addition d’une coiffe (Chiu et al., 2002), polyadénylation (Calzado et al., 2004)

et épissage (Berro et al., 2006).

63

v/ Export et traduction des transcrits du VIH-1

L’expression du VIH-1 se déroule en deux phases : (i) la phase précoce, qui

correspond à la synthèse des protéines (précoces) Tat, Rev et Nef à partir d’ARNm épissés, et

(ii) la phase tardive, qui donne lieu à la production des protéines structurales et accessoires à

partir d’ARNm partiellement ou non-épissés exportés vers le cytoplasme grâce à Rev (Karn

and Stoltzfus, 2012). Ainsi, contrairement aux transcrits eucaryotes partiellement ou non-

épissés dégradés au sein du noyau, ceux du VIH-1 s’y accumulent pour être exportés vers le

cytoplasme grâce à Rev. Rev s’oligomèrise sur son élément de réponse (i.e., RRE) présent

sous forme d’une tige-boucle allongée, au sein des ARNm mono- ou non-épissés et interagit

avec Crm1 (aussi appelé Exportin1) pour être transporté de façon énergie-dépendante au sein

des pores nucléaires (Karn and Stoltzfus, 2012).

La traduction des ARNm du VIH-1 nécessite la machinerie cellulaire. Cependant, le

mécanisme d’initiation de la traduction reste controversé. Ainsi, la présence de nombreuses

structures secondaires au sein de l’ARNm viral (exon 1, e.g., TAR, PBS) pourrait interférer

avec un scan de la séquence initiatrice (AUG) par le ribosome, bien que celui-ci soit

expérimentalement possible (Berkhout et al., 2011). Alternativement, l’initiation de la

traduction pourrait impliquer l’entrée interne des ribosomes et/ou l’interaction entre des

éléments de l’ARNm et des protéines cellulaires (Karn and Stoltzfus, 2012).

b/ Régulation de l’expression du VIH-1 par des structures secondaires de

l’ADN et/ou de l’ARN viral

i/ Impact des structures secondaires de l’ARN viral sur l’expression

du VIH-1

De nombreuses structures secondaires de l’ARNv régulent l’expression du VIH-1 à

différentes étapes du processus. C’est notamment le cas des séquences TAR et RRE, comme

développé ci-dessus (cf., § III.B.2, Figure 21A, B). De plus, comme décrit ci-dessus,

l’initiation de la traduction est régulée par les structures secondaires de l’ARNm présentes

dans l’exon 1 (Figure 21A). Le changement du cadre de lecture (frameshift) qui permet la

synthèse du précurseur gag-pro-pol tous les 20 précurseurs gag est régulé (au moins en partie)

par une structure secondaire particulière qui permet une pause du ribosome (Figure 21A)

(Karn and Stoltzfus, 2012). Enfin, l’analyse de la structure d’ARN du génome du VIH-1 par

Watts et al. a récemment mis en évidence une corrélation entre l'organisation de l’ARN et les

séquences codant les boucles inter-domaines des protéines virales, suggérant que la structure

64

ARN modulerait la vitesse des ribosomes pendant la traduction de façon à promouvoir un

repliement protéique correct (Watts et al., 2009).

Figure 21 : Structure des extrémités 5’ (A) et 3’ (B) du génome du VIH-1 sous forme

ARN. Ces structures secondaires de l’ARN ont été déterminées par l’analyse SHAPE

(selective 2’-hydroxyl acylation analysed by primer extension) des ARNs à haut-débit.

Chaque nucléotide (nt) est représenté par un rond, dont la couleur indique sa réactivité.

L’échelle de réactivité (R) SHAPE représente le niveau de structuration de l’ARN (nt non-

structuré : R = 0). Les différentes structures secondaires importantes sont indiquées. Les

lettres indiquent les régions codantes des protéines [A/B : début/fin de gag (MA), C/D :

début/fin de gag (CA), E/F : début/fin de gag (p2), G/H : début/fin de gag (NC), I/K :

début/fin de gag (p1), J/M : début/fin du peptide en transframe, L/O : début/fin de gag (p6),

N : début de pol (PR), Hh : fin de env (gp120), Ii/Mm : début/fin de env (gp41), Jj : fin de tat,

Kk : début de l’exon 2 de tat/rev, Ll : fin de rev, Nn/Oo : début/fin de nef] [adaptée de (Watts

et al., 2009)].

ii/ Boucles d’ADN/ARN transcription-dépendante

Il a été reporté la formation de boucles d’ADN/ARN transcription-dépendante

impliquant des interactions entre promoteur et éléments de terminaison de transcription

[poly(A)] chez la levure [cf., revue (Hampsey et al., 2011)], et plus récemment chez l’homme

pour le gène brca1 (Tan-Wong et al., 2008) et le VIH-1 sous forme provirale et plasmidique

[Figure 22A, B (Perkins et al., 2008)].

Dans le cas du VIH-1, les interactions ont lieu entre le promoteur autologue (i.e., U3)

ou hétérologue (e.g., CMV) au sein du 5’LTR et la queue poly(A) située dans la région R du

3’LTR (Figure 22). L’expression du génome du VIH-1 serait ainsi régulée par les structures

secondaires des séquences d’ADN et d’ARN. Cependant, l’impact de leur modification par

insertion/délétion d’éléments hétérologues (dans le cadre du design de vecteurs) sur

A B

65

l’expression transgénique n’est jamais été analysé et fera l’objet d’une partie des résultats de

cette thèse.

Figure 22: Représentations schématiques des boucles d’ADN-ARN du génome du VIH-1

sous forme provirale (A) et plasmidique (B). Les interactions (potentielles) indiquées entre

élèments d’initiation et de terminaison de la transcription ont été analysées par capture 3C

(chromosome conformation capture). Les lignes fines et épaisses représentent l’ARN et

l’ADN, respectivement. Les cercles gris et blanc indiquent les régions transcrites du

promoteur (U3) et la queue de polyadénylation (polyA, dans R), respectivement [adaptée de

(Perkins et al., 2008)]. MSD, major site donor.

3/ Expression à partir de l’ADN viral non-intégré

L’ADNv non-intégré (ADNni), majoritaire après infection, ne permet pas un niveau

d’expression nécessaire à la production de virions. L’ADNni existe sous forme d’espèces

d’ADNv circulaires (à 1- ou 2-LTRs) stables, et d’ADNv linéaire, rapidement dégradé. Ces

trois espèces d’ADNni, et en particulier les cercles à 1-LTR, peuvent servir de substrat pour

l’expression du VIH-1 (aspect développé dans le § I.B.4) (Cara et al., 1996). Cependant,

l’ADNni peut être sous forme de structure chromatinienne condensée, qui limite l’initiation de

la transcription mais qui est réversible par traitement à l’aide d’inhibiteurs de HDACs (Kantor

et al., 2009).

Il a été mis en évidence que seuls les transcrits précoces codant Tat, Rev et Nef ainsi

que la protéine Nef sont présents dans les cellules infectées par des virus intégrase-défectifs

(i.e., contenant uniquement de l’ADNni) (Kelly et al., 2008; Wu and Marsh, 2003).

L’expression tardive, qui nécessite une accumulation suffisante de Rev pour permettre

l’export des ARNm non-épissés ou mono-épissés, ne peut atteindre un niveau suffisant pour

permettre une production virale uniquement à partir d’ADNni (Iyer et al., 2009). De plus,

l’expression à partir de l’ADNni a la particularité d’être faible (Gelderblom et al., 2008), mais

66

pourrait être augmentée par Vpr (Poon and Chen, 2003) et Tat (Cara et al., 1996). Cependant,

les quantités de Tat et Nef produites à partir de l’expression d’ADNni sont suffisantes pour

l’activation cellulaire et l’augmentation de l’infection productive, suggérant un rôle dans la

réplication virale (Wu and Marsh, 2001).

Une hypothèse actuelle propose que l’expression à partir d’ADNni puisse permettre un

gain de temps en cas de réinfection de la cellule puisque il y aurait réplication sans intégration

du second virus (Sloan and Wainberg, 2011). Ainsi, lors d’une co-infection par (au moins)

deux virus (fréquente in/ex vivo), il a été montré par Gelderblom et al. qu’il y avait (trans-

)complémentation entre ADNni et ADN intégré, ce qui contribue à la diversification des

génomes viraux (Gelderblom et al., 2008).

4/ La latence du VIH-1

a/ Mise en évidence

Depuis le milieu des années 1990, les patients infectés par le VIH-1 sont traités à

l’aide d’une thérapie antirétrovirale appelée HAART (développé dans le § I.A.3) qui permet

de réduire la charge virale en-dessous des limites de détection (par des techniques standards)

mais ne permet pas l’éradication du virus (Shen and Siliciano, 2008). En effet, malgré le

traitement, des cellules infectées capables de se répliquer persistent au sein de l’organisme.

Ces réservoirs viraux correspondent à des sanctuaires anatomiques où la HAART a une faible

pénétrance [e.g., système nerveux (Varatharajan and Thomas, 2009)] et/ou à des types

cellulaires contenant un provirus latent qui s’exprime peu ou pas (e.g., lymphocytes CD4+ au

repos, macrophages) (Colin and Van Lint, 2009).

b/ Définition

De la même façon qu’il existe deux phases dans le cycle viral, i.e., avant et après

intégration, il existe deux types de latence selon que le virus soit intégré ou non dans le

génome de son hôte (Colin and Van Lint, 2009).

La latence pré-intégrative résulte d’un blocage partiel ou complet du cycle viral à une

étape précédant l’intégration du virus dans le génome hôte (Colin and Van Lint, 2009). Ce

blocage peut être du à une transcription inverse incomplète du fait d’une quantité réduite de

dNTP dans les cellules métaboliquement inactives (Gao et al., 1993). Le PIC peut aussi ne pas

être importé dans le noyau à cause d’un manque d’ATP (Bukrinsky et al., 1991). La latence

67

pré-intégrative génère ainsi de l’ADNv (linéaire ou circulaire) susceptible d’être intégré au

sein du génome hôte après activation et/ou différenciation cellulaire (Bukrinsky et al., 1991).

La latence post-intégrative, ou transcriptionnelle, a lieu lorsqu’un provirus échoue à

exprimer efficacement son génome et est transcriptionnellement inactif (de façon réversible)

après intégration dans le génome hôte. Cet état de latence est exceptionnellement stable et

uniquement limité par la durée de vie de la cellule infectée et de ses descendants.

c/ La latence post-intégrative

La latence des provirus, ou silencing transcriptionnel, est médiée par un certain

nombre de mécanismes : (i) le site et l’orientation de l’intégration, (ii) les modifications

épigénétiques de l’ADNv, (iii) l’absence de Tat, de ses partenaires cellulaires ou d’autres

facteurs de l’hôte et (iv) l’interférence par les ARNs (ARNi). Ces différents mécanismes, qui

régulent positivement/négativement la transcription virale, coopèrent et/ou contribuent à

l’établissement et/ou au maintien de la latence post-intégrative du VIH-1.

i/ Site et orientation de l’intégration

Les partenaires (cellulaires, virales) de l’IN et/ou de l’ADNv au sein du PIC pourraient

influencer le site d’intégration [e.g., LEDGF/p75 au sein des gènes transcriptionnellement

actif, Ku80 en périphérie nucléaire (Masson et al., 2007)] mais aussi permettre le recrutement

de facteurs promoteurs/répresseurs de la transcription (aspect développé dans le § I.B.4).

Ainsi, IN1, sous-unité du complexe de SWI/SNF, interagit avec l’IN, favorise l’intégration in

vitro (Lesbats et al., 2011), mais pourrait initier une répression de la transcription du VIH-1

en l’absence de Tat (Boese et al., 2009).

De plus, la majorité des provirus VIH-1 latents est localisée au sein des gènes

transcriptionnellement actifs (Han et al., 2004; Lewinski et al., 2005) qui seraient plus

accessibles au sein de la chromatine (Schroder et al., 2002). Ainsi, les rares évènements

d’intégration au sein de l’hétérochromatine (Carteau et al., 1998) ne permettent pas

d’expliquer la latence transcriptionnelle. Le site et l’orientation de l’intégration au sein du

génome de l’hôte peuvent cependant générer de l’interférence transcriptionnelle qui jouerait

un rôle dans l’établissement de la latence (Colin and Van Lint, 2009). Ce phénomène peut

avoir lieu entre des promoteurs actifs divergents (Han et al., 2008) ou convergents (Callen et

al., 2004; Crampton et al., 2006). Au contraire, lorsque le provirus est intégré dans la même

orientation que le gène hôte, la transcription au-delà de la terminaison (read-through) peut

68

empêcher, par exemple, l’assemblage du complexe de pré-initiation de la transcription au

niveau du 5’LTR (Lenasi et al., 2008).

ii/ Modifications épigénétiques

Les modifications post-traductionelles des queues d’histones (e.g., déacétylation,

certaines méthylations) modulent les réarrangements chromatiniens et réduisent l’accessibilité

des facteurs de transcription et à l’ARN pol II en créant un remodelage des nucléosomes et

une structure condensée de la chromatine, qui influence la réplication du VIH-1.

Ainsi, la déacétylation des histones peut être initiée par des facteurs répresseurs de la

transcription, tels YY1 (yin and yang 1) et LSF (late SV40 factor) qui répriment la réplication

du VIH-1 dans les cellules CD4+

T infectées (Romerio et al., 1997) en recrutant HDAC1

(Coull et al., 2000). C’est aussi le cas d’autres facteurs de transcription, comme NF- B sous

forme d’homodimères p50 (Williams et al., 2006) ou CBF1 (C-promoter binding factor 1)

(Tyagi and Karn, 2007) dans de nombreuses lignées cellulaires.

De plus, la méthylation des histones peut être associée à l’activation de la transcription

ou à son silencing des gènes eucaryotes. Dans le cas du VIH-1, la formation de

l’hétérochromatine, associée au recrutement de HP1γ (heterochromatin protein 1 homologue-

γ), a été corrélée à la triméthylation de l’histone 3 sur K9, médiée par la méthyltransférase

SUV39H1 (histone-lysine N-methyltransferase suppressor of variegation 3–9 homologue 1)

et résulte en un silencing transcriptionnel du VIH-1 (du Chene et al., 2007). Le co-répresseur

CTIP2 [chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor (COUPTF)-interacting

protein 2] peut aussi recruter HDAC1, HDAC2, SUV39H1 et les protéines HP1 pour établir

un environnement hétérochromatinien qui mène au silencing du VIH-1 (Marban et al., 2007).

Cet état transcriptionnel latent peut être réactivé par traitement cellulaire à l’aide d’inhibiteurs

de HDACs qui induisent une ouverture de la chromatine associée à l’expression du VIH-1.

Cependant, le silencing transcriptionnel médié à l’aide de modifications épigénétiques

différentes serait graduel et impliquerait une initiation et un maintien de la latence.

L’initiation de la latence serait médiée par les modifications des queues d’histones qui, à leur

tour, pourraient permettre de recruter les partenaires nécessaires au maintien de la latence par

méthylation de l’ADN, comme décrit en 2009 par Blazkova et al. (Blazkova et al., 2009).

Cependant, il a été décrit très récemment que le 5’ LTR des réservoirs viraux issus de patients

traités par HAART est rarement méthylé, suggérant l’intervention d’autres mécanismes dans

le maintien de la latence (Blazkova et al., 2012).

69

iii/ Facteurs de l’hôte

Comme cité ci-dessus, l’expression du VIH-1 est fortement influencée par la

présence/absence de facteurs de transcription. Un exemple caractéristique est celui de I Bα,

qui séquestre NF- B sous forme p50/p65 dans le cytoplasme. Sa sur-expression inhibe la

réplication du VIH-1 et peut être responsable du maintien de la latence dans les cellules T au

repos (Coiras et al., 2007). De plus, le régulateur transcriptionel Myc, qui fixe SP1 au niveau

des LTRs, forme un complexe qui recrute HDAC1, inhibe l’expression du VIH-1 et est

responsable du maintien de la latence (Jiang et al., 2007).

L’absence/la présence de facteurs associés à Tat peut également être une source de

latence transcriptionnelle (Colin and Van Lint, 2009). Ainsi, la méthylation de résidus

arginine (Arg52 et 53) de Tat par PRMT6 (arginine N-methyltransferase 6) (Boulanger et al.,

2005) affecte négativement la formation du complexe Tat/TAR/cycline T1 (Xie et al., 2007).

iv/ Voie d’interférence par les ARN

La voie d’ARNi agit comme une barrière contre la multiplication virale (Corbeau,

2008). Un certain nombre de microARNs (ARNmi) cellulaires semble contrôler la réplication

du VIH-1 en ciblant les ARNm épissés ou non-épissés excepté celui codant Nef (Huang et al.,

2007). La sur-expression de ces ARNmi dans les cellules T CD4+ au repos inhibe la

traduction de la plupart des protéines du VIH-1 dont l’absence contribue à la latence virale

(e.g., Tat et Rev) (Han and Siliciano, 2007).

Les connaissances issues de l’étude des mécanismes de la latence du VIH-1 permettent

actuellement d’établir des approches thérapeutiques [e.g., combinant des inhibiteurs de

HDACs et des cytokines (Colin and Van Lint, 2009)] dont certaines sont testées en essais

cliniques dans le but d’éradiquer le virus de l’organisme infecté (Trono et al., 2010).

C/ L’EXPRESSION D’UN TRANSGENE AU SEIN D’UN LENTIVECTEUR MODIFIE

L’expression d’un transgène au sein d’un lentivecteur SIN-LTR est possible grâce à

l’utilisation d’un promoteur hétérologue (aspect développé dans le § II.B.2-4). Cependant, le

choix de ce promoteur est critique et doit être en adéquation avec l’utilisation qui sera faite du

vecteur. Dans ce paragraphe, sont présentées les caractéristiques des promoteurs qui seront

utilisés pour les travaux présentés dans la suite de cette thèse.

70

1/ Promoteurs eucaryotes et régulation différentielle de la transcription

Il existe trois types de polymérases chez les Eucaryotes : (i) l’ARN polymérase I

produit les pré-ARNs ribosomaux (ARNr) maturés en ARNr 28S, 18S et 8S ; (ii) l’ARN

polymérase II transcrit les gènes codant les ARNs messagers (ARNm) (codant les protéines)

et quatre des cinq petits ARN nucléaires (ARNsn) impliqués dans l’épissage des ARNs ; (iii)

l’ARN polymérase III produit les ARNs de transfert (ARNt), l’ARNr 5S et un ARNsn. Nous

nous intéresserons par la suite à la transcription de l’ARN polymérase II (ARN pol II).

a/ Différents types de promoteurs eucaryotes

Le promoteur core est défini par la région d’ADN adjacente au TSS qui permet la

transcription du gène en ARN. La position de ce dernier est déterminée par les multiples

séquences d’ADN spécifiques qui l’entourent, situées principalement en amont mais aussi en

aval, et qui varient selon les gènes (Valen and Sandelin, 2011). Ces séquences d’ADN

représentent des sites de fixation pour les facteurs de transcription (généraux ou spécifiques)

qui régulent le recrutement du complexe de pré-initiation de la transcription (Baumann et al.,

2010). Elles sont variables en fonction des différents types de promoteurs existants, i.e., à

TATA-box ou à îlot CpG, comme décrit ci-dessous.

i/ Les promoteurs de type TATA-box

Le TSS peut être positionné de façon précise lorsqu’il est situé (30 nt) en aval d’un

pattern riche en TA, appelé TATA-box, qui recrute la TBP (TATA-binding protein) (au niveau

de l’initiateur de la transcription, INR). Dix à 35 % des promoteurs possèdent une TATA-box

(Saxonov et al., 2006). Ils se situent souvent en amont de gènes exprimés spécifiquement dans

certains tissus et/ou induits par des signaux particuliers (e.g., stimuli extracellulaires), qui

nécessitent une réponse cellulaire adaptée et rapide. L’expression à partir de ces gènes est

donc hautement variable mais très forte une fois activée (Valen and Sandelin, 2011).

L’activité promotrice de ces gènes est extrêmement régulée et dépend de nombreuses

régions cis-régulatrices proches (< 250 bp du TSS) (i.e., promoteur proximal/distal si situé en

amont ou en aval du TSS, respectivement) et/ou plus lointaines (constituées d’enhancers,

silencers et/ou insulateurs) (Baumann et al., 2010) (Figure 23). Le promoteur core est

constitué de la TATA-box associée à (et agit de façon synergique avec) l’initiateur de la

transcription (Smale and Baltimore, 1989). Les autres séquences sur lesquelles se fixent ou

s’associent des composants du complexe de pré-initiation de la transcription qui définissent la

71

position précise du TSS (Baumann et al., 2010) (Figure 23). Par exemple, DPE (downstream

promoter element) et DCE (downstream core element) sont des sites de reconnaissances pour

TFIID, alors que BREu et BREd (TFIIB recognition element upstream ou downstream,

respectivement) interagissent avec TFIIB (Baumann et al., 2010). Les sites éloignés pouvant

stimuler, inhiber ou bloquer la transcription sont respectivement appelés enhancers, silencers

ou insulateurs, et interagissent avec le promoteur grâce à la formation de boucles (Figure 23)

(Ong and Corces, 2011). Il est à noter que les promoteurs à TATA-box sont particulièrement

dépendants de la présence et/ou l’absence de facteurs de transcription spécifiques impliqués

dans l’expression tissu-spécifique ou en réponse à un stimulus (Juven-Gershon and Kadonaga,

2010).

Figure 23: Eléments de régulation d’un promoteur à TATA-box. Le promoteur à TATA-

box est constitué des éléments core, proximal et distal. L’initiation de la transcription à partir

d’un promoteur à TATA-box peut être régulée par de nombreux enhancers qui sont localisés à

distance et séparés avec des silencers et insulateurs [fixés par la protéine régulatrice CTCF

(CCCTC-binding factor)]. Les enhancers sont définis par des caractéristiques

chromatiniennes favorables à la transcription (H3K4me1/2, H3.3/H2A.Z) et la fixation de la

protéine CBP [(cyclic AMP-responsive element-binding(CREB) binding protein]. Les

silencers portent des marques épigénétiques défavorables à la transcription (H3K27me3)

[issue de (Ong and Corces, 2011)].

ii/ Les promoteurs de type CGI

Au contraire, le TSS peut être positionné de façon plus large/dispersé (ce qui génère

des transcrits aux multiples extrémités 5’). Il se trouve alors au sein d’une large séquence

riche en GCs (sur-représentés comparé à la moyenne génomique) contenant une répétition de

GCs (localement sur-représentés) de 20-50 nt dans les 100 paires de bases (pb) en amont du

TSS. Cette répétition de GCs est appelé îlot CpG (CpG island, CGI) et existe dans 40 à 70 %

72

des promoteurs humains (Illingworth et al., 2010; Saxonov et al., 2006). Ces derniers se

trouvent en amont de gènes dit de ménage (e.g., phosphoglycerate kinase, PGK) exprimés

constitutivement de façon ubiquitaire à un niveau (faible) constant et qui ne nécessitent

qu’une régulation simple de leur expression.

Les promoteurs de type CGI ne possède pas les éléments du promoteur de type TATA-

box mais ont des sites de fixation pour des facteurs de transcription ubiquitaires, tel SP-1, NF-

1 (neurofibromin 1), E2F, and ETS-1 (Landolin et al., 2010). Ces sites de reconnaissance sont

définis par des motifs riches en CpG (Deaton and Bird, 2011). SP-1, par exemple, a été décrit

recrutant TBP au niveau de promoteurs ne possédant pas de TATA-box (Brandeis et al., 1994;

Butler and Kadonaga, 2002).

Les promoteurs de type CGI contiendraient ainsi plusieurs promoteurs core faibles,

qui définissent plusieurs TSS, alors que celui de type TATA-box possèderait un promoteur

core fort (Baumann et al., 2010).

Il est à noter que les CGIs n’existent que chez les Vertébrés alors que la TATA-box est

conservée de la levure à l’Homme. Ainsi, les contenus différentiels des promoteurs à TATA

ou CpG sont indicatifs de mécanismes de régulation différents. Cependant, les propriétés de

ces deux types de promoteurs ne sont pas mutuellement exclusives et il existe de nombreuses

exceptions, dont des promoteurs hybrides des deux classes (Valen and Sandelin, 2011).

b/ Régulation épigénétique de l’initiation de la transcription

La fixation de l’ARN pol II et l’initiation de la transcription nécessite le recrutement

dynamique de la machinerie de transcription basale et des composants régulateurs au niveau

des gènes cibles ainsi que des interactions dynamiques entre facteurs de transcription et la

chromatine. Cependant, la structure chromatinienne des promoteurs contenant une CGI ou

une TATA-box définit un accès de l’ADN respectivement favorable ou non à la transcription

et impliquent des régulations épigénétiques différentielles.

Ainsi, les promoteurs à CGIs (non-méthylées) sont occupés par des nucléosomes dit

instables car faiblement positionnés, ce qui facilite l’accès du promoteur au complexe de pré-

initiation de la transcription (Figure 24). Ces nucléosomes sont constitués des variants

d’histone H3.3 et H2A.Z à la place des histones canoniques H3 et H2A (Jin and Felsenfeld,

2007) qui permettent le recrutement de l’ARN pol II (Valen and Sandelin, 2011) (Figure 24).

Les queues d’histones peuvent aussi être modifiées, telle l’acétylation des histones H3 et H4

73

(Birney et al., 2007; Wang et al., 2008b) et la tri-méthylation de l’histone H3 (K4me3)

caractéristiques de la chromatine transcriptionnellement active (Figure 24). H3K4me3 est une

signature des promoteurs à CGIs qui permet le recrutement de TFIID (van Ingen et al., 2008;

Vermeulen et al., 2007) et persiste souvent même lorsque le gène associé est inactif (Guenther

et al., 2007; Mikkelsen et al., 2007; Thomson et al., 2010). L’expression à partir des

promoteurs à CGIs peut cependant être inhibée stablement par méthylation des CGIs pendant

le développement normal (ou pathologique dans le cas de cancers) [cf., revues (Deaton and

Bird, 2011; Li et al., 2007)]. Il est à noter que les promoteurs de types CGIs sont plutôt

régulés lors de l’élongation de la transcription au niveau des nucléosomes se trouvant en aval

du TSS (Figure 24) (Jones, 2012).

Figure 24: Eléments de régulation transcriptionnelle des promoteurs à CGIs. Les

promoteurs à CGIs (non-méthylées) sont occupés par des nucléosomes faiblement

positionnés, dit instables, qui facilitent l’accès du TSS aux facteurs de transcription et au

complexe de pré-initiation de la transcription. Les nucléosomes entourant le TSS portent la

triméthylation de l’histone H3 sur la lysine 4 (H3K4me3, rond orange), qui est associée avec

une transcription active, et le variant d’histone H2A.Z (en vert) associé à de l’ADN méthylé

(rond blanc). En aval du TSS, l’ADN est ne contient pas de CpG et est principalement

méthylé (ronds gris) médié par la fixation de méthyltransférases de l’ADN (DNMTs, en

violet), ce qui bloque l’élongation de la transcription [adaptée de (Jones, 2012)].

Les promoteurs à TATA-box sont organisés en structure chromatinienne constituée de

nucléosomes stables, qui les rend inaccessibles pour le complexe de pré-initiation de la

transcription et nécessite l’intervention des complexes de remodelage ATP-dépendants

SWI/SNF pour leur activation (Ramirez-Carrozzi et al., 2009). Ces complexes participent à la

décondensation de la chromatine et au remodelage local des nucléosomes qui garantissent

l’accès au promoteur, caractérisées par des modifications épigénétiques favorables à la

transcription. L’occupation stable de ces promoteurs par des nucléosomes fait qu’ils sont pour

la plupart transcriptionnellement inactifs par défaut (Valen and Sandelin, 2011).

74

2/ L’expression transgénique à partir d’un promoteur d’origine humaine

a/ La kinase phosphoglycérate

La kinase phosphoglycérate (phosphoglycerate kinase, PGK) est une enzyme de la

glycolyse qui catalyse le transfert d’un phosphate du 1,3 diphosphoglycérate (1,3-DPG) sur

l’adénosine diphosphate (ADP), ce qui génère l’acide 3-phosphoglycérique (3-PGA) et une

molécule d’ATP. Cette réaction est la première des deux qui génèrent une molécule d’ATP

pendant la glycolyse (Beutler, 2007; Parker and Hoffman, 1967 ).

Le gène codant cette enzyme est dit « de ménage » car exprimé ubiquitairement au

sein de toutes les cellules de l’organisme. Ce gène, appelé PGK1, est localisé sur le

chromosome X [en position Xq13 (Willard et al., 1985)]. PGK1, ainsi que la quasi-intégralité

des gènes codés par l’un des deux chromosomes X, peut être transcriptionnellement inactivé

au cours de l’embryogénèse chez les mammifères femelles par l’inactivation du chromosome

X, qui permet la compensation du dosage des gènes liés à l’X entre les organismes des deux

sexes (Monk, 1995). Un défaut en PGK (par mutation du gène) est une des causes

relativement rares d’anémie hémolytique congénitale non sphérocytaire, pouvant

s’accompagner de retards mentaux et/ou de myopathies (e.g., rhabdomyolyse) (Beutler,

2007).

b/ Organisation du promoteur PGK

Le promoteur du gène PGK1, appelé promoteur PGK par la suite, ne possède pas de

TATA-box (ni d’INR)(Singer-Sam et al., 1984) mais est riche en CpGs (dont des CGIs) et

contient des sites de fixation potentiels pour des facteurs de transcription ubiquitaires tels

SP1, NF1, ATF, C/EBP (déterminés par footprinting ex vivo après traitement à la DNAse

(Pfeifer and Riggs, 1991; Pfeifer et al., 1990 )) et prédictifs pour NF- B, EST1, AP2

(déterminés par reconnaissance de sites de fixation consensus sur la séquence du promoteur).

Le promoteur PGK est donc un promoteur de type CGIs.

c/ Régulation de l’expression à partir du promoteur PGK

i/ Dans un contexte sain

Le gène PGK1 est exprimé constitutivement au sein des cellules de l’organisme grâce

à la présence de facteurs de transcription ubiquitaires cités ci-dessus. La seule régulation

négative que peut subir le promoteur PGK dans un contexte sain est l’inactivation aléatoire de

75

l’X au cours du développement de l’embryon femelle [comme illustré chez la souris, (Monk,

1995)]. Ce silencing est initié par les transcripts spécifiques de l’inactivation de l’X (X-

inactivation specific transcript, XIST) et est maintenu par un certain nombre de modifications

épigénétiques, médiées notamment par le recrutement de complexes protéiques du groupe

Polycomb (PcG) et de facteurs de transcription répresseurs de la transcription (e.g., YY1) et la

méthylation de l’ADN (Lee, 2011; Wutz, 2011).

ii/ En conditions de stress nutritionnel

En conditions d’hypoxie, la synthèse d’ATP dépend plutôt de la glycolyse ayant lieu

dans le cytoplasme à la place de la phosphorylation oxydative qui se passe au sein des

mitochondries. Il a ainsi été observé au sein de tumeurs que l’hypoxie augmente l’expression

du gène PGK1 (Daly et al., 2004), de façon dépendant de HIF-1α (hypoxia-inducible factor

1α, qui possède des éléments de réponse à l’hypoxie sur le promoteur de ce gène (Kress et al.,

1998)], ce qui serait un des mécanismes compensatoires pour assurer la génération d’ATP

(Lam et al., 2007).

3/ L’expression transgénique à partir d’un promoteur d’origine virale

a/ Le cytomégalovirus

Le promoteur major immediate early (MIE) du cytomégalovirus (CMVie, ou CMV),

dont l’utilisation est largement répandue dans le domaine du transfert de gènes, est le

promoteur-enhancer du virus CMV humain (HCMV). Le HCMV appartient à la sous-famille

des β-Herpes virus et infecte tous les organes et tissus, causant une infection généralisée avec

un large éventail de symptômes (e.g., pneumonies, problèmes hépatiques et gastrointestinaux)

principalement chez des individus immunodéprimés ou ayant un système immunologique

immature [cf., revue (Stinski and Isomura, 2008)].

Le génome du HCMV [de 230 kb environ (Lakeman and Osborn, 1979; Stinski et al.,

1979 )] contient deux promoteurs divergents séparés par une région enhancer. En amont de la

région enhancer MIE, se trouvent le promoteur et les gènes très précoces (immediate early,

IE) qui permettent une réplication productive au sein des cellules permissives. Le promoteur

et les gènes UL127 ne sont quant à eux pas essentiels à la réplication en culture cellulaire. Il

est à noter que la transcription simultanée des deux gènes n’est pas possible [cf., revue

(Stinski and Isomura, 2008)].

76

b/ Organisation du promoteur CMV

Le promoteur-enhancer CMVie est constitué de la région enhancer MIE (distale et

proximale) et du promoteur des gènes IE. Le promoteur IE contient une TATA-box entre -28

et -22, une séquence crs (cis-repression) entre -13 and +1, et une INR entre +1 et +7 (Macias

et al., 1996) (Figure 25). Crs est essentiel à la phase précoce de la transcription des gènes IE,

et donc à l’infection.

La région enhancer MIE contient de nombreux sites de fixation, pouvant être répétés,

pour des facteurs activateurs (RAR, ETS, SP-1, ERF, CREB/ATF et NF-κB) et répresseurs

de la transcription (YY1) (Figure 25). Le promoteur-enhancer CMVie utilisé comme outil

pour les travaux de cette étude comprend la région -522 à +55 (Scharfmann et al., 1991). La

région enhancer MIE distale peut fonctionner dans les deux orientations et n’est pas

essentielle à forte m.o.i.. Cependant, sa délétion ralentie l’expression des gènes IE à faible

m.o.i. (Meier and Pruessner, 2000). La région enhancer MIE proximale influence directement

le niveau de transcription des gènes IE (Isomura et al., 2004), contient une séquence enhancer

minimale que sont les sites de fixation à SP-1 en -75 et -55 (Isomura et al., 2005) (Figure 25).

Figure 25: La région enhancer MIE du CMV, entourée de deux promoteurs divergents. Les TSS des gènes viraux (IE1/2 et UL127) sont représentés par une flèche. La région

enhancer MIE est composée de deux parties, proximal et distal. Une région appelée

« unique » se trouve entre l’enhancer distal et le promoteur UL127. Elle contient des sites de

fixation pour des facteurs répresseurs de la transcription et aurait un rôle d’insulateur. En aval

du promoteur UL127, se trouve une région appelée « modulateur ». Les sites de fixation pour

des facteurs activateurs/répresseurs de la transcription sont représentés par les formes et

couleurs indiquées [adaptée de (Stinski and Isomura, 2008)].

77

c/ Régulation de l’expression à partir du promoteur CMV

i/ Expression « normale » à partir du promoteur CMV

Les différents éléments cis-régulateurs peuvent agir de façon indépendante et coopérer

pour recruter l’ARN pol II et augmenter la transcription des gènes MIE (Meier et al., 2002).

Les protéines IE permettent ensuite de stimuler l’expression des gènes précoces (Early), dont

les produits induisent à leur tour l’expression des gènes tardifs (Late) (Wathen and Stinski,

1982). Cependant, les protéines régulent également négativement les promoteurs à partir

desquels elles sont exprimées. Ainsi, la région Crs adjacente au TSS régule l’expression des

gènes IE au cours de l’infection puisque la fixation de la protéine IE86 sur Csr inhibe la

transcription à partir du promoteur IE (Jupp et al., 1993).

ii/ Latence du promoteur CMV

Le HCMV a un large tropisme cellulaire mais ne peut se répliquer qu’au sein des

cellules différenciées (e.g., macrophages, cellules denditriques, cellules endothéliales,

fibroblastes). Il est donc incapable de se répliquer au sein de cellules peu différenciées (e.g.,

cellules progénitrices de la moelle osseuse, monocytes) dans lesquelles il se maintient dans un

état latent réactivable (Sinclair and Sissons, 1996). Le HCMV peut ainsi établir une infection

latente chez des individus immunocompétents qui est réactivée après traitement

immunosuppresseur (i.e., production de virus) (Glenn, 1981).

Le promoteur CMV latent est caractérisé par un certain nombre de modifications

épigénétiques, telles que des histones hypoacétylées, l’association avec des HDACs (e.g.,

HDAC1) et HP1 qui fixe des histones méthylées (Murphy et al., 2002; Reeves et al., 2005b).

L’activation du promoteur IE latent peut avoir lieu par traitement à la TSA (Murphy et al.,

2002) ou après différentiation cellulaire (Reeves et al., 2005a; Reeves et al., 2005b;

Soderberg-Naucler et al., 2001). Ainsi, la stimulation de l’expression des gènes IE, facteur

limitant de la réplication du HCMV, permet la réactivation du virus latent [cf., revue (Stinski

and Isomura, 2008)].

IV/ ROLES DE LA MACHINERIE DE REPARATION DE L’ADN

DANS LE CYCLE LENTIVIRAL

Les interactions hôte/virus sont inéluctables dans un contexte où le virus dépend des

fonctions cellulaires de son hôte pour se répliquer. Les stratégies de détournement cellulaire

78

varient en fonction des virus mais sont toujours conduites dans un même but : assurer la

réplication virale. Cependant, les protéines de l’hôte, dont la machinerie de réparation de

l’ADN, peuvent avoir un impact positif ou négatif sur le cycle viral afin de limiter l’infection

virale tout en préservant l’intégrité génomique de la cellule [cf., revue (Weitzman et al.,

2010)]. Les protéines/structures virales peuvent ainsi stimuler les voies de réponse aux

dommages de l’ADN qui peuvent intervenir à différentes étapes du cycle viral.

A/ STIMULATION DES VOIES DE REPONSE AUX DOMMAGES DE L’ADN LORS DE

L’INFECTION RETROVIRALE

1/ Signalisation et réparation des dommages de l’ADN

L’intégrité du génome humain est continuellement mise à l’épreuve par des agents

exogènes (de source physique ou chimique, e.g., lumière UV) et endogènes (e.g., espèces

oxygène réactives issues du métabolisme) qui génèrent différents types de lésions de l’ADN

(détaillés dans la Figure 26). Nos cellules ont évolué un système sophistiqué de surveillance

et de réparation pour détecter l’ADN endommagé, signaler sa présence et le réparer afin de

prévenir la transmission de mutations génétiques [cf., revues (Ciccia and Elledge, 2010;

Jackson and Bartek, 2009)].

Ainsi, la réponse aux dommages de l’ADN (DNA damage response, DDR) a lieu par

le recrutement successif des différents partenaires : senseurs, transducteurs, médiateurs,

effecteurs, qui détectent la lésion, transduisent et amplifient des signaux d’activation/de

recrutement (Polo and Jackson, 2011) (Figure 26). Ces signaux sont transmissibles par

modifications post-traductionnelles réversibles des protéines cibles (e.g., phosphorylation,

ubiquitination) pour obtenir rapidement une/des réponse(s) adaptée(s) (non-exclusives) au

type de lésion et à son intensité (e.g., apoptose, arrêt de la transcription, arrêt du cycle

cellulaire, remodelage de la chromatine, etc) (Polo and Jackson, 2011).

La DDR permet le recrutement des protéines qui réparent la lésion détectée en

permettant notamment la maturation des extrémités (avec résection ou non, e.g., endo/exo-

nucléase), la synthèse d’ADN (i.e., polymérase) et la ligature des extrémités générées (i.e.,

ligase). La signalisation en réponse à une cassure de l’ADN n’est pas dissociable de la

réparation physique puisque les deux agissent collectivement grâce à des protéines aux

activités (de signalisation et réparation) non-exclusives [e.g., Ku fixe les extrémités de l’ADN

et recrute la sous-unité catalytique de la DNA-PK (DNA-dependent protein kinase) pour

former le complexe DNA-PK] (Ciccia and Elledge, 2010). La réparation des dommages de

79

l’ADN inclut différentes voies qui sont activées en fonction du dommage détecté et du

contexte cellulaire. Ainsi, une cassure double-brin de l’ADN peut activer la voie de réparation

non-homologue NHEJ (non-homologous DNA end joining) ou la voie de recombinaison

homologue HR (homologous recombination) en fonction de la phase du cycle cellulaire dans

laquelle se trouve la cellule endommagée (et donc de son état de différenciation, i.e., cellule

souche qui se divise vs. différenciée) (Figure 26) (Ciccia and Elledge, 2010).

senseurs PARP-1/2 MRN,

PARP-1/2

Ku80/Ku70 RPA MSH2/6

transducteurs ATM DNA-PK ATR ATRIP

Médiateurs Claspin,

BRCA1/2,

53BP1

Effecteurs Chk1,

Chk2, p53

Effecteurs de la

réparation

glycosylase

(UNG2),

endonucléase(

FEN-1),

polymérase β,

DNase, ligase

I/III, Rad18

RPA,

Rad51,

Rad52,

polymérase

ARTEMIS,

XRCC4, Ligase

IV

Rad17,

Hus1, TFIIH

(XPB/XPD,

polymérase κ

MLH1,

PSM2,

PCNA,

polymérase

δ/ε, ligase I

Figure 26 : Types de lésions générés et principales voies de signalisation/réparation

mises en jeu. La figure représente les types de lésions de l’ADN pouvant être générés au sein

du génome humain et les voies de réparation activées en conséquence. Les protéines majeures

de ces voies sont annotées et classées en fonction de leur rôle (i.e., senseur, transducteur,

médiateur, ou effecteur) dans la signalisation des voies de réponse aux dommages de l’ADN.

Les protéines effectrices interviennent dans l’activation/le recrutement de facteurs impliqués

dans la réparation physique de la lésion (des exemples sont indiqués) ainsi que dans le

remodelage de la chromatine et/ou l’arrêt du cycle cellulaire [cf., revues (Ciccia and Elledge,

2010; Polo and Jackson, 2011)] [adaptée de (Lord and Ashworth, 2012)].

80

Le terme « machinerie de réparation de l’ADN » utilisé ultérieurement inclut les

protéines impliquées dans la signalisation et/ou la réparation des dommages de l’ADN, sans

pour autant qu’une voie de réparation entière soit activée.

2/ L’infection rétrovirale, un stress exogène qui stimule la DDR

a/ Différents niveaux de stimulation de la DDR par l’infection rétrovirale

Lors du cycle rétroviral, il existe au moins trois niveaux de stimulation des voies de

signalisation des dommages de l’ADN : (i) l’ADNv linéaire non-intégré, (ii) les protéines

virales telle que Vpr et (iii) les lésions de l’ADN générées lors de l’intégration (Figure 27).

En fonction de la nature et de l’intensité de cette stimulation, la cellule peut mourir ou

survivre.

i/ l’ADNv linéaire non-intégré

Il a été mis en évidence que les cellules déficientes pour la voie NHEJ (i.e., Ku, DNA-

PK ou Ligase IV) meurent par apoptose après infection par le VIH-1 à forte m.o.i.

(multiplicity of infection) de cellules de rongeurs (murines ou de hamster, i.e., Ku, DNA-PK)

et humaines (i.e., Ligase IV) (Daniel et al., 2004; Daniel et al., 1999; Li et al., 2001). Cette

réponse nécessiterait l’intégration de l’ADNv (Daniel et al., 2004; Daniel et al., 1999), ou au

moins la transcription inverse qui le forme (Li et al., 2001). En absence de facteurs de la voie

NHEJ, la présence d’extrémités doubles sur l’ADNv linéaire non-intégré favoriserait la mort

de la cellule infectée par une forte m.o.i. (Daniel et al., 2004; Daniel et al., 1999; Li et al.,

2001). Celle-ci peut cependant avoir lieu de façon indépendante de l’accumulation d’ADNv

linéaire en présence des facteurs NHEJ (Bergeron and Sodroski, 1992 ; Laurent-Crawford and

Hovanessian, 1993) qui le circularisent en cercles à 2-LTRs (Li et al., 2001). Ces résultats

restent malgré tout controversés et seront développés ultérieurement dans le paragraphe

IV.B.2.

ii/ Vpr

L’expression de la protéine virale Vpr induit un arrêt du cycle cellulaire en G2/M

après activation de ATR [Ataxia-telangeictasia mutated (ATM)-and Rad3-related (ATR);

accompagnée de la phosphorylation de CHK1 (Checkpoint kinase 1) et dépendante de Rad17

et Hus1] et la formation de foyers (foci) nucléaires de 53BP1 (p53-binding protein 1), γH2AX

(phosphorylée sur la sérine 139) et BRCA1 (Breast Cancer Gene 1) (Andersen et al., 2005;

81

Lai et al., 2005; Zimmerman et al., 2004). Vpr cause ainsi la mort (par apoptose) des cellules

infectées (Roshal et al., 2003), après fixation sur la chromatine (Lai et al., 2005; Tachiwana et

al., 2006) qui pourrait être médiée par DDB1 (damage-specific DNA-binding protein 1)

(Schrofelbauer et al., 2007) et interférée avec la réplication de l’ADN (Lai et al., 2005;

Zimmerman et al., 2006) et/ou induire des cassures double-brins (double-strand breaks, DSB)

de l’ADN (Tachiwana et al., 2006). Il est à noter que cette propriété de Vpr pourrait être mise

à profit dans des approches anti-cancéreuses (Muthumani et al., 2009).

iii/ Lésions de l’ADN générées lors de l’intégration

Les lésions de l’ADN générées lors de la troisième étape du processus d’intégration de

l’ADNv dans le génome hôte nécessitent une réparation médiée par la machinerie de

réparation de l’ADN de la cellule hôte (cf., § I.B.4). Il ressort des multiples études menées

pour identifier les acteurs essentiels à la réparation de ces lésions exogènes (reportées dans le

tableau 8) qu’aucune des voie de réparation cellulaire ne serait essentielle. En effet, seules

des fonctions de réparation données seraient nécessaires pour une réparation correcte [e.g.,

polymérase, nucléase et ligase (Yoder and Bushman, 2000)] du fait de la redondance des

protéines cellulaires ayant une même fonction lors du processus de réparation physique.

Cependant, les protéines impliquées dans les étapes initiales (dont détection et

signalisation) des voies de réparation des DSBs NHEJ (e.g., Ku, DNA-PK) ou HR (e.g.,

MRE11-NBS1, PARP-1, ATM) semblent importantes dans le cycle du VIH-1 (Tableau 8,

aspects développés dans le § IV.B.2).

b/ Implication des kinases de la DDR après infection par le VIH-1

Les kinases ATM, ATR, et DNA-PK de la famille PI3K (phosphoinositide-3-kinase)

jouent un rôle essentiel dans la transduction des signaux en aval de la détection d’une lésion

de l’ADN. Il a été montré l’implication, le recrutement et/ou l’activation de ces trois kinases

en réponse à une infection cellulaire par le VIH-1 (Tableau 8, Figure 27). En effet, ce sont

des cibles privilégiées du virus car elles possèdent de nombreuses cibles et induisent une

réponse rapide en les phosphorylant de façon réversible (Zimmerman et al., 2004). Il y a

cependant un certain nombre de controverses sur les rôles exacts de ces protéines (Tableau 8,

aspects développés dans le § IV.B.2).

82

c/ Phosphorylation de H2AX après infection rétrovirale

En absence d’infection, les kinases ATM, ATR et DNA-PK activées phosphorylent le

variant d’histone H2A, γH2AX au niveau du site de la lésion de l’ADN (Ciccia and Elledge,

2010). γH2AX a été observé précocement, à partir de 4 h après infection par l’ASV, lors des

premiers évènements d’intégration sans pour autant être nécessaire au processus de réparation

(Daniel et al., 2004). Cette caractéristique majeure d’un dommage de l’ADN n’a cependant

été observée que tardivement (20 h, 48 h) après infection par le VIH-1 et résulterait de

l’expression de Vpr [cf., § IV.A.2, (Zimmerman et al., 2004)] (Figure 27).

Figure 27 : Stimulation des voies de réponse aux dommages de l’ADN lors de l’infection

rétrovirale. Trois niveaux de stimulation des voies de signalisation des dommages de

l’ADN peuvent être activées pendant le cycle rétroviral, il existe: (i) l’ADNv linéaire non-

intégré, (ii) les protéines virales (e.g., Vpr), et (iii) les lésions de l’ADN générées lors de

l’intégration. Ces protéines/intermédiaires viraux peuvent impliqués/activés/recrutés les

kinases ATM, ATR ou DNA-PK qui participent à la transduction de la signalisation, pouvant

faire intervenir la phosphorylation du variant d’histone H2AX (i.e., γH2AX).

83

B/ INTERACTIONS DYNAMIQUES ENTRE LE CYCLE RETROVIRAL ET LA

MACHINERIE DE REPARATION DE L’ADN

1/ Etat actuel des connaissances sur les interactions entre cycle rétroviral et

machinerie de réparation de l’ADN

En réponse à la stimulation de la DDR, et/ou de par leur rôle physiologique, un certain

nombre de protéines impliquées dans la machinerie de réparation de l’ADN peuvent avoir un

rôle positif ou négatif sur différentes étapes de l’infection rétrovirale (Tableau 8).

Figure 28 : Protéines de la réparation de l’ADN identifiées comme nécessaires à la

multiplication du VIH lors d’approches globales. Les études de criblage du génome basées

sur l’utilisation de l’ARNi ont mis en œuvre des lignées cellulaires ou des virus/vecteurs VIH-

1 qui peuvent varier, comme indiqué. Les voies de réparation auxquelles appartiennent les

protéines identifiées sont également annotées à l’aide d’un code couleur.

Dans ce contexte, de récentes analyses génomiques par ARNi des gènes cellulaires

impliqués dans le cycle du VIH-1 ont reporté ceux codant des protéines de la machinerie de

réparation de l’ADN parmi les ~1400 nécessaires à la réplication du VIH-1 (Brass et al.,

2008; Espeseth et al., 2011; Genovesio et al., 2011; Konig et al., 2008; Rato et al., 2010;

84

Waninger et al., 2004; Zhou et al., 2008) [études ayant globalement un faible chevauchement,

comme indiqué dans (Bushman et al., 2009)].

Ces interactions dynamiques entre hôte et virus sont organisées de façon spatio-

temporelle en différents niveaux, dépendants de la localisation cellulaire et de l’étape du cycle

viral (Tableau 8). Il est à noter que les controverses indiquées dans le tableau 8 ainsi que le

peu de chevauchement entre protéines de la réparation identifiées lors d’approches globales

(Figure 28) pourraient s’expliquer par la mise en œuvre de protocoles expérimentaux

différents (e.g., espèce ou type cellulaire utilisé, virus réplicatif vs. vecteur défectif

pseudotypés), comme décrit dans le § IV.B.2).

Tableau 8 : Interactions dynamiques entre le cycle rétroviral et la machinerie de

réparation de l’ADN. Sont indiqués le rôle positif (+) ou négatif (-) des protéines de la

machinerie de réparation de l’ADN avec l’étape du cycle rétroviral concerné (cytoplasmique

ou nucléaire). Les protéines impliquées dans les voies HR et NHEJ sont indiquées en vert et

orange, respectivement.

Cellule Etape du cycle

rétroviral Rôle Protéines (et références)

Cytoplasme

Apoptose

+ ATR stimulée par Vpr (Roshal et al., 2003)

-

ATM [(Daniel et al., 2001), intégration-dépendante (Lau et al.,

2005)], ATR [via intégration (Daniel et al., 2003)], DNA-PK

[(Daniel et al., 2001), via intégration (Daniel et al., 1999),

controversé (Baekelandt et al., 2000)] , Ku [(Li et al., 2001),

controversé (Baekelandt et al., 2000)], Ligase IV [intégration-

dépendante (Daniel et al., 2004), transcription inverse-dépendante

(Li et al., 2001)], NBS1 [via ATM et intégration (Smith et al.,

2008)]

Dégradation de

l’ADNv -

Rad18 (Lloyd et al., 2006), XPB et XPD [(Yoder et al., 2006), au

sein du noyau (Yoder et al., 2011)], UNG2 (Priet et al., 2005)

Insertions de

mutations dans

l’ADNv

+ PMS2 [MLV, à un taux faible (Tang and Zhang, 2000)], UNG2 [via

encapsidation dépendante de Vpr (Chen et al., 2004)]

- UNG2 [(Priet et al., 2005), controversé (Kaiser and Emerman,

2006)]

Noyau

Maturation et protection

des extrémités

ATM, Mre11, NBS1, Artemis (Sakurai et al., 2009), TREX1

[MoMLV (Beck-Engeser et al., 2009)]

Circularisation

des 2-LTRs

+

Ku [(Li et al., 2001), dont Ku80 (Jeanson et al., 2002; Masson et al.,

2007)], Ligase IV (Kilzer et al., 2003; Li et al., 2001), XRCC4 (Li

et al., 2001)

- Rad 52 [compétition avec Ku pour fixer le LTR (Lau et al., 2004)]

Circularisation

des 1-LTR +

MRE11 [(Kilzer et al., 2003), controversé (Sakurai et al., 2009)],

NBS1 (Kilzer et al., 2003)

85

Intégration au

sein du génome

+

ATM [(Lau et al., 2005; Nunnari et al., 2005), controversé (Ariumi

et al., 2005)], ATR [(Daniel et al., 2003; Nunnari et al., 2005; Smith

et al., 2007), controversé (Ariumi et al., 2005; Dehart et al., 2005)],

DNA-PK [(Daniel et al., 1999), controversé (Ariumi et al., 2005;

Baekelandt et al., 2000)], Ku80 [(Jeanson et al., 2002; Waninger et

al., 2004; Zheng et al., 2011), controversé (Li et al., 2001; Masson et

al., 2007)], NBS1 (Smith et al., 2008), PARP-1 [(Ha et al., 2001;

Kameoka et al., 2005), controversé (Ariumi et al., 2005; Baekelandt

et al., 2000; Siva and Bushman, 2002)], WRN [recrutement de

PCAF/P-TEFb (Sharma et al., 2007)], voie BER (Espeseth et al.,

2011; Yoder et al., 2011) dont FEN-1 (Brin et al., 2000; Yoder and

Bushman, 2000) et complexe SET [inhibe autointégration (Yan et

al., 2009)] dont Metnase (Williamson et al., 2008)

- Rad52 [compétition avec Ku sur fixation LTR (Lau et al., 2004)],

Rad51 (intéragit avec IN (Cosnefroy et al., 2012))

Localisation

ATM (Sakurai et al., 2009), DNA-PK [FLV, (Hasegawa et al.,

2005)], Ku80 [LV-SIN en périphérie nucléaire (Masson et al.,

2007)], PARP-1 [centromères (Kameoka et al., 2005)]

Expression +

ATM (via Rev, (Ariumi and Trono, 2006)), DNA-PK (interaction

avec pol II (Tyagi et al., 2011)), Ku80 ((Waninger et al., 2004),

PARP-1 (activation LTR intégré (Kameoka et al., 2004)), Rad51

(interagit avec C/EBPb (Chipitsyna et al., 2006))

-

Ku80 (MMTV, via DNA-PK (Giffin et al., 1999), KBS (Jeanson

and Mouscadet, 2002 ; Masson et al., 2007)), PARP-1 (compétition

avec Tat ou le complexe Tat/P-TEFb pour TAR in vitro (Parent et

al., 2005)), UNG2 (Fenard et al., 2009)

Abréviations : BER, Base Excision Repair [qui inclut Ogg1, Myh, Neil1 et Polß dans (Yoder

et al., 2011), et MUTYH, NTHL1, NEIL3, et POLB dans (Espeseth et al., 2011)]; UNG2, uracil

DNA glycosylase ; MMR, Mispathch repair ; MMTV, mouse mammary tumor virus ; FEN-1,

Flap endonucléase 1 ; Complexe SET, contient les endonucleases APE1 et NM23-H1, la 5’-

3’ exonuclease TREX1 et Metnase ; FLV, Friend leukemia virus ; PARP-1, Poly(ADP-

ribose) polymerase-1.

Il ressort des études citées dans le tableau 8 que les membres des voies de réparation

des DSBs NHEJ et HR sont largement représentés dans les interactions hôte/virus, et ce des

étapes pré-intégratives du cycle viral jusqu’à l’étape cruciale d’expression du génome viral

intégré.

2/ Implications des voies de réparation des cassures double-brins dans le cycle du

VIH-1

La sur-représentation des voies de réparation des DSBs dans les interactions hôte/virus

peut s’expliquer par la capacité des protéines senseurs de ces voies à s’associer aux extrémités

double-brin de l’ADN et à ensuite recruter ses partenaires. Une autre hypothèse (non-

exclusive) repose sur le fait que les lésions simple-brin de l’ADN générées lors de

l’intégration de l’ADNv sont transformées en DSB au cours de la réplication si elles ne sont

86

pas réparées (Smith and Daniel, 2006). Elles doivent cependant être réparées en privilégiant la

voie de réparation associée au moins de délétions possibles des séquences virale/hôte initiales.

a/ Les voies de réparation des cassures double-brin

i/ Principales voies de réparation des cassures double-brin

Les voies de réparation des DSBs sont divisées en deux voies majeures, appelées voie

de réparation non-homologue NHEJ et voie de recombinaison homologue HR. Deux voies

mineures de réparation des DSBs qui nécessitent une homologie de séquence entre les régions

se situant de part et d’autre de la cassure double-brin ont été décrites. Il s’agit des voies de

réparation médiées par l’hybridation des simples brins (single-strand annealing, SSA), ou de

micro-homologies (micro-homology-mediated end joining, MMEJ ; aussi appelé alternative-

NHEJ) (Ciccia and Elledge, 2010; Mladenov and Iliakis, 2011).

ii/ Choix de la voie de réparation

Le choix de la voie de réparation des DSBs est régulé par de nombreux facteurs, dont

la nature de la lésion et la phase du cycle cellulaire dans laquelle se trouve la cellule au

matériel génétique endommagé. En particulier, la régulation du choix entre NHEJ et HR se

fait par la résection des extrémités double-brin de l’ADN dont l’activation dépend des kinases

cycline-dépendantes (CDK) (Ciccia and Elledge, 2010).

C’est la voie NHEJ qui est principalement utilisée chez les vertébrés et peut être

activée tout au long du cycle cellulaire. Elle met en jeu la ligature des extrémités double-brin

de l’ADN lésé qui n’ont, au préalable, été que peu ou pas maturées et protégées par Ku

(Figure 29A). Cette voie de réparation est considérée comme peu fidèle mais est corrélée à

une réparation sans mutation/insertion/délétion si les deux extrémités des cassures ne sont ni

maturées, ni endommagées (Ciccia and Elledge, 2010).

Les autres voies de réparation nécessitent une résection 5’-3’ des extrémités de l’ADN

lésé. La voie HR est une réparation fidèle qui nécessite un substrat homologue,

principalement la chromatide sœur du chromosome portant la lésion présente après la

duplication de l’ADN, pendant la fin de la phase S et la phase G2 du cycle cellulaire (Figure

29B). La voie MMEJ nécessite des micro-homologies au niveau des extrémités de la DSB

(Figure 29C). La voie SSA a lieu par recombinaison homologue entre les séquences

homologues se situant de part et d’autre de la DSB (Figure 29D). Ces deux dernières voies de

87

réparation aboutissent, respectivement, à des délétions/insertions minimes ou importantes

(Ciccia and Elledge, 2010).

Figure 29 : Voies de réparation des cassures double-brins de l’ADN. Le choix de

réparation des cassures double-brins a lieu par fixation des extrémités double-brin par Ku (A)

ou PARP-1 (B) qui induisent respectivement les voies NHEJ ou HR [ou alt-NHEJ/MMEJ (C),

ou SSA (D)]. Chacune des voies activées induit un processus de réparation qui diffère de par

les partenaires recrutés, aboutissant in fine à la réparation de la lésion prise en charge [adaptée

de (Ciccia and Elledge, 2010)].

b/ Interactions des voies NHEJ et HR avec les différentes étapes du cycle

du VIH-1

i/ Importance de la voie NHEJ dans le cycle du VIH-1

Il a été mis en évidence que les protéines de la voie NHEJ (i.e., Ku, DNA-PK, Ligase

IV) ont un effet positif sur la réplication du VIH au sein de cellules de rongeurs (i.e., Ku,

DNA-PK) et humaines (i.e., Ligase IV). Elles agissent en limitant l’apoptose (Daniel et al.,

2001; Daniel et al., 1999) et en favorisant l’intégration de l’ADNv (Daniel et al., 2004; Daniel

et al., 1999) ou au moins la transcription inverse (Li et al., 2001). Cependant, ces résultats

88

sont controversés et ne sont visibles qu’après une infection à forte m.o.i. (> 1) (Ariumi et al.,

2005; Baekelandt et al., 2000).

Les protéines de la voie NHEJ seraient également impliquées dans la circularisation

des espèces circulaires d’ADNv à 2-LTRs, comme reporté pour Ku (à faible et forte m.o.i)

dans des cellules humaines infectées par un virus VIH-1 réplicatif (Jeanson et al., 2002;

Zheng et al., 2011) ou des cellules de rongeurs transduites par un vecteur dérivé du VIH-1

(i.e., non-réplicatif) (Li et al., 2001; Masson et al., 2007). De plus, Ligase IV/XRCC4 a été

décrit influencer la génération des cercles à 2-LTRs à forte m.o.i. dans des cellules humaines

transduites par un vecteur VIH-1 (Li et al., 2001).

L’implication de DNA-PK dans l’intégration du VIH-1 au sein du génome hôte,

décrite à forte m.o.i. au sein de cellules de rongeurs (Daniel et al., 1999), reste controversée

(Ariumi et al., 2005; Baekelandt et al., 2000). Il en est de même pour Ku80 qui participerait à

ce processus à faible m.o.i. uniquement dans les cellules humaines dépourvues en Ku80

infectées par un virus VIH-1 réplicatif (Jeanson et al., 2002 ; Zheng et al., 2011) ou

transduites par un vecteur dérivé du VIH-1 (Waninger et al., 2004).

Cependant, DNA-PK et/ou Ku80 interviendraient dans le ciblage rétroviral dans la

chromatine [du FLV (Hasegawa et al., 2005) et d’un vecteur SIN dérivé du VIH-1 en

périphérie nucléaire (Masson et al., 2007)] au sein de cellules de rongeurs. Ces protéines ont

également été décrites impliquées dans la régulation positive [DNA-PK (Tyagi et al., 2011),

Ku80 (Waninger et al., 2004)] et/ou négative [Ku80 (Jeanson and Mouscadet, 2002 ; Masson

et al., 2007)] de l’expression du VIH-1 au sein de cellules humaines (Jeanson and Mouscadet,

2002; Tyagi et al., 2011; Waninger et al., 2004), et de rongeurs (Masson et al., 2007) (aspects

concernant Ku développés dans le § IV.C.3).

Les controverses liées à ces résultats proviendraient de la mise en œuvre de designs

expérimentaux différents, comme décrit dans le paragraphe iv/ ci-dessous (cf., IV.B.2).

ii/ Importance de la voie HR dans le cycle du VIH-1

La voie HR, via ATM, a également été décrite comme ayant un rôle positif dans la

réplication du VIH-1. ATM agit en réduisant l’apoptose induite par l’infection du VIH-1

(Daniel et al., 2001) à faible m.o.i. de façon dépendante de NBS1 et de l’intégration de

l’ADNv (Lau et al., 2005; Smith et al., 2008) dans des cellules humaines (Daniel et al., 2001;

Lau et al., 2005; Smith et al., 2008) et murines (Daniel et al., 2001; Lau et al., 2005). La voie

HR serait aussi impliquée dans la maturation et protection des extrémités de l’ADNv (Sakurai

89

et al., 2009) et la circularisation des cercles à 1-LTR à forte m.o.i. (Kilzer et al., 2003) au sein

des cellules humaines transduites par un vecteur dérivé du VIH-1 (Kilzer et al., 2003; Sakurai

et al., 2009). La voie HR a également été décrite comme inhibant la circularisation des cercles

à 2-LTRs dans les cellules murines infectées par le VIH-1 réplicatif (Lau et al., 2004).

ATM et PARP-1 agiraient positivement sur l’intégration [(Ha et al., 2001; Kameoka et

al., 2005; Lau et al., 2005; Nunnari et al., 2005), résultat controversé (Ariumi et al., 2005;

Baekelandt et al., 2000)] au sein de cellules humaines (Baekelandt et al., 2000; Kameoka et

al., 2005; Lau et al., 2005; Nunnari et al., 2005) et de rongeurs (Ariumi et al., 2005;

Baekelandt et al., 2000; Ha et al., 2001; Kameoka et al., 2005) transduites par un vecteur

dérivé du VIH-1 (Ariumi et al., 2005; Baekelandt et al., 2000; Ha et al., 2001; Kameoka et al.,

2005; Lau et al., 2005) ou infectées par un virus VIH-1 réplicatif (Baekelandt et al., 2000;

Nunnari et al., 2005).

Les protéines ATM et PARP-1 de la voie HR interviendraient dans le ciblage (partiel)

du VIH-1 au sein du génome hôte [ATM (Sakurai et al., 2009), PARP-1 (Kameoka et al.,

2005)] au sein de cellules humaines (Kameoka et al., 2005; Sakurai et al., 2009) et de

rongeurs (Kameoka et al., 2005) transduites par un vecteur dérivé du VIH-1. Elles auraient

également un rôle dans la régulation de l’expression virale de façon positive [ATM (Ariumi

and Trono, 2006), PARP-1 (Kameoka et al., 2004)] et/ou négative [PARP-1 in vitro (Parent et

al., 2005)] au sein de cellules humaines (Ariumi and Trono, 2006; Kameoka et al., 2004) et de

rongeurs (Ariumi and Trono, 2006) transduites par un vecteur VIH-1 (Ariumi and Trono,

2006; Kameoka et al., 2004) ou infectées par le VIH-1 réplicatif (Ariumi and Trono, 2006)

(aspects concernant PARP-1 développés dans le § IV.C.3).

Cependant, des acteurs de la voie HR se trouvant en aval de ATM, Rad51 et Rad52,

défavoriseraient l’intégration du VIH-1 au sein du génome hôte (Cosnefroy et al., 2012), ce

dernier pouvant être en compétition avec Ku pour fixer le LTR (Lau et al., 2004).

iii/ Importance des voies de réparation lors d’une infection dans un

contexte indépendant de l’intégration

Il a très récemment été mis en évidence que l’infection par le VIH-1 dans un contexte

déficient pour l’intégration est favorisée dans des conditions de dommages de l’ADN (i.e.,

pré-traitement des cellules par irradiation ou au peroxyde d’hydrogène avant infection) et

corrélée à une expression virale moindre (comparé au VIH-1 compétent pour l’intégration)

(Ebina et al., 2012). De plus, l’analyse des jonctions LTR-chromatine hôte a montré qu’elles

90

portent des délétions pour le LTR ou des insertions > 50 bp, résultat corrélé à une insertion

fréquente du VIH-1 dans les répétitions minisatellites-like (Ebina et al., 2012). Cette étude

suggère une prise en charge de l’ADNv par la voie NHEJ et/ou HR qui pourrait influencer le

site d’intégration du VIH-1 et être associée à la constitution de réservoirs viraux (Ebina et al.,

2012).

iv/ Controverses

Comme décrit ci-dessus, il existe un certain nombre de controverses sur l’implication

de la machinerie de réparation de l’ADN sur le cycle rétroviral qui repose sur la mise en

œuvre de designs expérimentaux différents. Ils varient quant à l’utilisation du type cellulaire

(hôte naturel du VIH-1, ou autre pouvant avoir des voies de réparation privilégiées), du

virus/vecteur ( e.g., VIH-1 réplicatif, pseudotypé, etc), de la m.o.i. [comme discuté dans

(Sinclair et al., 2006) et illustré dans (Yang et al., 2010)], du temps d’analyse post-

transduction, de molécules pharmacologiques [dont la spécificité est concentration- et type

cellulaire-dépendante (Yang et al., 2010)] et, enfin, des techniques (qui deviennent plus

précises, e.g., espèces d’ADNv circulaires analysées sur gel d’agarose après PCR vs. Q-PCR

actuellement).

Notamment, un certain nombre d’études a pu être mené au sein de cellules de rongeurs

[i.e., souris (e.g., mouse embryonic fibroblasts, MEFs) ou hamster (e.g., Chinese Hamster

Ovary, CHO)] qui peuvent être aisément déplétées en facteurs de la réparation de l’ADN. De

plus, les protéines impliquées dans la réparation de l’ADN n’ont pas la même abondance dans

les cellules humaines et de rongeurs. C’est ains le cas de DNA-PK, très abondante dans les

cellules humaines (Ting et al., 1999). Cette différence sous-tend des rôles attribués aux

protéines impliquées dans la réparation de l’ADN qui pourraient varier entre espèces (chez les

mammifères) et être spécifique, au sein d’une espèce, d’interaction(s) avec un agent

infectieux donné (e.g., Ku avec le VIH-1, aspect développé dans le § IV.C.3).

v/ NHEJ versus HR

La circularisation des espèces d’ADNv non-intégrées à 1- et 2-LTRs par les voies HR

et NHEJ est cohérente avec leur fonction de réparation par recombinaison homologue et

ligature, respectivement.

Il a été proposé que la voie NHEJ soit utilisée préférentiellement dans la réparation

post-intégration de l’ADNv dans le génome hôte du fait de son activation tout au long du

91

cycle cellulaire et du substrat que représente l’ADNv avec des extrémités maturées mais non-

endommagées (Smith and Daniel, 2006). Cependant, la voie HR (ainsi que les voies de

réparation des cassures simple-brin) semble avoir aussi un rôle non négligeable dans ce

processus (Tableau 8). Le choix de la voie de réparation mise en jeu dans la réparation post-

intégration de l’ADNv intégré serait multifactoriel et/ou non-exclusif, surtout en cas

d’infection multiple.

Enfin, l’implication des protéines des voies NHEJ et HR dans la localisation du

provirus intégré et/ou la régulation de son expression pourraient être des conséquences

secondaires dues à leur rôle dans la réparation post-intégration, le résultat d’une prise en

charge précoce de l’ADNv, et/ou indépendant de leur fonction/recrutement lors du processus

de réparation.

3/ Implication de la machinerie de réparation dans le cycle lentiviral et

remodelage chromatinien

Certaines des conséquences secondaires de l’implication de la machinerie de

réparation dans le cycle rétroviral ont déjà été évoquées dans les paragraphes ci-dessus (e.g.,

apoptose, arrêt du cycle cellulaire, etc). Cependant, l’intervention de la machinerie de

réparation dans un contexte « sain » nécessite un remodelage de la chromatine associé à des

modifications épigénétiques qui permettent d’assurer l’accès à la machinerie de réparation de

l’ADN à la zone chromatinienne lésée, de la même façon que lors de l’activation de

l’initiation de la transcription (e.g., code histone spécifique de la réparation vs. transcription,

aspects développés dans le § III.A.1).

Dans ce contexte, l’infection par le VIH-1 pourrait induire un remodelage local de la

chromatine en réponse à un recrutement initié par la DDR, ou un changement global de

l’organisation chromatinienne, en fonction du degré d’intensité de stress auquel est corrélée

l’infection (Lilley et al., 2010). Un remodelage de la chromatine global ou local au niveau du

site d’intégration en réponse à l’infection du VIH-1, médiée par le recrutement de la

machinerie de réparation de l’ADN et/ou la mise en place de modifications épigénétiques

spécifiques, pourrait ainsi avoir un impact sur l’expression virale qui pourrait être variable au

cours du temps.

A titre d’exemple, comme décrit précédemment, l’infection par l’ASV peut induire la

phosphorylation de H2AX (Daniel et al., 2004). De plus, Metnase, impliquée dans la

méthylation de l’histone H3 après activation de la voie NHEJ (Lee et al., 2005), a été décrit

92

avoir un rôle dans l’intégration lentivirale au sein du génome hôte (Williamson et al., 2008).

Néanmoins, il n’a pas été montré de lien direct entre remodelage de la chromatine, réparation

de l’ADN et infection par le VIH-1.

C/ ROLES DU COMPLEXE KU DANS LE CYCLE RETROVIRAL

Au cours de notre étude, nous nous sommes plus précisément intéressés aux rôles du

complexe Ku dans le cycle de réplication du VIH-1. Ainsi, ce facteur a été décrit participer à

de nombreuses étapes du cycle rétroviral (Tableau 8) mais ses fonctions restent malgré tout

controversées.

1/ Le complexe Ku

a/ Identification des protéines Ku70 et Ku80

Le complexe protéique Ku est composé de deux sous-unités : Ku80 (de 86 kDa, aussi

appelée Ku86) et Ku70 (de 70 kDa). Cet hétérodimère a été identifié en 1981 dans le sang de

patients atteints de syndrome de chevauchement sclérodermie-polymyosite (i.e., maladie

autoimmune caractérisée par deux types d’atteintes cliniques/biologiques) dont la moitié

avaient des anticorps anti-Ku (nom issu des initiales du premier patient identifié) (Mimori et

al., 1981). Il a ensuite été retrouvé dans le sang de patients atteints d’autres maladies

autoimmunes (e.g., lupus érythrémateux systémique) (Francoeur et al., 1986; Mimori et al.,

1986; Reeves, 1985).

b/ Gènes codant le complexe Ku

Ku80 est codé par le gène XRCC5 tandis que Ku70 est codé par XRCC6 (X-ray repair

complementing defective repair in Chinese hamster cells 5 et 6, respectivement), en référence

aux études menées chez le rongeur qui ont permis d’identifier Ku comme un facteur important

dans la réparation des lésions de l’ADN (Errami et al., 1996; Singleton et al., 1997). Ces gène

sont situés sur les chromosome humains 2 et 22 (positions 2q35 et 22q13, respectivement)

(Koike, 2002).

Chez les eucaryotes supérieurs, il existe un autre membre au sein de la famille Ku,

appelé KARP-1 (Ku80-autoantigen-related protein-1) qui est transcrit à partir du locus

XRCC5 en utilisant un promoteur en aval et des exons supplémentaires (Myung et al., 1997).

La protéine qui en résulte possède une extension en N-terminal de ~9 kDa comparée à Ku80

93

(Myung et al., 1997). KARP-1 ne pourrait cependant pas remplacer Ku80 lors de la réparation

des DSBs malgré le fait qu’elle puisse s’hétérodimériser avec Ku70, comme décrit récemment

(Koike et al., 2011).

c/ Caractéristiques de l’hétérodimère Ku

i/ Conservation de Ku au cours de l’évolution

Chez les eucaryotes, des homologues de Ku ont été retrouvés chez les singes, les

amphibiens (i.e., Xenopus laevis), les insectes (i.e., Drosophilia melanogaster) et les rongeurs

(i.e., souris, hamster). Il est cependant à noter, comme cité précédemment, que la

concentration en Ku est nettement moins importante dans les cellules de rongeurs comparées

à celles d’origine humaine (Tuteja and Tuteja, 2000). Cependant, la majorité des eucaryotes

inférieurs ne possèdent ni la DNA-PKcs, ni le domaine d’interaction avec cette protéine au

sein de l’homologue de Ku80. La capacité de Ku80 à recruter la DNA-PKcs est ainsi

spécifique des eucaryotes supérieurs (Downs and Jackson, 2004). La conservation structurale

et fonctionnelle de Ku chez les eucaryotes suggère cependant l’existence de fonctions de Ku

indépendantes de la réparation des DSBs chez les eucaryotes supérieurs, ainsi que de

nouvelles fonctions dépendantes de la réparation de l’ADN.

Enfin, des homologues de Ku, codés par un gène, ont été découverts chez les bactéries

et archées (Aravind and Koonin, 2001; Doherty et al., 2001).

ii/ Propriétés structurales du complexe Ku

Les sous-unités Ku70 et Ku80 du complexe Ku présentent seulement 14 % d’identité

de séquences mais un repliement quasi-identique, ce qui suggère qu’elles proviendraient d’un

même gène ancestral (Walker et al., 2001). Elles ont une organisation structurale proche

puisque toutes deux sont constituées de trois régions : le domaine N-terminal (term) en hélices

α et feuillets β, un domaine central en tonneau β et de domaines C-term divergents (Figure

30A, B, C).

94

Figure 30 : Organisation du complexe Ku. (A-B) Représentations schématiques de

l’organisation des domaines des sous-unités Ku80 (A) et Ku70 (B). Elles sont constituées des

régions suivantes : le domaine N-terminal (term) α/β , un domaine central en tonneau β et de

domaines C-term divergents. Ku80 possède un long domaine C-term en hélices, comparé au

domaine SAP (SAF-A/B, Acinus and PIAS) en C-term de Ku70. (C-D) Structures

tridimensionnelles du complexe Ku seul (C) ou en interaction avec l’ADN (D). Ku80 et Ku70

sont représentées en bleu et rouge, respectivement. Sont indiqués les domaines décrits ci-

dessus. Le rond bleu ciel indique le dernier acide aminé du domaine C-term de Ku80 [adaptée

de (Rivera-Calzada et al., 2007)].

Les domaines aux extrémités ont la capacité de fixer des protéines alors que le

domaine central intéragit avec l’ADN de façon non-spécique (Figure 30D). Ku80 possède un

long domaine C-term lui permettant d’intéragir avec la sous-unité catalytique DNA-PKcs

pour former la DNA-PK. Quant à Ku70, il possède en C-term un domaine SAP (SAF-A/B,

Acinus and PIAS) qui lui permettrait de se lier à l’ADN. De plus, le domaine C-term de

chacune des deux sous-unités lui permet d’interagir avec le domaine central de l’autre sous-

unité (Figure 30 C, D) (Gullo et al., 2006; Rivera-Calzada et al., 2007).

iii/ Stabilité du complexe Ku

Le complexe hétérodimérique Ku70-Ku80 est extrêmement stable in vivo. Cette

stabilité lui est conférée par l’hétérodimérisation des deux sous-unités ainsi que par le

recrutement/activation de la DNA-PK. Ainsi, la déplétion stable en Ku80 dans les cellules de

hamster xrs-6 résulte en la perte de Ku70 (Singleton et al., 1997). De plus, la déplétion

(partielle stable ou transitoire) en Ku80 dans les cellules humaines HCT 116 est corrélée à la

diminution de Ku70, et vice-versa [(Li et al., 2002), observations personnelles]. De la même

façon, la trans-complémentation (transitoire) de Ku80 au sein de cellules de rongeurs ou

95

humaines déplétées pour cette protéine permet de rétablir les niveaux protéiques des deux

sous-unités (Errami et al., 1996; Ghosh et al., 2007).

Cependant, Ku80 et Ku70 auraient chacune des fonctions qui leur sont propres

(Ochem et al., 1997). La stabilité des sous-unités de Ku dépendrait donc de leur

hétérodimérisation mais aussi de leur dégradation sous forme monomérique (Gullo et al.,

2006).

iv/ Localisation du complexe Ku

Les protéines Ku sont impliquées dans de nombreux processus nucléaires et

cytoplasmiques, ce qui suggère qu’elles puissent être actives à de nombreux emplacements au

sein de la cellule. Elles sont cependant majoritairement nucléaires, et localisées au sein des

régions transcriptionnellement actives du noyau (Gullo et al., 2006). Les sous-unités du

complexe Ku peuvent aussi être localisées dans le cytoplasme, notamment au cours de la

mitose au sein des cellules humaines (Koike, 2002). La translocation nucléaire de chacune des

deux sous-unités pendant la phase G1 se ferait ensuite de façon indépendante et le retour de

Ku70 précèderait alors celui de Ku80 (Koike, 2002). De plus, le transport au noyau de Ku80

et Ku70 impliquerait des régulateurs différents, comme en témoignent les signaux de

localisation nucléaire qui diffèrent entre ces deux protéines (Koike, 2002). Les protéines Ku

ont également été décrites être présentes à la membrane cellulaire de différents types

cellulaires (Prabhakar et al., 1990), où elles pourraient jouer le rôle de molécules d’adhésion

(Teoh et al., 1998).

Enfin, des changements de localisation subcellulaire de Ku (i.e., translocation

nucléaire) peuvent être contrôlés par des stimuli initiés lors de contacts entre cellules, ou de

stress produits par la privation en facteurs de croissance (i.e., apportés par le sérum) ou le

traitement à l’hydroxyurée (Fewell and Kuff, 1996).

v/ Activités de fixation des nucléotides et protéines par Ku

Ku a la capacité d’interagir avec les nucléotides (i.e., ADN, ARN). Les premières

études menées sur les capacités de fixation de l’ADN de Ku ont mis en évidence qu’elles se

produisent avec une haute affinité aux extrémités (endommagées ou non) de l’ADN de façon

non-spécifique, indépendante de leurs structures/séquences (Tuteja and Tuteja, 2000).

Cependant, Ku peut aussi se fixer de façon séquence-spécifique au niveau d’éléments de

régulation de la transcription de certains gènes viraux, tel le NRE (negative regulatory

96

element) au sein du LTR du MMTV (Giffin et al., 1999) et du HTLVI (Okumura et al., 1994),

et de nombreux gènes humains (Tuteja and Tuteja, 2000).

Ku peut également fixer sélectivement des structures ARN, tel l’élément TAR du

VIH-1 in vitro (Kaczmarski and Khan, 1993).

Il a également été mis en évidence que Ku interagit directement (de façon

indépendante de DNA-PK ou non) avec un certain nombre de protéines, dont la télomérase

(Ting et al., 2005), PARP-1 (Galande and Kohwi-Shigematsu, 1999), YY1 (Sucharov et al.,

2004) et l’histone H2AX (Heo et al., 2008).

vi/ Sous-unité de la DNA-PK

L’activité sérine-thréonine kinase de DNA-PK est portée par sa sous-unité catalytique,

DNA-PKcs. L’activité kinase de cette dernière est stimulée lors de son recrutement à l’ADN

par Ku (qui y est déjà fixé) pour ainsi former le complexe DNA-PK. Il a été démontré in vitro

la capacité de DNA-PK à phosphoryler de nombreuses protéines nucléaires régulatrices

pouvant se fixer à l’ADN, dont p53, SP-1, l’ARN pol II, TFIID, Artemis, Ku et elle-même, ce

qui souligne son implication dans un certain nombre de processus (Tuteja and Tuteja, 2000).

2/ Rôles de Ku

a/ Réparation

Le complexe Ku est essentiel à la réparation des DSBs médiée par la voie NHEJ

puisque son absence réduit l’activité NHEJ dans les cellules de rongeurs (Errami et al., 1996),

et au moins l’activité DNA-PK chez l’homme (Li et al., 2002).

Brièvement, Ku détecte les cassures double-brin de l’ADN et, via sa fixation, permet

de (i) choisir la voie NHEJ, (ii) protéger et rapprocher les extrémités de l’ADN et (iii) recruter

les autres facteurs de la voie NHEJ (Figure 31A). La première à être ensuite recrutée est la

DNA-PKcs qui forme avec Ku le complexe DNA-PK (Figure 31B). Les (auto-

)phosphorylations séquentielles de DNA-PK et Artemis favorisent la maturation (e.g.,

résection) des extrémités par Artemis et leur protection par DNA-PK (Figure 31C), ce qui

permet un rapprochement des extrémités (Figure 31D) avant ligation par XRCC4/Ligase

IV/XLF (Figure 31E) (Ciccia and Elledge, 2010). Il est à noter que le détachement de Ku de

la zone d’ADN réparée nécessite son ubiquitinilation préalable (Postow et al., 2008).

97

Figure 31 : Processus de réparation d’une cassure double-brin de l’ADN impliquant la

voie non-homologue NHEJ. La fixation des protéines Ku70/Ku80 aux extrémités double-

brin de la cassure de l’ADN (A) permet le recrutement de la DNA-PKcs (B). Le complexe

DNA-PK ainsi formé et Artemis (auto)phosphorylés favorisent la maturation des extrémités

de l’ADN (C) qui sont protégés par la DNA-PK (D) puis liguées par XRCC4/Ligase IV/XLF

(E)[adaptée de (Ciccia and Elledge, 2010)].

Cependant, l’accès à la lésion, permettant l’intervention des facteurs de la réparation,

nécessite un remodelage de la chromatine pouvant faire intervenir des protéines polycomb

[e.g., PHF1, (Hong et al., 2008)] et/ou des méthyltransférases [e.g., Metnase (Lee et al.,

2005)]. De la même façon, la chromatine doit être ré-assemblée après réparation. Ce

processus pourrait faire intervenir Ku, qui interagit in vitro avec CAF-1 (Chromatin assembly

factor 1), responsable de l’assemblage de novo des histones H3 et H4 (Hoek et al., 2011).

De plus, la voie NHEJ, dont Ku, participe à la recombinaison V(D)J (variable-

diversity-joining) impliquée dans le réarrangement des gènes d’immunoglobulines générant

ainsi de la diversité. En particulier, la voie NHEJ, grâce au processus décrit ci-dessus, permet

la maturation et la réparation des structures en boucles dont la formation est médiée par les

protéines RAG1 et RAG2 (recombination-activating gene) (Downs and Jackson, 2004).

98

Enfin, Ku inhiberait l’apoptose médiée par Apaf-1 après lésion de l’ADN en

interagissant directement avec le promoteur du gène codant ce facteur pro-apoptotique et en

régulant négativement sa transcription (De Zio et al., 2011).

b/ Télomères

Les télomères des chromosomes représentent une source perpétuelle d’extrémités de

l’ADN pour les cellules eucaryotes. Néanmoins, la longueur de ces extrémités varient en

fonction des espèces. Elles sont ainsi plutôt longues chez les rongeurs mais relativement

courtes chez l’homme. Leur taille est cependant critique pour la survie cellulaire (Espejel et

al., 2002).

Les évidences de l’implication de Ku dans le maintien des télomères proviennent

principalement des études menées chez Saccharomyces cerevisiae. Ku y a été décrit participer

à la localisation des télomères en périphérie nucléaire et être nécessaire à l’établissement d’un

état chromatinien trancriptionnellement inactif (Downs and Jackson, 2004).

Chez d’autres organismes, Ku a été mis en évidence dans la régulation des télomères.

Ainsi, Ku s’associe avec les télomères au sein des cellules humaines et de rongeurs, et en

particulier avec la télomérase chez l’homme (Ting et al., 2005). Notamment, Ku permet de

maintenir la longueur des télomères et protéger les extrémités des chromosomes (Riha et al.,

2006). Ku est donc essentielle à la survie des cellules humaines de par son rôle dans le

maintien des télomères (Li et al., 2002; Wang et al., 2009).

c/ Transcription

Un certain nombre de gènes possède des élèments de régulation pouvant être fixés par

Ku qui peut ainsi réguler leur expression (Tuteja and Tuteja, 2000). Le complexe a

notamment été décrit se fixer spécifiquement à des séquences d’ADN riches en purines et en

AT au niveau des gènes humains codant le récepteur à la transferrine (Roberts et al., 1994), le

récepteur aux glucocorticoïdes (Warriar et al., 1996), la xanthine oxidoréductase (Xu et al.,

2004), le récepteur aux androgènes (Mayeur et al., 2005), l’IL-2 (Shi et al., 2007) et c-

jun (Jiang et al., 2008) ainsi que des gènes viraux, dont ceux du rétrovirus murin MMTV

(Giffin et al., 1996). Le complexe Ku peut ainsi avoir un effet répresseur [e.g., du promoteur

du MMTV (Giffin et al., 1996)] ou activateur de la transcription [e.g., promoteur du gène

codant le récepteur aux glucocorticoïdes (Warriar et al., 1996) ou c-jun (Jiang et al., 2008)].

99

De plus, Ku a été retrouvé impliqué dans la régulation de l’expression médiée par les ARN

pol I, II et III (Downs and Jackson, 2004).

Un exemple caractéristique est la stimulation de la transcription du gène IL-2 par Ku et

NF90 au sein de cellules T activées. Dans ces cellules au repos, Ku(70/80) et NF90

interagissent avec le promoteur IL-2 in vivo et participerait à créer/maintenir un

environnement défavorable à la transcription. Lors de l’activation cellulaire, le remodelage de

la chromatine modifierait les fixations protéines-ADN en diminuant la fixation de Ku70 et

augmentant les interactions Ku80/NF90 avec le promoteur IL-2 qui favoriserait alors

l’initiation de la transcription (Shi et al., 2007).

Enfin, il a été très récemment mis en évidence que DNA-PK provoque une inhibition

de la transcription par l’ARN pol II en présence des DSBs, et son éviction de l’ADN, de

manière à favoriser la réparation des lésions (Pankotai et al., 2012).

Ainsi, Ku, de part ses caractéristiques particulières, peut être impliqué dans la

régulation de la transcription de façon dépendante ou indépendante du processus de

réparation.

d/ Interactions de Ku avec les virus

Il a été mis en évidence que DNA-PK/Ku régulerait négativement la réplication du

KSHV (Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus) sous forme latente en phosphorylant une

protéine clé de la latence appelée LANA (latency-associated nuclear antigen), impliquée

notamment dans la persistance et la réplication des épisomes viraux (Cha et al., 2010).

De plus, DNA-PK/Ku favoriserait la réplication du AAV in vitro (Choi et al., 2010).

Parallèlement, le ciblage de gène médié par un AAV est augmenté si la voie NHEJ, dont

Ku70, est inhibée (Fattah et al., 2008; Paulk et al., 2012).

Enfin, Ku80 permettrait d’augmenter la transcription lytique de l’EBV (Epstein-Barr

virus) en interagissant avec son facteur de transcription Zta au niveau du promoteur du gène

de la phase lytique BZLF1 (Chen et al., 2011).

3/ Rôles de Ku dans le cycle du VIH-1

Ku interagit à différentes étapes du cycle du VIH-1 (aspect développé dans le §

IV.B.2). Cependant, son rôle est controversé du fait de l’utilisation de designs expérimentaux

qui peuvent varier (cf., § IV.B.2). Le complexe Ku a malgré tout été identifié comme cible

100

cellulaire qui affecte la réplication du VIH-1 par deux analyses génomiques globales

(Genovesio et al., 2011; Waninger et al., 2004). Dans la suite de ce paragraphe, seront

distingués les rôles décrits à l’une ou l’autre des sous-unités du complexe Ku, ou du complexe

Ku lorsque les deux sous-unités sont impliquées.

a/ Etapes pré-intégratives

Il a été mis en évidence que Ku70 interagit avec l’IN du VIH-1 [ainsi qu’avec celle du

MLV (Li et al., 2001; Studamire and Goff, 2008)] au sein du PIC in vitro (Li et al., 2001) et in

vivo (de façon indépendante de Ku80) au sein de cellules humaines (Zheng et al., 2011). De

plus, grâce à cette interaction, Ku70 pourrait être encapsidé au sein des particules virales lors

de l’assemblage des virions et protégé l’IN d’une dégradation par le protéasome lors de

l’infection (Zheng et al., 2011). Ku est également impliqué dans la circularisation des espèces

circulaires d’ADNv à 2-LTRs à faible et forte m.o.i. dans des cellules humaines infectées par

un virus VIH-1 réplicatif (Jeanson et al., 2002; Zheng et al., 2011). } ou des cellules de

rongeurs transduites par un vecteur dérivé du VIH-1 (i.e., non-réplicatif) (Li et al., 2001;

Masson et al., 2007). Cependant, Ku n’interviendrait pas directement dans la stimulation de la

réaction d’intégration puisqu’elle ne participe ni au clivage des extrémités de l’ADNv, ni au

transfert de brin au sein du génome hôte (Li et al., 2001).

b/ Intégration et localisation

Ku80 a été décrit participer au processus d’intégration du VIH-1 uniquement dans les

cellules humaines déplétées (transitoirement ou stablement) en Ku80 infectées par le VIH-1

(Jeanson et al., 2002; Zheng et al., 2011) ou transduites par un vecteur dérivé (Waninger et

al., 2004). Le rôle de Ku dans l’intégration virale semble donc spécifique de l’espèce humaine

puisqu’aucun effet de la déplétion en Ku n’a été observé sur l’intégration du VIH-1 dans des

cellules de rongeur dépourvues en Ku (Baekelandt et al., 2000; Li et al., 2001; Masson et al.,

2007).

Enfin, notre laboratoire a décrit que Ku80 pourrait participer à la localisation d’un

vecteur SIN dérivé du VIH-1 en périphérie nucléaire de cellules de rongeur dépourvues en Ku

et influencer négativement l’expression virale dans le temps (Masson et al., 2007). Cependant,

dans cette étude, il n’a pas été mis en évidence si Ku80 participait au ciblage de l’intégration

ou à la relocalisation du provirus en périphérie nucléaire après transduction (Masson et al.,

2007).

101

c/ Expression

i/ Régulation de l’expression du VIH-1 et controverses

Il a été reporté que Ku80 peut influencer positivement (Waninger et al., 2004) ou

négativement (Jeanson and Mouscadet, 2002; Masson et al., 2007) l’expression du VIH-1. De

plus, DNA-PK régule de façon négative la transcription du MMTV grâce à la fixation de Ku

sur un élément de régulation spécifique présent au sein de l’élément NRE du LTR du MMTV

(Giffin et al., 1999). Ce site de fixation potentiel pour Ku (Ku binding site, KBS) a également

été identifié dans le NRE du LTR du VIH-1 (Jeanson and Mouscadet, 2002) et pourrait

participer à la répression de la transcription du VIH-1 au sein des cellules U1 contenant deux

provirus pseudolatents [i.e., qui porte une mutation au niveau du gène tat (Emiliani et al.,

1998)] (Jeanson and Mouscadet, 2002). Il a notamment observé dans ces cellules que la

déplétion transitoire de Ku80 stimule la production virale induite par le traitement au TNFα

(Jeanson and Mouscadet, 2002). De plus, l’expression (précoce) du VIH-1 et des vecteurs

dérivés est augmentée au sein des cellules de rongeurs déplétées en Ku80 (Jeanson and

Mouscadet, 2002; Masson et al., 2007).

Cependant, de façon contradictoire, Waninger et al. ont mis en évidence que la

déplétion en Ku80 (médiée par ARNi) diminue l’activation (précoce) du LTR du VIH-1

médiée par Tat (Waninger et al., 2004). Ce résultat est à rapprocher de l’implication positive

de DNA-PK (fonctionnelle) dans la régulation de l’expression précoce à partir du LTR du

VIH-1 (ou du promoteur CMV, observé à forte m.o.i.) et tardive lors de la réactivation de

provirus latent, compétent pour la réplication (Tyagi et al., 2011).

ii/ Explications possibles

Un certain nombre d’études analysant les effets de Ku sur le cycle du VIH-1 ont été

réalisés à l’aide de virus réplicatifs (Jeanson and Mouscadet, 2002; Jeanson et al., 2002; Tyagi

et al., 2011; Waninger et al., 2004; Zheng et al., 2011). Cependant, l’utilisation d’un virus

réplicatif peut conduire à la superposition des effets dus à l’absence d’une protéine sur les

étapes pré-intégratives, l’expression et les étapes de production virale (e.g., assemblage)

puisque les cellules cibles sont aussi les cellules productrices. Dans ce contexte, leur usage

dans les études précédemment citées a pu aboutir à masquer l’impact réel de Ku sur

l’expression du VIH-1 (Tyagi et al., 2011). Par exemple, une diminution de l’expression

pourrait réduire la quantité de particules virales produites qui se traduirait par un défaut

visible d’intégration après ré-infection des cellules productrices (Jeanson et al., 2002).

102

De plus, le temps d’analyse, i.e., à court- ou moyen/long-terme, après

infection/transduction pourrait expliquer les contradictions issues des études réalisées sur

l’impact de Ku sur l’expression du VIH-1 (et les étapes pré-intégratives du cycle viral). Une

partie des travaux présentés dans cette thèse vise notamment à éclaircir le rôle de Ku dans la

régulation de l’expression lentivirale dans le temps.

Enfin, des différences entre les caractéristiques des protéines impliquées dans la

réparation de l’ADN (e.g., abondance, rôles spécifiques et/ou essentiels) au sein des cellules

humaines et de rongeurs pourraient expliquer des contributions différentielles lors du cycle

viral, notamment lors de l’intégration du VIH-1 au sein de la chromatine hôte.

d/ Comparaison à un autre senseur des lésions de l’ADN : PARP-1

PARP-1 est une enzyme qui fixe les cassures simple- et double-brin de l’ADN [avec

une haute affinité (D'Silva et al., 1999)] et catalyse la modification post-traductionnelle de

nombreuses protéines à l’aide de polymères d’ADP-ribose (Luo and Kraus, 2012). Cette

protéine serait en compétition avec Ku pour la fixation des extrémités double-brin de l’ADN

lors d’une lésion double-brin de l’ADN et favoriserait l’intervention de la voie HR (Mladenov

and Iliakis, 2011). Cependant, cette compétition serait limitée par la régulation de la résection

des extrémités de l’ADN qui est dépendante du cycle cellulaire [cf., § IV.B.2, (Mladenov and

Iliakis, 2011)].

Comme décrit dans le paragraphe IV.B.2, il a été montré (de façon controversé) que

PARP-1 a un rôle dans l’intégration du VIH-1 (Ha et al., 2001; Kameoka et al., 2005), au sein

de cellules humaines (Kameoka et al., 2005) et de rongeurs (Ha et al., 2001; Kameoka et al.,

2005) transduites par un vecteur dérivé du VIH-1 (Ha et al., 2001; Kameoka et al.,

2005). Néanmoins, PARP-1 pourrait participer à la régulation de l’expression du VIH-1

puisqu’elle active le LTR intégré d’un vecteur VIH-1 au sein de cellules humaines (Kameoka

et al., 2004). De plus, PARP-1 a été décrit être un co-facteur dans l’activation des gènes

dépendants de NF-κB (Hassa and Hottiger, 1999), qui pourrait dépendre de sa capacité à

maintenir l’expression des HATs (Ota et al., 2003). Cependant, il a été mis en évidence in

vitro que PARP-1 est en compétition avec le complexe Tat/p-TEFb pour la fixation de TAR

(Parent et al., 2005). D’autres investigations seront nécessaires pour déterminer le(s) rôle(s)

exact(s) de PARP-1 dans le cycle du VIH-1, et en particulier, si sa participation dans la

régulation de l’expression virale évolue au cours du temps.

103

Ainsi, les protéines de la machinerie de la réparation qui interviennent très tôt dans la

détection des lésions de l’ADN, et en particulier Ku, pourraient participer à différentes étapes

du cycle viral, dont la régulation de l’expression virale dans le temps. Ces capacités qui leur

sont conférées ne dépendraient pas uniquement de leur rôle dans la signalisation et la

réparation des dommages de l’ADN, mais feraient intervenir leurs autres fonctions de façon

non-exclusive. Cependant, il est très difficile de mettre clairement en évidence les rôles exacts

des protéines étudiées, du fait notamment de phénomènes de compensation entre voies de

réparation au sein des lignées étudiées. Enfin, dans le cas de notre protéine d’intérêt Ku, se

pose le problème de son abondance et du fait qu’elle est essentielle à la survie des cellules

humaines.

Les impacts du complexe Ku sur le cycle du VIH-1 ont été évalués au cours de ce

travail de thèse.

104

PROBLEMATIQUE

105

Après infection de sa cellule hôte, le VIH-1 peut se répliquer uniquement s’il

s’exprime à un niveau suffisant pour produire les protéines/ARNs nécessaires à la formation

de nouveaux virions. L’expression nécessaire à la multiplication du VIH-1 requiert

l’intégration de son génome au sein de la chromatine hôte. Cependant, après intégration,

l’expression virale peut être sujette au silencing transcriptionnel. Cette forme de latence post-

intégrative contribue à la formation de réservoirs viraux qui constituent un obstacle à

l’éradication du virus chez les patients séropositifs traités par HAART.

D’autre part, le transfert de gène basé sur l’utilisation de vecteurs rétroviraux nécessite

le développement d’outils sûrs et efficaces basés sur un meilleur contrôle du site d’intégration

du transgène et de son expression dans le temps. En effet, l’intégration non-ciblée d’un

transgène peut générer une/des mutagénèse(s) insertionnelle(s), pouvant aboutir au processus

d’oncogénèse. De plus, l’expression du transgène intégré peut être influencée par le contexte

chromatinien environnant et atténuée et/ou perdue rapidement ou au cours du temps après

transduction.

L’expression du VIH-1 ainsi que celle d’un transgène d’origine lentivirale, sont donc

soumises à une régulation stricte de la part de déterminants viraux et cellulaires. Une

meilleure caractérisation de ces déterminants permettrait de contrôler l’établissement et/ou le

maintien d’un silencing post-intégratif en vu de (i) développer des traitement curatifs du VIH-

1 et (ii) maîtriser/moduler l’expression transgénique dans le cadre de transfert de gènes.

Le but de cette thèse a donc été de caractériser les impacts de certains éléments viraux

(e.g., promoteur natif ou hétérologue) et cellulaires (e.g., protéine de la réparation de l’ADN)

qui agissent spécifiquement sur l’expression lentivirale dans un contexte de transduction par

le VIH-1 ou des vecteurs qui en dérivent.

Dans un premier temps, nous avons étudié l’impact de l’insertion de séquences

hétérologues au sein des SIN-LTRs de vecteurs dérivés du VIH-1 sur l’expression lentivirale.

En effet, cette approche est particulièrement prisée lors du transfert de gène utilisant les

vecteurs rétroviraux du fait de la duplication des LTRs lors de la transcription inverse. Ainsi,

l’insertion d’un insulateur au sein des SIN-LTRs permettrait d’isoler le transgène au sein de la

chromatine hôte et d’(au moins) maintenir son expression dans le temps. Cependant, l’impact

réel de l’ajout de séquences au sein des SIN-LTRs sur l’expression transgénique reste mal

caractérisé. De plus, celui-ci pourrait varier en fonction du promoteur interne qui contrôle

l’expression du transgène et de la fonctionnalité de l’intégrase. La première partie des travaux

106

expérimentaux de cette thèse avait donc pour objectif de caractériser l’impact de l’insertion au

sein des SIN-LTRs sur l’expression lentivirale en fonction du design des vecteurs utilisés.

Dans un second temps, nous avons analysé les rôles de la machinerie de réparation de

l’ADN dans le cycle lentiviral. En effet, les facteurs impliqués dans la réparation de l’ADN

peuvent avoir un impact positif ou négatif sur le cycle rétroviral, en fonction de la protéine

et/ou de l’étape du cycle considéré, dont l’issue aboutit à une multiplication virale productive

ou abortive. Cependant, les études menées peuvent être contradictoires en fonction du design

expérimental. En particulier, le complexe Ku, impliqué dans la voie NHEJ de réparation de

l’ADN, aurait des fonctions dans le cycle du VIH-1 qui restent controversées. Il a notamment

été décrit que cet hétérodimère pouvait réguler positivement ou négativement l’expression

lentivirale. La deuxième partie des résultats de la présente étude visait à éclaircir les rôles de

Ku dans le cycle du VIH-1, et plus particulièrement, dans la régulation de son expression au

sein de cellules humaines.

Enfin, nous nous sommes intéressés à l’impact de l’insulation des vecteurs lentiviraux

sur l’expression transgénique dans un contexte défectueux pour la réparation de l’ADN.

Ainsi, les facteurs de la réparation de l’ADN sont décrits comme nécessaires à la réparation

post-intégration mais pourraient participer plus précocement à la prise en charge de l’ADN

viral, puis influencer son site d’intégration, et contrôler son expression dans le temps. Dans ce

contexte, le laboratoire a décrit que Ku participait à la localisation (pré- et/ou post-intégrative)

en périphérie nucléaire de vecteurs dérivés du VIH-1. La troisième partie de cette étude a

permis d’analyser l’influence de l’haplodéplétion en Ku sur l’expression lentivirale a priori

isolée du contexte chromatinien hôte.

107

RESULTATS

108

I/ IMPACTS DU DESIGN DE VECTEURS DERIVES DU VIH-1 SUR

L’EXPRESSION LENTIVIRALE

A/ CONTEXTE DE L’ETUDE

Le transfert de gènes pour la recherche ou la thérapie génique nécessite le

développement d’outils sûrs et efficaces. Environ 23% des essais cliniques actuellement

menés en thérapie génique utilisent des vecteurs de transfert dérivés de rétrovirus

(http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical/). Ceux-ci sont particulièrement adaptés au transfert

de gènes, notamment pour leur capacité à s’intégrer de façon quasi-aléatoire au sein de la

chromatine hôte. Cette caractéristique assure potentiellement une expression transgénique à

long-terme au sein des cellules transduites (Pauwels et al., 2009).

Cependant, il existe des problèmes de toxicités, pouvant être médiés par le vecteur

et/ou le transgène, qui proviennent des interactions entre les séquences du vecteur et

l’environnement génomique entourant les sites d’intégration [cf., revues (Emery, 2011;

Pauwels et al., 2009)].

Ainsi, l’intégration non-ciblée peut mener à l’inactivation d’un gène cellulaire ou des

modifications d’expression des gènes hôtes situés à proximité du provirus. Ces évènements

peuvent conférer un avantage sélectif aux cellules transduites, ce qui augmente le risque de

dominance clonale, ou même d’oncogénèse (Pauwels et al., 2009). Dans ce contexte, le

développement de vecteurs SIN, qui ne possèdent plus les séquences enhancer-promoteur de

la région U3 des LTRs, a considérablement contribué à réduire la génotoxicité des vecteurs

rétroviraux, en particulier s’ils contiennent un promoteur interne modérément actif (Maruggi

et al., 2009; Montini et al., 2009; Montini et al., 2006; Zhou et al., 2010; Zychlinski et al.,

2008). Depuis peu, le développement de IDLVs émerge également comme une approche

alternative (Banasik and McCray, 2010).

Toutefois, l’efficacité du transfert de gènes médiée par les vecteurs rétroviraux peut

être influencée par la chromatine à proximité du provirus et être variable, en particulier à

cause du silencing que peut subir le transgène. Celui-ci peut avoir lieu rapidement après

transduction ou s’établir progressivement au cours du temps (i.e., extinction) et/ou conduire à

de la variégation entre cellules sœurs qui exprimeraient différemment un même provirus

(Ellis, 2005). Diverses stratégies sont actuellement menées pour optimiser l’expression

transgénique [i.e., utilisation de UCOEs (ubiquitously acting chromatin opening elements)

optimisés (Knight et al., 2012)]. L’une d’entre elles repose sur la configuration des vecteurs

109

SIN qui permet l’insertion de séquences au sein du 3’ LTR (qui sont dupliquées dans le 5’

LTR au cours de la transcription inverse). Ces éléments incorporés dans les SIN-LTR incluent

les USEs (upstream polyadenylation enhancers) qui augmentent l’efficacité de terminaison de

la transcription, et les insulateurs (Schambach et al., 2009). L’utilisation de séquences

insulatrices, douées d’activités barrière et/ou enhancer-bloqueur, pourrait limiter le silencing

du transgène et/ou prévenir l’activation des gènes endogènes par l’enhancer hétérologue,

respectivement [cf., revues (Emery, 2011; Schambach et al., 2009 )]. L’importance de cette

dernière a récemment été illustrée par l’introduction de courts insulateurs synthétiques au sein

des SIN-LTRs d’un vecteur gammarétroviral (Gaussin et al., 2012).

L’insulateur cHS4 (de 1,2 kb) possède les activités enhancer-bloqueur et barrière, dont

la première nécessite la fixation du facteur CTCF (Aker et al., 2007; Arumugam et al., 2009;

Chung et al., 1993). La présence de cHS4 au sein de vecteurs rétroviraux a été décrite comme

réduisant le risque d’oncogénèse insertionelle (Evans-Galea et al., 2007; Ryu et al., 2007),

bien qu’un cas de dominance clonale ait été récemment reporté pendant un essai clinique

utilisant un vecteur SIN contenant cHS4 (Cavazzana-Calvo et al., 2010). De manière

frappante, l’activité barrière de cHS4 au sein de vecteurs rétroviraux varie grandement en

fonction du design des vecteurs étudiés (Emery et al., 2000; Nielsen et al., 2009; Uchida et al.,

2011; Yannaki et al., 2002). L’insertion de cHS4 dans le 3’ LTR a notamment été décrite

réduire le titre viral fonctionel (Arumugam et al., 2009; Hanawa et al., 2009; Nielsen et al.,

2009; Uchida et al., 2011), du à une moindre transcription inverse (Arumugam et al., 2009;

Hanawa et al., 2009) et/ou à une intégration de séquences virales incomplètes (Arumugam et

al., 2009; Nielsen et al., 2009 ). L’insertion de séquences autres que cHS4 au sein des SIN-

LTRs a aussi été explorée, telle celle de MAR, sans succès pour le moment (Grandchamp et

al., 2011).

L’impact réel de l’insertion de séquences hétérologues au sein des SIN-LTRs reste

donc à élucider. Cette tâche peut se révéler complexe de part les propriétés intrinsèques des

séquences clonées. Etant donné les nouvelles caractéristiques que pouvaient conférer

l’insertion de fragments exogènes au sein des SIN-LTRs des vecteurs rétroviraux, nous avons

analysé les titres viraux, l’intégration, l’efficacité de transduction ainsi que l’expression du

transgène d’un set de vecteurs lentiviraux intégrase-compétent ou -déficient. Ceux-ci

contiennent, au sein des SIN-LTRs, des inserts d’origine aviaire (cHS4), humaine (i.e.,

insulateur putatif et séquence « déserte ») ou bactérienne (spacer).

110

Nous avons observé que ces insertions induisent le plus souvent une diminution de la

transcription du transgène. Dans un contexte lentiviral et gammarétroviral, ce phénomène

d’attenuation est dépendant de l’orientation, stable à long terme (au moins 3 mois) et

n’augmente pas l’extinction ou la variégation. Les vecteurs générés au cours de cette étude

permettent la modulation de la transcription du transgène d’un facteur 0,3 à 1,8 (comparé au

vecteur parental) de façon stable ou transitoire (en fonction du statut de l’intégrase). Ils

pourraient ainsi constituer des outils génétiques intéressants pour réguler finement

l’expression du transgène.

B/ ARTICLE : ‘3’SELF-INACTIVATING LONG TERMINAL REPEAT INSERTS FOR

THE MODULATION OF TRANSGENE EXPRESSION FROM LENTIVIRAL VECTORS’

(PUBLIE DANS LE JOURNAL HUMAN GENE THERAPY METHODS, 2012 APR;23(2):84-97)

3¢ Self-Inactivating Long Terminal Repeat Insertsfor the Modulation of Transgene Expression

from Lentiviral Vectors

Gwenola Manic,1 Aurelie Maurin-Marlin,1 Lorenzo Galluzzi,2,3 Frederic Subra,1

Jean-Francois Mouscadet,1,4 and Stephanie Bury-Mone1

Abstract

Gene transfer for research or gene therapy requires the design of vectors that allow for adequate and safetransgene expression. Current methods to modulate the safety and expression profile of retroviral vectors caninvolve the insertion of insulators or scaffold/matrix-attachment regions in self-inactivating long terminal re-peats (SIN-LTRs). Here, we generated a set of lentiviral vectors (with internal CMV or PGK promoter) in whichwe inserted (at the level of SIN-LTRs) sequences of avian (i.e., chicken hypersensitive site-4, cHS4), human (i.e.,putative insulator and desert sequence), or bacterial origin. We characterized them with respect to viral titer,integration, transduction efficiency and transgene expression levels, in both integrase-proficient and -deficientcontexts. We found that the cHS4 insulator enhanced transgene expression by a factor of 1.5 only when cloned inthe antisense orientation. On the other hand, cHS4 in the sense orientation as well as all other inserts decreasedtransgene expression. This attenuation phenomenon persisted over long periods of time and did not correspondto extinction or variegation. Decreased transgene expression was associated with lower mRNA levels, yet RNAstability was not affected. Insertions within the SIN-LTRs may negatively affect transgene transcription in adirect fashion through topological rearrangements. The lentiviral vectors that we generated constitute valuablegenetic tools for manipulating the level of transgene expression. Moreover, this study demonstrates that SIN-LTR inserts can decrease transgene expression, a phenomenon that might be overcome by modifying insertorientation, thereby highlighting the importance of careful vector design for gene therapy.

Introduction

Gene transfer for research or gene therapy requires thedevelopment of safe and efficient delivery tools. Ap-

proximately 20% of current clinical trials involving gene ther-apy rely on retroviral transgenesis (http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical/). Lentiviral (LV) or gammaretroviral (GRV)vectors, which are derived from human immunodeficiencyvirus type 1 (HIV-1) or Moloney leukemia virus (MLV), re-spectively, represent suitable tools for gene transfer for severalreasons. First, their genome is simple; second, these vectors havebeen extensively characterized; third, they can integrate in thehost cell genome, potentially ensuring long-term transgene ex-pression (Pauwels et al., 2009). Of note, LV and GRV vectors arecharacterized by different infection and integration patterns(Mitchell et al., 2004; Yamashita and Emerman, 2006).

However, there are toxicity issues (related to the vectorand/or the transgene) that must be carefully considered forgene therapy approaches (reviewed in Chang and Sadelain,2007; Pauwels et al., 2009). Unspecific integration can lead tothe inactivation of a cellular gene or to changes in the ex-pression of host genes that reside in the vicinity of the pro-virus (e.g., after trans-activation, promoter interference, orread-through into neighboring genes). These events canconfer a selective advantage to transduced cells, increasingthe risk of clonal dominance or even oncogenesis (Pauwelset al., 2009). Thus, the design of safe and efficient vectors fortransgene expression remains a great challenge, and in-tegrase-deficient lentivectors (IDLVs) are emerging as analternative approach (Banasik and McCray, 2010).

In this context, the use of self-inactivating (SIN) vectors,which lack enhancer/promoter sequences in the U3 region of

1Laboratoire de Biologie et de Pharmacologie Appliquee, UMR 8113 CNRS, Ecole Normale Superieure de Cachan, FR-94230 Cachan, France.2INSERM, U848, FR-94800 Villejuif, France.3Universite Paris Descartes, Sarbonne Paris Cite, FR-75006, Paris, France.4Present address: Bio-Rad Laboratories, 92430 Marnes-la-Coquette, France.

HUMAN GENE THERAPY Part B: Methods 23:1– (April 2012)ª Mary Ann Liebert, Inc.DOI: 10.1089/hgtb.2011.154

1

the long terminal repeats (LTRs), reportedly reduces geno-toxicity, in particular if they contain an internal promoterthat is moderately active (Montini et al., 2006, 2009; Zy-chlinski et al., 2008; Maruggi et al., 2009; Zhou et al., 2010).The configuration of SIN vectors allows for the insertion ofsequences within the 3¢ LTR; these sequences are duplicatedin the 5¢ LTR during retrotranscription (Pauwels et al., 2009).The elements most commonly incorporated into SIN-LTRsinclude (1) transgenes (e.g., short hairpin RNAs); (2) up-stream polyadenylation enhancer elements (or upstream se-quence elements, USEs), which limit read-through intoneighboring (onco)genes; and (3) insulators, which eitherblock the interaction between the enhancer and promoter(so-called ‘‘enhancer-blockers’’) or stop the propagation ofheterochromatin (so-called ‘‘barrier insulators’’) (reviewed inPauwels et al., 2009; Schambach et al., 2009), as illustrated bythe introduction of short synthetic insulators within SIN-LTRs of a GRV vector (Gaussin et al., 2012).

The canonical chicken hypersensitive site-4 (cHS4) insu-lator (a 1.2-kb fragment) possesses both enhancer-blockingand barrier activities, of which the former (and perhaps alsothe latter) requires the binding of the CCCTC-binding factor(CTCF) (Chung et al., 1993; Aker et al., 2007; Arumugamet al., 2009). The presence of cHS4 within retroviral vectorsappears to reduce the risk of insertional oncogenesis (Evans-Galea et al., 2007; Ryu et al., 2007), although one case of clonaldominance has been reported during a clinical trial based ona cHS4-containing SIN vector (Cavazzana-Calvo et al., 2010).Strikingly, the cHS4 barrier activity in retroviral vectorsgreatly varies with vector design (Emery et al., 2000; Yannakiet al., 2002; Nielsen et al., 2009; Uchida et al., 2011) and inser-tion of cHS4 into the 3¢ LTR reportedly reduces the functionaltiter (Hanawa et al., 2009; Nielsen et al., 2009; Urbinati et al.,2009; Uchida et al., 2011), due to impaired reverse transcrip-tion (Hanawa et al., 2009; Urbinati et al., 2009) and/or inte-gration of incomplete viral sequences (Nielsen et al., 2009;Urbinati et al., 2009). The insertion of sequences other thancHS4 has also been explored. Bos and colleagues demon-strated that large double-copy vectors that contain differentpromoter–transgene cassettes within their SIN-LTRs arefunctional, yet exhibit a size-dependent decline in transduc-tion efficiency (Bos et al., 2010). The inclusion of CTCF-andCTF/NF1-binding sites was also shown to have a little effecton titers obtained from a GRV vector (Gaussin et al., 2012).

Nevertheless, the real impact of cloning exogenous se-quences within SIN-LTRs remains to be elucidated, a taskthat is complicated by the intrinsic properties of clonedsequences. Because the insertion of exogenous fragmentswithin the LTR may confer novel properties to retroviralvectors, we analyzed viral titer, integration, transductionefficiency, and transgene expression of a set of integrase-proficient or -deficient LV vectors containing, within the SIN-LTRs, inserts of avian (cHS4), human (i.e., putative insulatorand desert sequence), or bacterial (‘‘spacer’’) origin. Theseinsertions most often led to decreased transgene transcrip-tion. In the LV and GRV context, this attenuation phenom-enon was orientation dependent, was stable over longperiods of time, and did not increase extinction or variega-tion. The vectors that we generated allow for the modulationof transgene transcription from 0.3- to 1.5-fold (comparedwith the parental vector), and may constitute valuable ge-netic tools for the refined control of transgene expression.

Materials and Methods

Vector constructs

The genetic organization of LV and GRV vectors (seeSupplementary Table S1; supplementary data are availableonline at www.liebertonline.com/hgtb) is represented in Fig.1. All LV constructs were derived from RRLSIN.cPPT.hPGK-gfp (shortened to ‘‘LV-PPGK’’), an SIN LV vector carrying theenhanced gfp gene under the control of the human internalphosphoglycerate kinase (PGK) promoter (PPGK). RRLSIN.cPPT.hPGK-gfp was modified from a previously described vector(Zufferey et al., 1998) (a gift from the University of TurinMedical School, Turin, Italy) by deletion of the woodchuckhepatitis posttranscriptional regulatory element (WPRE).All GRV constructs were derived from MLV and the mu-rine sarcoma virus (MuSV)-based LNCX vector (Clontech/Takara Bio, Mountain View, CA), into which a multiplecloning site (including an XhoI restriction site) was intro-duced between the HindIII and ClaI sites (‘‘LNCX*’’). Thevector lacking both the transgene and the internal promoter(‘‘GRV-LTR-empty1’’) was generated by deletion of the BclI–BglII fragment of LNCX*, containing the neomycin resistancegene and the cytomegalovirus (CMV) promoter. A modulecontaining the GFP transgene under the control of the PGKpromoter (EcoRV–SalI fragment from LV-PPGK) was intro-duced between the compatible BsaBI and SalI sites of GRV-LTR-empty1. GRV-PPGK, a self-inactivating version of theresulting GRV-LTR-PPGK vector, was generated by deleting177 bp from the U3 3¢ LTR as follows: the product of a PCRamplification of LNCX* performed with OBM95 and OBM96primers (Supplementary Table S2) was digested with XhoIand XbaI and used to replace the XhoI–XbaI region of GRV-LTR-PPGK. For the insertions of fragments in LV vectors, asingle XbaI site was introduced into the 3¢ SIN-LTR of LV-PPGK by directed PCR mutagenesis, done with a QuikChangeXL site-directed mutagenesis kit (Agilent Technologies, SantaClara, CA) and OBM164 and OBM165 primers (Supple-mentary Table S2). The cHS4 1.2-kb insulator was obtainedby digestion of the pJC13-1 plasmid kindly provided byG. Felsenfeld (National Institutes of Health, Bethesda, MD)(Chung et al., 1993). The 1.2-kb cHS4 insulator XbaI fragmentwas inserted into the XbaI site within the 3¢ SIN-LTR ofLV-PPGK. The 1.07-kb Ins023¢ fragment (chr2: 220214795-220215860, Hg18 coordinates) was obtained by amplifyinghuman genomic DNA (from CEM-T4 cells) with the OBM176and OBM178 primers (Supplementary Table S2). The re-sulting amplicon was digested with XbaI and introduced intothe XbaI site within the 3¢ SIN-LTR of LV-PPGK. The 1.59-kbDS18 fragment (chr2: 220332055-220333640, Hg18 coordina-tes) was obtained by amplifying human genomic DNA (fromHeLa cells) with the OBM29 and OBM30 primers (Supple-mentary Table S2) followed by digestion with BamHI and theintroduction of the resulting fragment into the 3¢ SIN-LTR atthe BbsI site of LV-PPGK or at the XbaI site of GRV-PPGK (withblunting before ligation). The 1.54-kb fragment of the Es-cherichia coli lacZ gene was obtained by amplification ofpHR¢-CMV-LacZ (Naldini et al., 1996) with the OBM179 andOBM180 primers (Supplementary Table S2), followed bydigestion with BamHI or XbaI and introduction of the re-sulting fragment into the BamHI site within the 3¢ SIN-LTR ofLV-PPGK. All insertions (selected for the sense or antisenseorientation) were checked by plasmid sequencing. Deleted

2 MANIC ET AL.

forms of DS18 were generated by double-digestion of thevectors with appropriate enzymes (BbsI–AfeI, BbsI–XbaI, orSgrAI–AfeI; as indicated in Fig. 6), followed by blunting andligation. On the other hand, deletion of the mammalian-wideinterspersed repeat (MIR) element was achieved by directedmutagenic PCR (as described previously) of DS18-containingvectors, performed with the OBM174 and OBM175 primers(Supplementary Table S2). Replacement of the CMV pro-moter with the PGK promoter in LV vectors was done bysubstituting the ClaI–BamHI region (PGK promoter) with theClaI–BamHI fragment (CMV promoter) of the pHR¢-CMV-eGFP vector (Miyoshi et al., 1997). All constructs weremaintained and stored in the Stratagene SURE 2 E. coli hoststrain (Agilent Technologies).

LV and GRV vectors were produced with the psPAX2or pCMVR8.74 packaging plasmid (kindly given by theD. Trono laboratory, Lausanne, Switzerland; Addgene plas-mids 12260 and 22036, respectively) encoding HIV-1 Gag-Pol, Tat, and Rev proteins; and the Stratagene pVPack-GPpackaging plasmid (Agilent Technologies) encoding MLVGag-Pol proteins, respectively. IDLVs were produced withthe D116A pCMV-R8.74 packaging plasmid encoding a mu-tated (D116A) integrase (Drelich et al., 1992). This mutationwas introduced into the pCMV-R8.74 packaging plasmid bydirected PCR mutagenesis (as described above) and OBM156and OBM157 primers (Supplementary Table S2). All vectors

were pseudotyped with the vesicular stomatitis virus enve-lope glycoprotein (VSV-G) encoded by pMD.G (Ory et al., 1996).

Cell culture and treatment

Human cervix adenocarcinoma epithelial HeLa cells andhuman embryonic kidney (HEK) 293T cells were obtainedfrom the American Type Culture Collection (ATCC, Mana-ssas, VA; CCL-2 and CRL-11268, respectively) and main-tained in Dulbecco’s modified Eagle’s medium. Human Tlymphoblastoid CEM-T4 cells (a naturally isolated subcloneof the CEM line that displays high levels of surface CD4expression; obtained through the AIDS Research and Re-ference Reagent Program, Division of AIDS, National In-stitute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutesof Health: CEM-T4 from J.P. Jacobs) (Foley et al., 1965) werecultured in RPMI 1640. All media were supplemented with10% fetal bovine serum (FBS; PAA Laboratories, Pasching,Austria) and 1% penicillin–streptomycin (P/S; 100 units/ml).Wild-type human colorectal carcinoma epithelial HCT 116cells (kindly provided by E.E. Hendrickson) and Chinesehamster ovary (CHO) cells (CRL-9618; ATCC) were main-tained in McCoy’s 5A and minimal essential medium (MEM),respectively. Media were supplemented with 10% FBS, 1% P/S, and 10% essential amino acids for MEM. All cell lines usedin this study were incubated at 37�C, under an atmosphere

FIG. 1. Retroviral vector design and impact on functional titers. (A) Schematic representation of the lentiviral (LV) vectors(in the proviral, integrated form) used in this study. These vectors encode the green fluorescent protein transgene (gfp) underthe control of either the immediate-early human cytomegalovirus promoter (PCMV) or human phosphoglycerate kinasepromoter (PPGK) and contain a self-inactivating long terminal repeat (SIN-LTR). Within the SIN-LTRs, inserts were cloned ineither the sense (s) or antisense (as) orientation (except for the LacZ¢ sequence, which was introduced only in the senseorientation). cPPT, central polypurine tract; C, encapsidation signal. (B) Human cervical carcinoma HeLa cells were trans-duced with serial dilutions of GFP-encoding vectors based on the indicated promoter and containing within their SIN-LTRsthe indicated inserts (insert size is reported in kilobases) in the sense (s) or antisense (as) orientation and, 48 hr later, functionaltiters were assessed. Bars report functional titers as determined in at least 11 independent titrations of at least 4 productionsmade with 2 different shuttle plasmid preparations (means – SEM, *p < 0.05 and **p < 0.01 compared with parental vectorsbased on the same internal promoter). Statistically significant differences were not observed between PPGK- and PCMV-basedvectors that contained the same inserts ( p > 0.05). TU, transduction units.

3¢ SIN-LTR INSERT EFFECTS ON TRANSGENE EXPRESSION 3

containing 5% CO2. Unless otherwise indicated, media andsupplements for cell culture were purchased from Gibco/LifeTechnologies (Carlsbad, CA) and BD Falcon plasticware wasobtained from BD Discovery Labware (Bedford, MA).

For the analysis of RNA stability, cells were treated withactinomycin D (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) at a concen-tration of 5 lM (Leclerc et al., 2002) in 25-cm2 flasks. Six hoursafter treatment, 105 cells were harvested, centrifuged for5 min at 270 · g, washed once with phosphate-buffered saline(PBS), and stored at - 80�C for total RNA extraction.

Vector production

Retroviral vectors were produced by calcium phosphate-mediated transfection of 293T cells as previously described(Chen and Okayama, 1987; Masson et al. 2007) with the fol-lowing modifications. Briefly, 106 cells were plated in 75-cm2

flasks and maintained in culture for 3 days. Two hours be-fore the transfection, medium was replaced with fresh me-dium. Meanwhile, a mixture of plasmids composed of 6 lg ofshuttle vector plasmid, 4 lg of packaging plasmid (pVPack-GP) (psPAX2, pCMV-R8.74 or its derivate encoding a mu-tated integrase), and 2 lg of pMD.G per flask was prepared.A precipitate was formed by mixing the plasmids with 1 mlof 0.25 M CaCl2 and adding the resulting solution mix to1 ml of HEPES-buffered saline (280 mM NaCl, 10 mM KCl,1.5 mM Na2HPO4, 50 mM HEPES; pH 7.05) while vortexing.The mixture was incubated for 20 min at room temperatureand then added to the cells. The next day, the medium wasreplaced with fresh medium. Supernatants were then har-vested 48 and 72 hr after transfection, centrifuged for 5 minat 270 · g, following by centrifugation at 1730 · g for 20 minand then ultracentrifugation for 2 hr at 20,000 rpm, at atemperature of 4�C, in an Optima L-80 XP ultracentrifuge(Beckman Coulter, Brea, CA) with an SW 28 Ti rotor. Vec-tors were finally resuspended in PBS at a concentrationratio of 200 for lentiviral vectors and of 150 for gammare-troviral vectors, and aliquots were stored at - 80�C. Nodifference between viral titers was observed when thepsPAX2 or pCMV-R8.74 packaging plasmid was employedfor vector production.

Transduction procedure and analysis

The day before transduction, 105 cells per well wereseeded in duplicate for each set of conditions, in 12-wellplates. Where indicated, 25 lM 3¢-azido-3¢-deoxythymidine(AZT; Sigma-Aldrich) or 400 nM raltegravir (median inhibi-tory concentration [IC50], 20 nM; Prestwick Chemical,Washington, DC) was added 2 hr before transduction. Two,3, 6, and 10 days after transduction, the percentage andgeometric mean fluorescence intensity (MFI) of green fluo-rescent protein-positive (GFP + ) cells were assessed by flowcytometry on a FACSCalibur cytofluorometer (BD Bios-ciences, San Jose, CA). The multiplicity of infection (MOI)was calculated from the percentage of GFP + cells during thelinear phase of infection of HeLa cells. For experiments inwhich we explored the expression of transgene in a GFP +

population of transduced cells, GFP + cells were sorted byfluorescence-activated cell sorting (FACS) 1 week aftertransduction at low MOI by cytofluorometry and culturedfor 3 months. Sorted cells were subjected to expressionanalysis every week, as described previously.

Quantification of viral DNA species

Twenty-four and 72 hr after transduction, cells were re-collected, centrifuged for 5 min at 270 · g, and washed oncewith PBS. Genomic DNA (gDNA) was isolated with aQIAamp blood DNA minikit (Qiagen, Hilden, Germany) andquantified with a NanoVue spectrophotometer (GE Health-care, Chalfont St. Giles, UK). Primers and probes (Supple-mentary Table S2) for total lentiviral DNA amplification(MH531/MH532 primers and MH-FL/MH-FC probes forHR¢ and SIN vectors) and integrated viral DNA nested PCR(L-M667, Alu1 and Alu2 primers for the first PCR; Lambda-T/AA55M primers and LTR-FL/LTR-FC probes for thesecond PCR) have been described elsewhere (Brussel andSonigo, 2003). Quantitative PCR (qPCR) with these primersand probes was carried out with 2 ll (between 40 and 500 ng)of gDNA in a final volume of 20 ll of LightCycler FastStartDNA Master HybProbe mix, according to the manufacturer’srecommendations (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland).Amplification was carried out on a LightCycler (Roche Di-agnostics) as previously described (Brussel and Sonigo,2003). Each sample was examined in duplicate with each setof primers. The cell equivalents in sample DNA were cal-culated on the basis of the amplification of the b-globin gene(two copies per diploid cell) with the LightCycler instrumentand commercially available materials (control kit DNA;Roche Diagnostics). Copy numbers of both total and inte-grated viral DNA were determined with reference to twoDNA standard curves obtained by amplification of 101 to 104

HeLa cells containing one pR7-Neo Denv provirus per cell(Brussel and Sonigo, 2003) and 102 to 106 copies of linearizedLV-PPGK plasmid, as recommended by Hou and colleagues(2010). Viral DNA titers were determined on the basis of totalviral DNA quantified 24 hr posttransduction, a time point atwhich viral DNA is maximal (Brussel and Sonigo, 2003).

Quantitative RT-PCR

Total RNA was extracted from 105 cells with an RNeasymini kit (Qiagen) and resuspended in 50 ll of diethylpyr-ocarbonate (DEPC)-treated water. Genomic DNA contami-nation was removed by treating 25 ll of all mRNA sampleswith 20 U of RNase-free DNase (Roche Diagnostics) for 1 hrat 37�C, according to the manufacturer’s instructions. RNAwas repurified on RNeasy mini kit columns (Qiagen). Thequantity and quality of the isolated RNA were determinedwith a NanoVue spectrophotometer (GE Healthcare). DNA-free RNA (100–150 ng) was reverse-transcribed in a 20-llfinal reaction volume with PrimeScript reverse transcriptase(Takara Bio, Shiga, Japan) for 1 hr at 42�C, with 2 pmol ofOBM13 and OBM242 primers (Supplementary Table S2). Toconfirm the specificity of RT-qPCR, samples without tem-plate or without reverse transcriptase were used as negativecontrols. The OBM12–OBM13 and OBM241–OBM242 primerpairs (Supplementary Table S2) were used to amplify the gfpand GAPDH genes, respectively, from 2 ll (between 10 and20 ng) of complementary DNA in a final volume of 20 ll ofLightCycler DNA Master SYBR Green I mix, according to themanufacturer’s recommendations (Roche Diagnostics). Eachsample was analyzed in duplicate for each set of primers.Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) wasused as an invariant internal control (Zheng et al., 2008).Fold-change values were calculated by comparative Ct

4 MANIC ET AL.

analysis after normalizing for the quantity of GAPDH mRNAin the samples concerned (Pfaffl, 2001).

Statistical procedures

Unless otherwise specified, experiments were performedin triplicate parallel instances and independently repeated atleast twice. Data were analyzed with Microsoft Excel (Mi-crosoft, Redmond, WA) and statistical significance was as-sessed by means of two-tailed Student t tests. Unlessotherwise indicated, asterisks depict statistical significance(*p < 0.05, **p < 0.01).

Results

Retroviral vector design

We took advantage of a gfp-encoding HIV-1-based vector(Zufferey et al., 1998) and modified it at the promoter level aswell as by inserting different elements, in sense or antisenseorientation, within its SIN-LTRs (Fig. 1A, and SupplementaryTable S1). To overcome possible promoter-specific effects andto determine the impact of insertions on transcription fromboth moderate and strong promoters, we used the humanPGK and immediate-early human CMV promoters (PPGK

and PCMV, respectively). The elements inserted within the SIN-LTRs were as follows: (1) the 1.2-kb avian cHS4 insulator, (2)a 1.1-kb modified version of the human Ins023 sequence(DHS3) (Xi et al., 2007) (which we called Ins023¢), (3) a 1.6-kbhuman sequence from a regulatory factor-binding desert(which we named DS18), and (4) a 1.5-kb spacer sequencefrom the Escherichia coli lacZ gene (which we called LacZ¢).

Using the University of California at Santa Cruz (UCSC)Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/), we selectedIns023 because, similar to cHS4, it binds CTCF (Kim et al.,2007). In cell culture-based insulator assays, Ins023 displaysenhancer-blocking activity three times stronger than that ofcHS4 (Xi et al., 2007). Moreover, Ins023 is located on chro-mosome 2 at the frontier between an island and a regulatoryfactor-binding desert (Zhang et al., 2007), suggesting that thisIns023 may also have barrier properties. To avoid any pos-sible interference from the endogenous retroviral element(ERV) contained in Ins023, we removed it by PCR amplifi-cation, thereby generating Ins023¢. DS18 corresponds to asequence on chromosome 2 located in the regulatory factor-binding desert downstream of Ins023 (Zhang et al., 2007),

which presents heterochromatin marks (e.g., H3K27me3). Incontrast to Ins023¢ and cHS4, DS18 does not bind CTCF andcontains a CAT repetition as well as a mammalian-wide in-terspersed repeat (MIR) of the subfamily 2, also known asMIRb (Smit and Riggs, 1995). The 1.54-kb fragment from E.coli lacZ (LacZ¢) was cloned into the SIN-LTRs not in frame,to serve as an exonic spacer control.

By this approach, we wanted to elucidate the propertiesconferred to the vector by SIN-LTR inserts that bind CTCFand display enhancer-blocking and/or barrier activity (i.e.,cHS4, Ins023¢), while discriminating these from effects pro-vided by nonspecific sequences (i.e., DS18, LacZ¢).

Impact of vector design on lentiviral titers

Functional viral titers (which reflect the percentage of cellsexpressing GFP for given quantity of virus) were estimatedby transducing human cervical carcinoma HeLa cells withserial dilutions of vector stocks followed by cytofluorometricquantification of GFP-expressing cells (48 hr posttransduc-tion). The linear phase of transduction (approximately 3–30%GFP + cells) was used to calculate the functional titer. Toprecisely discriminate between GFP transduction and pseu-dotransduction (i.e., the presence of proteins carried on byviral particles) (Haas et al., 2000), we performed a parallelanalysis of the percentage of GFP + cells in the presence orabsence of AZT, an inhibitor of reverse transcription (Ru-precht et al., 1986). This led us to exclude the LV-PPGK-DS18as vector from further analysis, as it was associatedwith consistent pseudotransduction (Supplementary Fig. S1).The production of infectious viral particles from parentalvectors was not significantly affected by the internal pro-moter (Fig. 1B). With the exception of cHS4 in the LV-PPGK

backbone, SIN-LTR modifications tended to decrease func-tional viral titers in a pattern that did not correlate withCTCF-binding properties or sequence origin (Fig. 1B). De-crease in viral titer due to insert size has been reported inprevious studies (Ramezani et al., 2003; Hanawa et al., 2009;Nielsen et al., 2009; Urbinati et al., 2009; Bos et al., 2010;Uchida et al., 2011). This effect was minimal in our study,perhaps because of vector size (rather small, i.e., from 3.4 to5 kb, in our study) or because of the nature of SIN-LTR in-serts (which in our study always lacked promoter activi-ty). We observed a sequence- and orientation-dependent,rather than size-dependent, effect on functional titers, with

FIG. 2. Insertions within SIN-LTRs donot affect integration efficiency. Humancervical carcinoma HeLa cells weretransduced with GFP-encoding, PPGK- orPCMV-based vectors that contained withinSIN-LTRs the indicated inserts in eitherthe sense (s) or antisense (as) orientation.Seventy-two hours later, the levels of bothtotal and integrated viral DNA werequantified by qPCR. Columns report thepercentage of integrated (out of total) vi-ral DNA (means – SEM; results are fromthree independent experiments).

3¢ SIN-LTR INSERT EFFECTS ON TRANSGENE EXPRESSION 5

the LacZ¢ insertion being more deleterious than the DS18sinsertion (Fig. 1B). Of note, the viral DNA titer was de-creased only slightly by the presence of inserts within theSIN-LTRs of PCMV-based vectors, except in the case of theLacZ¢ insertion (Supplementary Fig. S2). This may be be-cause large inserts (e.g., LacZ¢) within the 3¢ LTR might affectreverse transcription, as previously reported (Urbinati et al.,2009). Altogether, these data demonstrate that the produc-tion of infectious viral particles is a complex phenomenonthat is affected by multiple parameters, not only by vectorlength.

Therefore, we tested our set of vectors for integration ef-ficiency. The insertion of cHS4 into the 3¢ LTR has beensuggested to facilitate genetic instability, leading to the lossof the transgene expression cassette on recombination be-tween LTRs (Nielsen et al., 2009). Because this phenome-non may introduce biases into the PCR-based determinationof viral integration efficiency, we specifically quantifiedintegrated viral DNA with probes and primers recognizinghuman Alu repeats and viral LTR sequences, as previ-ously described (Brussel and Sonigo, 2003). DNA levelswere determined 24 and 72 hr after transduction at an MOIof 0.1 (average percentage of GFP + cells, 10% at 48 hr, de-tected by cytofluorometry). Total viral DNA was greatlyreduced (10- to 25-fold) 72 hr posttransduction (as comparedwith 24 hr after transduction), corresponding to 0.04 – 0.01copy per cell of (mainly integrated) vector DNA (Fig. 2, andSupplementary Fig. S3). Minimal variations were ob-served with the various inserts (Supplementary Fig. S3). Ofnote, the efficiency of integration was not affected by theinsert size and composition (Fig. 2). These data indicate thata defect at the integration step does not explain the func-tional titer reduction observed in Fig. 1. We therefore in-vestigated whether such a reduction might be linked totransgene expression in transduced cells.

Impact of insertions within SIN-LTRs on transgeneexpression early after transduction

By analyzing gfp transduction and the expression levels ofGFP by cytofluorometry, we studied how the internal pro-moter and the genetic elements cloned within SIN-LTRs in-fluence transgene expression. We decided to study theseaspects on the basis of an MOI less than 0.5 (i.e., to 3 to 50%GFP + cells) so as to work in conditions in which cells weretransduced in the linear phase of functional titration. Weanalyzed GFP positivity as well as the geometric meanfluorescence intensity (MFI) of the GFP signal for up to 10days posttransduction, according to standardized, currentlyaccepted procedures (Buceta et al., 2011). To elucidate theinfluence of integrated versus unintegrated DNA forms ontransgene expression, the same experiments were performedwith integrase-proficient vectors in the presence or absenceof the integrase inhibitor raltegravir (Hazuda et al., 2000), orwith IDLVs (encoding a functionally inactive integrase var-iant). Efficient integrase inhibition was assessed by the ab-sence of highly fluorescent cells 48 hr posttransduction forLV-PPGK vectors (Supplementary Fig. S4) and by the rapidloss of GFP expression on mid-term culture (SupplementaryFig. S5).

Forty-eight hours posttransduction, at comparable per-centages of GFP + cells, we found that the cHS4 insulator

cloned in the antisense orientation leads to a 1.5-fold increasein early transgene expression from the strong PCMV internalpromoter (Fig. 3A). Consistent with previous observations(Emery et al., 2000; Yannaki et al., 2002; Hanawa et al., 2009;Uchida et al., 2011), this does not hold true when the samesequence is cloned in reverse (sense) orientation, or in thepresence of the moderately active PPGK promoter. These re-sults corroborate the notion that PCMV is more susceptible toshort-term silencing than PPGK (Gerolami et al., 2000) andsuggest that transcription from PCMV is facilitated by the

FIG. 3. Insertions within SIN-LTRs modulate early trans-gene expression from integrase-proficient or -deficient vec-tors in an orientation-dependent fashion. Human cervicalcarcinoma HeLa cells were transduced with GFP-encodingvectors based either on the (A) CMV promoter or (B) PGKpromoter, and containing within their SIN-LTRs the indi-cated inserts in the sense (s) or antisense (as) orientation.Forty-eight hours later, cytofluorometry was employed todetermine the percentage and intensity of GFP expression.Cell populations that exhibited comparable transduction ef-ficiency (percentage of GFP+ cells) were employed to estimateGFP expression levels. Here, the intensity of GFP expressionfrom insert-containing vectors is normalized to that of thecorresponding parental vectors (means – SEM; values werecalculated from at least 6 MOI obtained from at least six in-dependent experiments). Note that, 72 hr from transduction,the percentage of integrated viral DNA (determined byqPCR experiments) is significantly reduced (50-fold) in cellstransduced with integrase-deficient vectors in comparisonwith cells transduced with integrase-proficient vectors. f,functional, wild-type integrase; i, integrase inhibition withraltegravir; m, mutated integrase.

6 MANIC ET AL.

insulator capacity of cHS4. Such a positive impact of theantisense cHS4 insert on PCMV-driven transgene expressionis independent of integration (Fig. 3A) and declines withtime (Fig. 4A). This suggests that cHS4 inserted in the anti-sense orientation influences mostly early expression and/ortranscription from unintegrated DNA. Perhaps, the strongPCMV-driven expression from unintegrated circular DNAis improved in the presence of the transcriptional termina-tion that is associated with antisense cHS4 (Hanawaet al., 2009). On the other hand, the antisense cHS4 insertpositively modulates PPGK-driven transgene expression onlyon integration and mid-term culture (Fig. 4B). Taken to-gether, our results suggest that the antisense cHS4 enhancestransgene expression in a promoter- and integration-depen-dent fashion.

Surprisingly, 48 hr after transduction, the insertion withinSIN-LTRs of all sequences studied but cHS4 in the antisenseorientation led to a significant decrease in GFP expression(Fig. 3). Notably, for DS18-containing and (although to alesser extent) Ins023¢-containing vectors, we recorded a dif-ference in transgene expression that was promoter inde-pendent but orientation dependent. Thus, DS18 in theantisense orientation led to a more relevant decrease in GFPsignal than the same sequence cloned in the sense direction(Fig. 3A). This effect depended on integration for the LV-PPGK, but not the LV-PCMV, backbone (Fig. 3A and B), per-haps because PCMV is stronger than PPGK, and efficienttransgene expression from the latter might require integra-tion (Supplementary Fig. S1).

As vectors that contain moderate promoters present anoptimal safety profile (Pauwels et al., 2009), we investigatedfurther the reduction of transgene expression associated withcloning within the SIN-LTRs of PPGK-based constructs. Toexplore putative cell type-dependent effects (Rivella et al.,2000; Yao et al., 2003), we transduced PPGK-based vectors inhuman colorectal carcinoma HCT 116 cells, human T lym-phoblastoid leukemia CEM-T4 cells, and rodent ovariancarcinoma CHO cells. Two days after transduction, vectorscontaining insertions within their SIN-LTRs were signifi-cantly less efficient in expressing GFP than the parentalPPGK-based vector, in all tested cell lines (Fig. 5). Such a

decrease persisted over 6 days whereas, at this time point,antisense cHS4 had no impact (in CEM-T4 and CHO cells) ora positive impact (in HCT 116 cells) on transgene expression.Thus, vector design affects transgene expression more thancellular determinants. Similarly, the insertion of DS18 in thesense orientation within the SIN-LTRs of an MLV-derived,GFP-encoding, PPGK-based GRV vector decreased transgeneexpression by a factor of 0.6 – 0.1 (data not shown), demon-strating that DS18 attenuates transgene expression indepen-dently of a vector-specific effect.

We observed a slight tendency for large inserts (i.e., DS18in the antisense orientation, LacZ¢) to decrease transgeneexpression more relevantly than small inserts (i.e., cHS4 andIns023¢, both in the sense direction) (Fig. 3). However, thespecific nature and orientation of the insert played an evenmore important role, as demonstrated by the activating be-havior of cHS4 as well as by the fact that GFP expressionlevels on transduction with DS18-containing vectors variedfrom 0.6 – 0.1 to undetectable, and from 0.7 – 0.1 to 0.5 – 0.1(in the context of the PPGK and PCMV promoter, respectively),depending on insert orientation (Fig. 3).

Intrigued by the expression profile of DS18-containingvectors, we generated four subclones of this sequence in thesense orientation and carried out a systematic analysis todetermine which part of DS18 (from within SIN-LTRs) isresponsible for reducing transgene expression. Surprisingly,the effect of sense DS18 on GFP expression was not modifiedby the deletion of a 0.5-kb fragment upstream of the XbaIrestriction site (sDBX subclone), by the deletion of a 1.1-kbfragment upstream of the AfeI restriction site (sDBA sub-clone), or by the concomitant removal of the fragment up-stream of the XbaI restriction site and of the fragmentdownstream of the AfeI restriction site (sDBXDAS subclone)(Fig. 6). As the two latter subclones have no sequence incommon, it appears that no specific region of sense DS18 isresponsible for its inhibitory effect on transgene expression.Conversely, we found that this effect is exacerbated bydeletion of the MIRb element in the sense orientation(Fig. 6). Interestingly, inserts of equal size did not necessarilyhave similar effects on transgene expression. When thesame experiments were performed with antisense DS18, GFP

FIG. 4. Kinetics of GFP expression from PCMV- and PPGK-based vectors bearing insertions within their SIN-LTRs. Humancervical carcinoma HeLa cells were transduced with GFP-encoding vectors based either on the (A) CMV promoter or (B) PGKpromoter, and containing within their SIN-LTRs the indicated inserts in the sense (s) or antisense (as) orientation. GFPexpression was assessed by cytofluorometry 2, 3, 6, and 10 days after transduction, as described in Fig. 3. The intensity of GFPexpression from insert-containing vectors is normalized to that of the corresponding parental vectors (means – SEM; resultsare from at least 8 MOI obtained from at least eight independent experiments).

3¢ SIN-LTR INSERT EFFECTS ON TRANSGENE EXPRESSION 7

expression never exceeded the detection threshold imposedby pseudotransduction (data not shown). Taken together,these results and the fact that MIRb elements are described toadopt tRNA-like structures (Smit and Riggs, 1995) suggestthat sequence folding at the proviral level, rather than any

functional activity provided by the insertion, affects trans-gene expression. This phenomenon appears to be associatedwith the presence of an insert within SIN-LTRs and to bedependent on the orientation of the insert, rather than itssize.

Impact of SIN-LTR insertions on RNA stability

Because SIN-LTR insertions that are located upstream ofthe poly(A) signal of the R region (Fig. 1) are transcribed andconstitute the 3¢ end of the transgene mRNA, they may affectits folding and/or stability. To explore this issue, we trans-duced CEM-T4 cells (at a low MOI, < 0.15) with PPGK-basedvectors containing within their SIN-LTRs either no insert(control vector), cHS4 (in both orientations), or sense DS18 orits derivative sDBXDAS (as the minimal sequence presentingan interesting profile of modifications on transgene expres-sion; see previously). We sorted GFP + cells by FACS and, 5weeks later, we analyzed them for gfp mRNA content andstability.

We found that cHS4 in the antisense orientation favorsmid-term transgene expression from PPGK-based vectors, incontrast to cHS4 cloned in the sense direction as well asDS18 (Fig. 7). Similar to HeLa cells (Fig. 4), CEM-T4 cellsmanifested increased GFP expression when transducedwith a PPGK-based vector containing cHS4 in the antisenseorientation within the SIN-LTRs over time (starting from2 weeks posttransduction) (Fig. 7A). We also observeda correlation of normalized gfp mRNA levels and GFPexpression with all inserts but cHS4 in the antisense ori-entation (Fig. 7A), suggesting that decreased transgene ex-pression from sense cHS4- and DS18-containing PPGK-basedvectors reflects lowered mRNA levels. Intriguingly, GFPexpression from the vector containing cHS4 in the anti-sense orientation was higher than expected from mRNAlevels, pointing to the existence of a posttranscriptionalmechanism (e.g., polyadenylation enhancement) (Hanawaet al., 2009) whereby antisense cHS4 improves transgeneexpression.

To obtain more insights into these phenomena, we quan-tified gfp mRNA by RT-qPCR in cells before and after 6 hr oftreatment with actinomycin D (a transcriptional inhibitor).Notably, we failed to detect any difference in the turnover ofgfp mRNAs transcribed from PPGK-based vectors containingcHS4 and DS18 within their SIN-LTRs (compared with theinsert-free vector) (Fig. 7B). Thus, mRNA stability appearsnot to be involved in the decrease in transgene expressionthat results from the insertion of sense cHS4 and DS18.Moreover, the gfp mRNA species transcribed from the vectorthat contained cHS4 in the antisense orientation was notmore stable than its counterparts (Fig. 7B), indicating thatthere must be a posttranscriptional mechanism not linked tomRNA stability accounting for increased transgene expres-sion in this context.

Long-term decreases in transgene expression can resultfrom (1) extinction, the progressive silencing of an initiallyexpressed provirus during long-term culture or differentia-tion and/or (2) variegation, whereby genetically identicalsister cells inheriting the same provirus may express it ornot (Ellis, 2005). To formally exclude that DS18-containingPPGK-based vectors might be preferentially associatedwith these phenomena, we analyzed GFP expression in

FIG. 5. Attenuation of GFP expression due to insertionswithin SIN-LTRs is cell type independent. (A) Human lym-phoblastic CEM-T4 cells, (B) human colorectal carcinomaHCT 116 cells, or (C) Chinese hamster ovary CHO cells weretransduced (at an MOI < 0.3) with GFP-encoding, integrase-proficient, PPGK-based vectors containing within theirSIN-LTRs the indicated inserts in the sense (s) or antisense(as) orientation. The GFP expression was analyzed by cyto-fluorometry (as described in Fig. 3), 2 and 6 days aftertransduction. Here, the intensity of GFP expression frominsert-containing vectors is normalized to that of the corre-sponding parental vectors (means – SEM; values were cal-culated from at least 3 MOI obtained from at least threeindependent experiments).

8 MANIC ET AL.

HeLa cells transduced with a PPGK-based vector containingeither no insert (control vector) or DS18 in the sense ori-entation, sorted by FACS for GFP positivity, and kept thecells in culture for 3 months. Attenuation of transgene ex-pression was stable over this period (Fig. 8A and B). Threemonths after sorting, 97.6% of the cells transduced with theempty PPGK-based vector expressed GFP, some at highlevels (Fig. 8B). Such highly fluorescent cells were notpresent in the 96.6% GFP + cell population transduced withthe DS18-containing vector, which had a more homoge-neous (and less intense) pattern of GFP expression (Fig. 8Aand B).

We then determined the percentage of cells expressingGFP from LV-PPGK-based, LV-PCMV-based, and GRV-PPGK-based vectors (containing, or not containing, DS18)at multiple time points after transduction and sorting forGFP positivity. Notably, GFP + cells decreased with time,following a perfectly overlapping pattern in the case ofPPGK-based vectors irrespective of the vector type andDS18 presence (Fig. 8C). Initially, GFP + cells decreased ina relatively pronounced fashion when transduced withPCMV-based vectors (compared with their PPGK-basedcounterparts) (Fig. 8C), perhaps linked to a higher pro-pensity for silencing (immediate extinction) of the strongCMV promoter (Fig. 8D, and Supplementary Fig. S5)(Gerolami et al., 2000), associated with the fact that thepresence of the DS18 insert reduces transgene expressionbelow the threshold of detection. However, after 40 daysof cell culture, the difference between LV-PCMV-basedvectors containing, or not containing, DS18 remainedconstant. In conclusion, decreased expression from DS18-containing vectors is distinct from transgene extinction.

Decreased transgene expression by the SIN-LTRinsertion of DS18 persisted for at least 3 months anddid not increase transgene extinction or variegation

Last, on transduction and sorting, we isolated 7 to 10 (pertransduction condition) HeLa cell clones and maintainedthem in culture for a further 6 weeks. Most of the clones

randomly sorted from cells transduced with the DS18-containing vector were characterized by a lower GFP signalcompared with those transduced with the control insert-freevector, consistent with the stable nature of the attenuationphenomenon (Supplementary Fig. S6A and B). Moreover, wedid not observe any significant difference among the clonesrelative to the frequency of variegation, which we assessed interms of (1) a multimodal distribution of GFP expression and(2) the proportion of GFP-negative cells (Fig. 8D, and Sup-plementary Fig. S7). All together, these results demonstratethat the attenuation phenomenon associated with the inser-tion of DS18 (in the sense orientation) within SIN-LTRs isstable over long periods of time and does not correspond totransgene extinction or variegation.

Discussion

Gene transfer requires the development of safe, efficient,and flexible genetic tools. The ability of retroviral vectors toefficiently integrate in the host cell genome and express thetransgene of interest can be influenced by the presence ofexogenous sequences within their (SIN) LTRs. Driven bythese considerations, we investigated the impact on retro-transgenesis of large (1.1- to 1.6-kb) sequences of avian(cHS4), human (Ins023¢, DS18), or bacterial (LacZ¢) origincloned (in either the sense or antisense orientation) withinthe SIN-LTRs of (integrase-proficient or -deficient) LV andGRV vectors that express GFP under the control of the strongCMV or the moderate PGK promoter.

Kumar and colleagues have shown that viral titers de-crease semilogarithmically with increasing vector size (Ku-mar et al., 2001). Our results showed a similar tendency: largeinserts led to a more remarkable decrease in viral titers thandid small inserts (Fig. 1B), irrespective of internal promoter,insert orientation, and CTCF-binding abilities. The reductionof viral titers may be linked to less efficient preintegrativesteps (including production and reverse transcription) (Ha-nawa et al., 2009), genetic instability (Nielsen et al., 2009;Urbinati et al., 2009), and expression level in the target cell.

FIG. 6. Effects of the DS18 insert on early transgene expression are not specific to sequence. Human cervical carcinomaHeLa cells were transduced with < 0.5 MOI of a GFP-encoding, PPGK-based vector that contained within its SIN-LTRs noinsert, full-length DS18 in the sense orientation, or the depicted DS18 restriction fragments. Forty-eight hours later, cells wereanalyzed as described in Fig. 3. Left: Sense DS18 and its restriction fragments are depicted. Right: Bars depict GFP expressionfrom insert-containing vectors on normalization to that of the PPGK-based parental vector (means – SEM; *p < 0.05 comparedwith the vector containing full-length DS18; results are from at least 3 MOI obtained from at least three independentexperiments). All the constructs tested were significantly different from the vector without insert. DBA, deletion of the regionupstream of the AfeI site; DBXDAS, deletion of the region upstream of the XbaI site and of the region downstream of the AfeIsite; DBX, deletion of the region upstream of the XbaI site; DMIR, deletion of the MIRb element.

3¢ SIN-LTR INSERT EFFECTS ON TRANSGENE EXPRESSION 9

This said, the influence of cHS4 on retroviral titers wasmarginal, in line with results from previous studies pointingto negligible (Yannaki et al., 2002) or even positive (Emeryet al., 2000) effects of cHS4.

The vectors used in this study did not exhibit significantintegration defects (Fig. 2), yet all inserts, in at least oneorientation, significantly decreased early GFP expression inLV-transduced cells (Fig. 3). cHS4 cloned within SIN-LTRshas previously been shown to decrease transgene expressionfrom internal promoters (Yannaki et al., 2002; Ramezani et al.,2003; Hanawa et al., 2009; Uchida et al., 2011), but this phe-nomenon was ascribed to the ability of cHS4 to block the 3¢

LTR enhancer (Yannaki et al., 2002) and/or to topologicalconstraints (Yannaki et al., 2002; Ramezani et al., 2003). Ourfindings indicate that this effect is not specifically linked tothe capacity of cHS4 to recruit CTCF, as it persists whensequences that do not bind CTCF are cloned within SIN-LTRs (Fig. 3). Aker and colleagues previously reported thatthe insertion of putatively inert ‘‘spacer’’ sequences of ex-ogenous origin slightly decreases transgene expression (Akeret al., 2007). We observed a similar phenomenon, becauseboth DS18 and LacZ¢, which were selected as control se-quences (because they do not contain CTCF-binding sites),relevantly attenuated transgene expression. Altogether, theseobservations argue against the existence of totally ‘‘inert’’sequences that can be used as spacer controls for insertionwithin retroviral vectors.

Previous studied indicate that the efficiency of transduc-tion with vectors containing large inserts (of various nature)within the SIN-LTR decreases along with insert size (Hana-wa et al., 2009; Nielsen et al., 2009; Urbinati et al., 2009; Boset al., 2010). We also observed a tendency for the most pro-nounced attenuation of transgene expression to occur withlarge inserts (Fig. 3). However, further exploration with de-letion derivatives of DS18 did not confirm this trend (Fig. 6).Moreover, insert orientation as well as the deletion of somesequences (e.g., MIRb in sense DS18) significantly influencedtransgene expression attenuation, at least in some cases (Figs.3 and 6). Taken together, our results indicate that insert sizeis not the only element influencing transgene expressionfrom LV vectors.

Several phenomena might explain the attenuation oftransgene expression resulting from the insertion of se-quences within SIN-LTRs: (1) the recruitment or exclusionof cellular factors in the vicinity of insertions, which mayinfluence the activity of the internal promoter; (2) changesin LTR DNA topology, which may prevent transcriptionfactors from gaining access to the internal promoter; and(3) changes in RNA stability and/or (4) changes in RNAtopology, which may affect transcription/translation. Theattenuation of transgene expression that we observed wassequence and cell type independent, de facto excluding thefirst of these possibilities. The three-dimensional organi-zation of the proviral DNA might be disturbed by inser-tions, and features favoring transcription, such as loopsthat bring the SIN-LTRs close to each other, might be de-stabilized. The LV provirus reportedly forms a transcrip-tion-dependent gene loop structure between the 5¢ LTR orPCMV and the 3¢ LTR poly(A) signal, suggesting that pre-mRNA processing signals may indeed affect gene tran-scription (Perkins et al., 2008). We failed to detect signifi-cant changes in RNA stability (Fig. 7B), suggesting thatthe attenuation of transgene expression that we observedderives from topological rearrangements at the DNA and/or the RNA level. The U3 region of the LTR is included inthe 3¢ UTR of the mRNA, and hence is likely to affect foldingin an orientation-dependent manner, in particular when in-serts are large. We propose that these RNA-folding modifi-cations directly modify the level of transgene transcriptionfrom the retroviral loop structure. The impact of distinct in-serts within the LV-PCMV backbone even in the absence ofintegration favors the hypothesis of a direct action throughtopological rearrangements (Fig. 3A). Further studies will beneeded to better elucidate this issue and possibly identify

FIG. 7. Impact of insertions within the SIN-LTRs on mRNAlevels and stability. Human T lymphoblastoid CEM-T4 cellswere transduced with a GFP-encoding, PPGK-based vectorthat contained within its SIN-LTRs no insert or the indicatedsequence in the sense (s) or antisense (as) orientation. Twoweeks later, GFP + cells (containing 1 – 0.1 provirus per cell)were sorted and maintained in culture for 7 weeks, afterwhich GFP protein expression was analyzed by cyto-fluorometry and gfp mRNA levels were quantified (beforeand after a 6-hr-long treatment with actinomycin D) by RT-qPCR. (A) Dark gray columns report the intensity of GFPexpression from insert-containing vectors on normalizationto that of the corresponding parental vector. Light gray col-umns illustrate the levels of gfp mRNA in cells transducedwith insert-containing vectors (normalized to the gapdhmRNA content as well as to the gfp mRNA levels recorded incells transduced with the parental vector). (B) Columns de-pict the levels of gfp mRNA after actinomycin D treatmentnormalized to the gapdh mRNA content as well as to thelevels of gfp mRNA recorded before the administration ofactinomycin D thus illustrating RNA stability. Data repre-sent mean values from two independent experiments per-formed in duplicate – SEM. Significant differences were notobserved ( p > 0.05).

10 MANIC ET AL.

which topological elements are optimal for transgene tran-scription. Hanawa and colleagues detected increased amountsof polyadenylated gfp mRNA resulting from the insertionwithin SIN-LTRs of the 0.25-kb core insulator (in one givenorientation) (Hanawa et al., 2009). In line with this, we ob-

served increased gfp mRNA levels in cells transduced withPPGK-based vectors containing within SIN-LTRs cHS4 in theantisense (but not the sense) orientation (Fig. 7A). Taken to-gether, these observations suggest that multiple elements in-fluence transgene expression from a given vector, including

FIG. 8. Reduction of transgene expression by the insertion within SIN-LTRs of sense DS18 is stable and does not involveextinction or variegation. (A and B) GFP expression from DS18-containing PPGK-based vectors is stable. Human cervicalcarcinoma HeLa cells were left uninfected or were transduced with < 0.2 MOI of a GFP-encoding, PPGK-based vector thatcontained within its SIN-LTR no insert or full-length DS18 in the sense (s) orientation. One week later, cells were sorted byFACS and GFP + cells were maintained in culture for an additional 3 months. At the indicated time points, GFP expressionwas evaluated by cytofluorometry. (A) GFP expression profiles (M1 and M2 define GFP-negative and -positive cell popu-lations, respectively). (B) GFP expression is plotted as a function of red autofluorescence and percentages indicate theincidence of long-term GFP positivity. Results are representative of two independent experiments. (C) Changes in the long-term percentage of GFP + cells on transduction with vectors containing, or not containing, the DS18 element in their SIN-LTRs.Human cervical carcinoma HeLa cells were transduced with less than 0.2 MOI of lentiviral (LV) or gammaretroviral (GRV) GFP-encoding, PCMV- or PPGK-based vectors containing, or not containing, within their SIN-LTRs the DS18 element in the senseorientation. One week later, cells were sorted by FACS and GFP + cells were maintained in culture for an additional 3 months.The percentage of GFP-expressing cells is reported as a function of time. Results are from one representative experiment inwhich the sorted populations of LV-PPGK-, LV-PCMV-, and GRV-PPGK-based vectors (containing, or not containing, sense DS18)had, respectively, 1 – 0.3 vector copy number per cell (determined by qPCR experiments performed at various times after cellsorting). (D) Frequency of variegation. Seven to 10 clones were sorted from HeLa cells transduced as in (C) and maintained inculture for 6 weeks. The number of clones displaying a variegated GFP expression pattern (clear multimodal distribution of GFPexpression or significantly higher fraction of completely silenced cells) among the total number of clones analyzed for eachvector is reported. Detailed profiles of GFP expression for each clone are reported in Supplementary Fig. 7.

3¢ SIN-LTR INSERT EFFECTS ON TRANSGENE EXPRESSION 11

(but perhaps not limited to) vector backbone and size, insertsize and orientation, internal promoter, and the transgene it-self. In our study, cHS4 increased transgene expression onlywhen cloned within SIN-LTRs in the antisense configuration(Figs. 3, 4, 5, and 7A). The importance of insert orientation forthe modulation of transgene expression from retroviral vec-tors has been previously reported (Emery et al., 2000; Yannakiet al., 2002; Hanawa et al., 2009; Uchida et al., 2011). In thiscontext, attenuation may minimize the positive effects ofsome SIN-LTR inserts, and this may explain partially contra-dictory results about the efficiency of cHS4 as an insulatingelement in retroviral vectors (Nielsen et al., 2009; Uchida et al.,2011). Here, we demonstrate that SIN-LTR inserts can de-crease transgene expression, a phenomenon that sometimescan be overcome by modifying insert orientation, thus high-lighting the importance of careful vector design for genetherapy.

Our results reveal that cHS4 in the antisense orientationcan improve transgene expression, although in a promot-er-dependent fashion, from unintegrated DNA forms (Fig.3A), bringing new perspectives to approaches of IDLV-based gene transfer. Conversely, increased transgene ex-pression from PPGK-based constructs bearing antisensecHS4 insert appeared over time, on integrated DNA forms(Figs. 4B and 5). These observations emphasize the factthat cHS4 might act through several mechanisms (in-cluding termination improvement, enhancer-blocker andbarrier effects).

We observed no increased transgene expression fromvectors including the Ins023¢ sequence, which contains aCTCF-binding site associated with blocker-enhancer ac-tivity three times stronger than that of cHS4 (Xi et al.,2007). We cannot rule out the possibility that Ins023¢ is notfunctional in the retroviral context. As an alternative, theinsertion-dependent attenuation of transgene expressionmight mask any enhancer activity by Ins023¢, or thebinding of CTCF might not be sufficient to ensure in-creased transgene expression (Yao et al., 2003; Arumugamet al., 2009).

Is attenuation of transgene expression advantageous forgene transfer? The level of transgene expression influencesgene transfer efficiency and safety. Most gene therapystrategies that are currently under evaluation for the cure ofinherited diseases are based on complementation ap-proaches, in which the transfer of a functional copy of themutant gene leads to phenotypic correction of the geneticdefect. For such an approach to be successful, transgene ex-pression should be stable over time and appropriate (interms of expression levels and localization) for the physio-logical context (reviewed in Chang and Sadelain, 2007).Moreover, a balance must be found between the benefits andtoxicity of gene expression, in particular relative to the pos-sible recognition, neutralization, or destruction of transducedtargets by the immune system (in immune-proficient hosts).Thus, depending on the disease, the expression of the ther-apeutic transgene ranges from low (e.g., X-linked severecombined immunodeficiency syndrome or adenosine de-aminase deficiency), to moderate (e.g., Wiskott-Aldrichsyndrome), to high (e.g., b-thalassemia and sickle cell dis-ease, hemophilia) (Chang and Sadelain, 2007). In this context,or to establish well-defined cellular models, it would beadvantageous to use vectors whose transgene expression

levels can be finely modulated by SIN-LTR inserts, such asthose presented in this study.

Acknowledgments

The authors thank Sylvain Thierry, Olivier Delelis, andHerve Leh for stimulating discussions and Yann Lecluse fortechnical support. G. Manic and A. Maurin-Marlin held fel-lowships from the Association Francaise contre les Myo-pathies and the Ecole Normale Superieure de Cachan,respectively.

Conflict of Interest Statement

The authors declare no conflict of interest.

References

Aker, M., Tubb, J., Groth, A.C., et al. (2007). Extended core se-quences from the cHS4 insulator are necessary for protectingretroviral vectors from silencing position effects. Hum. GeneTher. 18, 333–343.

Arumugam, P.I., Urbinati, F., Velu, C.S., et al. (2009). The 3¢region of the chicken hypersensitive site-4 insulator hasproperties similar to its core and is required for full insulatoractivity. PLoS One 4, e6995.

Banasik, M.B., and McCray, P.B., Jr. (2010). Integrase-defectivelentiviral vectors: Progress and applications. Gene Ther. 17,150–157.

Bos, T.J., De Bruyne, E., Van Lint, S., et al. (2010). Large dou-ble copy vectors are functional but show a size-dependentdecline in transduction efficiency. J. Biotechnol. 150,37–40.

Brussel, A., and Sonigo, P. (2003). Analysis of early human im-munodeficiency virus type 1 DNA synthesis by use of a newsensitive assay for quantifying integrated provirus. J. Virol. 77,10119–10124.

Buceta, M., Galbete, J.L., Kostic, C., et al. (2011). Use of humanMAR elements to improve retroviral vector production. GeneTher. 18, 7–13.

Cavazzana-Calvo, M., Payen, E., Negre, O., et al. (2010).Transfusion independence and HMGA2 activation aftergene therapy of human b-thalassaemia. Nature 467, 318–322.

Chang, A.H., and Sadelain, M. (2007). The genetic engineering ofhematopoietic stem cells: The rise of lentiviral vectors, theconundrum of the LTR, and the promise of lineage-restrictedvectors. Mol. Ther. 15, 445–456.

Chen, C., and Okayama, H. (1987). High-efficiency transforma-tion of mammalian cells by plasmid DNA. Mol. Cell. Biol. 7,2745–2752.

Chung, J.H., Whiteley, M., and Felsenfeld, G. (1993). A 5¢ ele-ment of the chicken b-globin domain serves as an insulator inhuman erythroid cells and protects against position effect inDrosophila. Cell 74, 505–514.

Drelich, M., Wilhelm, R., and Mous, J. (1992). Identificationof amino acid residues critical for endonuclease and integra-tion activities of HIV-1 IN protein in vitro. Virology 188,459–468.

Ellis, J. (2005). Silencing and variegation of gammare-trovirus and lentivirus vectors. Hum. Gene Ther. 16,1241–1246.

Emery, D.W., Yannaki, E., Tubb, J., and Stamatoyannopoulos, G.(2000). A chromatin insulator protects retrovirus vectors from

12 MANIC ET AL.

chromosomal position effects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97,9150–9155.

Evans-Galea, M.V., Wielgosz, M.M., Hanawa, H., et al. (2007).Suppression of clonal dominance in cultured human lym-phoid cells by addition of the cHS4 insulator to a lentiviralvector. Mol. Ther. 15, 801–809.

Foley, G.E., Lazarus, H., Farber, S., et al. (1965). Continuousculture of human lymphoblasts from peripheral blood of achild with acute leukemia. Cancer 18, 522–529.

Gaussin, A., Modlich, U., Bauche, C., et al. (2012). CTF/NF1transcription factors act as potent genetic insulators for inte-grating gene transfer vectors. Gene Ther. 19, 15–24.

Gerolami, R., Uch, R., Jordier, F., et al. (2000). Gene transfer tohepatocellular carcinoma: Transduction efficacy and trans-gene expression kinetics by using retroviral and lentiviralvectors. Cancer Gene Ther. 7, 1286–1292.

Haas, D.L., Case, S.S., Crooks, G.M., and Kohn, D.B. (2000).Critical factors influencing stable transduction of humanCD34 + cells with HIV-1-derived lentiviral vectors. Mol. Ther.2, 71–80.

Hanawa, H., Yamamoto, M., Zhao, H., et al. (2009). Optimizedlentiviral vector design improves titer and transgene expres-sion of vectors containing the chicken b-globin locus HS4 in-sulator element. Mol. Ther. 17, 667–674.

Hazuda, D.J., Felock, P., Witmer, M., et al. (2000). Inhibitors ofstrand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1replication in cells. Science 287, 646–650.

Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., and Lin, S. (2010). Seriousoverestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled)plasmid standard: Microalgal PCNA as the model gene. PLoSOne 5, e9545.

Kim, T.H., Abdullaev, Z.K., Smith, A.D., et al. (2007). Analysis ofthe vertebrate insulator protein CTCF-binding sites in thehuman genome. Cell 128, 1231–1245.

Kumar, M., Keller, B., Makalou, N., and Sutton, R.E. (2001).Systematic determination of the packaging limit of lentiviralvectors. Hum. Gene Ther. 12, 1893–1905.

Leclerc, G.J., Leclerc, G.M., and Barredo, J.C. (2002). Real-timeRT-PCR analysis of mRNA decay: Half-life of b-actin mRNAin human leukemia CCRF-CEM and Nalm-6 cell lines. CancerCell Int. 2, 1.

Maruggi, G., Porcellini, S., Facchini, G., et al. (2009). Transcrip-tional enhancers induce insertional gene deregulation inde-pendently from the vector type and design. Mol. Ther. 17,851–856.

Masson, C., Bury-Mone, S., Guiot, E., Saez-Cirion, A., Schoevaert-Brossault, D., Brachet-Ducos, C., Delelis, O., Subra, F., Jeanson-Leh, L., Mouscadet, JF. (2007). Ku80 participates in the targetingof retroviral transgenes to the chromatin of CHO cells. J Virol.81(15):7924–7932. Epub 2007 May 16. PubMed PMID: 17507472;PubMed Central PMCID: PMC1951289.

Mitchell, R.S., Beitzel, B.F., Schroder, A.R., et al. (2004). Retro-viral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distincttarget site preferences. PLoS Biol. 2, E234.

Miyoshi, H., Takahashi, M., Gage, F.H., and Verma, I.M. (1997).Stable and efficient gene transfer into the retina using an HIV-based lentiviral vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 10319–10323.

Montini, E., Cesana, D., Schmidt, M., et al. (2006). Hematopoieticstem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model un-covers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat.Biotechnol. 24, 687–696.

Montini, E., Cesana, D., Schmidt, M., et al. (2009). The genotoxicpotential of retroviral vectors is strongly modulated by vector

design and integration site selection in a mouse model of HSCgene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964–975.

Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., et al. (1996). In vivo genedelivery and stable transduction of nondividing cells by alentiviral vector. Science 272, 263–267.

Nielsen, T.T., Jakobsson, J., Rosenqvist, N., and Lundberg, C.(2009). Incorporating double copies of a chromatin insulatorinto lentiviral vectors results in less viral integrants. BMCBiotechnol. 9, 13.

Ory, D.S., Neugeboren, B.A., and Mulligan, R.C. (1996). A stablehuman-derived packaging cell line for production of high titerretrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 11400–11406.

Pauwels, K., Gijsbers, R., Toelen, J., et al. (2009). State-of-the-artlentiviral vectors for research use: Risk assessment and bio-safety recommendations. Curr. Gene Ther. 9, 459–474.

Perkins, K.J., Lusic, M., Mitar, I., et al. (2008). Transcription-dependent gene looping of the HIV-1 provirus is dictatedby recognition of pre-mRNA processing signals. Mol. Cell 29,56–68.

Pfaffl, M.W. (2001). A new mathematical model for relative quan-tification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45.

Ramezani, A., Hawley, T.S., and Hawley, R.G. (2003). Perfor-mance- and safety-enhanced lentiviral vectors containing thehuman interferon-b scaffold attachment region and thechicken b-globin insulator. Blood 101, 4717–4724.

Rivella, S., Callegari, J.A., May, C., et al. (2000). The cHS4 insu-lator increases the probability of retroviral expression at ran-dom chromosomal integration sites. J. Virol. 74, 4679–4687.

Ruprecht, R.M., O’Brien, L.G., Rossoni, L.D., and Nusinoff-Lehrman, S. (1986). Suppression of mouse viraemia and ret-roviral disease by 3¢-azido-3¢-deoxythymidine. Nature 323,467–469.

Ryu, B.Y., Persons, D.A., Evans-Galea, M.V., et al. (2007). Achromatin insulator blocks interactions between globin regu-latory elements and cellular promoters in erythroid cells.Blood Cells Mol. Dis. 39, 221–228.

Schambach, A., Swaney, W.P., and van der Loo, J.C. (2009).Design and production of retro- and lentiviral vectors for geneexpression in hematopoietic cells. Methods Mol. Biol. 506,191–205.

Smit, A.F., and Riggs, A.D. (1995). MIRs are classic, tRNA-de-rived SINEs that amplified before the mammalian radiation.Nucleic Acids Res. 23, 98–102.

Uchida, N., Washington, K.N., Lap, C.J., et al. (2011). ChickenHS4 insulators have minimal barrier function among progenyof human hematopoietic cells transduced with an HIV1-basedlentiviral vector. Mol. Ther. 19, 133–139.

Urbinati, F., Arumugam, P., Higashimoto, T., et al. (2009). Me-chanism of reduction in titers from lentivirus vectors carryinglarge inserts in the 3¢LTR. Mol. Ther. 17, 1527–1536.

Xi, H., Shulha, H.P., Lin, J.M., et al. (2007). Identification andcharacterization of cell type-specific and ubiquitous chromatinregulatory structures in the human genome. PLoS Genet. 3,e136.

Yamashita, M., and Emerman, M. (2006). Retroviral infection ofnon-dividing cells: Old and new perspectives. Virology 344,88–93.

Yannaki, E., Tubb, J., Aker, M., et al. (2002). Topological con-straints governing the use of the chicken HS4 chromatin in-sulator in oncoretrovirus vectors. Mol. Ther. 5, 589–598.

Yao, S., Osborne, C.S., Bharadwaj, R.R., et al. (2003). Retrovirussilencer blocking by the cHS4 insulator is CTCF independent.Nucleic Acids Res. 31, 5317–5323.

3¢ SIN-LTR INSERT EFFECTS ON TRANSGENE EXPRESSION 13

Zhang, Z.D., Paccanaro, A., Fu, Y., et al. (2007). Statistical analysisof the genomic distribution and correlation of regulatory ele-ments in the ENCODE regions. Genome Res. 17, 787–797.

Zheng, J., Shan, Y., Lambrecht, R.W., et al. (2008). Differentialregulation of human ALAS1 mRNA and protein levels by hemeand cobalt protoporphyrin. Mol. Cell. Biochem. 319, 153–161.

Zhou, S., Mody, D., Deravin, S.S., et al. (2010). A self-inactivatinglentiviral vector for SCID-X1 gene therapy that does notactivate LMO2 expression in human T cells. Blood 116, 900–908.

Zufferey, R., Dull, T., Mandel, R.J., et al. (1998). Self-inactivatinglentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J.Virol. 72, 9873–9880.

Zychlinski, D., Schambach, A., Modlich, U., et al. (2008). Phy-siological promoters reduce the genotoxic risk of integratinggene vectors. Mol. Ther. 16, 718–725.

Address correspondence to:Dr. Stephanie Bury-Mone

LBPA, CNRSEcole Normale Superieure (ENS) de Cachan

61 avenue du President Wilson94235 Cachan

France

E-mail: stephanie.bury-mone@lbpa.ens-cachan.fr

Received for publication August 21, 2011;accepted after revision February 27, 2012.

Published online: March 2, 2012.

14 MANIC ET AL.

Supplementary Data

SUPPLEMENTARY FIG. S1. Cytofluorometric analysis of AZT- or raltegravir-treated cells transduced with parentalvectors or its derivatives bearing insertions within SIN-LTRs. Untreated cells, AZT-treated cells, and raltegravir-treated HeLacells were transduced with < 0.4 MOI of GFP-encoding vectors based on the PGK promoter (A and C) or CMV promoter (Band D), and containing within their SIN-LTRs the indicated inserts in the sense (s) or antisense (as) orientation. Forty-eighthours later, cytofluorometry was employed to determine the (A and B) percentage and (C and D) intensity of GFP expression(which is expressed in arbitrary units. Data are from representative experiments performed at least four times in duplicate(means – SEM). ‘‘Orientation’’ and ‘‘type’’ indicate the orientation and type of the insert contained within the SIN-LTR of thetransduced vector. AU, arbitrary units.

SUPPLEMENTARY FIG. S2. Viral DNA titers of PCMV-based vectors. Human cervical carcinoma HeLa cells weretransduced with serial dilutions of GFP-encoding, PCMV-based vectors bearing within their SIN-LTRs the indicatedinserts in the sense (s) or antisense (as) orientation. Twenty-four hours later, total viral DNA was quantified by qPCR (oncell populations with an average GFP positivity of 10 – 3%).Viral DNA titers were calculated by dividing the quantity oftotal DNA (values per cell · number of transduced cells) bythe volume of viral preparation used in each experiment.Columns report mean values – SEM (*p < 0.05, **p < 0.01compared with parental vector) obtained from seven inde-pendent experiments. vDNA, viral DNA.

HGTB-2011-154-ver9-Manic-Suppl_1P.3d 03/19/12 3:28pm Page 1

SUPPLEMENTARY FIG. S3. Vector copy number per celltransduced with parental vectors or its derivatives contain-ing insertions within their SIN-LTRs. Human cervical carci-noma HeLa cells were transduced with serial dilutions ofGFP-encoding vector based on the (A) PGK promoter or (B)CMV promoter and containing within their SIN-LTRs theindicated inserts in the sense (s) or antisense (as) orientation.Seventy-two hours later, total viral DNA and cell numberwere quantified by qPCR (on cell populations with an av-erage GFP positivity of 10 – 3%). Vector copy number per cellwas calculated by reporting the total viral DNA to cellnumber. Columns report mean values – SEM (*p < 0.05 com-pared with parental vector) obtained from three independentexperiments. Of note, the rapid reduction in total viral DNA(0.04 – 0.01 copy per cell, 72 hr posttransduction as comparedwith 0.7 – 0.1 copy per cell 24 hr posttransduction) that weobserved suggests that a fraction of GFP fluorescence de-tected 48 hr after transduction comes from either GFP syn-thesized from unintegrated DNA or from stable GFPprotein/mRNA species synthesized at earlier time points.

HGTB-2011-154-ver9-Manic-Suppl_1P.3d 03/19/12 3:28pm Page 2

SUPPLEMENTARY FIG. S4. GFP expression profiles of cells transduced with integrase-proficient or -deficient vectors.Human cervical carcinoma HeLa cells were transduced with less than 0.2 MOI of GFP-encoding vectors based on the (A) PGKpromoter or (B) CMV promoter. The vectors used carried a functional integrase that was inhibited by treatment of the cellswith a specific integrase inhibitor (i.e., raltegravir) before transduction. Alternatively, these experiments were performed withvectors carrying a mutated integrase. Forty-eight hours later, cytofluorometry was employed to determine the percentageand geometric mean fluorescence intensity (MFI) of GFP expression. Profiles are representative of at least six independentexperiments.

HGTB-2011-154-ver9-Manic-Suppl_1P.3d 03/19/12 3:28pm Page 3

SUPPLEMENTARY FIG. S5. Kinetics of GFP expression from PCMV- and PPGK-based vectors bearing insertions withintheir SIN-LTRs. Human cervical carcinoma HeLa cells were transduced with < 0.4 MOI of GFP-encoding vectors based on the(A, C, and E) PGK promoter or (B, D, and F) CMV promoter and containing within their SIN-LTRs the indicated inserts in thesense (s) or antisense (as) orientation, as described in Supplementary Fig. S4. GFP expression was assessed by cyto-fluorometry 2, 3, 6, and 10 days after transduction in (A), (B), (D), and (F), as described in Fig. 3. For conditions represented in(C) and (E), cytofluorometric analysis were performed until 6 days, because GFP expression was lost at this time point.Kinetics are representative of at least six independent experiments.

HGTB-2011-154-ver9-Manic-Suppl_1P.3d 03/19/12 3:28pm Page 4

SUPPLEMENTARY FIG. S6. GFP expression analysis of HeLa cell clones 2 months after transduction with a GFP-en-coding, PPGK-based vector containing within its SIN-LTR DS18 in the sense orientation. Human cervical carcinoma HeLa cellswere transduced as detailed in Fig. 8C and 7 to 10 clones were sorted by cytofluorometry 1 week after transduction. Sevenweeks later, these clones were characterized by cytofluorometry for GFP expression. (A) Representative GFP expressionprofiles. (B) Quantitative data are reported (mean GFP expression – SEM; *p < 0.05 compared with the parental vector).

HGTB-2011-154-ver9-Manic-Suppl_1P.3d 03/19/12 3:28pm Page 5

SUPPLEMENTARY FIG. S7. GFP expression profiles of HeLa cell clones transduced with lentiviral (LV) or gammare-troviral (GRV) GFP-encoding, PCMV- or PPGK-based vectors bearing within their SIN-LTRs the DS18 element in the senseorientation and maintained in culture for 1.5 months. Representative expression profiles at multiple time points are reported.

HGTB-2011-154-ver9-Manic-Suppl_1P.3d 03/19/12 3:28pm Page 6

SUPPLEMENTARY FIG. S7. (Continued).

HGTB-2011-154-ver9-Manic-Suppl_1P.3d 03/19/12 3:28pm Page 7

Supplementary Table S1. Vectors Used in Study

Type Promoter Insertion Insert size (kb) Orientation Name

LV PGK — — — LV-PPGK

cHS4 1.2 s LV-PPGK-cHS4 sas LV-PPGK-cHS4 as

Ins023¢ 1.1 s LV-PPGK-Ins023¢ sas LV-PPGK-Ins023¢ as

DS18 1.6 s LV-PPGK-DS18 sas LV-PPGK-DS18 as

LacZ¢ 1.5 s LV-PPGK-LacZ¢ sLV CMV — — — LV-PCMV

cHS4 1.2 s LV-PCMV-cHS4 sas LV-PCMV-cHS4 as

Ins023¢ 1.1 s LV-PCMV-Ins023¢ sas LV-PCMV-Ins023¢ as

DS18 1.6 s LV-PCMV-DS18 sas LV-PCMV-DS18 as

LacZ¢ 1.5 s LV-PCMV-LacZ¢ sGRV PGK — — — GRV-PPGK

DS18 1.6 s GRV-PPGK-DS18 sas GRV-PPGK-DS18 as

as, antisense; cHS4, chicken hypersensitive site-4; CMV, cytomegalovirus; GRV, gammaretroviral; LV, lentiviral; PGK, phosphoglyceratekinase; s, sense.

Supplementary Table S2. Primers Used for This Study

Name Target Sequencea

Primers used for vector cloningOBM29 DS18 GGATCCTTGGGGAATAATTTTACTCTTTTGOBM30 DS18 GGATCCTGATGGTGATGAAATAAAGTTGOBM95 LNCX 3¢ region CTCGAGCACGTGATGCATCAOBM96 LNCX U3 TCTAGAGTTAACCTGTTCCATCTGTTCCTGACOBM156 IND116A-sense GTACATACAGCCAATGGCAGCAATTTCACCAGOBM157 IND116A-antisens TGCCATTGGCTGTATGTACTGTTTTTACTGGOBM164 3¢LV SIN-LTR CAACGATCTAGACAAGATCTGCTTTTTGCOBM165 3¢LV SIN-LTR GATCTTGTCTAGATCGTTGGGAGTGAATTAGCCOBM174 DS18 CACTGGTTCTCTATGATAGTATCATCTTCACGATCATGATCATCATCACCAGGGCCOBM175 DS18 ATCATGATCGTGAAGATGATACTATCATAGAGAACCAGTGGCCCTCTGAGOBM176 Ins023 CGGCGCGCCGGTACCTCTAGAAGAGATGTGCCTGGAACCACTCCTGATGOBM178 Ins023 CGGCGCGCCGGTACCTCTAGAGCACATTGGGGAGCAAAATTGGAAAAAGOBM179 lacZ CGGCGCGCCTCTAGAGGATCCGAGCTCGGCGTTAACTCGGCGTTTCATCTGTGGTGCOBM180 lacZ CGGCGCGCCTCTAGAGGATCCGAGCTCGTTATCGCTATGACGGAACAGGPrimers used for quantitative PCROBM12 eGfp AGAACGGCATCAAGGTGAACOBM13 eGfp ACTGGGTGCTCAGGTAGTGGOBM241 Human gapdh CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTOBM242 Human gapdh CCATGGTGTCTGAGCGATGTAlu1 Human Alu TCCCAGCTACTGGGGAGGCTGAGGAlu2 Human Alu GCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGL-M667 LV ATGCCACGTAAGCGAAACTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGLambda-T L-M667 ATGCCACGTAAGCGAAACTAA55M LV GCTAGAGATTTTCCACACTGACTAAMH 531 LV TGTGTGCCCGTCTGTTGTGTMH 532 LV GAGTCCTGCGTCGAGAGAGCProbes used for quantitative PCRLTR-FL LV CACAACAGACGGGCACACACTACTTGA (3¢ fluorescein)LTR-FC LV CACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGC (5¢ LC red 640 dye and 3¢-P)MH-FL LV CCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAA (3¢ fluorescein)MH-LC LV TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG (5¢ LC red 640 dye and 3¢-P)

aRestriction sites are underlined.

HGTB-2011-154-ver9-Manic-Suppl_1P.3d 03/19/12 3:28pm Page 8

133

II/ IMPACTS DE LA MACHINERIE DE REPARATION DE L’ADN SUR

L’EXPRESSION LENTIVIRALE

A/ CONTEXTE DE L’ETUDE

Les facteurs impliqués dans la réparation de l’ADN des cellules infectées ont été

décrits comme des acteurs clés dans les interactions hôte/rétrovirus ainsi que dans la réponse à

leur infection (Skalka and Katz, 2005; Smith and Daniel, 2006). Les signaux déclenchés lors

des premières étapes de l’infection rétrovirale (e.g., lésions créées lors l’intégration) peuvent

stimuler les voies de réponses aux dommages de l’ADN en activant et/ou recrutant les kinases

ATM et ATR (Lau et al., 2005; Roshal et al., 2003; Smith et al., 2008). Cette stimulation peut

alors induire la mort (Andersen et al., 2005) ou la survie (Daniel et al., 1999; Lau et al., 2005;

Smith et al., 2008) de la cellule infectée.

Les protéines des différentes voies de réparation de l’ADN interviennent directement

dans plusieurs étapes du cycle rétroviral en stimulant ou inhibant la multiplication virale (cf.,

Introduction, Tableau 8). Cependant, la littérature concernant certaines de ces protéines est

contradictoire. Notre laboratoire a notamment mis en évidence un rôle négatif de Ku dans la

régulation de l’expression précoce du VIH-1 au sein de cellules de rongeurs (Jeanson and

Mouscadet, 2002; Masson et al., 2007) ainsi que dans la latence virale au sein des cellules

humaines (Jeanson and Mouscadet, 2002). A l’inverse, Waninger et al. ont démontré que la

déplétion en Ku80 diminue l’activation (précoce) du LTR du VIH-1 (Waninger et al., 2004).

Ku70 et Ku80 forment l’hétérodimère Ku qui recrute la DNA-PK et active le

complexe du même nom lors de l’activation de la voie de réparation non-homologue (NHEJ)

des cassures double-brins de l’ADN. De part ses capacités à fixer les acides nucléiques, Ku

est important dans un certain nombre d’autres processus nucléaires, dont le maintien des

télomères et la transcription (Gullo et al., 2006).

Récemment, deux analyses génomiques indépendantes par ARNi des gènes cellulaires

nécessaires à la réplication du VIH-1 ont identifié Ku comme cible cellulaire qui affecte la

multiplication du VIH-1 (Genovesio et al., 2011; Waninger et al., 2004), soulignant son

importance dans le cycle du VIH-1. En accord avec ces données, Ku agirait à différentes

étapes du cycle du VIH-1. Ku70 a été décrit interagir avec l’IN du VIH-1 (Studamire and

Goff, 2008) au sein du PIC (Li et al., 2001; Zheng et al., 2011), ce qui pourrait influencer les

étapes pré-intégratives. De plus, grâce à cette interaction, Ku70 pourrait être encapsidé au sein

des particules virales (Zheng et al., 2011). Ku serait également impliqué dans la

circularisation des espèces d’ADNv à 2-LTRs (Jeanson et al., 2002; Li et al., 2001; Masson et

134

al., 2007; Zheng et al., 2011). Ku a aussi été décrit participer au processus d’intégration du

VIH-1 après transduction de cellules humaines (Jeanson et al., 2002; Waninger et al., 2004;

Zheng et al., 2011). Enfin, l’action de Ku sur l’expression du VIH-1 pourrait être médiée par

la fixation de la KBS identifiée dans le LTR du VIH-1 (Jeanson and Mouscadet, 2002) et/ou

le ciblage/relocalisation du site d’intégration lentivirale en périphérie nucléaire au sein de

cellules de rongeurs (Masson et al., 2007).

Afin de clarifier le rôle du complexe Ku dans le cycle du VIH-1, nous avons réalisé

une étude de l’expression lentivirale au cours du temps à partir d’un set de vecteurs dérivés du

VIH-1 non-réplicatifs transduisant le transgène gfp sous le contrôle du promoteur du VIH-1

(LTRs natifs) ou hétérologue (i.e., d’origine virale, le CMV ou humaine, le PGK). Etant

donné le caractère essentiel de Ku à la survie des cellules humaines (Wang et al., 2009), nous

avons utilisé le modèle cellulaire humain HCT 116 issu d’un carcinome colorectal stablement

haplodéplété en Ku80. Ce modèle a été obtenu par inactivation ciblée du locus XRCC5 (Li et

al., 2002) et est l’un des seuls modèles de déplétion en Ku à être caractérisé

phénotypiquement (Ghosh et al., 2007; Li et al., 2002). Les cellules HCT 116 Ku80+/-

ont

notamment un niveau élevé en p53 (TP53) WT (wild-type) (comparés aux cellules WT)

(Ghosh et al., 2007; Li et al., 2002), protéine clé dans la réponse aux dommages de l’ADN qui

est non-fonctionnelle dans les autres lignées cellulaires utilisées pour l’étude du VIH-1. Ce

modèle a aussi l’avantage de nous affranchir d’une approche ARNi qui peut être non-

spécifique, abolie lors d’une infection par le VIH-1 (Bennasser et al., 2005; Bennasser et al.,

2006; Qian et al., 2009) et/ou d’une sur-expression de sh/siRNA (Grimm et al., 2006).

Cette étude nous a permis de démontrer que le statut en Ku joue un rôle double en

réponse à la transduction par le VIH-1 dans les cellules HCT 116, en stimulant

spécifiquement la transcription précoce du LTR du VIH-1 et en limitant la quantité de cellules

contenant un provirus latent. La déplétion en Ku n’a pas d’impact sur les étapes pré-

intégratives du VIH-1 mais diminue l’expression précoce du VIH-1, en agissant au niveau

transcriptionnel. De plus, cet effet peut être partiellement aboli lors de la déplétion en p53 des

cellules HCT 116 Ku80+/-

qui rétablit un niveau de Ku proche à celui des cellules WT. Enfin,

nous avons mis en évidence que la déplétion en Ku augmente la proportion de cellules

contenant un provirus peu ou pas exprimé ainsi que la (re-)activation de l’expression virale

observée après traitement par la TSA ou au TNFα. Notre étude souligne ainsi les

conséquences potentielles du ciblage de protéines cellulaires impliquées dans la régulation de

l’expression du VIH-1 sur la constitution de cellules réservoirs contenant un provirus latent.

135

B/ ARTICLE : ‘IMPACT OF THE KU COMPLEX ON HIV-1 EXPRESSION AND

CONSEQUENCE OF ITS DEPLETION IN THE ESTABLISHMENT OF VIRAL LATENCY’

(SOUMIS AU JOURNAL RETROVIROLOGY)

Impact of the Ku complex on HIV-1 expression and consequence of its

depletion in the establishment of viral latency

Gwenola Manic1,

*, Aurélie Maurin-Marlin1,

*, Fanny Laurent1, Ilio Vitale

2,3, Sylvain Thierry

1,

Philippe Dessen2,4

, Michèle Vincendeau5, Christine Leib-Mösch

5,6, Uriel Hazan

1, Jean-

François Mouscadet1,#

, Stéphanie Bury-Moné1,§

1LBPA, CNRS, Ecole Normale Supérieure de Cachan, FR-94230 Cachan, France;

2Institut Gustave Roussy, FR-

94800 Villejuif, France; 3INSERM, U848, FR-94800 Villejuif, France;

4INSERM, U985, FR-94800 Villejuif,

France; 5Institute of Virology, Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental

Health, DE-85764 Neuherberg, Germany; 6Department of Hematology and Oncology, Mannheim Medical

Center, University of Heidelberg, DE-68135 Mannheim, Germany. *These authors contributed equally to the

work.

Abstract

Background : Ku, a cellular complex required for human cell survival and involved in double

strand break (DSB) DNA repair and multiple other cellular processes, may modulate

retroviral multiplication, although the precise mechanism through which it acts is still

controversial. Recently, two global approaches identified Ku as a possible anti-human

immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) target in human cells. Here we investigated the role

of Ku on HIV-1 replication cycle by analyzing the expression level of a panel of non-

replicative lentiviral vectors expressing the green fluorescent protein (gfp) on human

colorectal carcinoma HCT 116 cells, stably or transiently depleted from Ku.

Results : We found that the depletion of Ku did not affect the efficiency of pre-integrative

steps but decreased the early HIV-1 expression by acting at the transcriptional level. This

negative effect was specific for the HIV-1 promoter, required the obligatory step of viral

DNA integration and was reversed by the partial restoration of Ku by means of p53 transient

depletion. In presence of a normal level of Ku, HIV-1 expression was gradually lost over

time, likely due to the counter-selection of HIV-1-expressing cells. On the contrary, the

reactivation of transgene expression from HIV-1 by means of trichostatin A (TSA) or tumor

necrosis factor (TNF administration, was enhanced in condition of Ku depletion,

suggesting a phenomenon of provirus latency.

Conclusions : These observations pleased to favor the hypothesis that Ku has an impact on

HIV-1 expression at short- and middle-time after integration, as its depletion reduces the level

of early transgene expression from HIV-1 promoter, decreases the counter-selection of HIV-

1-expressing cells over the time and promotes the establishment of a viral latency.

136

Background

The signals triggered by retroviral infection have been shown to promote either the

survival [1-4] or the death [5] of the infected cell, and this depending on their nature and

intensity.

The components of the machinery responsible for DNA repair in host cells seem to

play a critical role in the interactions with retroviruses, thus potentially influencing the

outcome of viral infections (for a more detailed description, refer to [6, 7]). Indeed, the DNA

damage response pathways are stimulated in the initial steps of retroviral infection - and in

particular during virus integration in host genome - of multiple retrovirus [7, 8]. For instance,

the activation and/or the recruitment to viral DNA (vDNA) of the kinases ataxia telangiectasia

mutated (ATM) [3 , 4] and ATM-and Rad3-related (ATR) [9] have been observed following

infection by the lentiviral (LV) human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). In addition,

either avian sarcoma virus (ASV) or HIV-1 infections induced the generation of

phosphorylated H2AX (γ-H2AX) foci in host cells [10, 11]. DNA repair response signaling in

HIV-1-infected cells may be triggered by distinct signals, including viral proteins, (e.g., Vpr

[5]), viral genomes presented in a linear unintegrated form [2] and DNA lesions generated by

the vDNA integration [1, 12].

So, it appears that the DNA repair machinery is necessary to complete viral integration

[8], but may also constitute one among the first lines of defense against viral infection put in

place by the cell [13].

Indeed, DNA repair proteins could also directly interfere with HIV-1 cycle, namely by

influencing the stability of vDNA [e.g., XPB/XPD [14]], the integration of the virus [e.g.,

RAD51 [15]] and/or the expression of viral genes [e.g., DNA-dependant protein kinase

(DNA-PK) [16]]. As a consequence, retroviral replication in host cells may be either

stimulated or inhibited. Nevertheless, for some among these proteins, the results present in

literature are sometimes controversial. For instance, in two previous studies performed by our

and another group, the Ku complex (also known as Ku) has been reported to affect proviral

gene expression in a negative [17, 18] or a positive [19] fashion, respectively.

Ku is a heterodimer complex composed by two DNA-binding subunits, Ku70 and

Ku80 (official gene names xrcc6 and xrcc5, respectively). In presence of double strand-breaks

(DSBs), Ku recruits the kinase subunit DNA-PKcs to generate the DNA-PK complex, which

is involved in the non-homologous end-joining (NHEJ) pathway of DSB repair [20]. Ku also

137

contributes to additional nuclear processes, including the maintenance of telomere, VDJ

recombination, and transcription (for a comprehensive description on Ku roles, see [21]).

Recently, two independent genome-wide screens assays identified Ku complex as a

target against HIV-1 replication, thus underlining a potential role of this complex on HIV-1

cycle [19, 22]. Accordingly, several studies reported that Ku might act at different stages of

the HIV-1 cycle. For instance, we and others previously demonstrated that Ku had a role in

the formation of 2-LTR circular forms in human and rodent cells [2, 18, 23, 24]. Moreover,

Ku might be involved in provirus integration in human cells [19, 23, 24]. However, in contrast

with these findings, a dispensable function of Ku and/or the DNA PK complex in HIV-1

integration into human [25, 26], horse [26] and rodent [2, 18, 26, 27] cells have been also

described. In addition, Ku was shown to interact directly with the HIV-1 integrase (IN), thus

potentially influencing the pre-integrative steps [2, 24, 28 ]. Finally, we recently described

that the Ku level may modulate provirus localization in chinese hamster ovary (CHO) cells

[18]. Nevertheless, the precise impact of Ku on both HIV-1 integration and HIV-1 expression

remains unclear and needs further examinations.

To gain insights on Ku functions on LV cycle, we performed a systematic analysis on

viral expression from a collection of defective LV vectors transducing the green fluorescent

protein (gfp) transgene under the control of viral or cellular promoters. As Ku is essential for

human cell survival [29], the studies were carried out in Ku80+/-

human colorectal carcinoma

HCT 116 cells that have previously been subjected to targeted disruption of the ku80 locus

[30]. The results have been confirmed by parallel studies on HCT 116 cells transiently

depleted from Ku70 or Ku80 through RNA interference approaches.

With this strategy, we demonstrated that Ku played a dual function in response to

HIV-1 infection, namely to promote the early transcription from the HIV-1 promoter and to

limit the constitution of viral latency. Ku depletion had no impact on the pre-integrative steps,

but rather decreased HIV-1 expression by acting at the transcriptional level. Accordingly, p53

knockdown in Ku80-haplodepleted cells enhanced both Ku protein levels and HIV-1

expression. Finally, we showed that the depletion of Ku limited the counter-selection of HIV-

1-expressing cells over the time and favored the establishment of cells containing latent

viruses, which may be readily reactivated by the administration of the histone deacetylase

inhibitor trichostatine A (TSA) or the nuclear factor κB (NF-κB) activator tumor necrosis

factor (TNF .

138

Results

The level of Ku influences the efficiency of HIV-1 transduction

To investigate the effects of Ku on the HIV-1 replication cycle, we took advantage of

heterozygous Ku80+/-

human colon carcinoma HCT 116 cells [30]. These cells represent a

valid model for Ku depletion for at least two reasons: (i) they are characterized by an

expression of Ku80 (at both the mRNA and protein levels) that is half that of parental Ku80+/+

(wild type, WT) cells ([30] and Figure S1A, B) and (ii) as the binding to Ku80 stabilizes

Ku70, they also manifest a marked (approximately 50 %) depletion of Ku70 ([30] and Figure

S1B).

We first evaluated the effect of Ku depletion on HIV-1 transduction efficiency. For

this, WT and Ku80+/-

HCT 116 cells were transduced with XCD3 [an env-defective HIV-1

construct in which nef was replaced by a gfp transgene under the control of the native HIV-1

LTR and an internal ribosome binding site (IRES) (Figure 1A)] followed by the

cytofluorometry-mediated assessment of GFP expression 48 h later. When performing this

analysis at a low multiplicity of infection (m.o.i. of 0.3), we observed that the percentage of

GFP-positive (GFP+) cells among Ku80

+/- HCT 116 cells was approximately half that of their

WT counterparts (~15 % vs. ~30 %) (Figure 2A, B). Moreover, as compared to Ku80+/+

cells,

transduced Ku80+/-

HCT 116 cells displayed lower GFP expression levels, as monitored by

the geometric mean fluorescence intensity (MFI) (Figure 2C, D). At high m.o.i., the

percentage of GFP+ cells among the Ku80-haploinsufficient population was nearly equal to

that observed among WT cells, perhaps due to a phenomenon of saturation of the number of

cell expressing the transgene (Figure 2A, B). However, the difference in GFP expression

levels was conserved (Figure 2C, D), indicating that Ku depletion affected transgene

expression even at high m.o.i. XCD3 transduction had no significant effect on

proliferation/viability in either WT or Ku80+/-

HCT 116 cells, as evaluated by a colorimetric

assay performed 48 h after transduction (data not shown). This finding indicates that the

difference in GFP expression levels that we observed (Figure 2) cannot be ascribed to the loss

of transduced cells.

To confirm these results, we performed additional experiments in which WT and

Ku80+/-

HCT 116 cells were transiently depleted of Ku by means of transfection with small

interfering (si) RNAs directed against either Ku80 or Ku70 (Figure 3A). Seventy-two hours

after transfection, cells were transduced with XCD3 for additional 48 h, and then analyzed by

cytofluorometry for transgene expression. As shown in Figure 3B, the knockdown of Ku

139

significantly decreased HIV-1 expression levels in WT cells. Apparently, in Ku80+/-

HCT 116

cells transgene expression was not altered by the siRNAs further depleting Ku (Figure 3B),

suggesting that a ~50 % depletion of Ku was already sufficient to affect HIV-1 transcription.

Taken together, these observations demonstrate that either the prolonged (Figure 2) or

the transient (Figure 3) depletion of Ku negatively affects GFP expression from the HIV-1

promoter.

Ku and p53 may cooperate for the modulation of HIV-1 expression

In accordance to what previously reported by [30, 31], we observed that the basal

levels of p53 were higher in Ku80-haploinsufficient cells than in their WT counterparts

(Figure 3C, Figure S1C). Intrigued by this finding, we thus decided to investigate the effects

of a p53 specific siRNA (Figure 3B, C).

First, we analyzed the effect of p53 knockdown on the levels of the Ku complex,

finding that p53 depletion in Ku80+/-

cells was associated with increased amounts of Ku70

(not shown) and Ku80 (Figure 3C). Indeed, in this condition, Ku80 reached level close to that

exhibited by WT HCT 116 cells (Figure 3C).

Strikingly, while the knockdown of p53 in WT HCT 116 cells was associated to a

decreased in transgene expression from XCD3, p53 depletion in Ku80+/-

HCT 116 cells

increased HIV-1 expression to a level that was intermediate between those observed in WT

and Ku80+/-

HCT 116 cells (Figure 3B). Although we could not exclude a direct role for p53

on HIV-1 expression, we speculated that this finding might be due to the increase in Ku

protein levels as observed in Ku80+/-

cells depleted of p53. To confirm this hypothesis, we

performed experiments in which we transiently or stably trans-complemented Ku in Ku80+/-

HCT 116 cells by means of Ku80-expressing plasmids or viral vectors (either alone or

combined with the fluorescent protein DsRed). Thereafter, the polyclonal cell population as

well as ~30 DsRed+ cell clones isolated by cytofluorometry-assisted sorting were assessed for

Ku protein levels. In addition, we took advantage of a commercially available Ku trans-

complemented Ku80+/-

HCT 116 clone (named pKu80 Ku80+/-

clone). In none of these

experiments, which we repeated at least 2 times yielding similar results, we observed

increased Ku expression upon trans-complementation (data not shown and Figure S2 for

pKu80 Ku80+/-

clone). This observation is in contrast with previous findings [31] and suggests

that Ku is tightly controlled in Ku80+/-

HCT 116 cells, perhaps by a mechanism directly

140

controlling protein levels or negatively affecting the survival/proliferation of cells expressing

excessive amounts of Ku.

In conclusion, we provided experimental evidences on a process linking in a tight

fashion the expression levels of Ku and p53 that may be relevant for HIV-1 expression.

Ku depletion negatively affects the HIV-1 expression via a transcriptional mechanism

For elucidating the impact of the Ku complex on the pre-integrative steps of the HIV-1

cycle, we quantified by quantitative PCR (Q-PCR) all vDNA species - namely, total vDNA,

2-LTR circular viral forms, and integrated proviral DNA - in human colon carcinoma (WT

and Ku80+/-

HCT 116) and in T lymphoid leukemia (Jurkat and CEM-T4) cells previously

transduced with XCD3.

As determined in parallel cytofluorometric assessments, the early GFP expression was

similar in WT HCT 116, Jurkat and CEM-T4 cells, being in all cases higher than in Ku80+/-

HCT 116 cells (Figure 4A). In line with previous results [32], transgene expression rapidly

decreased over time, in all analyzed cell lines (Figure 4A). As demonstrated by Q-PCR

analyses, XCD3 efficiently integrated in the genome of both Ku80+/+

and Ku80+/-

HCT 116

cells. Indeed, ~50 % of total vDNA was integrated in the cellular genome 24 h post-

transduction (Figure 4B), a percentage that is consistent with previous reports [33]. Similar

levels of vDNA integration were also observed in both CEM-T4 and Jurkat cells (Figure 4B).

In our hands, the decrease in integrated or total vDNA was more rapid in HCT 116 and CEM-

T4 cells than in Jurkat cells (Figure 4C). Moreover, both the levels of integrated DNA and

the proportion of vDNA present as 2-LTR circular forms at an early time (from 2 to 72 h)

following XCD3 transduction were similar in Ku80+/+

and Ku80+/-

HCT 116 cells (Figure 4C,

D). Intriguingly, the quantity of total and integrated vDNA per cell 10 days after transduction

was higher in Ku80+/-

HCT 116 cells than in their parental WT counterparts (Figure 4B).

These results demonstrate that the depletion of Ku affects neither the capacity of the

vDNA to form 2-LTR circles nor that to integrate in the cellular genome.

Importantly, lower levels of GFP-encoding mRNAs were detected in Ku80+/-

HCT

116 cells 2 days after transduction, than in their WT counterparts (Figure S3). Indeed, in two

distinct experiments, the quantitative difference between GFP-encoding mRNAs detected in

Ku80+/+

vs. Ku80+/-

correlated with that observed in GFP expression levels (Figure S3).

Altogether, these results indicate that Ku depletion has no impact on the HIV-1

integration step but rather affects HIV-1 expression at the transcriptional level.

141

HIV-1-driven expression is stimulated by Ku status

Given that Ku has been implicated in the transcriptional regulation of various genes

(e.g., IL2 [34]), we wondered whether this complex also controls transcription from the HIV-1

promoter, which directs transgene expression.

For this, we conducted transduction experiments with LV vectors in which gfp was

placed under the control of the cytomegalovirus immediate early (CMV) (i.e., the HR’-CMV

vector, Figure 1B) or the human phosphoglycerate kinase (PGK) internal promoter [i.e., the

self-inactivating (SIN)-PGK vector, Figure 1C]. As opposed to what observed for XCD3

(harboring the HIV-1 promoter, Figure 1A), the percentage of GFP+ cells after transduction

with SIN-PGK or HR’-CMV at an m.o.i. of 0.1 was comparable in WT and Ku80+/-

HCT 116

cell lines (Figure 5A), and this independently from the m.o.i. used (data not shown). So, Ku

appeared to have no significant impact on the GFP expression of SIN-PGK and HR’-CMV

LV vectors, pointing to a specific role for Ku related to the HIV-1 promoter.

We then evaluated the impact of HIV-1 accessory proteins on this phenomenon. To

this aim, we took advantage of XCD24, a vector containing the gfp under the control of HIV-

1 promoter and deleted from all HIV-1 coding sequences (Figure 1D). Consistent with our

observations on XCD3, GFP expression from XCD24 was reduced in Ku-depleted cells as

compared to their WT counterparts, at different m.o.i. (Figure 5A). Similar results were

obtained with an XCD3 variant lacking Vpr (Figure S4A, B), de facto excluding that HIV-1

accessory proteins are required for the effects of Ku on HIV-1 expression. Vpr is reported to

induce the G2/M arrest of cells infected by HIV-1 [9]. Nevertheless, the cytofluorometry-

assisted cell cycle distribution analyses on cells stained with the DNA dye propidium iodure

(PI) put in evidence no significant difference between the cell cycle profiles of WT and

Ku80+/-

cell or transduced with XCD3 or XCD3 lacking Vpr (data not shown). Of note, these

cell lines displayed a similar cell cycle profile also in control conditions (Figure S1D).

To rule out the possible contribution of Tat proteins coming from packaging cells, we

employed a XCD24 variant carrying the C37T mutation in the transactivation-responsive

(TAR) element [XCD24 TAR(C37T), Figure 1D], which affects Tat responsiveness [35].

Both WT and Ku80+/-

HCT 116 cells were less efficiently transduced by this vector, as

compared to XCD3 (Figure 5A), owing to a defective virus production (for more details refer

to [35]). Nonetheless, this decrease was more pronounced in Ku80+/-

cells than in their WT

counterparts, confirming that the effect of Ku on the expression of the HIV-1-based constructs

is independent from Tat. Similar results were also recorded with the XCD24 Sc-216-196

vector,

carrying a scrambled sequence in place of a previously identified Ku-binding sequence

142

(KBS), extending from nucleotides -216 to -196 in the U3 LTR [17] (Figure 1D), suggesting

that Ku influenced transgene expression without binding the putative KBS (Figure 5A).

Altogether, these findings indicate that the effect of Ku on HIV-1 expression is

specific for the HIV-1 promoter, is abolished by the presence of an internal heterologous

promoter (e.g., PGK or CMV), is independent from Tat and does not require Ku to bind the

HIV-1 KBS-216-196

sequence.

Ku specifically modulates the expression from exogenous and integrated viral DNA

The re-expression of silent retroviral sequences in the human genome has been

reported during oncogenesis as well as upon UVB-irradiation, two conditions that activate the

DNA damage response [36, 37]. As HIV-1-driven transcription appeared to be modulated by

the Ku level, we investigated whether Ku would exert a similar effect on the expression of

human endogenous retroviruses (HERV). To this aim, we performed a comprehensive

microarray-based analysis of the transcriptional activity of HERVs in WT and Ku80+/-

HCT

116 cells (Figure S5, Table S1), as previously described [38]. Only 4 HERV taxons (HML-1,

HML-3, HML-5 and HML-9) among 57 (24 groups of HERVs related to β-retrovirus, γ-

retroviruses and spumaviruses) probed by RetroArrays exhibited a small but significant

variation of expression in WT vs. Ku80-haplodeficient cells (non parametric p value < 0.01,

intensity threshold fixed at ± 30 % of variation between the two cell lines, Table S1; for more

details, see also Methods). However, subsequent RT-Q-PCR experiments performed for the

HERV groups exhibiting the most robust difference (namely, HML-1 and HML-5) did not

confirm this result, which is probably due to a limited sensibility of the RetroArrays and the

fact that the primers used for RT-Q-PCR do not match exactly the same subset of HERV

sequences as the capture probes spotted on the RetroArrays [38] (Table S1).

Irrespective to this discrepancy, our results suggest that the Ku level has a mild (if

any) impact on HERV expression in HCT 116 cells, further confirming that Ku specifically

influences HIV-1 expression.

To corroborate once more this issue, we assessed transgene expression in WT and

Ku80+/-

HCT 116 cancer cells upon transient transfection with pSIN-PGK, pHR’-CMV,

pXCD3 or pXCD24 shuttle plasmids. We observed that the percentages of GFP+ cells were

similar between the two cell lines (data not shown), while the MFI of GFP were even higher

in Ku80+/-

than in WT HCT 116 cells (Figure 5B). This result is apparently at odds to what

we observed with viral transduction (Figure 2) yet is consistent with similar findings obtained

in a rodent model of Ku depletion [17, 18]. This finding suggests that Ku modulation of HIV-

143

1 expression needs viral integration. In line with this hypothesis, Ku had no effect on the basal

levels of transgene expression from unintegrated vDNA forms in cells transduced with XCD3

harboring the IN D116A mutation [XCD3 IN(D116A)] (Figure 1A, Figure 5C).

In conclusion, the Ku complex appears to specifically promote the expression of the

integrated form of the HIV-1 genome.

The reactivation of latent HIV-1 is favored in Ku80-haplodepleted cells

Finally, we monitored the role of Ku in the events that are associated with the

establishment of the provirus latency and with the reactivation of latent proviruses.

To address this issue, transgene expression was evaluated in WT and Ku80+/-

HCT 116

cells upon transduction with XCD3 followed by exposure to either the TNF (which

promotes HIV-1 LTR-driven transcription by activating the transcription factor NF-κB [39]),

or the histone deacetylase inhibitor TSA (which stimulates transgene expression by promoting

histone acetylation [40]) (Figure 6A). This approach represents a standard experimental

procedure for monitoring viral latency and reactivation [32, 41].

As expected, the administration of TNF or TSA to both WT and Ku80+/-

HCT 116

cells transduced 9 days earlier with XCD3 induced a significant increase in GFP expression

(Figure 6A, B). However, even in response to TNF or TSA, the percentage of GFP+ cells

and the GFP MFI were higher in Ku80+/-

than in WT cells (Figure 6B). Similar results were

observed with an alternative strategy, in which WT and Ku80+/-

HCT 116 cells were

transduced with XCD3 at low or middle m.o.i. (< 0.6), and treated one day later with TSA for

additional 24 h (Figure 6A). Indeed, TSA increased GFP expression in WT and Ku80+/-

HCT

116 cells, de facto cancelling the difference between these two cell lines in this respect

(Figure 6C).

This observation suggests that a pool of TSA-responsive GFP- cells is present at early

and middle time upon XCD3 transduction in both cell lines and that this fraction of cells

harboring a silent provirus in a reactivable state is higher after the depletion of Ku.

In line with this hypothesis, the Ku level altered neither the kinetic of transgene

extinction nor the percentage of GFP reactivation in GFP-positive HCT 116 cells isolated 2

days after transduction and incubated or not for 24 h with TSA 2 or 4 weeks later (Figure S6).

To give further confirmation to our hypothesis, we repeated the same experiments by

using the Tat-deficient vector XCD24, a condition that reportedly induces virus pseudo-

latency [42]. Transgene expression from the XCD24 vector was subjected to a dramatic

increase by TNFα and TSA in both WT and Ku80+/-

HCT 116 cells (Figure 6D). However,

144

the depletion of Ku favored transgene re-expression from this vector. Indeed, the ratio

between the percentage of GFP+ cells in presence or in absence of TSA or TNFα 10 days after

transduction with XCD24 was almost 1.5 fold higher in Ku-depleted than in WT cells, a value

that was similar to that observed for XCD3 (Figure 6E). Of note, as opposed to what

observed for XCD3, WT and Ku80+/-

cells transduced with XCD24 (Figure 6D) or with the

Vpr- XCD3 vector (Figure S4A, C) failed to exhibit or presented a limited decrease in

transgene expression over time. Hence, it appears that the decrease in transgene expression

from XCD3 may be due to the potential cytostatic and/or cytotoxic effects of HIV-1 accessory

proteins [e.g., Vpr, as described in [5]], which may promote the counter-selection/elimination

of cells expressing the integrated virus. As expected, the administration of reactivating agents

did not modify transgene expression from SIN-PGK in both WT and Ku80-haplodeficient

cells (Figure 6D, E). Of note, the percentage of GFP expression from this latter vector was

stable over the time (Figure 6D).

Altogether, these results suggest that the depletion of Ku, which has a negative impact

on early HIV-1-driven transgene expression, may favor the establishment of a pool of cells

bearing an integrated, latent and readily re-activable provirus.

Discussion

Ku depletion decreases HIV-1 expression

Here, we investigated the impact of Ku on LV cycle by transducing distinct non-

replicative LV vectors encoding for the gfp transgene. We put in evidence a two-fold

reduction of early (48/72 h) HIV-1 expression in human Ku80-haplodeficent HCT 116 colon

carcinoma cells as compared to their Ku80-proficient counterparts (Figure 2). Similar results

were obtained on WT HCT 116 cells transfected with Ku70- or Ku80-depleting siRNAs

(Figure 3B). Although the positive effect of Ku on GFP expression from HIV-1 required the

obligatory step of vDNA integration in host genome (Figure 5C), Ku had no impact in HIV-1

pre-integrative stages. This finding was demonstrated by comparing the capacity to form 2-

LTR circles and the integration efficiency of either WT vs. Ku80-haplodepleted HCT 116

(Figure 4B, D) cells or WT HCT 116 cells transfected with an unrelated vs. a Ku80- or a

Ku70-directed siRNAs (data not shown). Accordingly, GFP expression from HIV-1-based

vectors containing an internal promoter (e.g., HR’-CMV and SIN-PGK) were as efficient in

WT as in Ku80+/-

HCT 116 cells (Figure 5A).

As detailed in the introduction section, the impact of Ku complex in provirus

integration is debated. This controversy may be due to the intrinsic differences in the cellular

145

model, which may display a variable requirement of DNA damage signaling pathways during

retroviral infection, as well as to the characteristic of the virus (i.e., replicative vs. non-

replicative form). Moreover, our findings seem to exclude, at least in this experimental model,

a role not only for the endogenous but also for the exogenous Ku in pre-integrative steps of

LV replication cycle. Indeed, the level of HIV-1 expression in HCT 116 cells was similar

when these cells were transduction with HIV-1 vectors produced in human embryonic kidney

(HEK) 293T cells transiently depleted or not from Ku (data not shown).

We found that, in Ku80+/-

HCT 116 cells transduced with the HIV-1 vector XCD3, the

decrease in transgene expression was correlated to a reduced level of gfp mRNA as compared

to their WT counterparts (Figure 2, Figure S2), suggesting that Ku rather acts at a

transcriptional level. Reportedly, Ku displayed both a positive and a negative impact on the

transcription of multiple genes, and this through the direct interaction with their promoters

[e.g., [34, 43]]. Concerning HIV-1 expression, previous reports ascribed opposite effects to

Ku. In one study, we showed that Ku negatively affect HIV-1 re-expression in human

promonocytic CD4+ U1 cells pseudo-latently infected with a mutated form of HIV-1 [17]. We

hypothesized that this impact could be due to the binding of Ku80 to a putative KBS element

in the HIV-1 promoter that we identified [17]. In striking opposition to this observation, the

silencing of Ku70 impaired HIV-1 replication in different human cell lines including cervical

carcinoma HeLa cells and Jurkat cells [19, 22] Accordingly, Waninger and colleagues

reported a negative effect of Ku80 depletion on HIV-1 expression on HeLa and CEM cells

[19]. This latter impact was explained by a low level of de novo Tat synthesis in Ku80+/-

cells,

resulting in the decrease of Tat trans-activation of HIV-1 LTR. Finally, Ku has been reported

to bind the TAR RNA sequence of HIV-1 [44].

Here, we demonstrated that Ku has a positive effect on HIV-1 short-term expression in

HCT 116 cells that was (i) specific to the HIV-1 promoter (Figure 5A, Figure S5); (ii)

independent from HIV-1 accessory proteins (Figure 5A, Figure S4); and (iii) not correlated

to the binding to the putative KBS of HIV-1, as proven by the low transgene expression from

XCD24 Sc-216-196

in Ku80-haplodepleted cells as compared to their WT counterparts (Figure

5A). Importantly, as GFP expression from XCD24 TAR(C37T) was also affected by Ku

depletion, we ruled out that the impact of Ku depended on Tat as it was previously suggested

[19].

Although to date the exact contribution of Ku to HIV-1 expression is not precisely

known, we propose two alternative and non-mutually exclusive hypotheses. Theoretically, Ku

may promote the early transcription from the LTR by (contributing to the) targeting of the

146

virus to specific host chromatin region characterized by high level of transcription.

Alternatively, as Ku80 interacts with multiple proteins that are positively implicated in HIV-1

transcription - including Sp1, RNA polymerase II, NF- B, Ets-1 and DNA-PK [16, 45-48] - it

may participate to the establishment of a local environment favorable for the early

transcription from the LTR. The obligatory requirement of virus integration shown in this

study may corroborate this hypothesis. Nevertheless, so far, distinct - and a more direct - role

of Ku on HIV-1 expression could not be excluded. Further analyses are needed in order to

elucidate this issue.

Cross-regulation between Ku and p53

We also put in evidence a cross-regulation between the expression levels of Ku and

p53, a finding that prompt us for hypothesizing the existence of an unknown compensatory

mechanism that increases the level of one protein when the other is low expressed (Figure

3C). These observations confirm the complex and mutual regulation between Ku80 and p53

anticipated by [31]. Previous studies reported that either human Ku80+/-

or murine Ku80-/-

cells display a high level of spontaneous DNA lesions and/or DNA damage response [30, 31,

49]. So, an appealing hypothesis would be that this mechanism could participate to limit the

potential deleterious effets due to this endogenous DNA damages [30, 31].

Intriguingly, here, HIV-1 expression appeared to be affected by this Ku80/p53

interlinked control (Figure 3B). These preliminary results, which may suggest both a direct

(e.g., by acting on HIV-1-LTR) or indirect (e.g., by modulating the expression of Ku)

contribution of p53 in the regulation of HIV-1 transcription, need further investigations.

Nevertheless, these findings point to the evidence that both DNA repair machinery and p53

level may influence HIV-1-driven expression, an observation that has to be taken into account

for the choice of election of the cellular model used in the study of HIV-1 cycle. As exemples,

p53 is mutated in CEM, Jurkat and U1 cell lines (database: http://www-p53.iarc.fr) and p53

functions are altered by the human papillomavirus E6 protein in HeLa cells [50] or by the

human T leukemia virus type I (HTLV-I) Tax protein in C8166 cells [24]. So, given that the

human HCT 116 cells express a wild-type p53, and that the complete absence of Ku is lethal

in human, Ku80+/-

HCT 116 cells represent a suitable model to evaluate Ku functions on HIV-

1 cycle.

Ku depletion promotes viral latency

Finally, we demonstrated that Ku might promote viral latency. Indeed, the depletion of

Ku negatively affected early transgene expression (Figure 2, Figure 5), did not influence the

147

kinetic of transgene extinction (Figure S6) but induced a marked reactivation of gfp

expression in presence of the reactivating agents TNFα and TSA (Figure 6). This latter effect

was observed either at early (2 days) or middle time (10 days) upon transduction, in

agreements with our previous observations made in Ku80-depleted U1 cells, a model of virus

pseudo-latency [17].

Driven by these observations, we propose the following model for describing the

action of Ku in response to HIV-1 transduction (Figure 7). When normally expressed in

target cells, Ku may favor the early HIV-1-driven transcription (2 days post-transduction) by

direct and/or indirect interactions with the provirus (promoter). This positive effect is

associated to the limitation of viral latency and is followed by the decrease in transgene

expression occurring at middle time (10 days) post-transduction and mainly due to the

counter-selection of transduced cells (Figure 7A). Conversely, in absence of Ku, the HIV-1-

driven transcription is negatively affected at early time upon transduction, when a higher

proportion of cells harbors silenced or poorly expressed proviruses (Figure 7B). However,

these cells with an integrated provirus are less subjected to counter-selection over time and

display an elevated capacity to be reactivated by TNFα or TSA administration (Figures 7B).

Conclusions

The present study demonstrates that the efficiency of HIV-1 transduction and

expression in host human cells are affected by multiple parameters, including the design of

vector, the genetic/phenotypic background of target cells and the time elapsed from cell

transduction. In particular, among the DNA repair factors that have been proposed as

promising targets for antiretroviral therapy [51], here, we found that Ku had roles to sustain

HIV-1 expression at the transcriptional level after proviral integration and to prevent provirus

latency. The precise mechanisms by which Ku acts are of great interest and need further

investigations.

Methods

Plasmids and vectors. The genetic organization of the LV vectors is presented in Figure 1.

RRLSIN.cPPT.hPGK-gfp (shortened to “SIN-PGK”, with a supplementary “p” for the plasmid form) is a SIN-

LV vector containing the enhanced gfp gene under the control of the human PGK internal promoter. SIN-PGK

was modified from a previously described vector [52] (gift from the University of Turin Medical School, Italy)

by deletion of the woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element (WPRE). pXCD3 is derived from

pNL4.3 containing the HIV-1 genome (GenBank: AF324493.1) into which the NheI-BsaBI region of the env

gene was deleted and the HpaI-XhoI fragment (corresponding to the nef gene) was replaced by the compatible

148

IRES-humanized Renilla GFP (hrGFP) fragment from the pIRES-hrGFP 1a plasmid (Clontech Laboratories,

Inc., Mountain View, CA, US). pXCD3 IN(D116A) is an integrase-defective version of pXCD3 encoding a

mutated (D116A) integrase. This mutation was introduced into pXCD3 by directed PCR mutagenesis made by

using the QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, US)

according to manufacturer's indications and with OBM156/OBM157 primers (Table S2). HR’-CMV-gfp

(shortened to “HR’-CMV”) is a LV vector containing the gfp gene under the control of both the CMV and U3

LTR promoters [53]. pXCD24 was derived from pHR’-CMV by deleting the ClaI-BamHI fragment

corresponding to the CMV promoter. The pXCD24 TAR(C37T) construct was generated by replacing the

original KpnI-XbaI 3’LTR fragment of pXCD24 by a TAR(C37T) mutated version. This latter was obtained

after insertion of the original KpnI-XbaI 3’LTR fragment into the pGem-T-easy vector (Promega Corporation,

Madison, WI, US) and directed mutagenesis (as described above) with the OBM200/OBM201 primers (Table

S2). The pXCD24 Sc-216-196

construct was obtained by replacing the putative KBS

(CGGAGAGAGAAGTATTAGAGT) located between -216 and -196 nucleotides of the KpnI-XbaI U3 3’ LTR

region of pXCD24 by a scrambled sequence (ACTCTCCTAGGTCTACTTGAC). This latter was generated after

insertion of the KpnI-XbaI 3’LTR region of pXCD24 into the pGem-T-easy vector (Promega) followed by fusion

PCR. In this aim, two separate PCR were performed on pXCD24 by using the OBM101/OBM102 primers

(Table S2) for the first PCR, and the OBM103/OBM104 primers (Table S2) for the second one following the

manufacturer’s recommendations for Taq Platinium High Fidelity amplification reactions (Invitrogen, Life

Technologies Co., Grand Island, NY, US). Then, 1/50 of each PCR products were mixed to perform a third PCR

without primers for the 10 first cycles (98°C for 10s/45°C for 10s/72°C for 30s), and with the

OBM101/OBM104 primers (Table S2) for the 20 last amplification cycles (98°C for 10 s/60°C for 10 s/72°C for

30 s). The resulting PCR product was inserted into the pGem-T-easy vector (Promega) according to the

manufacturer’s recommendations, thereby generating the KpnI-XbaI 3’LTR mutated fragment containing the

scrambled sequence. The KpnI-XbaI 3’LTR mutated fragment containing the scrambled sequence in place of the

putative KBS was reintroduced into pXCD24 to replace the original KpnI-XbaI region, thereby generating the

pXCD24 Sc-216-196

construct. All constructs were maintained and stored in the Sure2 E. coli host strain (Agilent

Technologies).

LV vectors (except XCD3 and its derivatives) were produced with the psPAX2 or the pCMV-R8.74 packaging

plasmid (kindly given by Didier Trono’s laboratory, Lausanne, Switzerland - Addgene plasmids 12260 and

22036) encoding HIV-1 Gag-Pol, Tat and Rev proteins. All vectors were pseudotyped with the vesicular

stomatitis virus envelope glycoprotein (VSV-G) encoded by pMD.G [54].

Cell culture and treatment. Wild type and Ku80+/-

70.32 human colorectal carcinoma epithelial HCT 116 cells

(kindly provided by Dr E. A. Hendrickson) [30] were maintained in McCoy’s 5A medium. Ku80+/-

HCT 116

derivatives containing either a neomycin (Neo) or a hygromycin-Ku80 expression pcDNA3.1 plasmid (named

A6 clone) (shortened as ‘pCtl’ and ‘pKu80’, respectively) were obtained from Horizon Discovery Ltd

(Cambridge, UK) and maintained in McCoy’s 5A medium (under a 10 µg/ml hygromycin selection for pKu80

Ku80+/-

HCT 116 cells). HEK 293T cells were maintained in Dulbecco’s modified Eagle medium. Human T

CD4+ lymphoid leukemia Jurkat cells [55] and human T CD4

+ lymphoblastoid leukemia CEM-T4 cells (a

naturally isolated subclone of the CEM line which displays high levels of surface CD4 expression; obtained

through the AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, National Institute of Allergy

149

and Infectious Diseases, National Institutes of Health, from J.P. Jacobs) [56] were cultured in RPMI 1640. All

media were supplemented with 10 % fetal bovine serum (FBS; PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria) and

1 % penicillin/streptomycin (p/s; 100 units/mL). All cell lines used in this study were incubated at 37°C, under

an atmosphere containing 5 % CO2. Unless otherwise indicated, media and supplements for cell culture were

purchased from Gibco (Life technologies) and plastic ware was obtained from BD Falcon (BD Biosciences,

Franklin Lakes, NJ, US).

Vector production. LV vectors were produced by calcium phosphate-mediated transfection of 293T cells as

previously described [57, 58] with the following modifications. Briefly, cells were transfected by a mixture of

plasmids constitued of 6 µg of shuttle vector plasmid, 2 µg of envelop plasmid (pMD.G) and 4 µg of packaging

plasmid (psPAX2 or pCMV-R8.74, except for XCD3 production). After supernatant harvesting and

ultracentrifugation, vector pellets were finally resuspended in PBS (Gibco) at a final concentration of 200 (as

compared to the initial uncentrifuged supernatant), and aliquots were stored at -80°C.

Plasmid transfection and RNA interference. For plasmid transfection, WT and Ku80+/-

HCT 116 cells were

seeded in 12-well plates at a density of 105 cells per well the day before. Then, cells were transfected at 80 %

confluence with 1 µg of shuttle vector plasmids (pSIN-PGK, pHR’-CMV, pXCD3, or pXCD24), in triplicate for

each set of conditions, in 1.5 µl of Attracten® transfection reagent (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)

dissolved in a final volume of 80 µl of free-McCoy’s 5A as recommended by the manufacturer. After

complexing time of 20 min at RT, transfection complexes were added to the cultures overnight. Transfection

efficiency was determined after 48 h by cytofluorometric analysis, as described below.

Custom-designed siRNAs duplexes (Table S2) targeting Ku80, Ku70, p53 encoding mRNA or a sequence

unrelated to human genome (Ctl) were purchased from Eurogentec (Eurogentec S.A., Seraing, Belgium). SiRNA

transfection was achieved by plating HCT 116 cells in 12-well plates at a density of 105 cells per well (30–40 %

confluence) at least 6 h before transfection using the HiPerFect® transfection reagent (QIAGEN) following the

manufacter’s recommendations. Briefly, 2.8 µl of HiPerFect® transfection reagent were added to 20 pmol of

each siRNA dissolved in 100 µl of free-McCoy’s 5A for a final concentration of 23.5 µM. After 10 min at RT,

transfection complexes were added to the cultures overnight. After 72 h, transfection efficiency was determined

by immunoblotting or transduced by vector, as described below.

Transduction procedure and analysis. The day before transduction, 105 cells per well were plated in triplicate

for each set of conditions, in 12-well plates. Problems due to differences in plating and cell growth between cell

lines were overcome by estimating the confluence of each cell line on the day of transduction and modifying the

volume of the viral suspension added, in accordance with this estimation. Two days after transduction, the

percentage and MFI of GFP+ cells were determined by flow cytometry analysis as described below. The m.o.i.

was calculated from the percentages of GFP+ cells observed during the linear phase of transduction of WT HCT

116 cells. Alternatively, cell viability was measured by a MTT assay. For experiments exploring the reactivation

of transgene expression in a mixed population of GFP- and GFP

+ cells, cells were transduced and maintained in a

25 cm² flask. One week after transduction, 105 cells per well were plated in duplicate for each set of conditions,

in 12-well plates. One day later, cells were treated for 24 h with 200 nM of TSA (Sigma-Aldrich Co., St Louis,

MO, US) or 10 ng/ml of TNF (BD Biosciences, San Jose, CA, US) before the analysis of transgene expression

by flow cytometry. DMSO was used as a negative control for TSA treatment. For experiments exploring the

reactivation of transgene expression in a pure population of transduced cells, GFP+ cells were sorted two or three

150

days after transduction at low m.o.i. (< 0.1). Cells were then cultured for six weeks and subjected every week to

a TSA treatment of 24 h before GFP expression analysis, as described above.

Cytofluorometric studies. To assess cell cycle distribution, cells were collected, fixed by gentle vortexing in

ice-cold 80 % (v/v) ethanol and stained with 50 mg/ml propidium iodide (Sigma-Aldrich) in 0.1 % (w/v) D-

glucose in PBS (Gibco) supplemented with 1 mg/ml (w/v) RNAse A (Sigma-Aldrich). The analysis of

transfection or transduction (i.e., percentage and MFI of GFP+ cells) was estimated by flow cytometry on a

FACSCaliburTM

cytofluorometer (BD Biosciences). Statistical analysis was carried out by using the

CellQuestTM software (BD Biosciences), upon gating on the events characterized by normal forward scatter and

side scatter parameters.

Immunoblotting. Cells were washed with ice-cold PBS, resuspended in 100 µL of Mammalian Lysis Buffer

from Qproteome Mammalian Protein Prep Kit (QIAGEN) and incubated on a rotary shaker for 5 min at 4°C.

Protein concentration in cellular extracts was determined using a standard bicinchoninic acid assay (Thermo

Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, US). Thereafter, protein extracts (50 µg per lane) were separated according

to their molecular weight on 12 % SDS-PAGE gels, followed by electrotransfer to nitrocellulose membranes

(Amersham Biosciences, GE Healthcare, Piscataway, NJ, US) and immunoblotting with specific antibodies for

Ku80, Ku70, p53 [all from Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, US; references (ref.) H-300, N3H10,

D0-1, respectively]. Primary antibody that specifically recognizes -actin (from Santa Cruz Biotechnology Inc.,

ref.I-19) was used as loading control. Finally, membranes were incubated with appropriate secondary antibodies

conjugated to the horseradish peroxidase (Santa Cruz Biotechnology), followed by chemiluminescence detection

using the ECL Western Blotting Detection Reagents and photographic films (both from GE Healthcare).

Quantification of viral DNA species. Two hours 8 h, 24 h, 72 h and 240 h after transduction, cells were

recollected, centrifuged at 270 g and washed once with PBS. Thereafter, genomic DNA (gDNA) samples were

prepared and quantitative PCR (Q-PCR) were performed as previously described [58]. Primers and probes

(Table S2) used for integrated vDNA nested PCR as well as LV total vDNA and 2-LTR amplification [carried

out on LightCycler 1.5 or II 480 (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)] have been described in [33]. The cell

equivalents in sample DNA as well as copy number of total vDNA and integrated vDNA were calculated as

previously described by [58]. Alternatively, copy number of 2-LTR circular vDNA forms were determined with

reference to102 to 10

6 copies of linearized pXCD3 plasmid or pGem-T-easy vector containing XCD3 2-LTR

sequence.

RetroArrays experiments and analysis. Total RNA from 4.106 cells was extracted with the RNAeasy Mini kit

(QIAGEN) and resuspended in 50 µl of diethylpyrocarbonate (DEPC)-treated water (Gibco). Genomic DNA

contamination was removed by treating 30 µg of all mRNA samples with 2 U of Turbo DNase I (Ambion, from

Life technologies) for 30 min at 37°C, according to the manufacturer’s instructions. RNA was repurified on

RNAeasy Mini kit columns (QIAGEN). The quantity and quality of the isolated RNA were determined by

analysis on gel (1 % TBE 0.5X) and with a Nanovue spectrophotometer (GE HealthCare). The absence of

genomic DNA was controlled by classic PCR on 50 ng of RNA with Taq Platinium enzyme (Invitrogen, from

Life technologies) and mixed oligonucleotide primers (MOP) [38] with the following amplification program :

94°C 2 min ; 30X (94°C 30S, 50°C 2 min, 72°C 2 min); 72°C 7 min. Reverse transcription of mRNA,

hybridization target synthesis and labeling MOP PCR as well as microarray preparation and hybridization and

151

post-processing of retrovirus-specific microarrays were performed as previously described [38]. Two

independent PCR labeling and microarrays experiments, with positive (mix of RNA) and negative (H2O)

controls, were performed for each sample. RetroArray contains 57 HERV groups, each in triplicate. Images

saved in the Bitmap file format were used to present the results by false color mapping. One result

(representative of the triplicate) has been aligned for each microarray and each condition (Figure S5). Images

saved in TIF file format were processed with ImaGeneTM

8.0 software tool package (BioDiscovery Inc., Los

Angeles, CA, US). Local background was subtracted, generating “Norm1” set of data. Data were then

normalized to the total fluorescence of each microarray (data “Norm2”). Ratios of mean intensity of each locus

in WT over Ku80+/-

HCT 116 condition were calculated, as well as p values associated to a two-paired Student’s

t test. Loci presenting a ratio superior or equal to 1.3 or inferior or equal to 0.7, and a p value inferior to 0.01 are

presented in Table S1. In a second step, the distribution of log-intensity microarray spots for each microarray

was used to normalize hybridization efficiencies of microarrays, bringing them all to an equivalent distribution

(data “Norm3”). Given the relatively low number of spots per microarray, the following analyses were

performed on “Norm1” and “Norm3” data. A statistical non parametric analysis in BRB (Biometric Research

Branch-ArrayTools, Dr. Richard Simon and BRB-ArrayTools Development Team) was conducted. The p value

was set to the robust value of 0.01 in order to highlight loci differentially expressed. Candidate genes for

differential expression between the conditions studied were selected from theses analyses (Table S1).

Quantitative RT-PCR. DNA-free RNA samples were prepared and RT-Q-PCR analyses were performed as

previously described [58]. The actin, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gapdh), hr-gfp, or xrcc5

genes or HERV loci were amplified by means of the corresponding primer pairs (Table S2), from 2 µl (between

10 and 20 ng) of complementary DNA in a final volume of 20 µl of LightCycler DNA Master SYBR Green I

mix, according to the manufacturer’s recommendations (Roche Diagnostics). For HERV loci expression

analysis, the amplification was: 95°C 10 min; 40-45 x [95°C 1”; 50°C 5”; 72°C 10-12”]; 1 x [95°C 0”; 65°C

15”; 95°C 0” 0.1°C/sec). For other genes, the amplification program was the same with the following

modifications: the hybridization temperature was 60°C, the elongation times were 6” (gapdh), 10” (hr-gfp,

actin), or 15” (xrcc5). For Ku80 encoding mRNA quantification and HERV transcriptome analysis, fold-change

values were calculated by comparative Ct analysis after normalizing for the quantity of gapdh or actin mRNA in

the samples concerned [59]. For analysis of (HR-)GFP expression, copy numbers of hr-gfp and gapdh mRNAs

were determined with reference to a standard curve obtained by amplification 102 to 10

7 copies of linearized

cloned DNA with matching sequences, and used to calculate the normalized ratios.

Statistical procedures. Unless otherwise specified, experiments were performed in triplicate parallel instances

and independently repeated at least twice. Data were analyzed with Microsoft Excel (Microsoft Co., Redmond,

USA) and statistical significance was assessed by means of two-tailed Student’s t tests. Unless otherwise

indicated, asterisks depict statistical significance (*p < 0.05, ** p < 0.01).

Competing interests.

The authors declare no conflict of interest.

Author’s contributions.

GM and AMM have carried out clonings; designed, performed, analyzed and interpreted Q-PCR/cellular

experiments, and drafted the manuscript. MV and FL performed RNA extraction and RetroArrays analysis. IV

152

was involved in siRNA experiment design and cell cycle experiment analyses, and participated in writing the

manuscript. PD performed the statistical analysis. ST contributed to analysis and interpretation of data on HIV-1

expression and cell counter-selection at middle term. CLM participated in the design of the study of endogenous

retroviruses expression. UH revised the manuscript. JFM participated in the study design and helped to draft the

manuscript. SBM conceived the study, participated in its design/coordination, performed Q-PCR analysis, and

wrote the manuscript. All authors read and approved the final manuscript.

Acknowledgments.

We thank Hervé Leh, Frédéric Subra and Olivier Delelis for stimulating discussions and Yann Lécluse for

technical support. We acknowledge Wolfgang Seifarth, from Medical Faculty Mannheim, for discussions about

the microarray data. We specially thank Arzu Demir and Antonin Demange for their technical help and

enthusiasm. The research leading to these results was funded by the Agence Nationale de Recherches sur le

SIDA et les Hépatites (ANRS) and the ANR (grant PCV-0015I IMFOVIR). GM holds a fellowship from the

Association Française contre les Myopathies (AFM). AMM holds a fellowship from the Ecole Normale

Supérieure of Cachan.

References

1. Daniel R, Katz RA, Skalka AM: A role for DNA-PK in retroviral DNA integration. Science 1999,

284:644-647.

2. Li L, Olvera JM, Yoder KE, Mitchell RS, Butler SL, Lieber M, Martin SL, Bushman FD: Role of the

non-homologous DNA end joining pathway in the early steps of retroviral infection. Embo J 2001,

20:3272-3281.

3. Lau A, Swinbank KM, Ahmed PS, Taylor DL, Jackson SP, Smith GC, O'Connor MJ: Suppression of

HIV-1 infection by a small molecule inhibitor of the ATM kinase. Nat Cell Biol 2005, 7:493-500.

4. Smith JA, Wang FX, Zhang H, Wu KJ, Williams KJ, Daniel R: Evidence that the Nijmegen breakage

syndrome protein, an early sensor of double-strand DNA breaks (DSB), is involved in HIV-1 post-

integration repair by recruiting the ataxia telangiectasia-mutated kinase in a process similar to, but

distinct from, cellular DSB repair. Virol J 2008, 5:11.

5. Andersen JL, Zimmerman ES, DeHart JL, Murala S, Ardon O, Blackett J, Chen J, Planelles V: ATR

and GADD45alpha mediate HIV-1 Vpr-induced apoptosis. Cell Death Differ 2005, 12:326-334.

6. Skalka AM, Katz RA: Retroviral DNA integration and the DNA damage response. Cell Death Differ

2005, 12 Suppl 1:971-978.

7. Smith JA, Daniel R: Following the path of the virus: the exploitation of host DNA repair mechanisms

by retroviruses. ACS Chem Biol 2006, 1:217-226.

8. Craigie R, Bushman FD: HIV DNA Integration. Cold Spring Harb Perspect Med 2012, 2:a006890.

9. Roshal M, Kim B, Zhu Y, Nghiem P, Planelles V: Activation of the ATR-mediated DNA damage

response by the HIV-1 viral protein R. J Biol Chem 2003, 278:25879-25886.

10. Daniel R, Ramcharan J, Rogakou E, Taganov KD, Greger JG, Bonner W, Nussenzweig A, Katz RA,

Skalka AM: Histone H2AX is phosphorylated at sites of retroviral DNA integration but is dispensable

for postintegration repair. J Biol Chem 2004, 279:45810-45814.

11. Zimmerman ES, Chen J, Andersen JL, Ardon O, Dehart JL, Blackett J, Choudhary SK, Camerini D,

Nghiem P, Planelles V: Human immunodeficiency virus type 1 Vpr-mediated G2 arrest requires Rad17

and Hus1 and induces nuclear BRCA1 and gamma-H2AX focus formation. Mol Cell Biol 2004,

24:9286-9294.

12. Daniel R, Greger JG, Katz RA, Taganov KD, Wu X, Kappes JC, Skalka AM: Evidence that stable

retroviral transduction and cell survival following DNA integration depend on components of the

nonhomologous end joining repair pathway. J Virol 2004, 78:8573-8581.

13. Lilley CE, Schwartz RA, Weitzman MD: Using or abusing: viruses and the cellular DNA damage

response. Trends Microbiol 2007, 15:119-126.

14. Yoder K, Sarasin A, Kraemer K, McIlhatton M, Bushman F, Fishel R: The DNA repair genes XPB and

XPD defend cells from retroviral infection. Proc Natl Acad Sci U S A 2006, 103:4622-4627.

153

15. Cosnefroy O, Tocco A, Lesbats P, Thierry S, Calmels C, Wiktorowicz T, Reigadas S, Kwon Y, De Cian

A, Desfarges S, et al: Stimulation of the human RAD51 nucleofilament restricts HIV-1 integration in

vitro and in infected cells. J Virol 2012, 86:513-526.

16. Tyagi S, Ochem A, Tyagi M: DNA-dependent protein kinase interacts functionally with the RNA

polymerase II complex recruited at the human immunodeficiency virus (HIV) long terminal repeat and

plays an important role in HIV gene expression. J Gen Virol 2011, 92:1710-1720.

17. Jeanson L, Mouscadet JF: Ku represses the HIV-1 transcription: identification of a putative Ku binding

site homologous to the mouse mammary tumor virus NRE1 sequence in the HIV-1 long terminal repeat.

J Biol Chem 2002, 277:4918-4924.

18. Masson C, Bury-Mone S, Guiot E, Saez-Cirion A, Schoevaert-Brossault D, Brachet-Ducos C, Delelis

O, Subra F, Jeanson-Leh L, Mouscadet JF: Ku80 participates in the targeting of retroviral transgenes to

the chromatin of CHO cells. J Virol 2007, 81:7924-7932.

19. Waninger S, Kuhen K, Hu X, Chatterton JE, Wong-Staal F, Tang H: Identification of cellular cofactors

for human immunodeficiency virus replication via a ribozyme-based genomics approach. J Virol 2004,

78:12829-12837.

20. Lieber MR: The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-

joining pathway. Annu Rev Biochem 2010, 79:181-211.

21. Gullo C, Au M, Feng G, Teoh G: The biology of Ku and its potential oncogenic role in cancer. Biochim

Biophys Acta 2006, 1765:223-234.

22. Genovesio A, Kwon YJ, Windisch MP, Kim NY, Choi SY, Kim HC, Jung S, Mammano F, Perrin V,

Boese AS, et al: Automated genome-wide visual profiling of cellular proteins involved in HIV

infection. J Biomol Screen 2011, 16:945-958.

23. Jeanson L, Subra F, Vaganay S, Hervy M, Marangoni E, Bourhis J, Mouscadet JF: Effect of Ku80

depletion on the preintegrative steps of HIV-1 replication in human cells. Virology 2002, 300:100-108.

24. Zheng Y, Ao Z, Wang B, Jayappa KD, Yao X: Host protein Ku70 binds and protects HIV-1 integrase

from proteasomal degradation and is required for HIV replication. J Biol Chem 2011, 286:17722-

17735.

25. Ariumi Y, Turelli P, Masutani M, Trono D: DNA damage sensors ATM, ATR, DNA-PKcs, and PARP-

1 are dispensable for human immunodeficiency virus type 1 integration. J Virol 2005, 79:2973-2978.

26. Kilzer JM, Stracker T, Beitzel B, Meek K, Weitzman M, Bushman FD: Roles of host cell factors in

circularization of retroviral dna. Virology 2003, 314:460-467.

27. Baekelandt V, Claeys A, Cherepanov P, De Clercq E, De Strooper B, Nuttin B, Debyser Z: DNA-

Dependent protein kinase is not required for efficient lentivirus integration. J Virol 2000, 74:11278-

11285.

28. Studamire B, Goff SP: Host proteins interacting with the Moloney murine leukemia virus integrase:

multiple transcriptional regulators and chromatin binding factors. Retrovirology 2008, 5:48.

29. Wang Y, Ghosh G, Hendrickson EA: Ku86 represses lethal telomere deletion events in human somatic

cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2009, 106:12430-12435.

30. Li G, Nelsen C, Hendrickson EA: Ku86 is essential in human somatic cells. Proc Natl Acad Sci U S A

2002, 99:832-837.

31. Ghosh G, Li G, Myung K, Hendrickson EA: The lethality of Ku86 (XRCC5) loss-of-function mutations

in human cells is independent of p53 (TP53). Radiat Res 2007, 167:66-79.

32. Duverger A, Jones J, May J, Bibollet-Ruche F, Wagner FA, Cron RQ, Kutsch O: Determinants of the

establishment of human immunodeficiency virus type 1 latency. J Virol 2009, 83:3078-3093.

33. Brussel A, Sonigo P: Analysis of early human immunodeficiency virus type 1 DNA synthesis by use of

a new sensitive assay for quantifying integrated provirus. J Virol 2003, 77:10119-10124.

34. Shi L, Qiu D, Zhao G, Corthesy B, Lees-Miller S, Reeves WH, Kao PN: Dynamic binding of Ku80,

Ku70 and NF90 to the IL-2 promoter in vivo in activated T-cells. Nucleic Acids Res 2007, 35:2302-

2310.

35. Emiliani S, Van Lint C, Fischle W, Paras P, Jr., Ott M, Brady J, Verdin E: A point mutation in the HIV-

1 Tat responsive element is associated with postintegration latency. Proc Natl Acad Sci U S A 1996,

93:6377-6381.

36. Buscher K, Trefzer U, Hofmann M, Sterry W, Kurth R, Denner J: Expression of human endogenous

retrovirus K in melanomas and melanoma cell lines. Cancer Res 2005, 65:4172-4180.

37. Hohenadl C, Germaier H, Walchner M, Hagenhofer M, Herrmann M, Sturzl M, Kind P, Hehlmann R,

Erfle V, Leib-Mosch C: Transcriptional activation of endogenous retroviral sequences in human

epidermal keratinocytes by UVB irradiation. J Invest Dermatol 1999, 113:587-594.

38. Seifarth W, Frank O, Zeilfelder U, Spiess B, Greenwood AD, Hehlmann R, Leib-Mosch C:

Comprehensive analysis of human endogenous retrovirus transcriptional activity in human tissues with

a retrovirus-specific microarray. J Virol 2005, 79:341-352.

154

39. Israel N, Hazan U, Alcami J, Munier A, Arenzana-Seisdedos F, Bachelerie F, Israel A, Virelizier JL:

Tumor necrosis factor stimulates transcription of HIV-1 in human T lymphocytes, independently and

synergistically with mitogens. J Immunol 1989, 143:3956-3960.

40. Van Lint C, Emiliani S, Ott M, Verdin E: Transcriptional activation and chromatin remodeling of the

HIV-1 promoter in response to histone acetylation. Embo J 1996, 15:1112-1120.

41. Pearson R, Kim YK, Hokello J, Lassen K, Friedman J, Tyagi M, Karn J: Epigenetic silencing of human

immunodeficiency virus (HIV) transcription by formation of restrictive chromatin structures at the viral

long terminal repeat drives the progressive entry of HIV into latency. J Virol 2008, 82:12291-12303.

42. Emiliani S, Fischle W, Ott M, Van Lint C, Amella CA, Verdin E: Mutations in the tat gene are

responsible for human immunodeficiency virus type 1 postintegration latency in the U1 cell line. J Virol

1998, 72:1666-1670.

43. Giffin W, Gong W, Schild-Poulter C, Hache RJ: Ku antigen-DNA conformation determines the

activation of DNA-dependent protein kinase and DNA sequence-directed repression of mouse

mammary tumor virus transcription. Mol Cell Biol 1999, 19:4065-4078.

44. Kaczmarski W, Khan SA: Lupus autoantigen Ku protein binds HIV-1 TAR RNA in vitro. Biochem

Biophys Res Commun 1993, 196:935-942.

45. Bertinato J, Tomlinson JJ, Schild-Poulter C, Hache RJ: Evidence implicating Ku antigen as a structural

factor in RNA polymerase II-mediated transcription. Gene 2003, 302:53-64.

46. Choul-li S, Drobecq H, Aumercier M: DNA-dependent protein kinase is a novel interaction partner for

Ets-1 isoforms. Biochem Biophys Res Commun 2009, 390:839-844.

47. Kim H: DNA repair Ku proteins in gastric cancer cells and pancreatic acinar cells. Amino Acids 2008,

34:195-202.

48. Tuteja R, Tuteja N: Ku autoantigen: a multifunctional DNA-binding protein. Crit Rev Biochem Mol

Biol 2000, 35:1-33.

49. Holcomb VB, Rodier F, Choi Y, Busuttil RA, Vogel H, Vijg J, Campisi J, Hasty P: Ku80 deletion

suppresses spontaneous tumors and induces a p53-mediated DNA damage response. Cancer Res 2008,

68:9497-9502.

50. Kessis TD, Slebos RJ, Nelson WG, Kastan MB, Plunkett BS, Han SM, Lorincz AT, Hedrick L, Cho

KR: Human papillomavirus 16 E6 expression disrupts the p53-mediated cellular response to DNA

damage. Proc Natl Acad Sci U S A 1993, 90:3988-3992.

51. Daniel R: DNA repair in HIV-1 infection: a case for inhibitors of cellular co-factors? Curr HIV Res

2006, 4:411-421.

52. Zufferey R, Dull T, Mandel RJ, Bukovsky A, Quiroz D, Naldini L, Trono D: Self-inactivating lentivirus

vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol 1998, 72:9873-9880.

53. Miyoshi H, Takahashi M, Gage FH, Verma IM: Stable and efficient gene transfer into the retina using

an HIV-based lentiviral vector. Proc Natl Acad Sci U S A 1997, 94:10319-10323.

54. Ory DS, Neugeboren BA, Mulligan RC: A stable human-derived packaging cell line for production of

high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc Natl Acad Sci U S A 1996,

93:11400-11406.

55. Schneider U, Schwenk HU, Bornkamm G: Characterization of EBV-genome negative "null" and "T"

cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-

Hodgkin lymphoma. Int J Cancer 1977, 19:621-626.

56. Foley GE, Lazarus H, Farber S, Uzman BG, Boone BA, McCarthy RE: Continuous Culture of Human

Lymphoblasts from Peripheral Blood of a Child with Acute Leukemia. Cancer 1965, 18:522-529.

57. Chen C, Okayama H: High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell

Biol 1987, 7:2745-2752.

58. Manic G, Maurin-Marlin A, Galluzzi L, Subra F, Mouscadet JF, Bury-Mone S: 3' Self-Inactivating

Long Terminal Repeat Inserts for the Modulation of Transgene Expression from Lentiviral Vectors.

Hum Gene Ther Methods 2012.

59. Pfaffl MW: A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids

Res 2001, 29:e45.

60. Nimura Y, Kawata T, Uzawa K, Okamura J, Liu C, Saito M, Shimada H, Seki N, Nakagawara A, Ito H,

et al: Silencing Ku80 using small interfering RNA enhanced radiation sensitivity in vitro and in vivo.

Int J Oncol 2007, 30:1477-1484.

61. Ayene IS, Ford LP, Koch CJ: Ku protein targeting by Ku70 small interfering RNA enhances human

cancer cell response to topoisomerase II inhibitor and gamma radiation. Mol Cancer Ther 2005, 4:529-

536.

62. Vitale I, Senovilla L, Jemaa M, Michaud M, Galluzzi L, Kepp O, Nanty L, Criollo A, Rello-Varona S,

Manic G, et al: Multipolar mitosis of tetraploid cells: inhibition by p53 and dependency on Mos. Embo

J 2010, 29:1272-1284.

155

Figures

Figure 1: Design of lentiviral vectors. (A-D) Schematic representation of the lentiviral (LV)

vectors (in the proviral, integrated form) used in this study. (A) XCD3 is a human

immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) construct lacking the env and nef genes and carrying

the green fluorescent protein (gfp) transgene under the control of the native HIV-1 long

terminal repeat (LTR) and an internal ribosome entry site (IRES) (also referred as HIV-1 env-

nef- IRES-gfp). Two derived versions of this vector have been engineered, the first presenting

the deletion of Vpr (vpr-) and the second the D116A mutation in the integrase (IN) coding

sequence [named XCD3 vpr-

and XCD3 IN(D116A), respectively]. (B) HR’-CMV is a LV

vector carrying the gfp transgene under the control of both the immediate early human

cytomegalovirus (CMV) and HIV-1 promoters. (C) SIN-PGK is a self-inactivating (SIN, i.e.,

U3-deleted, ΔU3) LV vector containing the gfp under the control of the human

phosphoglycerate kinase (PGK) internal promoter. (D) XCD24 is a LV vector lacking all

HIV-1 genes and carrying the gfp under the control of the WT HIV-1 promoter. Two variants

of this vector have been derived, the first mutated in the putative Ku binding site [KBS,

XCD24 Sc-216-196

] and the second in the trans-activation response (TAR) element [XCD24

TAR(C37T)]. ψ, encapsidation signal.

156

Figure 2: Ku80 haplodepletion reduces HIV-1-driven GFP expression. (A-D) Wild-type

(WT) and Ku80+/-

human colon carcinoma HCT 116 cells were transduced with serial

dilutions of XCD3 (HIV-1 env- nef

- IRES-gfp) as indicated and, 48 hours later, analyzed by

means of cytofluorimetry for the percentage and the geometric mean fluorescence intensity

(MFI) of GFP-positive (GFP+) cells. Panels (A) and (C) show the results (mean of duplicates

± SD; *, p < 0.05; **, p < 0.01) of the percentage and the MFI of GFP+ cells, respectively,

obtained in one representative experiment (out of three independent ones that yielded similar

results) at the multiplicity of infection (m.o.i.) illustrated. The ratios between WT and Ku80+/-

HCT 116 cells for the percentage and the MFI of GFP+

cells at the depicted m.o.i. are

illustrated in panels (B) and (D), respectively (mean ± SD, n = 3). AU, arbitrary units.

157

Figure 3: HIV-1-driven GFP expression in WT HCT 116 cells is decreased by Ku

transient depletion. (A-C) Wild-type (WT) and Ku80+/-

human colon carcinoma HCT 116

cells were transfected with an unrelated sequence (siCtl) or with siRNAs directed against

Ku80 (siKu80 1 or 2), Ku70 (siKu70) or p53 (sip53). Seventy-two hours later, the protein

levels of Ku80 and Ku70 (A) or Ku80 and p53 (C) were assessed by Western-blot analysis.

Actin levels were monitored to ensure equal loading of lanes. Alternatively, 72 h upon

transfection, cells were transduced with XCD3 (HIV-1 env- nef

- IRES-gfp) at low m.o.i. (<

0.3) for additional 48 h followed by cytofluorimetric assessment of GFP expression (B). NT

(non-transfected) and HP (Hiperfect®) correspond to cells kept in control condition or

exposed to the same amount of liposomes used for transfection but in absence of siRNA,

respectively. To avoid bias linked to cell counting, in (B) the percentages of GFP+ cells were

normalized to the total viral DNA content per cell as determined by quantitative PCR (Q-

PCR) 24 h after transduction. The results obtained from at least 3 independent experiments

were then normalized to a GFP expression of 25 % (of note, the level of GFP expression of

NT, HP or siCtl WT cells before normalization were always comprised between 20 to 30 %).

Results are expressed as mean ± SEM. *, p < 0.05 and **, p < 0.01 as compared to HP and

siCtl-transfected WT cells; #, p < 0.05 and

##, p < 0.01 as compared to WT cells subjected to

the same transfection condition.

158

Figure 4: Ku80 haplodepletion does not affect HIV-1 integration efficiency and 2-LTR

circle formation. (A-D) Wild-type (WT) and Ku80+/-

human colon carcinoma HCT 116 cells

as well as the human T lymphoid leukemia Jurkat and CEM-T4 cell lines were transduced

with the same volume of XCD3 (HIV-1 env- nef

- IRES-gfp) at a m.o.i < 0.2. Upon the

depicted time from transduction, cells were subjected either to cytofluorimetric analysis, to

measure GFP expression (A) or to Q-PCR assays, to quantify viral DNA species (B-D). In

panel (A), results obtained in one representative experiment (out of 2 independent ones that

yielded similar results) are shown (mean of duplicates ± SD). In panels (B-D), the copy

number of the integrated viral DNA (B), the total viral DNA (C) and the 2-LTR circular

forms of viral DNA (D) per 1x106 cells for each cell line are reported (mean ± SEM; n = 2).

The last data point (240 h from the transduction) is shown at higher magnification.

159

Figure 5: Ku stimulates HIV-1-driven expression independently from Tat or the

putative KBS-216-196

sequence but requires provirus integration. (A) Wild-type (WT) and

Ku80+/-

human colon carcinoma HCT 116 cells were transduced for 48 h either with SIN-

PGK, HR’-CMV, XCD3 (HIV-1 env- nef

- IRES-gfp), XCD24 (at a m.o.i. 0.1 and 0.25) or its

derivatives in which the putative KBS (XCD24 Sc-216-196

) or TAR element [XCD24

TAR(C37T)] was mutated (at a m.o.i. 0.02 to 0.06 or 0.04 to 0.22, respectively) (for more

detail on these vectors, refer to Figure 1). Thereafter, the percentage of fluorescent (GFP+)

cells was measured by flow cytometry. Of note, the volume of viral suspension was adjusted

to the number of cells to be transduced for both cell lines. (B) Alternatively, cells were

transfected with pXCD3, pXCD24, pHR’-CMV and pSIN-PGK shuttle plasmids, followed by

cytofluorimetry-mediated determination of the MFI of fluorescent cells. (C) WT and Ku80+/-

HCT 116 cells were transduced for 48 h either with XCD3 or its integrase-defective

derivative, XCD3 IN(D116A) (at a m.o.i. 0.15), followed by cytofluorometry-mediated

assessment of the percentage of GFP+ cells. In all panels, results are expressed as mean ± SD

(*, p < 0.05; **, p < 0.01) and refer to the values obtained in one representative experiment

conducted in duplicate out of (at least) 2 independent observations yielding similar results (A)

or coming from at least 3 experiments (B,C). When not specified, the m.o.i. was 0.3.

160

Figure 6: Ku80 haplodepletion increases the level of TNFα- or TSA-induced HIV-1

reactivation. (A-C) Wild-type (WT) and Ku80+/-

human colon carcinoma HCT 116 cells

transduced with XCD3 (HIV-1 env- nef

- IRES-gfp) at an m.o.i. < 0.6 were incubated for 24 h

in absence or presence of 200 nM tricostatin A (TSA) or 10 ng/ml tumor necrosis factor α

(TNFα) upon cultivation for 9 days in standard condition (A,B), or - alternatively - upon 24 h

post-transduction (A,C). Thereafter, the percentage and the MFI of GFP+ cells were estimated

by flow cytometry 2 (B,C) and 10 (B) days post-transduction (p.t.). Results from one

representative experiment (out of 3 three independent ones yielding similar results) performed

in duplicate are presented as mean ± SD (*, p < 0.05; **, p < 0.01). (D) WT and Ku80+/-

HCT

116 cells transduced with XCD24 or SIN-PGK were treated 9 days later with TSA or

TNF as described in (A,B). The panel reports data for one representative observation (out of

3 three independent ones yielding similar results) performed in duplicate (mean ± SD; *, p <

0.05; **, p < 0.01). (E) Ratio between the percentage of GFP+ cells of Ku80

+/- and WT HCT

116 cells in presence or absence of TSA or TNF as determined in (B) and (D) for each LV

vector (mean ± SD, n = 3).

161

Figure 7: Hypothetical model for the role of Ku on HIV-1 expression and latency at

early and middle-time upon transduction. (A) When expressed at normal level (as in Ku80-

proficient cells), Ku stimulates the early expression of HIV-1, a condition that is accompanied

by a low level of viral latency and in turn leads to a high counter-selection of transduced cells

over the time. This latter effect is probably due to Vpr-induced toxicity (see text for more

details). (B) On the contrary, low level of Ku (as in Ku80+/-

cells or in WT cells transfected

with Ku-depleting siRNAs) negatively affects the expression of HIV-1, increases the

proportion of cells with latent viruses and reduces the counter-selection phenomenon.

Accordingly, the reactivation of HIV-1 upon TSA- or TNFα-treatment at 2 or 10 days after

transduction is more efficient in Ku80+/-

cells that in their WT counterparts. Hence, we

hypothesize that the depletion of Ku may favor the appearance of cells harboring integrated

proviruses in a latent and readily reactivable state starting from the early phases from HIV-1

transduction.

162

Supplementary Figures

Supplementary Figure 1: Characterization of WT and Ku80+/-

HCT 116 cells. (A,C)

Wild-type (WT) and Ku80+/-

human colon carcinoma HCT 116 cells were subjected to RT-Q-

PCR analysis (A), to evaluate the level of Ku80 encoding xrcc5 mRNA and western-blot

assay (B-C), to assess Ku80, Ku70 ad p53 protein contents. In panel (A), xrcc5 mRNA

content (normalized to that of β-actin mRNA) of WT HCT 116 cells was normalized to that

of Ku80+/-

cells (mean ± SD, n=3). In panels B,C, actin levels were monitored to ensure equal

loading of lanes. (D) WT and Ku80+/-

HCT 116 cells were stained with propidium iodide for

the cytofluorometric assessment of cell cycle progression. Panel D reports cell cycle

distributions and quantitative data for both cell lines of one representative observation out of 3

three independent ones yielding similar results.

Supplementary Figure 2: Characterization of a Ku trans-complemented Ku80

+/- HCT

116 clone. Wild-type (WT) and Ku80+/-

human colon carcinoma HCT 116 cells as well as

derivatives containing either a neomycin (Neo) or a hygromycin-Ku80 expression pcDNA3.1

plasmid (shortened as ‘pCtl’ and ‘pKu80’, respectively) were subjected to western-blot

assessment of Ku80 protein contents. Actin level was monitored to ensure equal loading of

lanes. Please note that the pKu80 Ku80+/-

HCT 116 clone was maintained or not under a 10

µg/ml hygromycin selection (noted as ‘H’).

163

Supplementary Figure 3: GFP expression level correlates to gfp mRNA content in both

WT and Ku80+/-

HCT 116 cells. Wild-type (WT) and Ku80+/-

human colon carcinoma HCT

116 cells were transduced at middle m.o.i. (< 0.5) with XCD3 (HIV-1 env- nef

- IRES-gfp) and

subjected 48 h later to either flow cytometric analyses, to measure the percentage and the MFI

of GFP-positive cells or RT-Q-PCR assays, to quantify the gfp mRNA content (normalized to

gapdh mRNA content). The ratios between WT and Ku80+/-

cells HCT 116 cells for the

indicated parameters are illustrated. Results correspond to two representative and independent

experiments. Of note, the percentages of GFP+ WT cells in experiments 1 and 2 were of 15 %

and 25 %, respectively.

164

Supplementary Figure 4: The decrease of HIV-1-driven expression over time is reduced

in the absence of Vpr. (A-C) Wild-type (WT) and Ku80

+/- human colon carcinoma HCT 116

cells were transduced with XCD3 expressing Vpr (XCD3), or its derivative lacking Vpr

(XCD3 Vpr-, refer to Figure 1A for more details on these vectors). Upon 2 or 10 days from

transduction, the percentage of GFP+ cells was determined by flow cytometry (D2 and D10,

respectively). (A) One representative experiment performed in triplicates (out of four

independent ones yielding similar results) is shown (mean ± SD; *, p < 0.05). In panel B, the

ratios of GFP-positive cells between WT and Ku80

+/- HCT 116 cells 2 days after transduction

with XCD3 or XCD3 Vpr- [as obtained in (A)] are illustrated (mean ± SD, n = 4). In panel C,

the ratios of GFP-positive cells between 2 and 10 days after transduction with XCD3 or

XCD3 Vpr-, as obtained in (A) in cells with the depicted genetic background are represented

(mean ± SD; *, p < 0.05; n = 3).

165

Supplementary Figure 5: HERVs show the same transcription profile in both WT and

Ku80+/-

HCT 116 cells. Three independent pairs of total RNA from WT and Ku80+/-

human

colon carcinoma HCT 116 were compared by microarray hybridization. Images were saved in

the Bitmap file format and were used to present the results by false color mapping. Each

hybridization result is representative of a triplicate yielding similar results. Grey boxes

indicate the four HERV groups that were identified by Biometric Research Branch-

ArrayTools(BRB)-mediated analyses (for more detail, please refer to Methods section).

166

Supplementary Figure 6: Ku80 haplodepletion does not increase the HIV-1 reactivation

level in GFP+

transduced cells. (A,B). Wild-type (WT) and Ku80+/-

human colon carcinoma

HCT 116 cells were transduced for 2 days with XCD3 (HIV-1 env- nef

- IRES-gfp) at low

m.o.i. (< 0.1; i.e., one provirus per cell), followed by the isolation of GFP+ cells by means of

cytofluorometry-mediated cell sorting. Thereafter, GFP+ isolated cells were maintained in

culture for 45 days and the percentages of GFP-expressing were routinely monitored by flow

cytometry-mediated analysis, as indicated (A). Alternatively, 2 and 4 weeks after cell sorting,

transduced cells were left untreated or exposed for 24 h to 200 nM TSA (B). Columns in (B)

represent percentages of GFP+ cells in each condition (mean ± SD). Results in panels (A) and

(B) are from one representative experiment performed at least 2 independent times.

167

Table S1: HERV groups analyzed by RT-Q-PCR

Condition: WT HCT 116 versus Ku80+/-

HCT 116

Locus Class Parametric analysis on

Norm2 data

(Ratio, Student’s t test)

BrB analysis

RT-Q-PCR

results:

Ratio

WT/Ku80+/-

(± SD)

2

independent

experiments

realized on

each RNA

extract

Ratio

WT/Ku80+/-

(Norm1 data)

P value Norm1 Data

(parametric p

value or «- »

if p>0,01)

Norm3

data

(parametric

p value or

«- » if

p>0,01)

ERV-

FRD

0,7 0,00002 - - 0,8 (± 0,2)

ERV9

(seq59)

0,7 0,009 - - nd

HML-2

HERV-K

(HP1)

0,7 0,003 - - 0,8 (± 0,3)

HERV-S spuma 0,6 0,005 - - nd

ERI

HERV-R

(ERV3)

0,7 0,001 - - nd

HML-7

MMWV-

7

0,6 0,0008 - - nd

HML-9

MMWV-

9

0,6 0,000001 0,001 0,006 ns

HML-4

(Seq10)

0,7 0,0000003 - - nd

HML-5 0,4 0,00053 0,009 0,003 0,7 (± 0,3)

HML-1 1,6 0,008 0,007 - 0,8 (± 0,3)

HML-3

(Seq26)

0,8 0,006 - 0,09 nd

Actin 1,0 (± 0,2)

nd (not determined)

ns (non specific signal of RT-Q-PCR)

168

Table S2: Sequence of primers, probes and siRNA used for this study

Name Target Sequence* Refe-

rence

Primers used for cloning

OBM101

LV LTR

GGTACCTTTAAGACCAATG

This

study

OBM102 GTCAAGTAGACCTAGGAGAGTGGTCATCCATCCCA

TGCAGGCT

OBM103 ACTCTCCTAGGTCTACTTGACGGAGGTTTGACAGC

CGCCTAG

OBM104 TCTAGATGCTGCTAGAGATTTTC

OBM156 HIV pol

GTACATACAGCCAATGGCAGCAATTTCACCAG [58]

OBM157 TGCCATTGGCTGTATGTACTGTTTTTACTGG

OBM200 HIV tar

sequence

AGAGAACTCCCAGGCTCAGATCT This

study OBM201 GGGAGTTCTCTGGCTAACTAGG

Primers used for quantitative RT-PCR

OBM209 human

XRCC5

gene

(encodin

g Ku80)

ACCAAAGCGCCTGAGGAC This

study OBM210 CTCATGGTAAAGCCCACGTC

OBM257 hr-gfp

AAACCTGGCCCTGTCTTCTT This

study OBM258 GAGGAACTGCTTCCTTCACG

OBM24 Human

-actin

AAATCTGGCACCACACCTTC This

study R TCACCGGAGTCCATCACGAT

OBM241 human

gapdh

CGCTCTCTGCTCCTCCTGTT [58]

OBM242 CCATGGTGTCTGAGCGATGT

OBM247 ERV-

FRD

AAAAAGGAAGAAGTTAACAGC [38]

OBM248 ATATAAAGACTTAGGTCCTGC

OBM249 HML2-

ERV-K-

HP1

GGCCATCAGAGTCTAAACCAC From

Leib-

Mösch

’s lab OBM250 CTGACTTTCTGGGGGTGGCCG

OBM251 HML-5

TGAAAGGCCAGCTTGCTG [38]

OBM252 CAATTAGGAAATTCTTTTCTAC

OBM253 HML-1

AAAATCAGGGAAATGGAGAATG This

study OBM254 CTTGGGCAGCTAAAGGAATG

Primers used for quantitative PCR

Alu1 Human

Alu

TCCCAGCTACTGGGGAGGCTGAGG

[33]

Alu2 GCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAG

L-M667 LV ATGCCACGTAAGCGAAACTCTGGCTAACTAGGGAA

CCCACTG

Lambda-

T L-M667 ATGCCACGTAAGCGAAACT

AA55M LV GCTAGAGATTTTCCACACTGACTAA

169

MH 531 TGTGTGCCCGTCTGTTGTGT

MH 532-

UNIV CCGAGTCCTGCGTCGAGAGA

This

study

HIV F 2-LTR

LV

junction

GTGCCCGTCTGTTGTGTGACT [33]

HIV R1 ACTGGTACTAGCTTGTAGCACCATCCA

BGLOB

sense -globin

CAACTTCATCCACGTTCACC Contro

l kit

DNA;

Roche BGLOB

antisense ACACAACTGTGTTCACTAGC

Probes used for quantitative PCR

LTR-FL

LV

CACAACAGACGGGCACACACTACTTGA (3’

fluoresceine)

[33]

LTR-FC CACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGC (5’ LC red 640

dye and 3’-P)

MH-FL CCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAA (3’

fluoresceine)

MH-LC TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG (5’ LC red 640

dye and 3’-P)

HIV FL 2-LTR

LV

junction

CCACACACAAGGCTACTTCCCTGA (3’ fluoresceine)

HIV LC TGGCAGAACTACACACCAGGGC (5’ LC red 640 dye et

3’ phosphorylée)

siRNA (5’-3’sense sequence indicated)

Ku80 2 xrcc5

mRNA

encoding

Ku80)

GCGAGUAACCAGCUCAUAAdTdT [60]

Ku80 1 GAGCUAAUCCUCAAGUCGGdTdT [19]

Ku70

xrcc6

mRNA

encoding

Ku70)

GAUGCCCUUUACUGAAAAAdTdT [61]

P53 tp53

mRNA GUGAGCGCUUCGAGAUGUUdTdT [62]

Ctl

Scramble

sequence

unrelated

to human

genome

GCCGGUAUGCCGGUUAAGUdTdT [62]

170

III/ IMPACT DE LA MACHINERIE DE REPARATION DE L’ADN

SUR L’EXPRESSION DE VECTEURS LENTIVIRAUX CONTENANT

L’INSULATEUR CHS4 AU SEIN DE LEURS SIN-LTRS

A/ CONTEXTE DE L’ETUDE

Au cours de notre première étude, nous avons mis en évidence l’action positive

orientée de l’insulateur cHS4 (en antisens) sur l’expression du transgène (Manic et al., 2012).

Cependant, nous avons observé que cet effet est dépendant du promoteur qui contrôle

l’expression de la gfp (Manic et al., 2012). Ainsi, l’augmentation de l’expression transgénique

en présence de cHS4 antisens est transitoire ou révélée au cours du temps lorsque la gfp est

sous contrôle du promoteur CMV ou PGK, respectivement (Manic et al., 2012). De plus, le

bénéfice apporté par l’insulateur cHS4 en antisens sur l’expression transgénique contrôlée par

le PPGK est variable en fonction du type cellulaire transduit (e.g., HCT 116 vs CEM-T4)

(Manic et al., 2012). Il est à noter, qu’en accord avec la littérature, nous avons caractérisé

l’expression à partir du PPGK comme stable au cours du temps alors que celle contrôlée par le

PCMV est sujette à extinction (Manic et al., 2012).

Lors de notre deuxième étude, nous n’avons pas observé d’impact de la déplétion en

Ku sur l’expression transgénique précoce de vecteurs dérivés du VIH-1 contenant un

promoteur interne CMV ou PGK (également à moyen-terme pour ce dernier) au sein des

cellules humaines HCT 116 (Manic et al., en préparation ; cf., § II). Cependant, nous n’avons

pas testé l’évolution de l’expression de la gfp contrôlée par le PCMV dans un contexte déplété

en Ku. En effet, Ku pourrait influencer l’expression du transgène au cours du temps en

intervenant, par exemple, sur sa localisation, comme récemment décrit au sein des cellules de

rongeurs (Masson et al., 2007).

Au cours de cette étude, nous avons souhaité évaluer si la déplétion en Ku pouvait

influencer l’extinction de l’expression transgénique contrôlée par le PCMV. De plus, nous

avons voulu tester un éventuel impact du statut en Ku sur l’expression du transgène a priori

isolé de son environnement (i.e., bordé de l’insulateur cHS4). Pour répondre à cette

problèmatique, nous avons réalisé des expériences de transduction au sein des cellules HCT

116 WT et Ku80+/-

avec des vecteurs dérivés du VIH-1 codant la gfp sous contrôle du PCMV

ou PPGK et contenant l’insulateur cHS4 au sein de leur SIN-LTRs.

Nous avons ainsi mis en évidence que le promoteur interne (CMV ou PGK) ou le fond

génétique transduit (WT ou Ku80+/-

) n’influence pas la perte du pourcentage des cellules

171

GFP+ transduites par les vecteurs contenant cHS4 orienté en antisens. De plus, l’insertion de

cHS4 en antisens au sein des SIN-LTRs induit une augmentation spécifique de l’intensité de

l’expression de la gfp normalisée. Enfin, de façon étonnante, l’expression de la gfp sous

contrôle du PPGK augmentée par la présence de cHS4 en antisens est favorisée lors de la

déplétion en Ku. Ces données suggèrent une régulation différentielle de l’activité de cHS4 en

antisens en fonction du statut en Ku dans notre modèle.

B/ RESULTATS (NON-PUBLIES)

Les cellules humaines HCT 116 WT et Ku80+/-

(issues d’un carcinome colorectal) ont

été transduites avec des vecteurs codant la gfp sous contrôle du promoteur CMV ou PGK, et

contenant au sein de leur SIN-LTRs l’insulateur cHS4 dans l’orientation sens ou antisens. Le

pourcentage des cellules GFP+ et l’intensité de l’expression (i.e., MFI) de la GFP ont été

estimés par cytofluorométrie 2, 6 et 10 jours après transduction.

Nous avons tout d’abord mis en évidence que la perte du pourcentage des cellules

GFP+ a lieu principalement entre 2 et 6 jours post-transduction de façon identique pour

chacun de vecteurs transduits (vide, ou contenant cHS4 orienté en sens ou en antisens)

(Figure 32A-C), comme observé précédemment (Figure S5, #1). Nous avons toutefois noté

que cette chute du pourcentage des cellules GFP+

semble supérieure pour les cellules

transduites par les vecteurs contenant le promoteur CMV, comparé à celles transduites avec

les constructions SIN-PPGK (Figure 32A-C). Ces données pourraient s’expliquer par la

capacité du PCMV à s’exprimer à partir des formes d’ADN virales non-intégrées qui sont

perdues lors des divisions cellulaires, en accord avec nos données précédentes (Figure S4,

#1). Cependant, nous n’avons pas observé de différence significative de la perte du

pourcentage de cellules GFP+ entre les deux fonds génétiques HCT 116 transduits (i.e., WT et

Ku80+/-

, Figure 32A-C).

La perte du pourcentage des cellules WT ou Ku80+/-

GFP+ transduites par les vecteurs

SIN-PPGK ou -PCMV contenant cHS4 (en antisens) de 2 à 10 jours post-transduction est donc

similaire quelque soit le promoteur interne contrôlant l’expression de la gfp et le fond

génétique transduit (Figure 32).

172

Figure 32 : Suivi des cellules HCT 116 WT et Ku80

+/- GFP

+ transduites par des vecteurs

lentiviraux contenant cHS4 au sein de leur SIN-LTRs. Les cellules humaines HCT 116

WT et Ku80+/-

(issues d’un carcinome colorectal) ont été transduites avec des vecteurs codant

la gfp sous contrôle du promoteur CMV ou PGK, et contenant au sein de leur SIN-LTRs

l’insulateur cHS4 dans l’orientation sens (s) ou antisens (as). Le pourcentage des cellules

GFP+ a été estimé par cytofluorométrie 2, 6 et 10 jours après transduction. (A) Cinétique du

pourcentage des cellules WT ou Ku80+/-

GFP+ transduites par les vecteurs SIN-PGK ou -

CMV sans insert (A) ou contenant cHS4 orienté en antisens (B) ou en sens (C) (moyenne ±

SD, résultats représentatifs d’au moins deux expériences indépendantes).

L’intensité de l’expression de la GFP à partir des vecteurs contenant cHS4 (orienté en

sens ou en antisens) a ensuite été normalisée sur celle du vecteur parental correspondant au

sein de populations cellulaires ayant des efficacités de transduction comparables. L’analyse de

l’intensité de l’expression de la GFP normalisée pendant 10 jours post-transduction a mis en

évidence une réduction de l’expression de la GFP des cellules WT ou Ku80+/-

transduites par

les vecteurs contenant cHS4 (en sens) quelque soit le promoteur interne (Figure 33A, B).

A l’inverse, l’expression transgénique contrôlée par le PPGK est augmentée au sein des

cellules WT ou Ku80+/-

transduites par les vecteurs contenant cHS4 en antisens (Figure 33A,

B), de façon cohérente avec nos observations précédentes au sein de différentes lignées

cellulaires (Figures 4 et 5, #1). Cependant, l’expression de la gfp contrôlée par le promoteur

CMV à partir des vecteurs contenant cHS4 en antisens est également augmentée à 10 jours

post-transduction (Figure 33B, C). Ces données sont en désaccord avec ce que nous avons

observé précédemment après transduction des cellules HeLa (Figure 4, #1).

Enfin, de façon étonnante, nous avons mis en évidence que l’augmentation de

l’intensité de l’expression de la gfp des vecteurs contenant cHS4 (en antisens) est supérieure

lorsque la gfp était sous contrôle du promoteur PGK dans un fond génétique haplodéplété en

Ku80 (comparé au promoteur CMV et aux cellules WT, Figure 33A-C).

173

Figure 33 : L’expression de la gfp à partir d’un vecteur lentiviral est augmentée lorsque

cHS4 est inséré en antisens dans les SIN-LTRs au sein des cellules Ku80+/-

. (A-C) Les

cellules humaines HCT 116 WT et Ku80+/-

(issues d’un carcinome colorectal) ont été

transduites avec des vecteurs codant la gfp sous contrôle du promoteur CMV ou PGK, et

contenant au sein de leur SIN-LTRs l’insulateur cHS4 dans l’orientation sense (s) ou

antisense (as). Le pourcentage et l’intensité de l’expression de la GFP ont été estimés par

cytofluorométrie 2, 6 et 10 jours après transduction. Ici, l’intensité de l’expression de la GFP

des vecteurs contenant cHS4 (en s ou as) a été normalisée sur celle du vecteur parental

correspondant. (A-B) Cinétique de l’intensité de l’expression de la GFP normalisée des

cellules WT ou Ku80+/-

transduites par les vecteurs (A) SIN-PGK ou (B) SIN-CMV contenant

cHS4 (en s ou as) (moyenne ± SEM, résultats représentatifs d’au moins deux expériences

indépendantes). (C) Cinétique de l’intensité de l’expression de la GFP normalisée des cellules

WT ou Ku80+/-

transduites par les vecteurs SIN-PGK ou -CMV contenant cHS4as (moyenne

± SEM, valeurs issues de trois expériences indépendantes).

C/ DISCUSSION

Nous avons mis en évidence que la présence de cHS4 (en antisens) favorise

l’expression de la gfp à partir du PPGK (dès 2 jours post-transduction) et du PCMV (à partir de

10 jours post-transduction) au sein des cellules HCT 116. Ces données sont cohérentes avec

nos observations précédentes dans le cas du PPGK (Figures 4 et 5, #1) mais pas dans le cas du

PCMV pour lequel nous avons observé un impact positif transitoire de cHS4 (en antisens) sur

l’expression transgénique au sein des cellules HeLa (Figure 4, #1). Ces contradictions

pourraient s’expliquer par le fait que (i) l’expression contrôlée par le PCMV (à partir des

formes intégrées et non-intégrées de l’ADNv) soit plus sensible au contexte cellulaire au sein

duquel le PCMV agit (comparé au PPGK) et/ou (ii) que l’action positive sur l’expression de la

séquence cHS4 en antisens puisse être dépendante du type cellulaire transduit (e.g., HCT 116

vs. HeLa).

De façon intéressante, nous avons également montré que la déplétion en Ku favorise

spécifiquement l’expression de la gfp à partir du PPGK en présence de cHS4 (en antisens) au

sein des cellules HCT 116. Cet effet pourrait avoir lieu grâce à l’augmentation de l’activité

174

barrière et/ou de terminaison de transcription de cHS4 (en antisens) par (i) un ciblage dans des

zones transcriptionnellement actives par défaut en absence de Ku, comme hypothétisé au sein

des cellules de rongeurs, où l’action de cHS4 se révèlerait davantage, et/ou (ii) l’intervention,

par défaut ou favorisée par la déplétion de Ku, d’une protéine impliquée dans la régulation de

l’activité barrière de cHS4 (i.e., PARP-1). Un environnement favorable à l’expression qui

serait améliorée/créé par cHS4 (en antisens) devrait davantage favoriser le PCMV, plus

susceptible au silencing. Cependant, aucune différence significative de l’expression du

transgène contrôlée par le PCMV n’a été observée entre le fond génétique WT ou Ku80+/-

(Figure 33B, C). Nous ne pouvons exclure cette notion de ciblage mais privilégions

l’intervention de facteurs propices à l’expression transgénique en présence de cHS4 (en

antisens) favorisée par la déplétion en Ku. Cette hypothèse inclut la possibilité d’une prise en

charge précoce de l’ADNv linéaire par Ku, ou par PARP-1 lorsque les quantités de Ku sont

moindres, qui se fixerait de façon non-spécifique aux extrémités de l’ADNv (cf., discussion §

II.B.2 pour plus de détails).

175

DISCUSSION ET PERSPECTIVES

176

Ces travaux de thèse visaient à étudier les impacts de déterminants viraux et cellulaires

sur la régulation de l’expression du VIH-1 et de vecteurs qui en dérivent. Les figures des

articles de la section Résultats seront citées dans la section Discussion en utilisant les

annotations #1 pour (Manic et al., 2012) et #2 pour Manic et al. (soumis à Retrovirology).

I/ IMPACTS DES DETERMINANTS VIRAUX

SUR L’EXPRESSION LENTIVIRALE

Nous avons mis en évidence que l’absence de certaines protéines virales au sein du

VIH-1 (partie A) ou la présence de séquences hétérologues dans les vecteurs dérivés (partie

B) peut influencer l’expression lentivirale et le devenir des cellules transduites.

A/ IMPACTS DES DETERMINANTS VIRAUX SUR L’EXPRESSION DU VIH-1

1/ Perte limitée des cellules transduites par le VIH-1 en absence de Vpr

Nous avons décrit une chute importante de l’expression du VIH-1 à moyen-terme (10

jours) après transduction de cellules tumorales épithéliales (HCT 116 WT) ou lymphocytaires

(CEM-T4, Jurkat) (Figure 4A #2). Celle-ci était corrélée à une forte diminution de la quantité

d’ADN viral par cellule (Figure 4C, B #2), ce qui indique qu’il y a une contre-sélection

massive des cellules GFP+ qui expriment les protéines du VIH-1. A l’inverse, la perte de

l’expression du VIH-1 au cours du temps est limitée ou nulle en absence de Vpr (Figure S4

#2) ou de l’ensemble des protéines auxiliaires du VIH-1 (Figure 6C #2), respectivement,

après transduction des cellules HCT 116.

Ces observations suggèrent que l’expression des protéines auxiliaires, dont Vpr,

induirait une toxicité et/ou, au moins, une contre-sélection des cellules transduites par le VIH-

1 dans notre modèle. Ces résultats sont cohérents avec le rôle double décrit de Vpr qui, néo-

synthétisée après infection, induit un arrêt du cycle cellulaire en G2/M, ce qui favorise

l’expression du LTR (Goh et al., 1998) mais provoque une mort par apoptose (Andersen et al.,

2008). Nos données devront toutefois être confirmées par des expériences de Q-PCR.

2/ Etat de latence des cellules transduites par le VIH-1 en absence de Tat

Nous avons observé que l’expression du VIH-1 est réduite en absence de protéines

auxiliaires (dont Tat) après transduction des cellules HCT 116 (données non-montrées). Ce

résultat est corrélé à une absence de contre-sélection au cours du temps (comme décrit ci-

177

dessus, § I.A.1) et à une (ré)activation massive après traitement à l’aide d’un inhibiteur des

HDACs, la TSA ou d’un activateur de NF-κB, le TNFα (Figure 6C #2).

Ces données indiquent que l’absence des protéines auxiliaires, dont Tat, diminue

l’expression précoce du VIH-1 et induit une latence post-intégrative du VIH-1 au sein des

cellules HCT 116. Nos observations sont en accord avec le rôle de Tat dans la trans-activation

du LTR (Colin and Van Lint, 2009) ainsi que l’état de pseudo-latence du VIH-1 décrit lorsque

Tat n’est pas fonctionnelle, comme au sein des cellules U1 (Emiliani et al., 1998), ou de

latence transcriptionnelle en absence des co-facteurs cellulaires de Tat (Colin and Van Lint,

2009). Tat aurait donc un rôle dans l’inhibition de la mise en place d’un silencing

transcriptionnel du VIH-1, comme récemment décrit par (Donahue et al., 2012). Nos résultats

doivent cependant être confirmés par une trans-complémentation en Tat.

L’étude des impacts des déterminants viraux sur l’expression du VIH-1 nous a permis

de décrire que (i) l’absence de Vpr limiterait la contre-sélection des cellules transduites, et

(ii) l’absence des autres protéines auxiliaires virales, dont Tat, réduirait considérablement

l’expression des provirus, qui se trouveraient dans un état latent (re)activable.

B/ MODULATION DE L’EXPRESSION LENTIVIRALE LORS DE L’INSERTION DE

SEQUENCES HETEROLOGUES AU SEIN DE VECTEURS DERIVES DU VIH-1

1/ Impacts de promoteurs internes sur l’expression d’un transgène intégré ou non

a/ Le promoteur CMV induit une expression variable qui tend à être éteinte

Nous avons mis en évidence que le promoteur viral CMV (PCMV) induit une

expression hétérogène du transgène (Figure S4B #1) qui est cependant équivalente dans un

contexte compétent ou déficient pour l’intégration (Figure S1B, D #1). Ces données

suggèrent que les formes d’ADNv intégrées et non-intégrées s’expriment (précocement) de la

même façon à partir du PCMV. L’expression transgénique contrôlée par le PCMV à partir des

vecteurs non-intégratifs a toutefois été décrite être inférieure à celle issue de vecteurs

intégratifs (Bayer et al., 2008). Malgré cela, le PCMV reste un promoteur de choix dans les

approches IDLV (Wanisch and Yanez-Munoz, 2009).

De plus, l’expression de la gfp contrôlée par le PCMV est (i) sujette à un silencing

précoce, comme observé après traitement à la TSA 2 jours post-transduction au sein d’une

population mixte (i.e., GFP- et GFP

+, données non-montrées), (ii) soumise à extinction au sein

178

des cellules HeLa GFP+ isolées après transduction (Figure 8C #1), et (iii) associée à de la

variégation au sein de populations clonales (Figure 8D #1). Ces résultats sont en accord avec

la description de silencing de l’expression régulée par le PCMV observé après transduction de

lentivecteurs (Gerolami et al., 2000) ou infection par le CMV (Stinski and Isomura, 2008).

b/ Le promoteur humain PGK induit une expression homogène et stable

Le promoteur cellulaire PGK (PPGK) induit une expression homogène du transgène

(Figure S4A #1) de façon indépendante du type cellulaire transduit (données non-montrées),

en accord avec (Qin et al., 2010). De plus, cette expression est moindre en absence d’intégrase

fonctionnelle (Figures S1 et S4B, D #1), ce qui suggère que le transgène doit être intégré

pour que le PPGK soit fonctionnel et/ou être localisé au sein d’un environnement chromatinien

favorable. Enfin, l’expression de la gfp contrôlée par PPGK est stable dans le temps, comme

observé au sein d’une population transduite mixte (Figure S5A #1) ou GFP+ (au moins

lorsque les vecteurs sont d’origine lentivirale, Figure 8C #1).

L’ensemble de ces données concernant la régulation de l’expression par les

promoteurs CMV et PGK sont en accord avec leurs caractéristiques intrinsèques

précédemment décrites (cf., Introduction § III.C.2). Nos observations sont également

cohérentes avec les études comparant l’expression transgénique contrôlée par ces promoteurs

à partir de vecteurs rétroviraux (Norrman et al., 2010; Wang et al., 2008a; Xia et al., 2007).

2/ Modulation de l’expression transgénique lors de l’insertion de séquences

hétérologues au sein des SIN-LTRs

a/ L’insertion dans les SIN-LTRs influence peu les étapes pré-intégratives du

cycle lentiviral

Une étude précédente de Kumar et al. a mis en évidence une réduction des titres

viraux de façon semi-logarithmique avec l’augmentation de la taille du vecteur (Kumar et al.,

2001). En accord avec cette étude, nos résultats montrent une tendance des larges inserts à

induire une diminution plus importante des titres viraux comparé aux inserts plus petits

(Figure 1B #1), quelque soit le promoteur interne, l’orientation de l’insert et sa capacité à

fixer CTCF. Nous avons toutefois observé que la réduction des titres viraux semblait plus

dépendante de la séquence insérée dans les SIN-LTRs et de son orientation, que de sa taille

(i.e., LacZ’ sens, Figure 1B #1). Cette diminution des titres viraux pourrait être liée à des

étapes pré-intégratives moins efficaces (dont la transcription inverse dans le cas de LacZ’,

179

Figure S2 #1) (Arumugam et al., 2009; Hanawa et al., 2009) et/ou au niveau d’expression au

sein de la cellule cible, comme détaillé dans le paragraphe b/ ci-dessous. Il est à noter que

l’influence de l’insulateur cHS4 (cloné en orientation sens ou antisens) sur les titres

lentiviraux est marginale, en accord avec les résultats d’études publiées qui montraient un

effet négligable (Yannaki et al., 2002) ou même positif (Emery et al., 2000) de cHS4.

Nous avons observé une efficacité d’intégration similaire des vecteurs utilisés dans

cette étude, quelque soit la séquence insérée dans les SIN-LTRs et sa taille (Figure 2 #1). Ces

donnés nous ont donc permis d’exclure une instabilité génétique des inserts (qui induirait une

perte du transgène après recombinaison homologue entre inserts) comme cause de la

diminution des titres viraux proposée par (Arumugam et al., 2009; Nielsen et al., 2009).

b/ Impacts de l’insertion dans les SIN-LTRs sur l’expression transgénique

Comme suggéré ci-dessus, la diminution des titres viraux pourrait provenir du niveau

d’expression au sein des cellules transduites puisque tous les inserts, excepté l’insulateur

cHS4 inséré en orientation antisens, diminuent significativement l’expression précoce de la

gfp après transduction (Figure 3 #1). En accord avec nos données, cHS4 cloné au sein des

(SIN-)LTRs a précédemment été décrit comme diminuant l’expression transgénique à partir

de promoteurs internes (Hanawa et al., 2009; Ramezani et al., 2003; Uchida et al., 2011;

Yannaki et al., 2002) mais ce phénomène avait été attribué à sa capacité de bloquer

l’enhancer du 3’ LTR (Yannaki et al., 2002)et/ou à des contraintes topologiques (Ramezani et

al., 2003; Yannaki et al., 2002). Nos résultats indiquent que l’atténuation de l’expression du

transgènique en présence de cHS4 inséré en orientation sens n’est pas spécifiquement lié à la

capacité de cHS4 à recruter CTCF puisqu’il persiste en présence de séquences ne fixant pas

CTCF au sein des SIN-LTRs (i.e., DS18 et LacZ’, Figure 3 #1). Il a été décrit que l’insertion

de séquences spacer potentiellement inertes d’origine exogène diminuait légèrement

l’expression du transgène (Aker et al., 2007). Nous avons observé un phénomène similaire :

DS18 et LacZ’, qui ont été sélectionnées comme des séquences contrôles, atténuent

significativement l’expression du transgène.

Ces observations soulèvent la question de l’existence de séquences totalement

inertes pouvant être utilisées comme contrôles lors de l’insertion au sein des vecteurs viraux.

Des études précédentes avaient montré que l’efficacité de transduction des vecteurs

contenant de larges inserts au sein des SIN-LTRs diminue en même temps qu’augmente la

taille de l’insert (Arumugam et al., 2009; Bos et al., 2010; Hanawa et al., 2009; Nielsen et al.,

2009). Nous avons également observé une tendance de la majorité des atténuations de

180

l’expression du transgène les plus prononcées à se produire avec les larges inserts (Figure 3

#1). Cependant, une exploration approfondie de ce phénomène à l’aide de séquences dérivées

de DS18 n’a pas confirmé cette tendance (Figure 6 #1). De plus, l’orientation de l’insert ainsi

que la délétion de certains éléments (e.g., MIRb de DS18) influencent significativement

l’atténuation de l’expression transgènique (au moins dans certains cas, Figures 3 et 6 #1).

L’ensemble de nos résultats indique que la taille de l’insert n’est pas le seul paramètre

qui influence l’expression du transgène à partir des vecteurs lentiviraux.

Il est à noter que l’atténuation de l’expression du transgène associée à l’insertion dans

les SIN-LTRs est visible en absence d’intégration de l’ADNv uniquement lorsque

l’expression est sous contrôle du PCMV (Figure 3A #1), de façon cohérente avec le fait que

l’expression à partir du PCMV soit indépendant de l’intégration de l’ADNv (cf., ci-dessus § a).

Enfin, l’atténuation de l’expression du transgène associé à l’insertion dans les SIN-LTRs que

nous décrivons est stable à long-terme, et ne modifie pas la variégation (Figure 8 #1).

c/ Hypothèses proposées pour expliquer l’atténuation de l’expression du

transgène associée à l’insertion dans les SIN-LTRs

Plusieurs phénomènes pourraient expliquer l’atténuation de l’expression du transgène

qui résulte de l’insertion de séquences au sein des SIN-LTRs. Premièrement, le recrutement

et/ou l’exclusion de facteurs cellulaires à proximité des insertions pourrait influencer l’activité

du promoteur interne. Cependant, l’atténuation de l’expression du transgène que nous avons

observé est indépendante de la séquence (Figures 3 et 4 #1) et du type cellulaire (Figure 5

#1), excluant de facto cette première possibilité. Deuxièmement, des changements de la

topologie ADN du LTR pourraient empêcher l’accès des facteurs de transcription au

promoteur interne. De plus, l’organisation 3D de l’ADNv pourrait être perturbée par la

présence d’inserts, et les caractères favorisant la transcription, comme la formation de boucles

qui provoquent un rapprochement des SIN-LTRs, pourraient être déstabilisées. En effet, le

provirus lentiviral a été décrit former une structure dépendante de la transcription en forme de

boucle entre le 5’LTR ou le PCMV et le signal poly(A) du 3’LTR, ce qui suggère que les

signaux de maturation du pré-ARNm pourraient affecter la transcription génique (Perkins et

al., 2008). Nous avons observé une corrélation entre l’expression de la gfp et les niveaux

d’ARNm sans détecter de changements significatifs de la stabilité des ARNs (Figure 7 #1), ce

qui exclut des modifications de la stabilité de l’ARN. Enfin, des changements de la topologie

de l’ARN pourraient également affecter la transcription/traduction. La région U3 du LTR est

inclut dans le 3’UTR de l’ARNm et pourrait donc affecter son repliement, de façon

181

dépendante de l’orientation, en particulier quand les inserts sont larges. Nous proposons que

ces modifications du repliement de l’ARN, ainsi que celui de l’ADN matrice, puissent

influencer directement le niveau de transcription du transgène. Des études supplémentaires

seront nécessaires pour mieux comprendre ce phénomène et peut-être identifier les éléments

topologiques nécessaires à une transcription optimale du transgène, grâce notamment à la

technique 3C (Perkins et al., 2008).

3/ Augmentation de l’expression du transgène grâce à l’insertion de cHS4

Nous avons cependant mis en évidence que l’insertion de l’insulateur cHS4 dans les

SIN-LTRs peut augmenter l’expression du transgène uniquement lorsqu’il est cloné dans

l’orientation antisens, en accord avec (Emery et al., 2000; Hanawa et al., 2009; Uchida et al.,

2011; Yannaki et al., 2002). Cette augmentation de l’expression du transgène en présence de

cHS4 en antisens est transitoire et/ou visible uniquement à partir des formes d’ADNni lorsque

l’expression est contrôlée par le PCMV (Figures 3A et 4B #1). A l’inverse, elle apparaît au

cours du temps à partir des formes d’ADN intégré lors de la transduction de contructions

contenant le PPGK (Figures 4A et 7A #1).

Ces observation suggèrent que l’expression à partir du PPGK est facilitée par l’activité

barrière et/ou la terminaison de la transcription que possède la séquence cHS4 insérée en

antisens (Hanawa et al., 2009). En accord avec (Hanawa et al., 2009), nous avons observé des

quantités plus importantes d’ARNm gfp grâce à l’insertion au sein des SIN-LTRs de

l’insulateur orienté en antisens (Figure 7A #1). En particulier, l’insertion de cHS4 orienté en

antisens pourrait favoriser la mise en place d’une structure ADN/ARN favorable à la

transcription à partir d’un promoteur faible comme le PPGK en augmentant la terminaison de la

transcription. Cette hypothèse est supportée par les études menées sur l’importance des

éléments d’initiation et de terminaison de la transcription dans la formation d’une boucle

ADN/ARN qui favorise l’expression du VIH-1 (Perkins et al., 2008) et du gène BRCA-1

(Tan-Wong et al., 2008). Dans le cas d’une expression régulée par le PCMV, cette structure ne

serait que transitoire et/ou observée uniquement à partir des formes non-intégrées de l’ADNv.

Ces données mettent l’accent sur le fait que cHS4 peut agir par plusieurs mécanismes, dont

l’amélioration de la terminaison, et/ou ses activités enhancer-blocker et barrière. Ces

mécanismes pourraient être non-exclusifs, comme décrit dans le cas de l’activité barrière de

cHS4 (en antisens) et de sa capacité à augmenter la terminaison de la transcription (Hanawa et

al., 2009).

182

L’ensemble de ces observations suggère que de multiples éléments influencent

l’expression du transgène à partir d’un vecteur donné, dont (mais peut-être pas limité à) le

type de vecteur et sa taille, la taille de l’insert et son orientation, le promoteur interne, la

fonctionnalité de l’intégrase et le transgène lui-même.

Nos travaux mettent en lumière l’hypothèse de l’existence d’une structure formée

entre l’ADNv et son transcrit dont la modification par insertion dans les SIN-LTRs pourrait

influencer le niveau de transcription à partir des formes virales intégrées ou non. L’impact de

l’insertion au sein des SIN-LTRs sur l’expression serait alors négatif pour la majorité des

séquences insérées (au moins dans une orientation) ou positif dans le cas d’un élément

spécifique comme l’insulateur cHS4 (en antisens). La topologie des éléments hétérologues

insérés dans les vecteurs viraux nécessiterait d’être davantage explorer dans le design de

vecteurs afin d’optimiser l’expression du transgène.

Notre étude a néanmoins permis de générer des vecteurs capables de moduler d’un

facteur 0,3 à 1,8 l’expression de façon stable ou transitoire (en fonction de l’intégration ou

non du transgène). L’utilisation des séquences que nous avons décrites réduire l’expression du

transgène pourrait être envisagée pour limiter une éventuelle toxicité de l’expression

transgénique, en complément de promoteurs tissu-spécifique ou inductibles par exemple.

II/ IMPACTS DES DETERMINANTS CELLULAIRES SUR

L’EXPRESSION LENTIVIRALE

Les composants de la signalisation et la réparation des dommages de l’ADN, dont le

complexe Ku, interagissent étroitement avec les rétrovirus à de nombreuses étapes de leur

cycle de multiplication (cf., Introduction, § IV.A/B). Nous avons donc analysé les impacts du

complexe Ku sur l’expression du VIH-1 (partie A) et de vecteurs dérivés (partie B).

A/ IMPACTS DU STATUT EN KU SUR L’EXPRESSION DU VIH-1

1/ Impact positif du statut en Ku sur l’expression du VIH-1 à court-terme

a/ La déplétion en Ku n’affecte pas les étapes pré-intégratives du cycle viral

La déplétion stable ou transitoire en Ku au sein des cellules HCT 116 Ku80+/-

n’a pas

d’impact ni sur la formation des cercles à 2-LTRs, ni sur l’intégration du VIH-1 (comparé aux

cellules WT, Figure 4B, D #2). De plus, en désaccord avec l’étude de (Zheng et al., 2011),

nous avons observé une même efficacité de transduction de vecteurs lentiviraux (i.e., XCD3

183

et SIN-PGK) produits en conditions proficientes ou déficientes en Ku au sein des cellules

cibles HCT 116 WT et Ku80+/-

(résultats non-montrés). Ces données indiquent que la

présence de Ku, d’origine endogène ou exogène, n’a pas d’impact sur les étapes pré-

intégratives du cycle lentiviral dans notre modèle.

L’ensemble de ces résultats est cohérent avec le rôle dispensable de Ku dans les étapes

pré-intégratives du cycle du VIH-1 décrit dans les cellules humaines (Ariumi et al., 2005;

Kilzer et al., 2003) ou issues d’autres mammifères [cheval (Kilzer et al., 2003) et rongeur

(Baekelandt et al., 2000; Kilzer et al., 2003)]. Ils sont cependant en désaccord avec des

observations précédentes sur le rôle positif de Ku sur la circularisation des espèces d’ADNv à

2-LTRs au sein de cellules de rongeurs [CHO (Li et al., 2001; Masson et al., 2007)] et

humaines [CEM (Jeanson et al., 2002)]. Nos résultats sont également en contradiction avec le

rôle décrit de Ku sur l’intégration du VIH-1 dans les cellules humaines [CEM (Jeanson et al.,

2002; Waninger et al., 2004); C8166 (Zheng et al., 2011)].

Ces controverses pourraient s’expliquer par le fait qu’une moindre intégration du VIH-

1 mise en évidence en absence de Ku puisse être le résultat de l’utilisation de virus réplicatifs,

comme dans (Jeanson et al., 2002; Waninger et al., 2004; Zheng et al., 2011), qui

s’exprimeraient peu et ne se multiplieraient donc pas avec la même efficacité au sein de

cellules déplétées en Ku. Il est à noter que l’utilisation de vecteurs VIH-1 pseudotypés avec

l’enveloppe VSV-G [dans notre étude et (Li et al., 2001; Masson et al., 2007)] pourrait

également influencer le cycle de multiplication du VIH-1 (comparé aux virus réplicatifs).

Toutefois, nous ne pouvons pas exclure une spécificité de chacun des types cellulaires étudiés

à nécessiter le recrutement et/ou l’activation d’une voie de réponse aux dommages de l’ADN

lors de l’infection lentivirale. Dans certains types cellulaires, l’intervention de celle-ci et/ou

d’un facteur spécifique en réponse aux signaux d’infection pourrait aussi être compensée via

l’utilisation de protéines pouvant le substituer.

b/ Impact positif du statut de Ku sur la transcription du LTR du VIH-1

Nous avons mis en évidence que la déplétion en Ku au sein des cellules HCT 116 a un

impact négatif sur la transcription du VIH-1 48/72 h post-transduction (Figures 2, 3 et S3 #2).

Cet effet n’est toutefois pas visible lorque l’expression de la gfp est sous contôle d’un

promoteur hétérologue interne CMV ou PGK (Figure 5A #2). L’impact positif du statut en

Ku sur l’expression du VIH-1 est donc spécifique du promoteur LTR. Ces résultats sont en

accord avec l’étude de Waninger et al. qui décrivait une activation transcriptionnelle Tat-

dépendante limitée du LTR du VIH-1 en absence de Ku80 (Waninger et al., 2004).

184

Cependant, dans notre étude, le statut en Ku a un effet stimulateur sur le LTR du VIH-1

indépendamment de la présence de protéines auxiliaires du VIH-1, dont Tat, et de la présence

de TAR non-muté (Figure 5A #2). Ce résultat exclut un effet direct de Ku sur Tat ou indirect

médié par la fixation de Ku sur TAR, comme suggéré dans (Kaczmarski and Khan, 1993;

Waninger et al., 2004).

Nous avons montré que l’absence d’impact de la mutation de la KBS, séquence

potentielle de fixation de Ku au sein du LTR du VIH-1 (Jeanson and Mouscadet, 2002), au

sein d’un vecteur dérivé du VIH-1 sur l’effet positif de Ku sur l’expression du VIH-1 (Figure

5A #2). Cette donnée suggère une action positive indirecte de Ku sur le LTR sans exlure le

possible recrutement de Ku (de façon non-spécifique) au niveau des extrémités de l’ADNv

qui pourrait aussi expliquer la spécificité de Ku pour le LTR (vs. promoteurs internes). De

plus, une prise en charge de l’ADNv par Ku pourrait influencer le site d’intégration et/ou

médié des interactions avec d’autres facteurs qui régulent positivement la transcription, dont

SP1, l’ARN pol II, Ets-1 ou DNA-PK (Bertinato et al., 2003; Choul-li et al., 2009; Tuteja and

Tuteja, 2000; Tyagi et al., 2011). En particulier, il a récemment été décrit le recrutement de

DNA-PK au niveau du LTR du VIH-1 qui interagit avec l’ARN pol II lors de la transcription

du VIH-1 (Tyagi et al., 2011). D’autres facteurs qui favorisent l’activité du promoteur LTR et

sont régulés positivement par Ku pourraient aussi être impliqués [e.g., NF-κB (Kim, 2008)].

Enfin, l’impact positif du statut en Ku sur l’expression précoce du VIH-1 nécessite

l’intégration de l’ADNv (Figure 5C #2), ce qui suggère que le processus d’intégration est, au

moins dans notre modèle, intimement lié au ciblage de l’ADNv dans un environnement local

qui favorise la transcription précoce du VIH-1 et/ou à l’établissement d’un tel environnement.

c/ Régulations mutuelles entre Ku et p53 et impact sur l’expression du VIH-1

Nous avons observé une régulation mutuelle des contenus en Ku et p53 (Figures 3C

et S1C #2), comme précédemment décrit (Ghosh et al., 2007; Li et al., 2002). Celle-ci

pourrait permettre de limiter les effets délétères causés par les dommages endogènes auxquels

sont confrontées les cellules HCT 116 Ku80+/-

(Li et al., 2002). Cette hypothèse est supportée

par l’observation d’une augmentation de la quantité de lésions et de l’activation de la DDR

médiée par p53 dans les cellules murines Ku80-/-

(Holcomb et al., 2008).

De plus, la déplétion de p53 dans les cellules HCT 116 Ku80+/-

permet de rétablir une

efficacité de transduction du VIH-1 intermédiaire à celles observées dans les cellules WT et

Ku80+/-

(Figure 3B #2). Cependant, p53 a un effet positif sur la transduction du VIH-1 dans

185

un contexte WT (Figure 3B #2), en accord avec des études précédentes (Mukerjee et al.,

2008; Pauls et al., 2006). L’efficacité de transduction du VIH-1 dans les cellules HCT 116

Ku80+/-

déplétées en p53 résulterait donc plutôt d’une balance entre effet négatif de la

déplétion en p53 et effet positif de l’augmentation en Ku sur la transduction du VIH-1 dans

ces cellules. Cependant, nous ne pouvons pas exclure qu’il n’y ait pas d’impact d’une

déplétion en Ku dans les cellules HCT 116 Ku80+/-

du fait d’une mortalité accrue des cellules

fortement déplétées en Ku (observable au microscope) et/ou du requièrement du peu de

protéines Ku restantes pour le maintien de ses fonctions essentielles.

p53 est un effecteur majeur dans la signalisation en réponse aux dommages de l’ADN.

De ce fait, la régulation réciproque des contenus en p53 et Ku et son impact sur l’expression

du VIH-1 suggère l’importance d’une protéine p53 fonctionnelle dans les modèles d’études

des rôles de la machinerie de réparation de l’ADN sur l’infection du VIH-1. Cependant, les

autres études ayant identifié Ku comme facteur clé de la réplication du VIH-1 (Genovesio et

al., 2011) ou, au moins, de son expression (Waninger et al., 2004) ont été menées au sein de

cellules possédant une protéine p53 non-fonctionnelle. Notamment, les fonctions de p53 ont

été inactivées par mutation(s), comme au sein de lignées lymphocytaires (e.g., CEM, Jurkat;

http://www-p53.iarc.fr) ou sont altérées par la présence d’une protéine virale [e.g., E6 du

papillomavirus au sein des cellules HeLa (Kessis et al., 1993)].

L’ensemble de nos résultats favoriserait donc plutôt un impact direct de Ku sur la

transcription du VIH-1 au sein des cellules HCT 116, sans exclure une possible contribution

de p53. Des expériences supplémentaires devront être conduites pour conclure quant au rôle

de p53 dans la régulation de l’expression du VIH-1 en absence de Ku grâce notamment à la

transduction du VIH-1 dans la lignée HCT 116 déficiente en p53 déplétée ou non en Ku.

2/ Impact négatif du statut en Ku sur l’établissement de la latence du VIH-1

A court-terme post-transduction, la diminution de l’expression du VIH-1 visible lors

de l’haplodéplétion de Ku80 au sein des cellules HCT 116 est réversible par traitement

cellulaire à la TSA (Figure 6B #2). Ainsi, lorsque le statut de Ku atteint une valeur critique

(i.e., inférieure ou égale à la moitié de la valeur normale), au moins la moitié des cellules

HCT 116 transduites possèdent un provirus peu ou pas exprimé qui pourrait être associé à une

ou des HDAC(s) (dont l’action est inhibée par la TSA).

L’impact négatif de la déplétion en Ku sur l’expression précoce du VIH-1 est corrélé à

une quantité deux fois supérieure d’ADNv à moyen terme (10 jours) post-transduction au sein

186

des cellules Ku80+/-

(Figure 4B, C #2). En accord avec les éléments discutés dans le

paragraphe I.A.1, une moindre expression du VIH-1 dans les cellules déplétées en Ku

diminuerait la proportion de cellules transduites contre-sélectionnées à moyen-terme. De plus,

l’haplodéplétion en Ku est associée à une réactivation 1,5 fois plus importante des provirus

latents (après traitement à la TSA ou au TNFα) dans une population mixte GFP+ et GFP

- de

cellules transduites (Figure 6A, D #2).

Ces résultats sont cohérents avec nos observations précédentes montrant une

stimulation de l’expression du VIH-1 après traitement au TNFα des cellules U1 qui était

augmentée après déplétion en Ku (Jeanson and Mouscadet, 2002). Cet état de latence

dépendrait donc de la disponibilité en NF-κB, comme décrit par (Duverger et al., 2009), mais

est (ré)activable après traitement adapté (e.g., TSA ou TNFα), en accord avec (Pearson et al.,

2008). Nos données sont en accord avec la description du LTR du provirus latent interagissant

(indirectement) avec des HDACs de classe I (i.e., HDAC-1, -2 et -3) qui induiraient la

formation d’une structure de la chromatine empêchant l’initiation de la transcription provirale

(Colin and Van Lint, 2009).

3/ Hypothèses de modes d’action de Ku

L’ensemble de nos résultats supporte l’hypothèse que des interactions

directes/indirectes entre l’ADN (pro)viral et Ku favoriseraient la transcription précoce du

LTR du VIH-1 lorsque celui-ci est intégré. Ku pourrait stimuler la transcription du LTR, de

façon indépendante de Tat, en interagissant directement avec le promoteur du VIH-1 [au

niveau d’une séquence autre que la KBS putative décrite par (Jeanson and Mouscadet, 2002)]

ou indirectement en recrutant des facteurs cellulaires qui régulent positivement l’expression

du VIH-1 (e.g., NF-κB) (cf., § II.A.1 ci-dessus). Cette stimulation précoce induirait cependant

une contre-sélection plus importante des cellules transduites à moyen terme post-transduction

(Figure 7 #2).

A l’inverse, la déplétion en Ku favoriserait la mise en place précoce d’une latence

post-intégrative du VIH-1. Celle-ci pourrait être établit et/ou maintenue par (i) une intégration

par défaut dans des régions peu exprimées du génome, soit une intégration silencieuse comme

suggéré par (Jordan et al., 2003); (ii) un recrutement (par défaut) de facteurs cellulaires

régulant négativement l’expression du VIH-1, dont des HDACs; (iii) un niveau insuffisant en

facteurs stimulant la transcription du LTR (e.g., NF-κB sous forme p65/p50); et/ou (iv) un

silencing épigénétique causé, par exemple, par la déacétylation des histones associées au

187

LTR. In fine, ce silencing transcriptionnel du VIH-1 résulterait en une proportion plus

importante de cellules contenant un provirus peu ou pas exprimé (mais réactivable), qui

seraient moins sujettes au phénomène de contre-sélection (Figures 6C et 7 #2).

Nos résultats ne nous ont pas permis d’identifier si l’action de Ku pouvait être engagée

à une étape précédant l’expression virale et, si oui, laquelle. Son absence ne modifie pas

l’efficacité d’intégration du VIH-1 dans notre modèle. Nous ne pouvons cependant pas

exclure un rôle de Ku dans la prise en charge de l’ADNv et/ou dans le ciblage de son

intégration. Les expériences de FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) 3D que nous avons

mené, en collaboration avec le laboratoire du Dr. Y. Vassetzky (Villejuif, France), pour tenter

de répondre à cette question n’ont pas été fructueuses, faute d’optimisation expérimentale. Il

serait cependant intéressant de les poursuivre, de façon couplée avec le pyroséquençage des

sites d’intégration du VIH-1 en condition compétente ou déplétée en Ku. Ces approches

permettraient de conclure quant à un éventuel rôle de Ku dans le ciblage de l’intégration du

VIH-1 dans des régions chromatiniennes transcriptionnellement actives des cellules

humaines. Elles pourraient être complétées par des expériences de ChIP (Chromatin

ImmunoPrecipitation) qui permettraient d’identifier les partenaires de Ku et/ou interagissant

avec le LTR dans un contexte haplodéplété en Ku.

L’ensemble de ces donnés a permis de démontrer que la déplétion de Ku qui stimule la

transcription précoce du LTR du VIH-1 favoriserait la mise en place d’une latence post-

intégrative au sein de cellules transduites moins susceptibles d’être contre-sélectionnées au

cours du temps.

Notre étude pointe les éventuels effets secondaires d’approches actuellement menées

contre les protéines de l’hôte impliquées dans la multiplication du VIH-1.

B/ IMPACT POSITIF DE LA DEPLETION EN KU SUR L’EXPRESSION TRANSGENIQUE

A PARTIR D’UN VECTEUR LENTIVIRAL INSULE

Nous avons mis en évidence que la déplétion en Ku favorise spécifiquement

l’expression de la gfp à partir du PPGK déjà augmentée par la présence de cHS4 en antisens au

sein des cellules HCT 116 Ku80+/-

(Figure 34).

Comme anticipé dans la discussion du paragraphe III.B de la section Résultats, nous

proposons que PARP-1 puisse être impliquée positivement dans le contrôle de l’activité

188

barrière de cHS4 en antisens (Aker et al., 2010). En effet, Ku et PARP-1 sont en compétition

pour la fixation des cassures double-brin de l’ADN (Ciccia and Elledge, 2010). De plus, la

fixation de l’une ou l’autre de ces protéines détermine le choix de la voie de réparation activée

[i.e., HR ou NHEJ (Mladenov and Iliakis, 2011)]. Une hypothèse intéressante repose sur

l’idée que le contexte haplodéplété en Ku pourrait favoriser la fixation de PARP-1 au niveau

de l’insulateur cHS4 qui augmenterait l’activité barrière de ce dernier et, par conséquent,

l’expression de la gfp. Il n’est cependant pas exclut une prise en charge des extrémités double-

brin de l’ADNv par défaut par PARP-1 en condition de déplétion en Ku qui serait non-

spécifique et pourrait expliquer l’augmentation progressive de l’expression de la gfp.

Cette hypothèse sera évaluée par la transduction des vecteurs SIN-PGK contenant ou

non cHS4 en antisens, couplées à des expériences de ChIP en conditions compétentes ou

déficientes pour PARP-1 au sein des cellules HCT 116 Ku80+/-

.

Ces observations suggèrent que le contexte cellulaire, dont la déplétion d’un facteur de

la réparation de l’ADN, pourrait influencer l’impact de séquences insulatrices comme cHS4,

ce qui est à prendre en considération lors du transfert de gène au sein de patients atteints de

cancers ou de maladies génétiques spécifiques.

189

CONCLUSIONS

190

L’ensemble de ces travaux de thèse a permis de mettre en évidence que l’expression

lentivirale est régulée par de nombreux paramètres, dont (i) le design du vecteur (e.g., LTR vs.

promoteur interne, intégrase fonctionnelle vs. mutée, absence vs. présence de séquences

hétérologues au sein des SIN-LTRs et leur orientation), (ii) le type cellulaire transduit et son

fond génétique (e.g., niveaux d’expression en Ku et p53), et (iii) le temps écoulé depuis la

transduction, comme résumé dans le tableau 9 ci-dessous.

Tableau 9 : Bilan des différents paramètres du design des vecteurs ou du contexte

cellulaire qui influencent l’expression trangénique en fonction du vecteur utilisé. Il est à

noter que « court et moyen terme » se réfèrent à 2 et 10 jours post-transduction dans notre

étude. Abréviations : as, antisens ; (+), effet positif ; (-), effet négatif ; Nd, non-déterminé. Vecteur SIN-PGK Vecteur SIN-CMV Vecteur LTR VIH-1

Caractéristiques du vecteur

Promoteur interne

de type CGI,

SIN-LTRs

Promoteur interne

de type TATA-box,

SIN-LTRs

Promoteur LTR à

TATA-box,

Expression des

protéines du VIH-1

Pro

mo

eteu

r

Extinction/contre-sélection Non Oui (extinction)

Oui (contre-

sélection associée à

l’expression de Vpr)

Réactivation Non Nd Oui

Expression à partir des formes

d’ADNv non-intégré Faible

Oui (équivalente à

celle à partir d’ADN

intégré)

Oui

Impact du type cellulaire

sur l’expression Non Nd Oui

Des

ign

des

SIN

-LT

Rs

Impact du clonage de larges inserts

(e.g., DS18) au sein des SIN-LTRs

sur l’expression

- - Nd

Impact de l’insulateur cHS4 as sur

l’expression du provirus + + Nd

Impact de l’insulateur cHS4 as

sur l’expression des formes

d’ADNv non intégré

- + Nd

Co

nte

xte

cel

lula

ire

Impact de la déplétion en Ku

(en absence de cHS4 as)

à court et moyen terme

Pas d’impact Pas d’impact

- sur l’expression (et

la contre-sélection),

+ sur la latence

Impact de la déplétion en Ku

(en présence de cHS4 as)

sur l’expression

+ Pas d’impact Nd

Impact de la déplétion en p53

sur la transduction Nd Nd

- en condition WT,

+ en condition

Ku80+/-

191

L’anayse du design de vecteurs dérivés du VIH-1 sur l’expression transgénique nous a

permis de montrer que l’expression à partir de promoteurs viraux fortement régulés, comme le

CMV, est variable en fonction du type cellulaire transduit et soumise à extinction. A l’inverse,

un promoteur décrit comme constitutif et ubiquitaire tel que le PPGK a une activité

indépendante du contexte cellulaire transduit et stable au cours du temps. En absence

d’intégration de l’ADNv, la force du PCMV lui confère la capacité d’être activé alors que le

PPGK doit être intégré pour être fonctionnel.

Néanmoins, la présence de séquences hétérologues dans les SIN-LTRs atténue

l’expression transgénique contrôlée par le PPGK ainsi que le PCMV. Ce type d’insertion pourrait

affecter la formation d’une structure ADN/ARN décrite comme favorisant la transcription.

Toutefois, le clonage de séquences spécifiques dans les SIN-LTRs, comme l’insulteur cHS4

en orientation antisens, peut influencer positivement l’expression à partir du PPGK et du PCMV

d’un transgène intégré (et non-intégré dans le cas de ce dernier). Cet effet est visible à court-

et moyen-terme de façon dépendante du type cellulaire transduit et, dans le cas du PPGK, de la

présence de facteurs cellulaires comme Ku.

Nous avons également démontré que le contexte cellulaire de transduction, et en

particulier, le statut de la machinerie de réparation de l’ADN, influence l’expression du LTR

du VIH-1. Ainsi, la déplétion de Ku au sein des cellules HCT 116 diminue l’expression

précoce du VIH-1 intégré de façon spécifique du LTR et indépendante de Tat. De plus, la

déplétion en Ku dans ces cellules favoriserait un état de latence transcriptionnelle

(re)activable du provirus qui limiterait la contre-sélection des cellules transduites. A l’inverse,

en présence d’un niveau normal en Ku, les cellules exprimant le VIH-1 seraient contre-

sélectionnées au cours du temps de façon dépendante de l’expression de Vpr.

Notre étude confirme l’importance de certains déterminants viraux et cellulaires dans

la régulation de l’expression lentivirale. Elle met notamment l’accent sur la nécessité

d’étudier de façon approfondie les éléments topologiques hétérologues indispensables à une

expression optimale en vu de l’amélioration du design des vecteurs lentiviraux. De plus, nos

travaux suggèrent que le contexte cellulaire pourrait influencer l’impact de séquences

insulatrices comme cHS4, ce qui est à prendre en considération lors du transfert de gène au

sein de patients atteints de cancers ou de maladies génétiques spécifiques. Enfin, nos données

mettent en avant les éventuels effets secondaires que pourraient avoir les approches

actuellement menées visant à cibler les protéines de l’hôte impliquées dans l’expression du

VIH-1.

192

BIBLIOGRAPHIE

193

Aiken, C. (1997) Pseudotyping human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) by the glycoprotein of

vesicular stomatitis virus targets HIV-1 entry to an endocytic pathway and suppresses both the

requirement for Nef and the sensitivity to cyclosporin A. J Virol, 71, 5871-5877.

Aker, M., Bomsztyk, K. and Emery, D.W. (2010) Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1)

contributes to the barrier function of a vertebrate chromatin insulator. J Biol Chem, 285,

37589-37597.

Aker, M., Tubb, J., Groth, A.C., Bukovsky, A.A., Bell, A.C., Felsenfeld, G., Kiem, H.P.,

Stamatoyannopoulos, G. and Emery, D.W. (2007) Extended core sequences from the cHS4

insulator are necessary for protecting retroviral vectors from silencing position effects. Hum

Gene Ther, 18, 333-343.

Allers, K., Hutter, G., Hofmann, J., Loddenkemper, C., Rieger, K., Thiel, E. and Schneider, T. (2011)

Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation.

Blood, 117, 2791-2799.

Andersen, J.L., Le Rouzic, E. and Planelles, V. (2008) HIV-1 Vpr: mechanisms of G2 arrest and

apoptosis. Exp Mol Pathol, 85, 2-10.

Andersen, J.L., Zimmerman, E.S., DeHart, J.L., Murala, S., Ardon, O., Blackett, J., Chen, J. and

Planelles, V. (2005) ATR and GADD45alpha mediate HIV-1 Vpr-induced apoptosis. Cell

Death Differ, 12, 326-334.

Aravind, L. and Koonin, E.V. (2001) Prokaryotic homologs of the eukaryotic DNA-end-binding

protein Ku, novel domains in the Ku protein and prediction of a prokaryotic double-strand

break repair system. Genome Res, 11, 1365-1374.

Arhel, N. (2010) Revisiting HIV-1 uncoating. Retrovirology, 7, 96.

Ariumi, Y. and Trono, D. (2006) Ataxia-telangiectasia-mutated (ATM) protein can enhance human

immunodeficiency virus type 1 replication by stimulating Rev function. J Virol, 80, 2445-

2452.

Ariumi, Y., Turelli, P., Masutani, M. and Trono, D. (2005) DNA damage sensors ATM, ATR, DNA-

PKcs, and PARP-1 are dispensable for human immunodeficiency virus type 1 integration. J

Virol, 79, 2973-2978.

Arumugam, P.I., Urbinati, F., Velu, C.S., Higashimoto, T., Grimes, H.L. and Malik, P. (2009) The 3'

region of the chicken hypersensitive site-4 insulator has properties similar to its core and is

required for full insulator activity. PLoS One, 4, e6995.

Baekelandt, V., Claeys, A., Cherepanov, P., De Clercq, E., De Strooper, B., Nuttin, B. and Debyser, Z.

(2000) DNA-Dependent protein kinase is not required for efficient lentivirus integration. J

Virol, 74, 11278-11285.

Baiker, A., Maercker, C., Piechaczek, C., Schmidt, S.B., Bode, J., Benham, C. and Lipps, H.J. (2000)

Mitotic stability of an episomal vector containing a human scaffold/matrix-attached region is

provided by association with nuclear matrix. Nat Cell Biol, 2, 182-184.

Banasik, M.B. and McCray, P.B., Jr. (2010) Integrase-defective lentiviral vectors: progress and

applications. Gene Ther, 17, 150-157.

Bannert, N. and Kurth, R. (2004) Retroelements and the human genome: new perspectives on an old

relation. Proc Natl Acad Sci U S A, 101 Suppl 2, 14572-14579.

Barboric, M., Nissen, R.M., Kanazawa, S., Jabrane-Ferrat, N. and Peterlin, B.M. (2001) NF-kappaB

binds P-TEFb to stimulate transcriptional elongation by RNA polymerase II. Mol Cell, 8, 327-

337.

Barre-Sinoussi, F., Chermann, J.C., Rey, F., Nugeyre, M.T., Chamaret, S., Gruest, J., Dauguet, C.,

Axler-Blin, C., Vezinet-Brun, F., Rouzioux, C., Rozenbaum, W. and Montagnier, L. (1983)

Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency

syndrome (AIDS). Science, 220, 868-871.

Bastone, P. and Lochelt, M. (2004) Kinetics and characteristics of replication-competent revertants

derived from self-inactivating foamy virus vectors. Gene Ther, 11, 465-473.

Baumann, M., Pontiller, J. and Ernst, W. (2010) Structure and basal transcription complex of RNA

polymerase II core promoters in the mammalian genome: an overview. Mol Biotechnol, 45,

241-247.

194

Bayer, M., Kantor, B., Cockrell, A., Ma, H., Zeithaml, B., Li, X., McCown, T. and Kafri, T. (2008) A

large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector.

Mol Ther, 16, 1968-1976.

Beck-Engeser, G.B., Eilat, D., Harrer, T., Jack, H.M. and Wabl, M. (2009) Early onset of autoimmune

disease by the retroviral integrase inhibitor raltegravir. Proc Natl Acad Sci U S A, 106, 20865-

20870.

Bennasser, Y., Le, S.Y., Benkirane, M. and Jeang, K.T. (2005) Evidence that HIV-1 encodes an

siRNA and a suppressor of RNA silencing. Immunity, 22, 607-619.

Bennasser, Y., Yeung, M.L. and Jeang, K.T. (2006) HIV-1 TAR RNA subverts RNA interference in

transfected cells through sequestration of TAR RNA-binding protein, TRBP. J Biol Chem,

281, 27674-27678.

Bergeron, L. and Sodroski, J. (1992) Dissociation of unintegrated viral DNA accumulation from

single-cell lysis induced by human immunodeficiency virus type 1. J Virol, 66, 5777-5787.

Berkhout, B., Arts, K. and Abbink, T.E. (2011) Ribosomal scanning on the 5'-untranslated region of

the human immunodeficiency virus RNA genome. Nucleic Acids Res, 39, 5232-5244.

Berro, R., Kehn, K., de la Fuente, C., Pumfery, A., Adair, R., Wade, J., Colberg-Poley, A.M., Hiscott,

J. and Kashanchi, F. (2006) Acetylated Tat regulates human immunodeficiency virus type 1

splicing through its interaction with the splicing regulator p32. J Virol, 80, 3189-3204.

Bertinato, J., Tomlinson, J.J., Schild-Poulter, C. and Hache, R.J. (2003) Evidence implicating Ku

antigen as a structural factor in RNA polymerase II-mediated transcription. Gene, 302, 53-64.

Beutler, E. (2007) PGK deficiency. Br J Haematol, 136, 3-11.

Birney, E., Stamatoyannopoulos, J.A., Dutta, A., Guigo, R., Gingeras, T.R., Margulies, E.H., Weng,

Z., Snyder, M., Dermitzakis, E.T., Thurman, R.E., Kuehn, M.S., Taylor, C.M., Neph, S.,

Koch, C.M., Asthana, S., Malhotra, A., Adzhubei, I., Greenbaum, J.A., Andrews, R.M.,

Flicek, P., Boyle, P.J., Cao, H., Carter, N.P., Clelland, G.K., Davis, S., Day, N., Dhami, P.,

Dillon, S.C., Dorschner, M.O., Fiegler, H., Giresi, P.G., Goldy, J., Hawrylycz, M., Haydock,

A., Humbert, R., James, K.D., Johnson, B.E., Johnson, E.M., Frum, T.T., Rosenzweig, E.R.,

Karnani, N., Lee, K., Lefebvre, G.C., Navas, P.A., Neri, F., Parker, S.C., Sabo, P.J.,

Sandstrom, R., Shafer, A., Vetrie, D., Weaver, M., Wilcox, S., Yu, M., Collins, F.S., Dekker,

J., Lieb, J.D., Tullius, T.D., Crawford, G.E., Sunyaev, S., Noble, W.S., Dunham, I., Denoeud,

F., Reymond, A., Kapranov, P., Rozowsky, J., Zheng, D., Castelo, R., Frankish, A., Harrow,

J., Ghosh, S., Sandelin, A., Hofacker, I.L., Baertsch, R., Keefe, D., Dike, S., Cheng, J., Hirsch,

H.A., Sekinger, E.A., Lagarde, J., Abril, J.F., Shahab, A., Flamm, C., Fried, C., Hackermuller,

J., Hertel, J., Lindemeyer, M., Missal, K., Tanzer, A., Washietl, S., Korbel, J., Emanuelsson,

O., Pedersen, J.S., Holroyd, N., Taylor, R., Swarbreck, D., Matthews, N., Dickson, M.C.,

Thomas, D.J., Weirauch, M.T., Gilbert, J., Drenkow, J., Bell, I., Zhao, X., Srinivasan, K.G.,

Sung, W.K., Ooi, H.S., Chiu, K.P., Foissac, S., Alioto, T., Brent, M., Pachter, L., Tress, M.L.,

Valencia, A., Choo, S.W., Choo, C.Y., Ucla, C., Manzano, C., Wyss, C., Cheung, E., Clark,

T.G., Brown, J.B., Ganesh, M., Patel, S., Tammana, H., Chrast, J., Henrichsen, C.N., Kai, C.,

Kawai, J., Nagalakshmi, U., Wu, J., Lian, Z., Lian, J., Newburger, P., Zhang, X., Bickel, P.,

Mattick, J.S., Carninci, P., Hayashizaki, Y., Weissman, S., Hubbard, T., Myers, R.M., Rogers,

J., Stadler, P.F., Lowe, T.M., Wei, C.L., Ruan, Y., Struhl, K., Gerstein, M., Antonarakis, S.E.,

Fu, Y., Green, E.D., Karaoz, U., Siepel, A., Taylor, J., Liefer, L.A., Wetterstrand, K.A., Good,

P.J., Feingold, E.A., Guyer, M.S., Cooper, G.M., Asimenos, G., Dewey, C.N., Hou, M.,

Nikolaev, S., Montoya-Burgos, J.I., Loytynoja, A., Whelan, S., Pardi, F., Massingham, T.,

Huang, H., Zhang, N.R., Holmes, I., Mullikin, J.C., Ureta-Vidal, A., Paten, B., Seringhaus,

M., Church, D., Rosenbloom, K., Kent, W.J., Stone, E.A., Batzoglou, S., Goldman, N.,

Hardison, R.C., Haussler, D., Miller, W., Sidow, A., Trinklein, N.D., Zhang, Z.D., Barrera, L.,

Stuart, R., King, D.C., Ameur, A., Enroth, S., Bieda, M.C., Kim, J., Bhinge, A.A., Jiang, N.,

Liu, J., Yao, F., Vega, V.B., Lee, C.W., Ng, P., Shahab, A., Yang, A., Moqtaderi, Z., Zhu, Z.,

Xu, X., Squazzo, S., Oberley, M.J., Inman, D., Singer, M.A., Richmond, T.A., Munn, K.J.,

Rada-Iglesias, A., Wallerman, O., Komorowski, J., Fowler, J.C., Couttet, P., Bruce, A.W.,

Dovey, O.M., Ellis, P.D., Langford, C.F., Nix, D.A., Euskirchen, G., Hartman, S., Urban,

A.E., Kraus, P., Van Calcar, S., Heintzman, N., Kim, T.H., Wang, K., Qu, C., Hon, G., Luna,

R., Glass, C.K., Rosenfeld, M.G., Aldred, S.F., Cooper, S.J., Halees, A., Lin, J.M., Shulha,

195

H.P., Zhang, X., Xu, M., Haidar, J.N., Yu, Y., Ruan, Y., Iyer, V.R., Green, R.D., Wadelius,

C., Farnham, P.J., Ren, B., Harte, R.A., Hinrichs, A.S., Trumbower, H., Clawson, H.,

Hillman-Jackson, J., Zweig, A.S., Smith, K., Thakkapallayil, A., Barber, G., Kuhn, R.M.,

Karolchik, D., Armengol, L., Bird, C.P., de Bakker, P.I., Kern, A.D., Lopez-Bigas, N., Martin,

J.D., Stranger, B.E., Woodroffe, A., Davydov, E., Dimas, A., Eyras, E., Hallgrimsdottir, I.B.,

Huppert, J., Zody, M.C., Abecasis, G.R., Estivill, X., Bouffard, G.G., Guan, X., Hansen, N.F.,

Idol, J.R., Maduro, V.V., Maskeri, B., McDowell, J.C., Park, M., Thomas, P.J., Young, A.C.,

Blakesley, R.W., Muzny, D.M., Sodergren, E., Wheeler, D.A., Worley, K.C., Jiang, H.,

Weinstock, G.M., Gibbs, R.A., Graves, T., Fulton, R., Mardis, E.R., Wilson, R.K., Clamp, M.,

Cuff, J., Gnerre, S., Jaffe, D.B., Chang, J.L., Lindblad-Toh, K., Lander, E.S., Koriabine, M.,

Nefedov, M., Osoegawa, K., Yoshinaga, Y., Zhu, B. and de Jong, P.J. (2007) Identification

and analysis of functional elements in 1% of the human genome by the ENCODE pilot

project. Nature, 447, 799-816.

Blazkova, J., Murray, D., Justement, J.S., Funk, E.K., Nelson, A.K., Moir, S., Chun, T.W. and Fauci,

A.S. (2012) Paucity of HIV DNA methylation in latently infected, resting CD4+ T cells from

infected individuals receiving antiretroviral therapy. J Virol, 86, 5390-5392.

Blazkova, J., Trejbalova, K., Gondois-Rey, F., Halfon, P., Philibert, P., Guiguen, A., Verdin, E., Olive,

D., Van Lint, C., Hejnar, J. and Hirsch, I. (2009) CpG methylation controls reactivation of

HIV from latency. PLoS Pathog, 5, e1000554.

Boese, A., Sommer, P., Holzer, D., Maier, R. and Nehrbass, U. (2009) Integrase interactor 1

(Ini1/hSNF5) is a repressor of basal human immunodeficiency virus type 1 promoter activity.

J Gen Virol, 90, 2503-2512.

Bos, T.J., De Bruyne, E., Van Lint, S., Heirman, C. and Vanderkerken, K. (2010) Large double copy

vectors are functional but show a size-dependent decline in transduction efficiency. J

Biotechnol, 150, 37-40.

Boulanger, M.C., Liang, C., Russell, R.S., Lin, R., Bedford, M.T., Wainberg, M.A. and Richard, S.

(2005) Methylation of Tat by PRMT6 regulates human immunodeficiency virus type 1 gene

expression. J Virol, 79, 124-131.

Brandeis, M., Frank, D., Keshet, I., Siegfried, Z., Mendelsohn, M., Nemes, A., Temper, V., Razin, A.

and Cedar, H. (1994) Sp1 elements protect a CpG island from de novo methylation. Nature,

371, 435-438.

Brass, A.L., Dykxhoorn, D.M., Benita, Y., Yan, N., Engelman, A., Xavier, R.J., Lieberman, J. and

Elledge, S.J. (2008) Identification of host proteins required for HIV infection through a

functional genomic screen. Science, 319, 921-926.

Bray, M., Prasad, S., Dubay, J.W., Hunter, E., Jeang, K.T., Rekosh, D. and Hammarskjold, M.L.

(1994) A small element from the Mason-Pfizer monkey virus genome makes human

immunodeficiency virus type 1 expression and replication Rev-independent. Proc Natl Acad

Sci U S A, 91, 1256-1260.

Brin, E., Yi, J., Skalka, A.M. and Leis, J. (2000) Modeling the late steps in HIV-1 retroviral integrase-

catalyzed DNA integration. J Biol Chem, 275, 39287-39295.

Brown, P.O., Bowerman, B., Varmus, H.E. and Bishop, J.M. (1989) Retroviral integration: structure

of the initial covalent product and its precursor, and a role for the viral IN protein. Proc Natl

Acad Sci U S A, 86, 2525-2529.

Brussel, A. and Sonigo, P. (2004) Evidence for gene expression by unintegrated human

immunodeficiency virus type 1 DNA species. J Virol, 78, 11263-11271.

Bukrinsky, M.I., Sharova, N., Dempsey, M.P., Stanwick, T.L., Bukrinskaya, A.G., Haggerty, S. and

Stevenson, M. (1992) Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1

preintegration complexes. Proc Natl Acad Sci U S A, 89, 6580-6584.

Bukrinsky, M.I., Sharova, N., McDonald, T.L., Pushkarskaya, T., Tarpley, W.G. and Stevenson, M.

(1993) Association of integrase, matrix, and reverse transcriptase antigens of human

immunodeficiency virus type 1 with viral nucleic acids following acute infection. Proc Natl

Acad Sci U S A, 90, 6125-6129.

Bukrinsky, M.I., Stanwick, T.L., Dempsey, M.P. and Stevenson, M. (1991) Quiescent T lymphocytes

as an inducible virus reservoir in HIV-1 infection. Science, 254, 423-427.

196

Burns, J.C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M. and Yee, J.K. (1993) Vesicular stomatitis

virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and

efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A,

90, 8033-8037.

Bushman, F., Lewinski, M., Ciuffi, A., Barr, S., Leipzig, J., Hannenhalli, S. and Hoffmann, C. (2005)

Genome-wide analysis of retroviral DNA integration. Nat Rev Microbiol, 3, 848-858.

Bushman, F.D., Malani, N., Fernandes, J., D'Orso, I., Cagney, G., Diamond, T.L., Zhou, H., Hazuda,

D.J., Espeseth, A.S., Konig, R., Bandyopadhyay, S., Ideker, T., Goff, S.P., Krogan, N.J.,

Frankel, A.D., Young, J.A. and Chanda, S.K. (2009) Host cell factors in HIV replication:

meta-analysis of genome-wide studies. PLoS Pathog, 5, e1000437.

Butler, J.E. and Kadonaga, J.T. (2002) The RNA polymerase II core promoter: a key component in the

regulation of gene expression. Genes Dev, 16, 2583-2592.

Callen, B.P., Shearwin, K.E. and Egan, J.B. (2004) Transcriptional interference between convergent

promoters caused by elongation over the promoter. Mol Cell, 14, 647-656.

Calzado, M.A., Sancho, R. and Munoz, E. (2004) Human immunodeficiency virus type 1 Tat increases

the expression of cleavage and polyadenylation specificity factor 73-kilodalton subunit

modulating cellular and viral expression. J Virol, 78, 6846-6854.

Cara, A., Cereseto, A., Lori, F. and Reitz, M.S., Jr. (1996) HIV-1 protein expression from synthetic

circles of DNA mimicking the extrachromosomal forms of viral DNA. J Biol Chem, 271,

5393-5397.

Carteau, S., Hoffmann, C. and Bushman, F. (1998) Chromosome structure and human

immunodeficiency virus type 1 cDNA integration: centromeric alphoid repeats are a

disfavored target. J Virol, 72, 4005-4014.

Cattoglio, C., Facchini, G., Sartori, D., Antonelli, A., Miccio, A., Cassani, B., Schmidt, M., von Kalle,

C., Howe, S., Thrasher, A.J., Aiuti, A., Ferrari, G., Recchia, A. and Mavilio, F. (2007) Hot

spots of retroviral integration in human CD34+ hematopoietic cells. Blood, 110, 1770-1778.

Cavazzana-Calvo, M., Payen, E., Negre, O., Wang, G., Hehir, K., Fusil, F., Down, J., Denaro, M.,

Brady, T., Westerman, K., Cavallesco, R., Gillet-Legrand, B., Caccavelli, L., Sgarra, R.,

Maouche-Chretien, L., Bernaudin, F., Girot, R., Dorazio, R., Mulder, G.J., Polack, A., Bank,

A., Soulier, J., Larghero, J., Kabbara, N., Dalle, B., Gourmel, B., Socie, G., Chretien, S.,

Cartier, N., Aubourg, P., Fischer, A., Cornetta, K., Galacteros, F., Beuzard, Y., Gluckman, E.,

Bushman, F., Hacein-Bey-Abina, S. and Leboulch, P. (2010) Transfusion independence and

HMGA2 activation after gene therapy of human beta-thalassaemia. Nature, 467, 318-322.

Cha, S., Lim, C., Lee, J.Y., Song, Y.J., Park, J., Choe, J. and Seo, T. (2010) DNA-PK/Ku complex

binds to latency-associated nuclear antigen and negatively regulates Kaposi's sarcoma-

associated herpesvirus latent replication. Biochem Biophys Res Commun, 394, 934-939.

Chen, C. and Okayama, H. (1987) High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid

DNA. Mol Cell Biol, 7, 2745-2752.

Chen, C.C., Yang, Y.C., Wang, W.H., Chen, C.S. and Chang, L.K. (2011) Enhancement of Zta-

activated lytic transcription of Epstein-Barr virus by Ku80. J Gen Virol, 92, 661-668.

Chen, H. and Engelman, A. (1998) The barrier-to-autointegration protein is a host factor for HIV type

1 integration. Proc Natl Acad Sci U S A, 95, 15270-15274.

Chen, R., Le Rouzic, E., Kearney, J.A., Mansky, L.M. and Benichou, S. (2004) Vpr-mediated

incorporation of UNG2 into HIV-1 particles is required to modulate the virus mutation rate

and for replication in macrophages. J Biol Chem, 279, 28419-28425.

Chipitsyna, G., Sawaya, B.E., Khalili, K. and Amini, S. (2006) Cooperativity between Rad51 and

C/EBP family transcription factors modulates basal and Tat-induced activation of the HIV-1

LTR in astrocytes. J Cell Physiol, 207, 605-613.

Chiu, Y.L., Ho, C.K., Saha, N., Schwer, B., Shuman, S. and Rana, T.M. (2002) Tat stimulates

cotranscriptional capping of HIV mRNA. Mol Cell, 10, 585-597.

Choi, Y.K., Nash, K., Byrne, B.J., Muzyczka, N. and Song, S. (2010) The effect of DNA-dependent

protein kinase on adeno-associated virus replication. PLoS One, 5, e15073.

Choul-li, S., Drobecq, H. and Aumercier, M. (2009) DNA-dependent protein kinase is a novel

interaction partner for Ets-1 isoforms. Biochem Biophys Res Commun, 390, 839-844.

197

Christ, F., Thys, W., De Rijck, J., Gijsbers, R., Albanese, A., Arosio, D., Emiliani, S., Rain, J.C.,

Benarous, R., Cereseto, A. and Debyser, Z. (2008) Transportin-SR2 imports HIV into the

nucleus. Curr Biol, 18, 1192-1202.

Chung, J.H., Whiteley, M. and Felsenfeld, G. (1993) A 5' element of the chicken beta-globin domain

serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in

Drosophila. Cell, 74, 505-514.

Ciccia, A. and Elledge, S.J. (2010) The DNA damage response: making it safe to play with knives.

Mol Cell, 40, 179-204.

Ciuffi, A. (2008) Mechanisms governing lentivirus integration site selection. Curr Gene Ther, 8, 419-

429.

Ciuffi, A., Diamond, T.L., Hwang, Y., Marshall, H.M. and Bushman, F.D. (2006) Modulating target

site selection during human immunodeficiency virus DNA integration in vitro with an

engineered tethering factor. Hum Gene Ther, 17, 960-967.

Ciuffi, A., Llano, M., Poeschla, E., Hoffmann, C., Leipzig, J., Shinn, P., Ecker, J.R. and Bushman, F.

(2005) A role for LEDGF/p75 in targeting HIV DNA integration. Nat Med, 11, 1287-1289.

Clavel, F., Guetard, D., Brun-Vezinet, F., Chamaret, S., Rey, M.A., Santos-Ferreira, M.O., Laurent,

A.G., Dauguet, C., Katlama, C., Rouzioux, C. and et al. (1986) Isolation of a new human

retrovirus from West African patients with AIDS. Science, 233, 343-346.

Clumeck, N. (1993) Current use of anti-HIV drugs in AIDS. J Antimicrob Chemother, 32 Suppl A,

133-138.

Coffin, J., Haase, A., Levy, J.A., Montagnier, L., Oroszlan, S., Teich, N., Temin, H., Toyoshima, K.,

Varmus, H., Vogt, P. and et al. (1986) What to call the AIDS virus? Nature, 321, 10.

Coiras, M., Lopez-Huertas, M.R., Perez-Olmeda, M. and Alcami, J. (2009) Understanding HIV-1

latency provides clues for the eradication of long-term reservoirs. Nat Rev Microbiol, 7, 798-

812.

Coiras, M., Lopez-Huertas, M.R., Rullas, J., Mittelbrunn, M. and Alcami, J. (2007) Basal shuttle of

NF-kappaB/I kappaB alpha in resting T lymphocytes regulates HIV-1 LTR dependent

expression. Retrovirology, 4, 56.

Colin, L. and Van Lint, C. (2009) Molecular control of HIV-1 postintegration latency: implications for

the development of new therapeutic strategies. Retrovirology, 6, 111.

Corbeau, P. (2008) Interfering RNA and HIV: reciprocal interferences. PLoS Pathog, 4, e1000162.

Coroadinha, A.S., Gama-Norton, L., Amaral, A.I., Hauser, H., Alves, P.M. and Cruz, P.E. (2010)

Production of retroviral vectors: review. Curr Gene Ther, 10, 456-473.

Cortez, K.J. and Maldarelli, F. (2011) Clinical management of HIV drug resistance. Viruses, 3, 347-

378.

Cosnefroy, O., Tocco, A., Lesbats, P., Thierry, S., Calmels, C., Wiktorowicz, T., Reigadas, S., Kwon,

Y., De Cian, A., Desfarges, S., Bonot, P., San Filippo, J., Litvak, S., Cam, E.L., Rethwilm, A.,

Fleury, H., Connell, P.P., Sung, P., Delelis, O., Andreola, M.L. and Parissi, V. (2012)

Stimulation of the human RAD51 nucleofilament restricts HIV-1 integration in vitro and in

infected cells. J Virol, 86, 513-526.

Cossarizza, A. (2008) Apoptosis and HIV infection: about molecules and genes. Curr Pharm Des, 14,

237-244.

Coull, J.J., Romerio, F., Sun, J.M., Volker, J.L., Galvin, K.M., Davie, J.R., Shi, Y., Hansen, U. and

Margolis, D.M. (2000) The human factors YY1 and LSF repress the human

immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat via recruitment of histone deacetylase 1. J

Virol, 74, 6790-6799.

Crampton, N., Bonass, W.A., Kirkham, J., Rivetti, C. and Thomson, N.H. (2006) Collision events

between RNA polymerases in convergent transcription studied by atomic force microscopy.

Nucleic Acids Res, 34, 5416-5425.

Cron, R.Q., Bartz, S.R., Clausell, A., Bort, S.J., Klebanoff, S.J. and Lewis, D.B. (2000) NFAT1

enhances HIV-1 gene expression in primary human CD4 T cells. Clin Immunol, 94, 179-191.

Cummins, N.W. and Badley, A.D. (2010) Mechanisms of HIV-associated lymphocyte apoptosis:

2010. Cell Death Dis, 1, e99.

198

D'Silva, I., Pelletier, J.D., Lagueux, J., D'Amours, D., Chaudhry, M.A., Weinfeld, M., Lees-Miller,

S.P. and Poirier, G.G. (1999) Relative affinities of poly(ADP-ribose) polymerase and DNA-

dependent protein kinase for DNA strand interruptions. Biochim Biophys Acta, 1430, 119-126.

Daly, E.B., Wind, T., Jiang, X.M., Sun, L. and Hogg, P.J. (2004) Secretion of phosphoglycerate kinase

from tumour cells is controlled by oxygen-sensing hydroxylases. Biochim Biophys Acta, 1691,

17-22.

Daniel, R., Greger, J.G., Katz, R.A., Taganov, K.D., Wu, X., Kappes, J.C. and Skalka, A.M. (2004)

Evidence that stable retroviral transduction and cell survival following DNA integration

depend on components of the nonhomologous end joining repair pathway. J Virol, 78, 8573-

8581.

Daniel, R., Kao, G., Taganov, K., Greger, J.G., Favorova, O., Merkel, G., Yen, T.J., Katz, R.A. and

Skalka, A.M. (2003) Evidence that the retroviral DNA integration process triggers an ATR-

dependent DNA damage response. Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 4778-4783.

Daniel, R., Katz, R.A., Merkel, G., Hittle, J.C., Yen, T.J. and Skalka, A.M. (2001) Wortmannin

potentiates integrase-mediated killing of lymphocytes and reduces the efficiency of stable

transduction by retroviruses. Mol Cell Biol, 21, 1164-1172.

Daniel, R., Katz, R.A. and Skalka, A.M. (1999) A role for DNA-PK in retroviral DNA integration.

Science, 284, 644-647.

De Zio, D., Bordi, M., Tino, E., Lanzuolo, C., Ferraro, E., Mora, E., Ciccosanti, F., Fimia, G.M.,

Orlando, V. and Cecconi, F. (2011) The DNA repair complex Ku70/86 modulates Apaf1

expression upon DNA damage. Cell Death Differ, 18, 516-527.

Deaton, A.M. and Bird, A. (2011) CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev, 25,

1010-1022.

Dehart, J.L., Andersen, J.L., Zimmerman, E.S., Ardon, O., An, D.S., Blackett, J., Kim, B. and

Planelles, V. (2005) The ataxia telangiectasia-mutated and Rad3-related protein is dispensable

for retroviral integration. J Virol, 79, 1389-1396.

Delelis, O., Parissi, V., Leh, H., Mbemba, G., Petit, C., Sonigo, P., Deprez, E. and Mouscadet, J.F.

(2007) Efficient and specific internal cleavage of a retroviral palindromic DNA sequence by

tetrameric HIV-1 integrase. PLoS One, 2, e608.

Deng, W. and Blobel, G.A. (2010) Do chromatin loops provide epigenetic gene expression states?

Curr Opin Genet Dev, 20, 548-554.

Dingwall, C., Ernberg, I., Gait, M.J., Green, S.M., Heaphy, S., Karn, J., Lowe, A.D., Singh, M. and

Skinner, M.A. (1990) HIV-1 tat protein stimulates transcription by binding to a U-rich bulge

in the stem of the TAR RNA structure. Embo J, 9, 4145-4153.

Doherty, A.J., Jackson, S.P. and Weller, G.R. (2001) Identification of bacterial homologues of the Ku

DNA repair proteins. FEBS Lett, 500, 186-188.

Donahue, D.A., Kuhl, B.D., Sloan, R.D. and Wainberg, M.A. (2012) The viral protein Tat can inhibit

the establishment of HIV-1 latency. J Virol, 86, 3253-3263.

Downs, J.A. and Jackson, S.P. (2004) A means to a DNA end: the many roles of Ku. Nat Rev Mol Cell

Biol, 5, 367-378.

du Chene, I., Basyuk, E., Lin, Y.L., Triboulet, R., Knezevich, A., Chable-Bessia, C., Mettling, C.,

Baillat, V., Reynes, J., Corbeau, P., Bertrand, E., Marcello, A., Emiliani, S., Kiernan, R. and

Benkirane, M. (2007) Suv39H1 and HP1gamma are responsible for chromatin-mediated HIV-

1 transcriptional silencing and post-integration latency. Embo J, 26, 424-435.

Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R.J., Nguyen, M., Trono, D. and Naldini, L. (1998) A third-

generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol, 72, 8463-8471.

Duverger, A., Jones, J., May, J., Bibollet-Ruche, F., Wagner, F.A., Cron, R.Q. and Kutsch, O. (2009)

Determinants of the establishment of human immunodeficiency virus type 1 latency. J Virol,

83, 3078-3093.

Ebina, H., Kanemura, Y., Suzuki, Y., Urata, K., Misawa, N. and Koyanagi, Y. (2012) Integrase-

independent HIV-1 infection is augmented under conditions of DNA damage and produces a

viral reservoir. Virology, 427, 44-50.

el Kharroubi, A. and Verdin, E. (1994) Protein-DNA interactions within DNase I-hypersensitive sites

located downstream of the HIV-1 promoter. J Biol Chem, 269, 19916-19924. Ellerman V., Bang O. Experimentell leukamie bei huhnern. Zentralbl. Bakteriol. 1908;46:595–609

199

Ellis, J. (2005) Silencing and variegation of gammaretrovirus and lentivirus vectors. Hum Gene Ther,

16, 1241-1246.

Emery, D.W. (2011) The use of chromatin insulators to improve the expression and safety of

integrating gene transfer vectors. Hum Gene Ther, 22, 761-774.

Emery, D.W., Yannaki, E., Tubb, J. and Stamatoyannopoulos, G. (2000) A chromatin insulator

protects retrovirus vectors from chromosomal position effects. Proc Natl Acad Sci U S A, 97,

9150-9155.

Emiliani, S., Fischle, W., Ott, M., Van Lint, C., Amella, C.A. and Verdin, E. (1998) Mutations in the

tat gene are responsible for human immunodeficiency virus type 1 postintegration latency in

the U1 cell line. J Virol, 72, 1666-1670.

Engelman, A. and Cherepanov, P. (2012) The structural biology of HIV-1: mechanistic and

therapeutic insights. Nat Rev Microbiol, 10, 279-290.

Errami, A., Smider, V., Rathmell, W.K., He, D.M., Hendrickson, E.A., Zdzienicka, M.Z. and Chu, G.

(1996) Ku86 defines the genetic defect and restores X-ray resistance and V(D)J recombination

to complementation group 5 hamster cell mutants. Mol Cell Biol, 16, 1519-1526.

Espejel, S., Franco, S., Rodriguez-Perales, S., Bouffler, S.D., Cigudosa, J.C. and Blasco, M.A. (2002)

Mammalian Ku86 mediates chromosomal fusions and apoptosis caused by critically short

telomeres. Embo J, 21, 2207-2219.

Espeseth, A.S., Fishel, R., Hazuda, D., Huang, Q., Xu, M., Yoder, K. and Zhou, H. (2011) siRNA

screening of a targeted library of DNA repair factors in HIV infection reveals a role for base

excision repair in HIV integration. PLoS One, 6, e17612.

Evans-Galea, M.V., Wielgosz, M.M., Hanawa, H., Srivastava, D.K. and Nienhuis, A.W. (2007)

Suppression of clonal dominance in cultured human lymphoid cells by addition of the cHS4

insulator to a lentiviral vector. Mol Ther, 15, 801-809.

Farnet, C.M. and Haseltine, W.A. (1991) Determination of viral proteins present in the human

immunodeficiency virus type 1 preintegration complex. J Virol, 65, 1910-1915.

Fattah, F.J., Lichter, N.F., Fattah, K.R., Oh, S. and Hendrickson, E.A. (2008) Ku70, an essential gene,

modulates the frequency of rAAV-mediated gene targeting in human somatic cells. Proc Natl

Acad Sci U S A, 105, 8703-8708.

Federici, T., Kutner, R., Zhang, X.Y., Kuroda, H., Tordo, N., Boulis, N.M. and Reiser, J. (2009)

Comparative analysis of HIV-1-based lentiviral vectors bearing lyssavirus glycoproteins for

neuronal gene transfer. Genet Vaccines Ther, 7, 1.

Fenard, D., Houzet, L., Bernard, E., Tupin, A., Brun, S., Mougel, M., Devaux, C., Chazal, N. and

Briant, L. (2009) Uracil DNA Glycosylase 2 negatively regulates HIV-1 LTR transcription.

Nucleic Acids Res, 37, 6008-6018.

Ferris, A.L., Wu, X., Hughes, C.M., Stewart, C., Smith, S.J., Milne, T.A., Wang, G.G., Shun, M.C.,

Allis, C.D., Engelman, A. and Hughes, S.H. (2010) Lens epithelium-derived growth factor

fusion proteins redirect HIV-1 DNA integration. Proc Natl Acad Sci U S A, 107, 3135-3140.

Fewell, J.W. and Kuff, E.L. (1996) Intracellular redistribution of Ku immunoreactivity in response to

cell-cell contact and growth modulating components in the medium. J Cell Sci, 109 ( Pt 7),

1937-1946.

Fischer, A., Hacein-Bey-Abina, S. and Cavazzana-Calvo, M. (2011) Gene therapy for primary

adaptive immune deficiencies. J Allergy Clin Immunol, 127, 1356-1359.

Follenzi, A., Ailles, L.E., Bakovic, S., Geuna, M. and Naldini, L. (2000) Gene transfer by lentiviral

vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences. Nat Genet,

25, 217-222.

Francoeur, A.M., Peebles, C.L., Gompper, P.T. and Tan, E.M. (1986) Identification of Ki (Ku,

p70/p80) autoantigens and analysis of anti-Ki autoantibody reactivity. J Immunol, 136, 1648-

1653.

Frankel, A.D. and Young, J.A. (1998) HIV-1: fifteen proteins and an RNA. Annu Rev Biochem, 67, 1-

25.

Frecha, C., Costa, C., Levy, C., Negre, D., Russell, S.J., Maisner, A., Salles, G., Peng, K.W., Cosset,

F.L. and Verhoeyen, E. (2009) Efficient and stable transduction of resting B lymphocytes and

primary chronic lymphocyte leukemia cells using measles virus gp displaying lentiviral

vectors. Blood, 114, 3173-3180.

200

Froelich, S., Ziegler, L., Stroup, K. and Wang, P. (2009) Targeted gene delivery to CD117-expressing

cells in vivo with lentiviral vectors co-displaying stem cell factor and a fusogenic molecule.

Biotechnol Bioeng, 104, 206-215.

Fujinaga, K., Irwin, D., Huang, Y., Taube, R., Kurosu, T. and Peterlin, B.M. (2004) Dynamics of

human immunodeficiency virus transcription: P-TEFb phosphorylates RD and dissociates

negative effectors from the transactivation response element. Mol Cell Biol, 24, 787-795.

Galande, S. and Kohwi-Shigematsu, T. (1999) Poly(ADP-ribose) polymerase and Ku autoantigen

form a complex and synergistically bind to matrix attachment sequences. J Biol Chem, 274,

20521-20528.

Gallo, R.C., Salahuddin, S.Z., Popovic, M., Shearer, G.M., Kaplan, M., Haynes, B.F., Palker, T.J.,

Redfield, R., Oleske, J., Safai, B. and et al. (1984) Frequent detection and isolation of

cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and at risk for AIDS. Science,

224, 500-503.

Gallo, R.C., Sarin, P.S., Gelmann, E.P., Robert-Guroff, M., Richardson, E., Kalyanaraman, V.S.,

Mann, D., Sidhu, G.D., Stahl, R.E., Zolla-Pazner, S., Leibowitch, J. and Popovic, M. (1983)

Isolation of human T-cell leukemia virus in acquired immune deficiency syndrome (AIDS).

Science, 220, 865-867.

Gao, F., Bailes, E., Robertson, D.L., Chen, Y., Rodenburg, C.M., Michael, S.F., Cummins, L.B.,

Arthur, L.O., Peeters, M., Shaw, G.M., Sharp, P.M. and Hahn, B.H. (1999) Origin of HIV-1 in

the chimpanzee Pan troglodytes troglodytes. Nature, 397, 436-441.

Gao, W.Y., Cara, A., Gallo, R.C. and Lori, F. (1993) Low levels of deoxynucleotides in peripheral

blood lymphocytes: a strategy to inhibit human immunodeficiency virus type 1 replication.

Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 8925-8928.

Garber, M.E., Wei, P. and Jones, K.A. (1998) HIV-1 Tat interacts with cyclin T1 to direct the P-TEFb

CTD kinase complex to TAR RNA. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 63, 371-380.

Gaszner, M. and Felsenfeld, G. (2006) Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic

mechanisms. Nat Rev Genet, 7, 703-713.

Gaussin, A., Modlich, U., Bauche, C., Niederlander, N.J., Schambach, A., Duros, C., Artus, A., Baum,

C., Cohen-Haguenauer, O. and Mermod, N. (2012) CTF/NF1 transcription factors act as

potent genetic insulators for integrating gene transfer vectors. Gene Ther, 19, 15-24.

Gelderblom, H.C., Vatakis, D.N., Burke, S.A., Lawrie, S.D., Bristol, G.C. and Levy, D.N. (2008)

Viral complementation allows HIV-1 replication without integration. Retrovirology, 5, 60.

Genovesio, A., Kwon, Y.J., Windisch, M.P., Kim, N.Y., Choi, S.Y., Kim, H.C., Jung, S., Mammano,

F., Perrin, V., Boese, A.S., Casartelli, N., Schwartz, O., Nehrbass, U. and Emans, N. (2011)

Automated genome-wide visual profiling of cellular proteins involved in HIV infection. J

Biomol Screen, 16, 945-958.

Gerolami, R., Uch, R., Jordier, F., Chapel, S., Bagnis, C., Brechot, C. and Mannoni, P. (2000) Gene

transfer to hepatocellular carcinoma: transduction efficacy and transgene expression kinetics

by using retroviral and lentiviral vectors. Cancer Gene Ther, 7, 1286-1292.

Gessain, A. and Gout, O. (1992) Chronic myelopathy associated with human T-lymphotropic virus

type I (HTLV-I). Ann Intern Med, 117, 933-946.

Geyer, P.K., Vitalini, M.W. and Wallrath, L.L. (2011) Nuclear organization: taking a position on gene

expression. Curr Opin Cell Biol, 23, 354-359.

Gheysen, D., Jacobs, E., de Foresta, F., Thiriart, C., Francotte, M., Thines, D. and De Wilde, M.

(1989) Assembly and release of HIV-1 precursor Pr55gag virus-like particles from

recombinant baculovirus-infected insect cells. Cell, 59, 103-112.

Ghosh, G., Li, G., Myung, K. and Hendrickson, E.A. (2007) The lethality of Ku86 (XRCC5) loss-of-

function mutations in human cells is independent of p53 (TP53). Radiat Res, 167, 66-79.

Giffin, W., Gong, W., Schild-Poulter, C. and Hache, R.J. (1999) Ku antigen-DNA conformation

determines the activation of DNA-dependent protein kinase and DNA sequence-directed

repression of mouse mammary tumor virus transcription. Mol Cell Biol, 19, 4065-4078.

Giffin, W., Torrance, H., Rodda, D.J., Prefontaine, G.G., Pope, L. and Hache, R.J. (1996) Sequence-

specific DNA binding by Ku autoantigen and its effects on transcription. Nature, 380, 265-

268.

201

Glenn, J. (1981) Cytomegalovirus infections following renal transplantation. Rev Infect Dis, 3, 1151-

1178.

Glover, D.J., Lipps, H.J. and Jans, D.A. (2005) Towards safe, non-viral therapeutic gene expression in

humans. Nat Rev Genet, 6, 299-310.

Goh, W.C., Rogel, M.E., Kinsey, C.M., Michael, S.F., Fultz, P.N., Nowak, M.A., Hahn, B.H. and

Emerman, M. (1998) HIV-1 Vpr increases viral expression by manipulation of the cell cycle:

a mechanism for selection of Vpr in vivo. Nat Med, 4, 65-71.

Gotte, M., Rausch, J.W., Marchand, B., Sarafianos, S. and Le Grice, S.F. (2010) Reverse transcriptase

in motion: conformational dynamics of enzyme-substrate interactions. Biochim Biophys Acta,

1804, 1202-1212.

Grandchamp, N., Henriot, D., Philippe, S., Amar, L., Ursulet, S., Serguera, C., Mallet, J. and Sarkis,

C. (2011) Influence of insulators on transgene expression from integrating and non-integrating

lentiviral vectors. Genet Vaccines Ther, 9, 1.

Grimm, D., Streetz, K.L., Jopling, C.L., Storm, T.A., Pandey, K., Davis, C.R., Marion, P., Salazar, F.

and Kay, M.A. (2006) Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short

hairpin RNA pathways. Nature, 441, 537-541.

Grizot, S., Epinat, J.C., Thomas, S., Duclert, A., Rolland, S., Paques, F. and Duchateau, P. (2010)

Generation of redesigned homing endonucleases comprising DNA-binding domains derived

from two different scaffolds. Nucleic Acids Res, 38, 2006-2018.

Guenther, M.G., Levine, S.S., Boyer, L.A., Jaenisch, R. and Young, R.A. (2007) A chromatin

landmark and transcription initiation at most promoters in human cells. Cell, 130, 77-88.

Gullo, C., Au, M., Feng, G. and Teoh, G. (2006) The biology of Ku and its potential oncogenic role in

cancer. Biochim Biophys Acta, 1765, 223-234.

Ha, H.C., Juluri, K., Zhou, Y., Leung, S., Hermankova, M. and Snyder, S.H. (2001) Poly(ADP-ribose)

polymerase-1 is required for efficient HIV-1 integration. Proc Natl Acad Sci U S A, 98, 3364-

3368.

Hacein-Bey-Abina, S., Garrigue, A., Wang, G.P., Soulier, J., Lim, A., Morillon, E., Clappier, E.,

Caccavelli, L., Delabesse, E., Beldjord, K., Asnafi, V., MacIntyre, E., Dal Cortivo, L.,

Radford, I., Brousse, N., Sigaux, F., Moshous, D., Hauer, J., Borkhardt, A., Belohradsky,

B.H., Wintergerst, U., Velez, M.C., Leiva, L., Sorensen, R., Wulffraat, N., Blanche, S.,

Bushman, F.D., Fischer, A. and Cavazzana-Calvo, M. (2008) Insertional oncogenesis in 4

patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest, 118, 3132-3142.

Hacein-Bey-Abina, S., Von Kalle, C., Schmidt, M., McCormack, M.P., Wulffraat, N., Leboulch, P.,

Lim, A., Osborne, C.S., Pawliuk, R., Morillon, E., Sorensen, R., Forster, A., Fraser, P., Cohen,

J.I., de Saint Basile, G., Alexander, I., Wintergerst, U., Frebourg, T., Aurias, A., Stoppa-

Lyonnet, D., Romana, S., Radford-Weiss, I., Gross, F., Valensi, F., Delabesse, E., Macintyre,

E., Sigaux, F., Soulier, J., Leiva, L.E., Wissler, M., Prinz, C., Rabbitts, T.H., Le Deist, F.,

Fischer, A. and Cavazzana-Calvo, M. (2003) LMO2-associated clonal T cell proliferation in

two patients after gene therapy for SCID-X1. Science, 302, 415-419.

Hacker, C.V., Vink, C.A., Wardell, T.W., Lee, S., Treasure, P., Kingsman, S.M., Mitrophanous, K.A.

and Miskin, J.E. (2006) The integration profile of EIAV-based vectors. Mol Ther, 14, 536-

545.

Hampsey, M., Singh, B.N., Ansari, A., Laine, J.P. and Krishnamurthy, S. (2011) Control of eukaryotic

gene expression: gene loops and transcriptional memory. Adv Enzyme Regul, 51, 118-125.

Han, Y., Lassen, K., Monie, D., Sedaghat, A.R., Shimoji, S., Liu, X., Pierson, T.C., Margolick, J.B.,

Siliciano, R.F. and Siliciano, J.D. (2004) Resting CD4+ T cells from human

immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes

within actively transcribed host genes. J Virol, 78, 6122-6133.

Han, Y., Lin, Y.B., An, W., Xu, J., Yang, H.C., O'Connell, K., Dordai, D., Boeke, J.D., Siliciano, J.D.

and Siliciano, R.F. (2008) Orientation-dependent regulation of integrated HIV-1 expression by

host gene transcriptional readthrough. Cell Host Microbe, 4, 134-146.

Han, Y. and Siliciano, R.F. (2007) Keeping quiet: microRNAs in HIV-1 latency. Nat Med, 13, 1138-

1140.

202

Hanawa, H., Yamamoto, M., Zhao, H., Shimada, T. and Persons, D.A. (2009) Optimized lentiviral

vector design improves titer and transgene expression of vectors containing the chicken beta-

globin locus HS4 insulator element. Mol Ther, 17, 667-674.

Hasegawa, M., Yamaguchi, S., Aizawa, S., Ikeda, H., Tatsumi, K., Noda, Y., Hirokawa, K. and

Kitagawa, M. (2005) Resistance against Friend leukemia virus-induced leukemogenesis in

DNA-dependent protein kinase (DNA-PK)-deficient scid mice associated with defective viral

integration at the Spi-1 and Fli-1 site. Leuk Res, 29, 933-942.

Hassa, P.O. and Hottiger, M.O. (1999) A role of poly (ADP-ribose) polymerase in NF-kappaB

transcriptional activation. Biol Chem, 380, 953-959.

Helseth, E., Kowalski, M., Gabuzda, D., Olshevsky, U., Haseltine, W. and Sodroski, J. (1990) Rapid

complementation assays measuring replicative potential of human immunodeficiency virus

type 1 envelope glycoprotein mutants. J Virol, 64, 2416-2420.

Hematti, P., Hong, B.K., Ferguson, C., Adler, R., Hanawa, H., Sellers, S., Holt, I.E., Eckfeldt, C.E.,

Sharma, Y., Schmidt, M., von Kalle, C., Persons, D.A., Billings, E.M., Verfaillie, C.M.,

Nienhuis, A.W., Wolfsberg, T.G., Dunbar, C.E. and Calmels, B. (2004) Distinct genomic

integration of MLV and SIV vectors in primate hematopoietic stem and progenitor cells. PLoS

Biol, 2, e423.

Heng, H.H., Goetze, S., Ye, C.J., Liu, G., Stevens, J.B., Bremer, S.W., Wykes, S.M., Bode, J. and

Krawetz, S.A. (2004) Chromatin loops are selectively anchored using scaffold/matrix-

attachment regions. J Cell Sci, 117, 999-1008.

Heo, K., Kim, H., Choi, S.H., Choi, J., Kim, K., Gu, J., Lieber, M.R., Yang, A.S. and An, W. (2008)

FACT-mediated exchange of histone variant H2AX regulated by phosphorylation of H2AX

and ADP-ribosylation of Spt16. Mol Cell, 30, 86-97.

Hirsch, V.M., Olmsted, R.A., Murphey-Corb, M., Purcell, R.H. and Johnson, P.R. (1989) An African

primate lentivirus (SIVsm) closely related to HIV-2. Nature, 339, 389-392.

Hoek, M., Myers, M.P. and Stillman, B. (2011) An analysis of CAF-1-interacting proteins reveals

dynamic and direct interactions with the KU complex and 14-3-3 proteins. J Biol Chem, 286,

10876-10887.

Holcomb, V.B., Rodier, F., Choi, Y., Busuttil, R.A., Vogel, H., Vijg, J., Campisi, J. and Hasty, P.

(2008) Ku80 deletion suppresses spontaneous tumors and induces a p53-mediated DNA

damage response. Cancer Res, 68, 9497-9502.

Hong, Z., Jiang, J., Lan, L., Nakajima, S., Kanno, S., Koseki, H. and Yasui, A. (2008) A polycomb

group protein, PHF1, is involved in the response to DNA double-strand breaks in human cell.

Nucleic Acids Res, 36, 2939-2947.

Howe, S.J., Mansour, M.R., Schwarzwaelder, K., Bartholomae, C., Hubank, M., Kempski, H.,

Brugman, M.H., Pike-Overzet, K., Chatters, S.J., de Ridder, D., Gilmour, K.C., Adams, S.,

Thornhill, S.I., Parsley, K.L., Staal, F.J., Gale, R.E., Linch, D.C., Bayford, J., Brown, L.,

Quaye, M., Kinnon, C., Ancliff, P., Webb, D.K., Schmidt, M., von Kalle, C., Gaspar, H.B. and

Thrasher, A.J. (2008) Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations

causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest, 118, 3143-

3150.

Huang, J., Wang, F., Argyris, E., Chen, K., Liang, Z., Tian, H., Huang, W., Squires, K., Verlinghieri,

G. and Zhang, H. (2007) Cellular microRNAs contribute to HIV-1 latency in resting primary

CD4+ T lymphocytes. Nat Med, 13, 1241-1247.

Huisinga, K.L., Brower-Toland, B. and Elgin, S.C. (2006) The contradictory definitions of

heterochromatin: transcription and silencing. Chromosoma, 115, 110-122.

Illingworth, R.S., Gruenewald-Schneider, U., Webb, S., Kerr, A.R., James, K.D., Turner, D.J., Smith,

C., Harrison, D.J., Andrews, R. and Bird, A.P. (2010) Orphan CpG islands identify numerous

conserved promoters in the mammalian genome. PLoS Genet, 6.

Imai, K. and Ochiai, K. (2011) Role of histone modification on transcriptional regulation and HIV-1

gene expression: possible mechanisms of periodontal diseases in AIDS progression. J Oral

Sci, 53, 1-13.

Iordanskiy, S., Berro, R., Altieri, M., Kashanchi, F. and Bukrinsky, M. (2006) Intracytoplasmic

maturation of the human immunodeficiency virus type 1 reverse transcription complexes

determines their capacity to integrate into chromatin. Retrovirology, 3, 4.

203

Isomura, H., Stinski, M.F., Kudoh, A., Daikoku, T., Shirata, N. and Tsurumi, T. (2005) Two Sp1/Sp3

binding sites in the major immediate-early proximal enhancer of human cytomegalovirus have

a significant role in viral replication. J Virol, 79, 9597-9607.

Isomura, H., Tsurumi, T. and Stinski, M.F. (2004) Role of the proximal enhancer of the major

immediate-early promoter in human cytomegalovirus replication. J Virol, 78, 12788-12799.

Iwakuma, T., Cui, Y. and Chang, L.J. (1999) Self-inactivating lentiviral vectors with U3 and U5

modifications. Virology, 261, 120-132.

Iyer, S.R., Yu, D., Biancotto, A., Margolis, L.B. and Wu, Y. (2009) Measurement of human

immunodeficiency virus type 1 preintegration transcription by using Rev-dependent Rev-CEM

cells reveals a sizable transcribing DNA population comparable to that from proviral

templates. J Virol, 83, 8662-8673.

Izmiryan, A., Basmaciogullari, S., Henry, A., Paques, F. and Danos, O. (2011) Efficient gene targeting

mediated by a lentiviral vector-associated meganuclease. Nucleic Acids Res, 39, 7610-7619.

Jackson, S.P. and Bartek, J. (2009) The DNA-damage response in human biology and disease. Nature,

461, 1071-1078.

Jeanson, L. and Mouscadet, J.F. (2002) Ku represses the HIV-1 transcription: identification of a

putative Ku binding site homologous to the mouse mammary tumor virus NRE1 sequence in

the HIV-1 long terminal repeat. J Biol Chem, 277, 4918-4924.

Jeanson, L., Subra, F., Vaganay, S., Hervy, M., Marangoni, E., Bourhis, J. and Mouscadet, J.F. (2002)

Effect of Ku80 depletion on the preintegrative steps of HIV-1 replication in human cells.

Virology, 300, 100-108.

Jiang, D., Zhou, Y., Moxley, R.A. and Jarrett, H.W. (2008) Purification and identification of positive

regulators binding to a novel element in the c-Jun promoter. Biochemistry, 47, 9318-9334.

Jiang, G., Espeseth, A., Hazuda, D.J. and Margolis, D.M. (2007) c-Myc and Sp1 contribute to proviral

latency by recruiting histone deacetylase 1 to the human immunodeficiency virus type 1

promoter. J Virol, 81, 10914-10923.

Jin, C. and Felsenfeld, G. (2007) Nucleosome stability mediated by histone variants H3.3 and H2A.Z.

Genes Dev, 21, 1519-1529.

Jolly, C. and Sattentau, Q.J. (2007) Regulated secretion from CD4+ T cells. Trends Immunol, 28, 474-

481.

Jones, K.A., Kadonaga, J.T., Luciw, P.A. and Tjian, R. (1986) Activation of the AIDS retrovirus

promoter by the cellular transcription factor, Sp1. Science, 232, 755-759.

Jones, K.A. and Peterlin, B.M. (1994) Control of RNA initiation and elongation at the HIV-1

promoter. Annu Rev Biochem, 63, 717-743.

Jones, P.A. (2012) Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond. Nat

Rev Genet, 13, 484-492.

Jordan, A., Bisgrove, D. and Verdin, E. (2003) HIV reproducibly establishes a latent infection after

acute infection of T cells in vitro. Embo J, 22, 1868-1877.

Jupp, R., Hoffmann, S., Depto, A., Stenberg, R.M., Ghazal, P. and Nelson, J.A. (1993) Direct

interaction of the human cytomegalovirus IE86 protein with the cis repression signal does not

preclude TBP from binding to the TATA box. J Virol, 67, 5595-5604.

Juven-Gershon, T. and Kadonaga, J.T. (2010) Regulation of gene expression via the core promoter

and the basal transcriptional machinery. Dev Biol, 339, 225-229.

Kaczmarski, W. and Khan, S.A. (1993) Lupus autoantigen Ku protein binds HIV-1 TAR RNA in

vitro. Biochem Biophys Res Commun, 196, 935-942.

Kaehlcke, K., Dorr, A., Hetzer-Egger, C., Kiermer, V., Henklein, P., Schnoelzer, M., Loret, E., Cole,

P.A., Verdin, E. and Ott, M. (2003) Acetylation of Tat defines a cyclinT1-independent step in

HIV transactivation. Mol Cell, 12, 167-176.

Kaiser, S.M. and Emerman, M. (2006) Uracil DNA glycosylase is dispensable for human

immunodeficiency virus type 1 replication and does not contribute to the antiviral effects of

the cytidine deaminase Apobec3G. J Virol, 80, 875-882.

Kameoka, M., Nukuzuma, S., Itaya, A., Tanaka, Y., Ota, K., Ikuta, K. and Yoshihara, K. (2004) RNA

interference directed against Poly(ADP-Ribose) polymerase 1 efficiently suppresses human

immunodeficiency virus type 1 replication in human cells. J Virol, 78, 8931-8934.

204

Kameoka, M., Nukuzuma, S., Itaya, A., Tanaka, Y., Ota, K., Inada, Y., Ikuta, K. and Yoshihara, K.

(2005) Poly(ADP-ribose)polymerase-1 is required for integration of the human

immunodeficiency virus type 1 genome near centromeric alphoid DNA in human and murine

cells. Biochem Biophys Res Commun, 334, 412-417.

Kang, Y., Moressi, C.J., Scheetz, T.E., Xie, L., Tran, D.T., Casavant, T.L., Ak, P., Benham, C.J.,

Davidson, B.L. and McCray, P.B., Jr. (2006) Integration site choice of a feline

immunodeficiency virus vector. J Virol, 80, 8820-8823.

Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P.E. and Kafri, T. (2009) Epigenetic activation of

unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for

HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A, 106, 18786-18791.

Kao, S.Y., Calman, A.F., Luciw, P.A. and Peterlin, B.M. (1987) Anti-termination of transcription

within the long terminal repeat of HIV-1 by tat gene product. Nature, 330, 489-493.

Kappes, J.C. and Wu, X. (2001) Safety considerations in vector development. Somat Cell Mol Genet,

26, 147-158.

Karageorgos, L., Li, P. and Burrell, C. (1993) Characterization of HIV replication complexes early

after cell-to-cell infection. AIDS Res Hum Retroviruses, 9, 817-823.

Karn, J. (2011) The molecular biology of HIV latency: breaking and restoring the Tat-dependent

transcriptional circuit. Curr Opin HIV AIDS, 6, 4-11.

Karn, J. and Stoltzfus, C.M. (2012) Transcriptional and Posttranscriptional Regulation of HIV-1 Gene

Expression. Cold Spring Harb Perspect Med, 2, a006916.

Keele, B.F., Van Heuverswyn, F., Li, Y., Bailes, E., Takehisa, J., Santiago, M.L., Bibollet-Ruche, F.,

Chen, Y., Wain, L.V., Liegeois, F., Loul, S., Ngole, E.M., Bienvenue, Y., Delaporte, E.,

Brookfield, J.F., Sharp, P.M., Shaw, G.M., Peeters, M. and Hahn, B.H. (2006) Chimpanzee

reservoirs of pandemic and nonpandemic HIV-1. Science, 313, 523-526.

Kelly, J., Beddall, M.H., Yu, D., Iyer, S.R., Marsh, J.W. and Wu, Y. (2008) Human macrophages

support persistent transcription from unintegrated HIV-1 DNA. Virology, 372, 300-312.

Kessis, T.D., Slebos, R.J., Nelson, W.G., Kastan, M.B., Plunkett, B.S., Han, S.M., Lorincz, A.T.,

Hedrick, L. and Cho, K.R. (1993) Human papillomavirus 16 E6 expression disrupts the p53-

mediated cellular response to DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 3988-3992.

Kiernan, R.E., Vanhulle, C., Schiltz, L., Adam, E., Xiao, H., Maudoux, F., Calomme, C., Burny, A.,

Nakatani, Y., Jeang, K.T., Benkirane, M. and Van Lint, C. (1999) HIV-1 tat transcriptional

activity is regulated by acetylation. Embo J, 18, 6106-6118.

Kilzer, J.M., Stracker, T., Beitzel, B., Meek, K., Weitzman, M. and Bushman, F.D. (2003) Roles of

host cell factors in circularization of retroviral dna. Virology, 314, 460-467.

Kim, H. (2008) DNA repair Ku proteins in gastric cancer cells and pancreatic acinar cells. Amino

Acids, 34, 195-202.

Kim, J.K., Samaranayake, M. and Pradhan, S. (2009) Epigenetic mechanisms in mammals. Cell Mol

Life Sci, 66, 596-612.

Kim, V.N., Mitrophanous, K., Kingsman, S.M. and Kingsman, A.J. (1998) Minimal requirement for a

lentivirus vector based on human immunodeficiency virus type 1. J Virol, 72, 811-816.

Kim, Y.K., Bourgeois, C.F., Pearson, R., Tyagi, M., West, M.J., Wong, J., Wu, S.Y., Chiang, C.M.

and Karn, J. (2006) Recruitment of TFIIH to the HIV LTR is a rate-limiting step in the

emergence of HIV from latency. Embo J, 25, 3596-3604.

Kingsman, S.M., Mitrophanous, K. and Olsen, J.C. (2005) Potential oncogene activity of the

woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element (WPRE). Gene Ther, 12, 3-4.

Knight, S., Zhang, F., Mueller-Kuller, U., Bokhoven, M., Gupta, A., Broughton, T., Sha, S., Antoniou,

M.N., Brendel, C., Grez, M., Thrasher, A.J., Collins, M. and Takeuchi, Y. (2012) Safer,

silencing-resistant lentiviral vectors: Optimization of ubiquitous chromatin opening element

(UCOE) through elimination of aberrant splicing. J Virol.

Koike, M. (2002) Dimerization, translocation and localization of Ku70 and Ku80 proteins. J Radiat

Res, 43, 223-236.

Koike, M., Yutoku, Y. and Koike, A. (2011) KARP-1 works as a heterodimer with Ku70, but the

function of KARP-1 cannot perfectly replace that of Ku80 in DSB repair. Exp Cell Res, 317,

2267-2275.

205

Konig, R., Zhou, Y., Elleder, D., Diamond, T.L., Bonamy, G.M., Irelan, J.T., Chiang, C.Y., Tu, B.P.,

De Jesus, P.D., Lilley, C.E., Seidel, S., Opaluch, A.M., Caldwell, J.S., Weitzman, M.D.,

Kuhen, K.L., Bandyopadhyay, S., Ideker, T., Orth, A.P., Miraglia, L.J., Bushman, F.D.,

Young, J.A. and Chanda, S.K. (2008) Global analysis of host-pathogen interactions that

regulate early-stage HIV-1 replication. Cell, 135, 49-60.

Korber, B., Muldoon, M., Theiler, J., Gao, F., Gupta, R., Lapedes, A., Hahn, B.H., Wolinsky, S. and

Bhattacharya, T. (2000) Timing the ancestor of the HIV-1 pandemic strains. Science, 288,

1789-1796.

Kotsopoulou, E., Kim, V.N., Kingsman, A.J., Kingsman, S.M. and Mitrophanous, K.A. (2000) A Rev-

independent human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-based vector that exploits a

codon-optimized HIV-1 gag-pol gene. J Virol, 74, 4839-4852.

Kramer, B., Pelchen-Matthews, A., Deneka, M., Garcia, E., Piguet, V. and Marsh, M. (2005) HIV

interaction with endosomes in macrophages and dendritic cells. Blood Cells Mol Dis, 35, 136-

142.

Kress, S., Stein, A., Maurer, P., Weber, B., Reichert, J., Buchmann, A., Huppert, P. and Schwarz, M.

(1998) Expression of hypoxia-inducible genes in tumor cells. J Cancer Res Clin Oncol, 124,

315-320.

Kumar, M., Keller, B., Makalou, N. and Sutton, R.E. (2001) Systematic determination of the

packaging limit of lentiviral vectors. Hum Gene Ther, 12, 1893-1905.

Kurth, R. and Bannert, N. (2010) Beneficial and detrimental effects of human endogenous

retroviruses. Int J Cancer, 126, 306-314.

Kutner, R.H., Zhang, X.Y. and Reiser, J. (2009) Production, concentration and titration of

pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nat Protoc, 4, 495-505.

Lai, M., Zimmerman, E.S., Planelles, V. and Chen, J. (2005) Activation of the ATR pathway by

human immunodeficiency virus type 1 Vpr involves its direct binding to chromatin in vivo. J

Virol, 79, 15443-15451.

Lakeman, A.D. and Osborn, J.E. (1979) Size of infectious DNA from human and murine

cytomegaloviruses. J Virol, 30, 414-416.

Lam, W., Leung, C.H., Bussom, S. and Cheng, Y.C. (2007) The impact of hypoxic treatment on the

expression of phosphoglycerate kinase and the cytotoxicity of troxacitabine and gemcitabine.

Mol Pharmacol, 72, 536-544.

Landolin, J.M., Johnson, D.S., Trinklein, N.D., Aldred, S.F., Medina, C., Shulha, H., Weng, Z. and

Myers, R.M. (2010) Sequence features that drive human promoter function and tissue

specificity. Genome Res, 20, 890-898.

Lau, A., Kanaar, R., Jackson, S.P. and O'Connor, M.J. (2004) Suppression of retroviral infection by

the RAD52 DNA repair protein. Embo J, 23, 3421-3429.

Lau, A., Swinbank, K.M., Ahmed, P.S., Taylor, D.L., Jackson, S.P., Smith, G.C. and O'Connor, M.J.

(2005) Suppression of HIV-1 infection by a small molecule inhibitor of the ATM kinase. Nat

Cell Biol, 7, 493-500.

Laurent-Crawford, A.G. and Hovanessian, A.G. (1993) The cytopathic effect of human

immunodeficiency virus is independent of high levels of unintegrated viral DNA accumulated

in response to superinfection of cells. J Gen Virol, 74 ( Pt 12), 2619-2628.

Lee, J.T. (2011) Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA

and chromatin control. Nat Rev Mol Cell Biol, 12, 815-826.

Lee, S.H., Oshige, M., Durant, S.T., Rasila, K.K., Williamson, E.A., Ramsey, H., Kwan, L., Nickoloff,

J.A. and Hromas, R. (2005) The SET domain protein Metnase mediates foreign DNA

integration and links integration to nonhomologous end-joining repair. Proc Natl Acad Sci U S

A, 102, 18075-18080.

Lenasi, T., Contreras, X. and Peterlin, B.M. (2008) Transcriptional interference antagonizes proviral

gene expression to promote HIV latency. Cell Host Microbe, 4, 123-133.

Lesbats, P., Botbol, Y., Chevereau, G., Vaillant, C., Calmels, C., Arneodo, A., Andreola, M.L.,

Lavigne, M. and Parissi, V. (2011) Functional coupling between HIV-1 integrase and the

SWI/SNF chromatin remodeling complex for efficient in vitro integration into stable

nucleosomes. PLoS Pathog, 7, e1001280.

206

Levine, B.L., Humeau, L.M., Boyer, J., MacGregor, R.R., Rebello, T., Lu, X., Binder, G.K.,

Slepushkin, V., Lemiale, F., Mascola, J.R., Bushman, F.D., Dropulic, B. and June, C.H.

(2006) Gene transfer in humans using a conditionally replicating lentiviral vector. Proc Natl

Acad Sci U S A, 103, 17372-17377.

Levy, J.A., Hoffman, A.D., Kramer, S.M., Landis, J.A., Shimabukuro, J.M. and Oshiro, L.S. (1984)

Isolation of lymphocytopathic retroviruses from San Francisco patients with AIDS. Science,

225, 840-842.

Lewinski, M.K., Bisgrove, D., Shinn, P., Chen, H., Hoffmann, C., Hannenhalli, S., Verdin, E., Berry,

C.C., Ecker, J.R. and Bushman, F.D. (2005) Genome-wide analysis of chromosomal features

repressing human immunodeficiency virus transcription. J Virol, 79, 6610-6619.

Lewinski, M.K. and Bushman, F.D. (2005) Retroviral DNA integration--mechanism and

consequences. Adv Genet, 55, 147-181.

Li, B., Carey, M. and Workman, J.L. (2007) The role of chromatin during transcription. Cell, 128,

707-719.

Li, G., Nelsen, C. and Hendrickson, E.A. (2002) Ku86 is essential in human somatic cells. Proc Natl

Acad Sci U S A, 99, 832-837.

Li, G. and Reinberg, D. (2011) Chromatin higher-order structures and gene regulation. Curr Opin

Genet Dev, 21, 175-186.

Li, L., Olvera, J.M., Yoder, K.E., Mitchell, R.S., Butler, S.L., Lieber, M., Martin, S.L. and Bushman,

F.D. (2001) Role of the non-homologous DNA end joining pathway in the early steps of

retroviral infection. Embo J, 20, 3272-3281.

Lilley, C.E., Chaurushiya, M.S. and Weitzman, M.D. (2010) Chromatin at the intersection of viral

infection and DNA damage. Biochim Biophys Acta, 1799, 319-327.

Lin, C.W. and Engelman, A. (2003) The barrier-to-autointegration factor is a component of functional

human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. J Virol, 77, 5030-5036.

Liu, J., Wright, E.R. and Winkler, H. (2010) 3D visualization of HIV virions by cryoelectron

tomography. Methods Enzymol, 483, 267-290.

Llano, M., Vanegas, M., Fregoso, O., Saenz, D., Chung, S., Peretz, M. and Poeschla, E.M. (2004)

LEDGF/p75 determines cellular trafficking of diverse lentiviral but not murine oncoretroviral

integrase proteins and is a component of functional lentiviral preintegration complexes. J

Virol, 78, 9524-9537.

Llano, M., Vanegas, M., Hutchins, N., Thompson, D., Delgado, S. and Poeschla, E.M. (2006)

Identification and characterization of the chromatin-binding domains of the HIV-1 integrase

interactor LEDGF/p75. J Mol Biol, 360, 760-773.

Lloyd, A.G., Tateishi, S., Bieniasz, P.D., Muesing, M.A., Yamaizumi, M. and Mulder, L.C. (2006)

Effect of DNA repair protein Rad18 on viral infection. PLoS Pathog, 2, e40.

Lombardo, A., Genovese, P., Beausejour, C.M., Colleoni, S., Lee, Y.L., Kim, K.A., Ando, D., Urnov,

F.D., Galli, C., Gregory, P.D., Holmes, M.C. and Naldini, L. (2007) Gene editing in human

stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nat

Biotechnol, 25, 1298-1306.

Lord, C.J. and Ashworth, A. (2012) The DNA damage response and cancer therapy. Nature, 481, 287-

294.

Lori, F., di Marzo Veronese, F., de Vico, A.L., Lusso, P., Reitz, M.S., Jr. and Gallo, R.C. (1992) Viral

DNA carried by human immunodeficiency virus type 1 virions. J Virol, 66, 5067-5074.

Luger, K., Mader, A.W., Richmond, R.K., Sargent, D.F. and Richmond, T.J. (1997) Crystal structure

of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature, 389, 251-260.

Luo, X. and Kraus, W.L. (2012) On PAR with PARP: cellular stress signaling through poly(ADP-

ribose) and PARP-1. Genes Dev, 26, 417-432.

Macias, M.P., Huang, L., Lashmit, P.E. and Stinski, M.F. (1996) Cellular or viral protein binding to a

cytomegalovirus promoter transcription initiation site: effects on transcription. J Virol, 70,

3628-3635.

MacNeil, A., Sankale, J.L., Meloni, S.T., Sarr, A.D., Mboup, S. and Kanki, P. (2006) Genomic sites of

human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) integration: similarities to HIV-1 in vitro and

possible differences in vivo. J Virol, 80, 7316-7321.

207

Manic, G., Maurin-Marlin, A., Galluzzi, L., Subra, F., Mouscadet, J.F. and Bury-Mone, S. (2012) 3'

self-inactivating long terminal repeat inserts for the modulation of transgene expression from

lentiviral vectors. Hum Gene Ther Methods, 23, 84-97.

Marban, C., Suzanne, S., Dequiedt, F., de Walque, S., Redel, L., Van Lint, C., Aunis, D. and Rohr, O.

(2007) Recruitment of chromatin-modifying enzymes by CTIP2 promotes HIV-1

transcriptional silencing. Embo J, 26, 412-423.

Martin-Serrano, J. and Neil, S.J. (2011) Host factors involved in retroviral budding and release. Nat

Rev Microbiol, 9, 519-531.

Maruggi, G., Porcellini, S., Facchini, G., Perna, S.K., Cattoglio, C., Sartori, D., Ambrosi, A.,

Schambach, A., Baum, C., Bonini, C., Bovolenta, C., Mavilio, F. and Recchia, A. (2009)

Transcriptional enhancers induce insertional gene deregulation independently from the vector

type and design. Mol Ther, 17, 851-856.

Masson, C., Bury-Mone, S., Guiot, E., Saez-Cirion, A., Schoevaert-Brossault, D., Brachet-Ducos, C.,

Delelis, O., Subra, F., Jeanson-Leh, L. and Mouscadet, J.F. (2007) Ku80 participates in the

targeting of retroviral transgenes to the chromatin of CHO cells. J Virol, 81, 7924-7932.

Matrai, J., Chuah, M.K. and VandenDriessche, T. (2010) Recent advances in lentiviral vector

development and applications. Mol Ther, 18, 477-490.

Mayeur, G.L., Kung, W.J., Martinez, A., Izumiya, C., Chen, D.J. and Kung, H.J. (2005) Ku is a novel

transcriptional recycling coactivator of the androgen receptor in prostate cancer cells. J Biol

Chem, 280, 10827-10833.

McDonald, D., Vodicka, M.A., Lucero, G., Svitkina, T.M., Borisy, G.G., Emerman, M. and Hope, T.J.

(2002) Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. J Cell Biol, 159, 441-

452.

Meier, J.L., Keller, M.J. and McCoy, J.J. (2002) Requirement of multiple cis-acting elements in the

human cytomegalovirus major immediate-early distal enhancer for viral gene expression and

replication. J Virol, 76, 313-326.

Meier, J.L. and Pruessner, J.A. (2000) The human cytomegalovirus major immediate-early distal

enhancer region is required for efficient viral replication and immediate-early gene expression.

J Virol, 74, 1602-1613.

Merten, O.W., Charrier, S., Laroudie, N., Fauchille, S., Dugue, C., Jenny, C., Audit, M., Zanta-

Boussif, M.A., Chautard, H., Radrizzani, M., Vallanti, G., Naldini, L., Noguiez-Hellin, P. and

Galy, A. (2011) Large-scale manufacture and characterization of a lentiviral vector produced

for clinical ex vivo gene therapy application. Hum Gene Ther, 22, 343-356.

Mikkelsen, T.S., Ku, M., Jaffe, D.B., Issac, B., Lieberman, E., Giannoukos, G., Alvarez, P.,

Brockman, W., Kim, T.K., Koche, R.P., Lee, W., Mendenhall, E., O'Donovan, A., Presser, A.,

Russ, C., Xie, X., Meissner, A., Wernig, M., Jaenisch, R., Nusbaum, C., Lander, E.S. and

Bernstein, B.E. (2007) Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-

committed cells. Nature, 448, 553-560.

Mild, M., Kvist, A., Esbjornsson, J., Karlsson, I., Fenyo, E.M. and Medstrand, P. (2010) Differences

in molecular evolution between switch (R5 to R5X4/X4-tropic) and non-switch (R5-tropic

only) HIV-1 populations during infection. Infect Genet Evol, 10, 356-364.

Miller, J.C., Holmes, M.C., Wang, J., Guschin, D.Y., Lee, Y.L., Rupniewski, I., Beausejour, C.M.,

Waite, A.J., Wang, N.S., Kim, K.A., Gregory, P.D., Pabo, C.O. and Rebar, E.J. (2007) An

improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing. Nat Biotechnol,

25, 778-785.

Miller, M.D., Farnet, C.M. and Bushman, F.D. (1997) Human immunodeficiency virus type 1

preintegration complexes: studies of organization and composition. J Virol, 71, 5382-5390.

Mimori, T., Akizuki, M., Yamagata, H., Inada, S., Yoshida, S. and Homma, M. (1981)

Characterization of a high molecular weight acidic nuclear protein recognized by

autoantibodies in sera from patients with polymyositis-scleroderma overlap. J Clin Invest, 68,

611-620.

Mimori, T., Hardin, J.A. and Steitz, J.A. (1986) Characterization of the DNA-binding protein antigen

Ku recognized by autoantibodies from patients with rheumatic disorders. J Biol Chem, 261,

2274-2278.

208

Mitchell, R.S., Beitzel, B.F., Schroder, A.R., Shinn, P., Chen, H., Berry, C.C., Ecker, J.R. and

Bushman, F.D. (2004) Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct

target site preferences. PLoS Biol, 2, E234.

Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F.H. and Verma, I.M. (1998) Development of a self-

inactivating lentivirus vector. J Virol, 72, 8150-8157.

Mladenov, E. and Iliakis, G. (2011) Induction and repair of DNA double strand breaks: the increasing

spectrum of non-homologous end joining pathways. Mutat Res, 711, 61-72.

Moiani, A., Paleari, Y., Sartori, D., Mezzadra, R., Miccio, A., Cattoglio, C., Cocchiarella, F.,

Lidonnici, M.R., Ferrari, G. and Mavilio, F. (2012) Lentiviral vector integration in the human

genome induces alternative splicing and generates aberrant transcripts. J Clin Invest, 122,

1653-1666.

Moir, S., Chun, T.W. and Fauci, A.S. (2011) Pathogenic mechanisms of HIV disease. Annu Rev

Pathol, 6, 223-248.

Moloney, J.B. (1966) A virus-induced rhabdomyosarcoma of mice. Natl Cancer Inst Monogr, 22, 139-

142.

Monk, M. (1995) Epigenetic programming of differential gene expression in development and

evolution. Dev Genet, 17, 188-197.

Montini, E., Cesana, D., Schmidt, M., Sanvito, F., Bartholomae, C.C., Ranzani, M., Benedicenti, F.,

Sergi, L.S., Ambrosi, A., Ponzoni, M., Doglioni, C., Di Serio, C., von Kalle, C. and Naldini,

L. (2009) The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design

and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J Clin Invest, 119, 964-

975.

Montini, E., Cesana, D., Schmidt, M., Sanvito, F., Ponzoni, M., Bartholomae, C., Sergi Sergi, L.,

Benedicenti, F., Ambrosi, A., Di Serio, C., Doglioni, C., von Kalle, C. and Naldini, L. (2006)

Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low

genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat Biotechnol, 24, 687-696.

Motomura, K., Chen, J. and Hu, W.S. (2008) Genetic recombination between human

immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and HIV-2, two distinct human lentiviruses. J Virol,

82, 1923-1933.

Mukerjee, R., Deshmane, S.L., Fan, S., Del Valle, L., White, M.K., Khalili, K., Amini, S. and Sawaya,

B.E. (2008) Involvement of the p53 and p73 transcription factors in neuroAIDS. Cell Cycle, 7,

2682-2690.

Murphy, J.C., Fischle, W., Verdin, E. and Sinclair, J.H. (2002) Control of cytomegalovirus lytic gene

expression by histone acetylation. Embo J, 21, 1112-1120.

Muthumani, K., Lambert, V.M., Sardesai, N.Y., Kim, J.J., Heller, R., Weiner, D.B. and Ugen, K.E.

(2009) Analysis of the potential for HIV-1 Vpr as an anti-cancer agent. Curr HIV Res, 7, 144-

152.

Myung, K., He, D.M., Lee, S.E. and Hendrickson, E.A. (1997) KARP-1: a novel leucine zipper

protein expressed from the Ku86 autoantigen locus is implicated in the control of DNA-

dependent protein kinase activity. Embo J, 16, 3172-3184.

Nabel, G. and Baltimore, D. (1987) An inducible transcription factor activates expression of human

immunodeficiency virus in T cells. Nature, 326, 711-713.

Nakashima, H., Matsui, T., Harada, S., Kobayashi, N., Matsuda, A., Ueda, T. and Yamamoto, N.

(1986) Inhibition of replication and cytopathic effect of human T cell lymphotropic virus type

III/lymphadenopathy-associated virus by 3'-azido-3'-deoxythymidine in vitro. Antimicrob

Agents Chemother, 30, 933-937.

Naldini, L., Blomer, U., Gage, F.H., Trono, D. and Verma, I.M. (1996a) Efficient transfer, integration,

and sustained long-term expression of the transgene in adult rat brains injected with a

lentiviral vector. Proc Natl Acad Sci U S A, 93, 11382-11388.

Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F.H., Verma, I.M. and Trono, D.

(1996b) In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral

vector. Science, 272, 263-267.

Nayak, S. and Herzog, R.W. (2010) Progress and prospects: immune responses to viral vectors. Gene

Ther, 17, 295-304.

209

Nermut, M.V. and Fassati, A. (2003) Structural analyses of purified human immunodeficiency virus

type 1 intracellular reverse transcription complexes. J Virol, 77, 8196-8206.

Nguyen, D.G., Booth, A., Gould, S.J. and Hildreth, J.E. (2003) Evidence that HIV budding in primary

macrophages occurs through the exosome release pathway. J Biol Chem, 278, 52347-52354.

Nielsen, T.T., Jakobsson, J., Rosenqvist, N. and Lundberg, C. (2009) Incorporating double copies of a

chromatin insulator into lentiviral vectors results in less viral integrants. BMC Biotechnol, 9,

13.

Nienhuis, A.W., Dunbar, C.E. and Sorrentino, B.P. (2006) Genotoxicity of retroviral integration in

hematopoietic cells. Mol Ther, 13, 1031-1049.

Norrman, K., Fischer, Y., Bonnamy, B., Wolfhagen Sand, F., Ravassard, P. and Semb, H. (2010)

Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One, 5, e12413.

Nowrouzi, A., Dittrich, M., Klanke, C., Heinkelein, M., Rammling, M., Dandekar, T., von Kalle, C.

and Rethwilm, A. (2006) Genome-wide mapping of foamy virus vector integrations into a

human cell line. J Gen Virol, 87, 1339-1347.

Nowrouzi, A., Glimm, H., von Kalle, C. and Schmidt, M. (2011) Retroviral vectors: post entry events

and genomic alterations. Viruses, 3, 429-455.

Nunnari, G., Argyris, E., Fang, J., Mehlman, K.E., Pomerantz, R.J. and Daniel, R. (2005) Inhibition of

HIV-1 replication by caffeine and caffeine-related methylxanthines. Virology, 335, 177-184.

O'Connell, K.A., Bailey, J.R. and Blankson, J.N. (2009) Elucidating the elite: mechanisms of control

in HIV-1 infection. Trends Pharmacol Sci, 30, 631-637.

Ochem, A.E., Skopac, D., Costa, M., Rabilloud, T., Vuillard, L., Simoncsits, A., Giacca, M. and

Falaschi, A. (1997) Functional properties of the separate subunits of human DNA helicase

II/Ku autoantigen. J Biol Chem, 272, 29919-29926.

Oh, T., Bajwa, A., Jia, G. and Park, F. (2007) Lentiviral vector design using alternative RNA export

elements. Retrovirology, 4, 38.

Okamura, H., Aramburu, J., Garcia-Rodriguez, C., Viola, J.P., Raghavan, A., Tahiliani, M., Zhang, X.,

Qin, J., Hogan, P.G. and Rao, A. (2000) Concerted dephosphorylation of the transcription

factor NFAT1 induces a conformational switch that regulates transcriptional activity. Mol

Cell, 6, 539-550.

Okumura, K., Takagi, S., Sakaguchi, G., Naito, K., Minoura-Tada, N., Kobayashi, H., Mimori, T.,

Hinuma, Y. and Igarashi, H. (1994) Autoantigen Ku protein is involved in DNA binding

proteins which recognize the U5 repressive element of human T-cell leukemia virus type I

long terminal repeat. FEBS Lett, 356, 94-100.

Olsen, H.S. and Rosen, C.A. (1992) Contribution of the TATA motif to Tat-mediated transcriptional

activation of human immunodeficiency virus gene expression. J Virol, 66, 5594-5597.

Ong, C.T. and Corces, V.G. (2011) Enhancer function: new insights into the regulation of tissue-

specific gene expression. Nat Rev Genet, 12, 283-293.

Ono, A., Waheed, A.A. and Freed, E.O. (2007) Depletion of cellular cholesterol inhibits membrane

binding and higher-order multimerization of human immunodeficiency virus type 1 Gag.

Virology, 360, 27-35.

Ota, K., Kameoka, M., Tanaka, Y., Itaya, A. and Yoshihara, K. (2003) Expression of histone

acetyltransferases was down-regulated in poly(ADP-ribose) polymerase-1-deficient murine

cells. Biochem Biophys Res Commun, 310, 312-317.

Pace, M.J., Agosto, L., Graf, E.H. and O'Doherty, U. (2011) HIV reservoirs and latency models.

Virology, 411, 344-354.

Pagans, S., Pedal, A., North, B.J., Kaehlcke, K., Marshall, B.L., Dorr, A., Hetzer-Egger, C., Henklein,

P., Frye, R., McBurney, M.W., Hruby, H., Jung, M., Verdin, E. and Ott, M. (2005) SIRT1

regulates HIV transcription via Tat deacetylation. PLoS Biol, 3, e41.

Page, K.A., Landau, N.R. and Littman, D.R. (1990) Construction and use of a human

immunodeficiency virus vector for analysis of virus infectivity. J Virol, 64, 5270-5276.

Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D. and Soutoglou, E. (2012) DNAPKcs-dependent arrest of RNA

polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nat Struct Mol Biol, 19, 276-282.

Paprotka, T., Delviks-Frankenberry, K.A., Cingoz, O., Martinez, A., Kung, H.J., Tepper, C.G., Hu,

W.S., Fivash, M.J., Jr., Coffin, J.M. and Pathak, V.K. (2011) Recombinant origin of the

retrovirus XMRV. Science, 333, 97-101.

210

Parent, M., Yung, T.M., Rancourt, A., Ho, E.L., Vispe, S., Suzuki-Matsuda, F., Uehara, A., Wada, T.,

Handa, H. and Satoh, M.S. (2005) Poly(ADP-ribose) polymerase-1 is a negative regulator of

HIV-1 transcription through competitive binding to TAR RNA with Tat.positive transcription

elongation factor b (p-TEFb) complex. J Biol Chem, 280, 448-457.

Park, F. and Kay, M.A. (2001) Modified HIV-1 based lentiviral vectors have an effect on viral

transduction efficiency and gene expression in vitro and in vivo. Mol Ther, 4, 164-173.

Parker, J.C. and Hoffman, J.F. (1967) The role of membrane phosphoglycerate kinase in the control of

glycolytic rate by active cation transport in human red blood cells. J Gen Physiol, 50, 893-916.

Parolin, C., Dorfman, T., Palu, G., Gottlinger, H. and Sodroski, J. (1994) Analysis in human

immunodeficiency virus type 1 vectors of cis-acting sequences that affect gene transfer into

human lymphocytes. J Virol, 68, 3888-3895.

Paulk, N.K., Marquez Loza, L., Finegold, M. and Grompe, M. (2012) AAV-mediated gene targeting is

significantly enhance by transient inhibition of NHEJ or the proteasome <i>in vivo.</i>. Hum

Gene Ther.

Pauls, E., Senserrich, J., Clotet, B. and Este, J.A. (2006) Inhibition of HIV-1 replication by RNA

interference of p53 expression. J Leukoc Biol, 80, 659-667.

Pauwels, K., Gijsbers, R., Toelen, J., Schambach, A., Willard-Gallo, K., Verheust, C., Debyser, Z. and

Herman, P. (2009) State-of-the-art lentiviral vectors for research use: risk assessment and

biosafety recommendations. Curr Gene Ther, 9, 459-474.

Pearson, R., Kim, Y.K., Hokello, J., Lassen, K., Friedman, J., Tyagi, M. and Karn, J. (2008)

Epigenetic silencing of human immunodeficiency virus (HIV) transcription by formation of

restrictive chromatin structures at the viral long terminal repeat drives the progressive entry of

HIV into latency. J Virol, 82, 12291-12303.

Peeters, M., Gueye, A., Mboup, S., Bibollet-Ruche, F., Ekaza, E., Mulanga, C., Ouedrago, R., Gandji,

R., Mpele, P., Dibanga, G., Koumare, B., Saidou, M., Esu-Williams, E., Lombart, J.P.,

Badombena, W., Luo, N., Vanden Haesevelde, M. and Delaporte, E. (1997) Geographical

distribution of HIV-1 group O viruses in Africa. Aids, 11, 493-498.

Perkins, K.J., Lusic, M., Mitar, I., Giacca, M. and Proudfoot, N.J. (2008) Transcription-dependent

gene looping of the HIV-1 provirus is dictated by recognition of pre-mRNA processing

signals. Mol Cell, 29, 56-68.

Perkins, N.D., Edwards, N.L., Duckett, C.S., Agranoff, A.B., Schmid, R.M. and Nabel, G.J. (1993) A

cooperative interaction between NF-kappa B and Sp1 is required for HIV-1 enhancer

activation. Embo J, 12, 3551-3558.

Peterlin, B.M. and Trono, D. (2003) Hide, shield and strike back: how HIV-infected cells avoid

immune eradication. Nat Rev Immunol, 3, 97-107.

Pfeifer, A., Kessler, T., Yang, M., Baranov, E., Kootstra, N., Cheresh, D.A., Hoffman, R.M. and

Verma, I.M. (2001) Transduction of liver cells by lentiviral vectors: analysis in living animals

by fluorescence imaging. Mol Ther, 3, 319-322.

Pfeifer, G.P. and Riggs, A.D. (1991) Chromatin differences between active and inactive X

chromosomes revealed by genomic footprinting of permeabilized cells using DNase I and

ligation-mediated PCR. Genes Dev, 5, 1102-1113.

Pfeifer, G.P., Tanguay, R.L., Steigerwald, S.D. and Riggs, A.D. (1990) In vivo footprint and

methylation analysis by PCR-aided genomic sequencing: comparison of active and inactive X

chromosomal DNA at the CpG island and promoter of human PGK-1. Genes Dev, 4, 1277-

1287.

Ping, Y.H. and Rana, T.M. (2001) DSIF and NELF interact with RNA polymerase II elongation

complex and HIV-1 Tat stimulates P-TEFb-mediated phosphorylation of RNA polymerase II

and DSIF during transcription elongation. J Biol Chem, 276, 12951-12958.

Pluta, K. and Kacprzak, M.M. (2009) Use of HIV as a gene transfer vector. Acta Biochim Pol, 56,

531-595.

Poeschla, E.M. (2008) Integrase, LEDGF/p75 and HIV replication. Cell Mol Life Sci, 65, 1403-1424.

Polo, S.E. and Jackson, S.P. (2011) Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a

focus on protein modifications. Genes Dev, 25, 409-433.

Poon, B. and Chen, I.S. (2003) Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Vpr enhances

expression from unintegrated HIV-1 DNA. J Virol, 77, 3962-3972.

211

Popovic, M., Sarngadharan, M.G., Read, E. and Gallo, R.C. (1984) Detection, isolation, and

continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and

pre-AIDS. Science, 224, 497-500.

Postow, L., Ghenoiu, C., Woo, E.M., Krutchinsky, A.N., Chait, B.T. and Funabiki, H. (2008) Ku80

removal from DNA through double strand break-induced ubiquitylation. J Cell Biol, 182, 467-

479.

Prabhakar, B.S., Allaway, G.P., Srinivasappa, J. and Notkins, A.L. (1990) Cell surface expression of

the 70-kD component of Ku, a DNA-binding nuclear autoantigen. J Clin Invest, 86, 1301-

1305.

Priet, S., Gros, N., Navarro, J.M., Boretto, J., Canard, B., Querat, G. and Sire, J. (2005) HIV-1-

associated uracil DNA glycosylase activity controls dUTP misincorporation in viral DNA and

is essential to the HIV-1 life cycle. Mol Cell, 17, 479-490.

Puigdomenech, I., Massanella, M., Izquierdo-Useros, N., Ruiz-Hernandez, R., Curriu, M., Bofill, M.,

Martinez-Picado, J., Juan, M., Clotet, B. and Blanco, J. (2008) HIV transfer between CD4 T

cells does not require LFA-1 binding to ICAM-1 and is governed by the interaction of HIV

envelope glycoprotein with CD4. Retrovirology, 5, 32.

Qian, S., Zhong, X., Yu, L., Ding, B., de Haan, P. and Boris-Lawrie, K. (2009) HIV-1 Tat RNA

silencing suppressor activity is conserved across kingdoms and counteracts translational

repression of HIV-1. Proc Natl Acad Sci U S A, 106, 605-610.

Qin, J.Y., Zhang, L., Clift, K.L., Hulur, I., Xiang, A.P., Ren, B.Z. and Lahn, B.T. (2010) Systematic

comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. PLoS One, 5,

e10611.

Raghavendra, N.K., Shkriabai, N., Graham, R., Hess, S., Kvaratskhelia, M. and Wu, L. (2010)

Identification of host proteins associated with HIV-1 preintegration complexes isolated from

infected CD4+ cells. Retrovirology, 7, 66.

Rain, J.C., Cribier, A., Gerard, A., Emiliani, S. and Benarous, R. (2009) Yeast two-hybrid detection of

integrase-host factor interactions. Methods, 47, 291-297.

Ramezani, A., Hawley, T.S. and Hawley, R.G. (2003) Performance- and safety-enhanced lentiviral

vectors containing the human interferon-beta scaffold attachment region and the chicken beta-

globin insulator. Blood, 101, 4717-4724.

Ramirez-Carrozzi, V.R., Braas, D., Bhatt, D.M., Cheng, C.S., Hong, C., Doty, K.R., Black, J.C.,

Hoffmann, A., Carey, M. and Smale, S.T. (2009) A unifying model for the selective regulation

of inducible transcription by CpG islands and nucleosome remodeling. Cell, 138, 114-128.

Rato, S., Maia, S., Brito, P.M., Resende, L., Pereira, C.F., Moita, C., Freitas, R.P., Moniz-Pereira, J.,

Hacohen, N., Moita, L.F. and Goncalves, J. (2010) Novel HIV-1 knockdown targets identified

by an enriched kinases/phosphatases shRNA library using a long-term iterative screen in

Jurkat T-cells. PLoS One, 5, e9276.

Reagan, R.L., Lillie, M.G., Hickman, J.W. and Brueckner, A.L. (1950) Studies of the virus of equine

infectious anemia. Am J Vet Res, 11, 157-158.

Recillas-Targa, F., Pikaart, M.J., Burgess-Beusse, B., Bell, A.C., Litt, M.D., West, A.G., Gaszner, M.

and Felsenfeld, G. (2002) Position-effect protection and enhancer blocking by the chicken

beta-globin insulator are separable activities. Proc Natl Acad Sci U S A, 99, 6883-6888.

Reeves, M.B., Lehner, P.J., Sissons, J.G. and Sinclair, J.H. (2005a) An in vitro model for the

regulation of human cytomegalovirus latency and reactivation in dendritic cells by chromatin

remodelling. J Gen Virol, 86, 2949-2954.

Reeves, M.B., MacAry, P.A., Lehner, P.J., Sissons, J.G. and Sinclair, J.H. (2005b) Latency, chromatin

remodeling, and reactivation of human cytomegalovirus in the dendritic cells of healthy

carriers. Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 4140-4145.

Reeves, W.H. (1985) Use of monoclonal antibodies for the characterization of novel DNA-binding

proteins recognized by human autoimmune sera. J Exp Med, 161, 18-39.

Reiser, J., Harmison, G., Kluepfel-Stahl, S., Brady, R.O., Karlsson, S. and Schubert, M. (1996)

Transduction of nondividing cells using pseudotyped defective high-titer HIV type 1 particles.

Proc Natl Acad Sci U S A, 93, 15266-15271.

Riha, K., Heacock, M.L. and Shippen, D.E. (2006) The role of the nonhomologous end-joining DNA

double-strand break repair pathway in telomere biology. Annu Rev Genet, 40, 237-277.

212

Rinke, C.S., Boyer, P.L., Sullivan, M.D., Hughes, S.H. and Linial, M.L. (2002) Mutation of the

catalytic domain of the foamy virus reverse transcriptase leads to loss of processivity and

infectivity. J Virol, 76, 7560-7570.

Rittner, K., Churcher, M.J., Gait, M.J. and Karn, J. (1995) The human immunodeficiency virus long

terminal repeat includes a specialised initiator element which is required for Tat-responsive

transcription. J Mol Biol, 248, 562-580.

Rivera-Calzada, A., Spagnolo, L., Pearl, L.H. and Llorca, O. (2007) Structural model of full-length

human Ku70-Ku80 heterodimer and its recognition of DNA and DNA-PKcs. EMBO Rep, 8,

56-62.

Roberts, M.R., Han, Y., Fienberg, A., Hunihan, L. and Ruddle, F.H. (1994) A DNA-binding activity,

TRAC, specific for the TRA element of the transferrin receptor gene copurifies with the Ku

autoantigen. Proc Natl Acad Sci U S A, 91, 6354-6358.

Robinson, P.J., Fairall, L., Huynh, V.A. and Rhodes, D. (2006) EM measurements define the

dimensions of the "30-nm" chromatin fiber: evidence for a compact, interdigitated structure.

Proc Natl Acad Sci U S A, 103, 6506-6511.

Romerio, F., Gabriel, M.N. and Margolis, D.M. (1997) Repression of human immunodeficiency virus

type 1 through the novel cooperation of human factors YY1 and LSF. J Virol, 71, 9375-9382.

Rosenberg, S.A., Aebersold, P., Cornetta, K., Kasid, A., Morgan, R.A., Moen, R., Karson, E.M.,

Lotze, M.T., Yang, J.C., Topalian, S.L. and et al. (1990) Gene transfer into humans--

immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes

modified by retroviral gene transduction. N Engl J Med, 323, 570-578.

Roshal, M., Kim, B., Zhu, Y., Nghiem, P. and Planelles, V. (2003) Activation of the ATR-mediated

DNA damage response by the HIV-1 viral protein R. J Biol Chem, 278, 25879-25886.

Rous, P. (1911) A Sarcoma of the Fowl Transmissible by an Agent Separable from the Tumor Cells. J

Exp Med, 13, 397-411.

Ryu, B.Y., Persons, D.A., Evans-Galea, M.V., Gray, J.T. and Nienhuis, A.W. (2007) A chromatin

insulator blocks interactions between globin regulatory elements and cellular promoters in

erythroid cells. Blood Cells Mol Dis, 39, 221-228.

Saad, J.S., Miller, J., Tai, J., Kim, A., Ghanam, R.H. and Summers, M.F. (2006) Structural basis for

targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci

U S A, 103, 11364-11369.

Sachdeva, G., D'Costa, J., Cho, J.E., Kachapati, K., Choudhry, V. and Arya, S.K. (2007) Chimeric

HIV-1 and HIV-2 lentiviral vectors with added safety insurance. J Med Virol, 79, 118-126.

Saenz, D.T., Loewen, N., Peretz, M., Whitwam, T., Barraza, R., Howell, K.G., Holmes, J.M., Good,

M. and Poeschla, E.M. (2004) Unintegrated lentivirus DNA persistence and accessibility to

expression in nondividing cells: analysis with class I integrase mutants. J Virol, 78, 2906-

2920.

Sakuma, T., Barry, M.A. and Ikeda, Y. (2012) Lentiviral vectors: basic to translational. Biochem J,

443, 603-618.

Sakurai, Y., Komatsu, K., Agematsu, K. and Matsuoka, M. (2009) DNA double strand break repair

enzymes function at multiple steps in retroviral infection. Retrovirology, 6, 114.

Sato, H., Orenstein, J., Dimitrov, D. and Martin, M. (1992) Cell-to-cell spread of HIV-1 occurs within

minutes and may not involve the participation of virus particles. Virology, 186, 712-724.

Saxonov, S., Berg, P. and Brutlag, D.L. (2006) A genome-wide analysis of CpG dinucleotides in the

human genome distinguishes two distinct classes of promoters. Proc Natl Acad Sci U S A,

103, 1412-1417.

Schambach, A., Galla, M., Maetzig, T., Loew, R. and Baum, C. (2007) Improving transcriptional

termination of self-inactivating gamma-retroviral and lentiviral vectors. Mol Ther, 15, 1167-

1173.

Schambach, A., Swaney, W.P. and van der Loo, J.C. (2009) Design and production of retro- and

lentiviral vectors for gene expression in hematopoietic cells. Methods Mol Biol, 506, 191-205.

Scharfmann, R., Axelrod, J.H. and Verma, I.M. (1991) Long-term in vivo expression of retrovirus-

mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proc Natl Acad Sci U S A, 88, 4626-

4630.

213

Schroder, A.R., Shinn, P., Chen, H., Berry, C., Ecker, J.R. and Bushman, F. (2002) HIV-1 integration

in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell, 110, 521-529.

Schrofelbauer, B., Hakata, Y. and Landau, N.R. (2007) HIV-1 Vpr function is mediated by interaction

with the damage-specific DNA-binding protein DDB1. Proc Natl Acad Sci U S A, 104, 4130-

4135.

Schweizer, M., Falcone, V., Gange, J., Turek, R. and Neumann-Haefelin, D. (1997) Simian foamy

virus isolated from an accidentally infected human individual. J Virol, 71, 4821-4824.

Schweizer, M. and Merten, O.W. (2010) Large-scale production means for the manufacturing of

lentiviral vectors. Curr Gene Ther, 10, 474-486.

Serafini, M., Naldini, L. and Introna, M. (2004) Molecular evidence of inefficient transduction of

proliferating human B lymphocytes by VSV-pseudotyped HIV-1-derived lentivectors.

Virology, 325, 413-424.

Sharma, A., Awasthi, S., Harrod, C.K., Matlock, E.F., Khan, S., Xu, L., Chan, S., Yang, H.,

Thammavaram, C.K., Rasor, R.A., Burns, D.K., Skiest, D.J., Van Lint, C., Girard, A.M.,

McGee, M., Monnat, R.J., Jr. and Harrod, R. (2007) The Werner syndrome helicase is a

cofactor for HIV-1 long terminal repeat transactivation and retroviral replication. J Biol Chem,

282, 12048-12057.

Sharma, G., Kaur, G. and Mehra, N. (2011) Genetic correlates influencing immunopathogenesis of

HIV infection. Indian J Med Res, 134, 749-768.

Shen, L. and Siliciano, R.F. (2008) Viral reservoirs, residual viremia, and the potential of highly active

antiretroviral therapy to eradicate HIV infection. J Allergy Clin Immunol, 122, 22-28.

Shi, L., Qiu, D., Zhao, G., Corthesy, B., Lees-Miller, S., Reeves, W.H. and Kao, P.N. (2007) Dynamic

binding of Ku80, Ku70 and NF90 to the IL-2 promoter in vivo in activated T-cells. Nucleic

Acids Res, 35, 2302-2310.

Shoemaker, C., Hoffman, J., Goff, S.P. and Baltimore, D. (1981) Intramolecular integration within

Moloney murine leukemia virus DNA. J Virol, 40, 164-172.

Shun, M.C., Raghavendra, N.K., Vandegraaff, N., Daigle, J.E., Hughes, S., Kellam, P., Cherepanov, P.

and Engelman, A. (2007) LEDGF/p75 functions downstream from preintegration complex

formation to effect gene-specific HIV-1 integration. Genes Dev, 21, 1767-1778.

Sinclair, A., Yarranton, S. and Schelcher, C. (2006) DNA-damage response pathways triggered by

viral replication. Expert Rev Mol Med, 8, 1-11.

Sinclair, J. and Sissons, P. (1996) Latent and persistent infections of monocytes and macrophages.

Intervirology, 39, 293-301.

Singer-Sam, J., Keith, D.H., Tani, K., Simmer, R.L., Shively, L., Lindsay, S., Yoshida, A. and Riggs,

A.D. (1984) Sequence of the promoter region of the gene for human X-linked 3-

phosphoglycerate kinase. Gene, 32, 409-417.

Singleton, B.K., Priestley, A., Steingrimsdottir, H., Gell, D., Blunt, T., Jackson, S.P., Lehmann, A.R.

and Jeggo, P.A. (1997) Molecular and biochemical characterization of xrs mutants defective in

Ku80. Mol Cell Biol, 17, 1264-1273.

Sirven, A., Pflumio, F., Zennou, V., Titeux, M., Vainchenker, W., Coulombel, L., Dubart-

Kupperschmitt, A. and Charneau, P. (2000) The human immunodeficiency virus type-1 central

DNA flap is a crucial determinant for lentiviral vector nuclear import and gene transduction of

human hematopoietic stem cells. Blood, 96, 4103-4110.

Siva, A.C. and Bushman, F. (2002) Poly(ADP-ribose) polymerase 1 is not strictly required for

infection of murine cells by retroviruses. J Virol, 76, 11904-11910.

Skalka, A.M. and Katz, R.A. (2005) Retroviral DNA integration and the DNA damage response. Cell

Death Differ, 12 Suppl 1, 971-978.

Sloan, R.D. and Wainberg, M.A. (2011) The role of unintegrated DNA in HIV infection.

Retrovirology, 8, 52.

Smale, S.T. and Baltimore, D. (1989) The "initiator" as a transcription control element. Cell, 57, 103-

113.

Smith, J.A. and Daniel, R. (2006) Following the path of the virus: the exploitation of host DNA repair

mechanisms by retroviruses. ACS Chem Biol, 1, 217-226.

Smith, J.A., Nunnari, G., Preuss, M., Pomerantz, R.J. and Daniel, R. (2007) Pentoxifylline suppresses

transduction by HIV-1-based vectors. Intervirology, 50, 377-386.

214

Smith, J.A., Wang, F.X., Zhang, H., Wu, K.J., Williams, K.J. and Daniel, R. (2008) Evidence that the

Nijmegen breakage syndrome protein, an early sensor of double-strand DNA breaks (DSB), is

involved in HIV-1 post-integration repair by recruiting the ataxia telangiectasia-mutated

kinase in a process similar to, but distinct from, cellular DSB repair. Virol J, 5, 11.

Soderberg-Naucler, C., Streblow, D.N., Fish, K.N., Allan-Yorke, J., Smith, P.P. and Nelson, J.A.

(2001) Reactivation of latent human cytomegalovirus in CD14(+) monocytes is differentiation

dependent. J Virol, 75, 7543-7554.

Srinivasakumar, N., Chazal, N., Helga-Maria, C., Prasad, S., Hammarskjold, M.L. and Rekosh, D.

(1997) The effect of viral regulatory protein expression on gene delivery by human

immunodeficiency virus type 1 vectors produced in stable packaging cell lines. J Virol, 71,

5841-5848.

Steffen, D. (1984) Proviruses are adjacent to c-myc in some murine leukemia virus-induced

lymphomas. Proc Natl Acad Sci U S A, 81, 2097-2101.

Stinski, M.F. and Isomura, H. (2008) Role of the cytomegalovirus major immediate early enhancer in

acute infection and reactivation from latency. Med Microbiol Immunol, 197, 223-231.

Stinski, M.F., Mocarski, E.S. and Thomsen, D.R. (1979) DNA of human cytomegalovirus: size

heterogeneity and defectiveness resulting from serial undiluted passage. J Virol, 31, 231-239.

Stoltzfus, C.M. and Madsen, J.M. (2006) Role of viral splicing elements and cellular RNA binding

proteins in regulation of HIV-1 alternative RNA splicing. Curr HIV Res, 4, 43-55.

Strang, B.L., Ikeda, Y., Cosset, F.L., Collins, M.K. and Takeuchi, Y. (2004) Characterization of HIV-

1 vectors with gammaretrovirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells.

Gene Ther, 11, 591-598.

Studamire, B. and Goff, S.P. (2008) Host proteins interacting with the Moloney murine leukemia virus

integrase: multiple transcriptional regulators and chromatin binding factors. Retrovirology, 5,

48.

Sucharov, C.C., Helmke, S.M., Langer, S.J., Perryman, M.B., Bristow, M. and Leinwand, L. (2004)

The Ku protein complex interacts with YY1, is up-regulated in human heart failure, and

represses alpha myosin heavy-chain gene expression. Mol Cell Biol, 24, 8705-8715.

Sundquist, W.I. and Krausslich, H.G. (2012) HIV-1 Assembly, Budding, and Maturation. Cold Spring

Harb Perspect Med, 2.

Sune, C. and Garcia-Blanco, M.A. (1995) Sp1 transcription factor is required for in vitro basal and

Tat-activated transcription from the human immunodeficiency virus type 1 long terminal

repeat. J Virol, 69, 6572-6576.

Suzuki, Y. and Craigie, R. (2007) The road to chromatin - nuclear entry of retroviruses. Nat Rev

Microbiol, 5, 187-196.

Tabin, C.J., Hoffmann, J.W., Goff, S.P. and Weinberg, R.A. (1982) Adaptation of a retrovirus as a

eucaryotic vector transmitting the herpes simplex virus thymidine kinase gene. Mol Cell Biol,

2, 426-436.

Tachiwana, H., Shimura, M., Nakai-Murakami, C., Tokunaga, K., Takizawa, Y., Sata, T.,

Kurumizaka, H. and Ishizaka, Y. (2006) HIV-1 Vpr induces DNA double-strand breaks.

Cancer Res, 66, 627-631.

Tan-Wong, S.M., French, J.D., Proudfoot, N.J. and Brown, M.A. (2008) Dynamic interactions

between the promoter and terminator regions of the mammalian BRCA1 gene. Proc Natl Acad

Sci U S A, 105, 5160-5165.

Tanaka, A., Takahashi, C., Yamaoka, S., Nosaka, T., Maki, M. and Hatanaka, M. (1990) Oncogenic

transformation by the tax gene of human T-cell leukemia virus type I in vitro. Proc Natl Acad

Sci U S A, 87, 1071-1075.

Tang, L.Y. and Zhang, J. (2000) The cellular mismatch repair system is able to repair mismatches

within MLV retroviral double-stranded DNA at a low frequency. Nucleic Acids Res, 28, 2302-

2306.

Teoh, G., Urashima, M., Greenfield, E.A., Nguyen, K.A., Lee, J.F., Chauhan, D., Ogata, A., Treon,

S.P. and Anderson, K.C. (1998) The 86-kD subunit of Ku autoantigen mediates homotypic

and heterotypic adhesion of multiple myeloma cells. J Clin Invest, 101, 1379-1388.

215

Thomson, J.P., Skene, P.J., Selfridge, J., Clouaire, T., Guy, J., Webb, S., Kerr, A.R., Deaton, A.,

Andrews, R., James, K.D., Turner, D.J., Illingworth, R. and Bird, A. (2010) CpG islands

influence chromatin structure via the CpG-binding protein Cfp1. Nature, 464, 1082-1086.

Ting, N.S., Chan, D.W., Lintott, L.G., Allalunis-Turner, J. and Lees-Miller, S.P. (1999) Protein-DNA

complexes containing DNA-dependent protein kinase in crude extracts from human and

rodent cells. Radiat Res, 151, 414-422.

Ting, N.S., Yu, Y., Pohorelic, B., Lees-Miller, S.P. and Beattie, T.L. (2005) Human Ku70/80 interacts

directly with hTR, the RNA component of human telomerase. Nucleic Acids Res, 33, 2090-

2098.

Trobridge, G.D., Miller, D.G., Jacobs, M.A., Allen, J.M., Kiem, H.P., Kaul, R. and Russell, D.W.

(2006) Foamy virus vector integration sites in normal human cells. Proc Natl Acad Sci U S A,

103, 1498-1503.

Trono, D. (1992) Partial reverse transcripts in virions from human immunodeficiency and murine

leukemia viruses. J Virol, 66, 4893-4900.

Trono, D., Van Lint, C., Rouzioux, C., Verdin, E., Barre-Sinoussi, F., Chun, T.W. and Chomont, N.

(2010) HIV persistence and the prospect of long-term drug-free remissions for HIV-infected

individuals. Science, 329, 174-180.

Tuteja, R. and Tuteja, N. (2000) Ku autoantigen: a multifunctional DNA-binding protein. Crit Rev

Biochem Mol Biol, 35, 1-33.

Tyagi, M. and Karn, J. (2007) CBF-1 promotes transcriptional silencing during the establishment of

HIV-1 latency. Embo J, 26, 4985-4995.

Tyagi, S., Ochem, A. and Tyagi, M. (2011) DNA-dependent protein kinase interacts functionally with

the RNA polymerase II complex recruited at the human immunodeficiency virus (HIV) long

terminal repeat and plays an important role in HIV gene expression. J Gen Virol, 92, 1710-

1720.

Uchida, N., Washington, K.N., Lap, C.J., Hsieh, M.M. and Tisdale, J.F. (2011) Chicken HS4

insulators have minimal barrier function among progeny of human hematopoietic cells

transduced with an HIV1-based lentiviral vector. Mol Ther, 19, 133-139.

Urisman, A., Molinaro, R.J., Fischer, N., Plummer, S.J., Casey, G., Klein, E.A., Malathi, K., Magi-

Galluzzi, C., Tubbs, R.R., Ganem, D., Silverman, R.H. and DeRisi, J.L. (2006) Identification

of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL

variant. PLoS Pathog, 2, e25.

Valen, E. and Sandelin, A. (2011) Genomic and chromatin signals underlying transcription start-site

selection. Trends Genet, 27, 475-485.

van Ingen, H., van Schaik, F.M., Wienk, H., Ballering, J., Rehmann, H., Dechesne, A.C., Kruijzer,

J.A., Liskamp, R.M., Timmers, H.T. and Boelens, R. (2008) Structural insight into the

recognition of the H3K4me3 mark by the TFIID subunit TAF3. Structure, 16, 1245-1256.

Van Lint, C., Amella, C.A., Emiliani, S., John, M., Jie, T. and Verdin, E. (1997) Transcription factor

binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site

are important for virus infectivity. J Virol, 71, 6113-6127.

Van Maele, B., De Rijck, J., De Clercq, E. and Debyser, Z. (2003) Impact of the central polypurine

tract on the kinetics of human immunodeficiency virus type 1 vector transduction. J Virol, 77,

4685-4694.

Varatharajan, L. and Thomas, S.A. (2009) The transport of anti-HIV drugs across blood-CNS

interfaces: summary of current knowledge and recommendations for further research.

Antiviral Res, 82, A99-109.

Vargas, J., Jr., Gusella, G.L., Najfeld, V., Klotman, M.E. and Cara, A. (2004) Novel integrase-

defective lentiviral episomal vectors for gene transfer. Hum Gene Ther, 15, 361-372.

Verdin, E. (1991) DNase I-hypersensitive sites are associated with both long terminal repeats and with

the intragenic enhancer of integrated human immunodeficiency virus type 1. J Virol, 65, 6790-

6799.

Verdin, E., Paras, P., Jr. and Van Lint, C. (1993) Chromatin disruption in the promoter of human

immunodeficiency virus type 1 during transcriptional activation. Embo J, 12, 3249-3259.

216

Vermeulen, M., Mulder, K.W., Denissov, S., Pijnappel, W.W., van Schaik, F.M., Varier, R.A.,

Baltissen, M.P., Stunnenberg, H.G., Mann, M. and Timmers, H.T. (2007) Selective anchoring

of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell, 131, 58-69.

Vogelmann, J., Valeri, A., Guillou, E., Cuvier, O. and Nollmann, M. (2011) Roles of chromatin

insulator proteins in higher-order chromatin organization and transcription regulation.

Nucleus, 2, 358-369.

Vogt, V.M. (1997) Retroviral Virions and Genomes.

Walker, J.R., Corpina, R.A. and Goldberg, J. (2001) Structure of the Ku heterodimer bound to DNA

and its implications for double-strand break repair. Nature, 412, 607-614.

Wang, G.P., Ciuffi, A., Leipzig, J., Berry, C.C. and Bushman, F.D. (2007) HIV integration site

selection: analysis by massively parallel pyrosequencing reveals association with epigenetic

modifications. Genome Res, 17, 1186-1194.

Wang, R., Liang, J., Jiang, H., Qin, L.J. and Yang, H.T. (2008a) Promoter-dependent EGFP

expression during embryonic stem cell propagation and differentiation. Stem Cells Dev, 17,

279-289.

Wang, Y., Ghosh, G. and Hendrickson, E.A. (2009) Ku86 represses lethal telomere deletion events in

human somatic cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 106, 12430-12435.

Wang, Z., Zang, C., Rosenfeld, J.A., Schones, D.E., Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T.Y.,

Peng, W., Zhang, M.Q. and Zhao, K. (2008b) Combinatorial patterns of histone acetylations

and methylations in the human genome. Nat Genet, 40, 897-903.

Waninger, S., Kuhen, K., Hu, X., Chatterton, J.E., Wong-Staal, F. and Tang, H. (2004) Identification

of cellular cofactors for human immunodeficiency virus replication via a ribozyme-based

genomics approach. J Virol, 78, 12829-12837.

Wanisch, K. and Yanez-Munoz, R.J. (2009) Integration-deficient lentiviral vectors: a slow coming of

age. Mol Ther, 17, 1316-1332.

Warnock, J.N., Daigre, C. and Al-Rubeai, M. (2011) Introduction to viral vectors. Methods Mol Biol,

737, 1-25.

Warriar, N., Page, N. and Govindan, M.V. (1996) Expression of human glucocorticoid receptor gene

and interaction of nuclear proteins with the transcriptional control element. J Biol Chem, 271,

18662-18671.

Warrilow, D., Tachedjian, G. and Harrich, D. (2009) Maturation of the HIV reverse transcription

complex: putting the jigsaw together. Rev Med Virol, 19, 324-337.

Wathen, M.W. and Stinski, M.F. (1982) Temporal patterns of human cytomegalovirus transcription:

mapping the viral RNAs synthesized at immediate early, early, and late times after infection. J

Virol, 41, 462-477.

Watts, J.M., Dang, K.K., Gorelick, R.J., Leonard, C.W., Bess, J.W., Jr., Swanstrom, R., Burch, C.L.

and Weeks, K.M. (2009) Architecture and secondary structure of an entire HIV-1 RNA

genome. Nature, 460, 711-716.

Weinberg, J.B., Matthews, T.J., Cullen, B.R. and Malim, M.H. (1991) Productive human

immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection of nonproliferating human monocytes. J Exp

Med, 174, 1477-1482.

Weitzman, M.D., Lilley, C.E. and Chaurushiya, M.S. (2010) Genomes in conflict: maintaining

genome integrity during virus infection. Annu Rev Microbiol, 64, 61-81.

Westerman, K.A., Ao, Z., Cohen, E.A. and Leboulch, P. (2007) Design of a trans protease lentiviral

packaging system that produces high titer virus. Retrovirology, 4, 96.

White, S.M., Renda, M., Nam, N.Y., Klimatcheva, E., Zhu, Y., Fisk, J., Halterman, M., Rimel, B.J.,

Federoff, H., Pandya, S., Rosenblatt, J.D. and Planelles, V. (1999) Lentivirus vectors using

human and simian immunodeficiency virus elements. J Virol, 73, 2832-2840.

Willard, H.F., Goss, S.J., Holmes, M.T. and Munroe, D.L. (1985) Regional localization of the

phosphoglycerate kinase gene and pseudogene on the human X chromosome and assignment

of a related DNA sequence to chromosome 19. Hum Genet, 71, 138-143.

Williams, S.A., Chen, L.F., Kwon, H., Ruiz-Jarabo, C.M., Verdin, E. and Greene, W.C. (2006) NF-

kappaB p50 promotes HIV latency through HDAC recruitment and repression of

transcriptional initiation. Embo J, 25, 139-149.

217

Williamson, E.A., Farrington, J., Martinez, L., Ness, S., O'Rourke, J., Lee, S.H., Nickoloff, J. and

Hromas, R. (2008) Expression levels of the human DNA repair protein metnase influence

lentiviral genomic integration. Biochimie, 90, 1422-1426.

Wolf, D. and Goff, S.P. (2008) Host restriction factors blocking retroviral replication. Annu Rev

Genet, 42, 143-163.

Wong, P.K. (1990) Moloney murine leukemia virus temperature-sensitive mutants: a model for

retrovirus-induced neurologic disorders. Curr Top Microbiol Immunol, 160, 29-60.

Woodward, C.L., Prakobwanakit, S., Mosessian, S. and Chow, S.A. (2009) Integrase interacts with

nucleoporin NUP153 to mediate the nuclear import of human immunodeficiency virus type 1.

J Virol, 83, 6522-6533.

Wu, X., Li, Y., Crise, B. and Burgess, S.M. (2003) Transcription start regions in the human genome

are favored targets for MLV integration. Science, 300, 1749-1751.

Wu, X., Wakefield, J.K., Liu, H., Xiao, H., Kralovics, R., Prchal, J.T. and Kappes, J.C. (2000)

Development of a novel trans-lentiviral vector that affords predictable safety. Mol Ther, 2, 47-

55.

Wu, Y. and Marsh, J.W. (2001) Selective transcription and modulation of resting T cell activity by

preintegrated HIV DNA. Science, 293, 1503-1506.

Wu, Y. and Marsh, J.W. (2003) Early transcription from nonintegrated DNA in human

immunodeficiency virus infection. J Virol, 77, 10376-10382.

Wutz, A. (2011) Gene silencing in X-chromosome inactivation: advances in understanding facultative

heterochromatin formation. Nat Rev Genet, 12, 542-553.

Xia, X., Zhang, Y., Zieth, C.R. and Zhang, S.C. (2007) Transgenes delivered by lentiviral vector are

suppressed in human embryonic stem cells in a promoter-dependent manner. Stem Cells Dev,

16, 167-176.

Xie, B., Invernizzi, C.F., Richard, S. and Wainberg, M.A. (2007) Arginine methylation of the human

immunodeficiency virus type 1 Tat protein by PRMT6 negatively affects Tat Interactions with

both cyclin T1 and the Tat transactivation region. J Virol, 81, 4226-4234.

Xu, P., LaVallee, P.A., Lin, J.J. and Hoidal, J.R. (2004) Characterization of proteins binding to E-

box/Ku86 sites and function of Ku86 in transcriptional regulation of the human xanthine

oxidoreductase gene. J Biol Chem, 279, 16057-16063.

Yan, N. and Chen, Z.J. (2012) Intrinsic antiviral immunity. Nat Immunol, 13, 214-222.

Yan, N., Cherepanov, P., Daigle, J.E., Engelman, A. and Lieberman, J. (2009) The SET complex acts

as a barrier to autointegration of HIV-1. PLoS Pathog, 5, e1000327.

Yang, Y.X., Guen, V., Richard, J., Cohen, E.A. and Berthoux, L. (2010) Cell context-dependent

involvement of ATR in early stages of retroviral replication. Virology, 396, 272-279.

Yannaki, E., Tubb, J., Aker, M., Stamatoyannopoulos, G. and Emery, D.W. (2002) Topological

constraints governing the use of the chicken HS4 chromatin insulator in oncoretrovirus

vectors. Mol Ther, 5, 589-598.

Yoder, K., Sarasin, A., Kraemer, K., McIlhatton, M., Bushman, F. and Fishel, R. (2006) The DNA

repair genes XPB and XPD defend cells from retroviral infection. Proc Natl Acad Sci U S A,

103, 4622-4627.

Yoder, K.E. and Bushman, F.D. (2000) Repair of gaps in retroviral DNA integration intermediates. J

Virol, 74, 11191-11200.

Yoder, K.E., Roddick, W., Hoellerbauer, P. and Fishel, R. (2011) XPB mediated retroviral cDNA

degradation coincides with entry to the nucleus. Virology, 410, 291-298.

Yu, D., Wang, W., Yoder, A., Spear, M. and Wu, Y. (2009) The HIV envelope but not VSV

glycoprotein is capable of mediating HIV latent infection of resting CD4 T cells. PLoS

Pathog, 5, e1000633.

Yu, S.F., von Ruden, T., Kantoff, P.W., Garber, C., Seiberg, M., Ruther, U., Anderson, W.F., Wagner,

E.F. and Gilboa, E. (1986) Self-inactivating retroviral vectors designed for transfer of whole

genes into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 83, 3194-3198.

Zaiss, A.K., Son, S. and Chang, L.J. (2002) RNA 3' readthrough of oncoretrovirus and lentivirus:

implications for vector safety and efficacy. J Virol, 76, 7209-7219.

Zaitseva, L., Cherepanov, P., Leyens, L., Wilson, S.J., Rasaiyaah, J. and Fassati, A. (2009) HIV-1

exploits importin 7 to maximize nuclear import of its DNA genome. Retrovirology, 6, 11.

218

Zanta-Boussif, M.A., Charrier, S., Brice-Ouzet, A., Martin, S., Opolon, P., Thrasher, A.J., Hope, T.J.

and Galy, A. (2009) Validation of a mutated PRE sequence allowing high and sustained

transgene expression while abrogating WHV-X protein synthesis: application to the gene

therapy of WAS. Gene Ther, 16, 605-619.

Zhang, X.Y., La Russa, V.F. and Reiser, J. (2004) Transduction of bone-marrow-derived

mesenchymal stem cells by using lentivirus vectors pseudotyped with modified RD114

envelope glycoproteins. J Virol, 78, 1219-1229.

Zhang, Y.A., Maitra, A., Hsieh, J.T., Rudin, C.M., Peacock, C.D., Karikari, C., Brekken, R.A.,

Stastny, V., Gao, B., Girard, L., Wistuba, I., Frenkel, E., Minna, J.D. and Gazdar, A.F. (2011)

Frequent detection of infectious xenotropic murine leukemia virus (XMLV) in human cultures

established from mouse xenografts. Cancer Biol Ther, 12, 617-628.

Zheng, Y., Ao, Z., Wang, B., Jayappa, K.D. and Yao, X. (2011) Host protein Ku70 binds and protects

HIV-1 integrase from proteasomal degradation and is required for HIV replication. J Biol

Chem, 286, 17722-17735.

Zhou, H., Xu, M., Huang, Q., Gates, A.T., Zhang, X.D., Castle, J.C., Stec, E., Ferrer, M., Strulovici,

B., Hazuda, D.J. and Espeseth, A.S. (2008) Genome-scale RNAi screen for host factors

required for HIV replication. Cell Host Microbe, 4, 495-504.

Zhou, M., Halanski, M.A., Radonovich, M.F., Kashanchi, F., Peng, J., Price, D.H. and Brady, J.N.

(2000) Tat modifies the activity of CDK9 to phosphorylate serine 5 of the RNA polymerase II

carboxyl-terminal domain during human immunodeficiency virus type 1 transcription. Mol

Cell Biol, 20, 5077-5086.

Zhou, S., Mody, D., DeRavin, S.S., Hauer, J., Lu, T., Ma, Z., Hacein-Bey Abina, S., Gray, J.T.,

Greene, M.R., Cavazzana-Calvo, M., Malech, H.L. and Sorrentino, B.P. (2010) A self-

inactivating lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy that does not activate LMO2

expression in human T cells. Blood, 116, 900-908.

Zhou, Y., Zhang, H., Siliciano, J.D. and Siliciano, R.F. (2005) Kinetics of human immunodeficiency

virus type 1 decay following entry into resting CD4+ T cells. J Virol, 79, 2199-2210.

Ziegler, L., Yang, L., Joo, K., Yang, H., Baltimore, D. and Wang, P. (2008) Targeting lentiviral

vectors to antigen-specific immunoglobulins. Hum Gene Ther, 19, 861-872.

Zimmerman, E.S., Chen, J., Andersen, J.L., Ardon, O., Dehart, J.L., Blackett, J., Choudhary, S.K.,

Camerini, D., Nghiem, P. and Planelles, V. (2004) Human immunodeficiency virus type 1

Vpr-mediated G2 arrest requires Rad17 and Hus1 and induces nuclear BRCA1 and gamma-

H2AX focus formation. Mol Cell Biol, 24, 9286-9294.

Zimmerman, E.S., Sherman, M.P., Blackett, J.L., Neidleman, J.A., Kreis, C., Mundt, P., Williams,

S.A., Warmerdam, M., Kahn, J., Hecht, F.M., Grant, R.M., de Noronha, C.M., Weyrich, A.S.,

Greene, W.C. and Planelles, V. (2006) Human immunodeficiency virus type 1 Vpr induces

DNA replication stress in vitro and in vivo. J Virol, 80, 10407-10418.

Zufferey, R., Donello, J.E., Trono, D. and Hope, T.J. (1999) Woodchuck hepatitis virus

posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by

retroviral vectors. J Virol, 73, 2886-2892.

Zufferey, R., Dull, T., Mandel, R.J., Bukovsky, A., Quiroz, D., Naldini, L. and Trono, D. (1998) Self-

inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol, 72, 9873-

9880.

Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R.J., Naldini, L. and Trono, D. (1997) Multiply attenuated lentiviral

vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat Biotechnol, 15, 871-875.

Zychlinski, D., Schambach, A., Modlich, U., Maetzig, T., Meyer, J., Grassman, E., Mishra, A. and

Baum, C. (2008) Physiological promoters reduce the genotoxic risk of integrating gene

vectors. Mol Ther, 16, 718-725.

RESUME

Une meilleure connaissance des déterminants viraux et cellulaires impliqués dans la régulation de

l’expression lentivirale est essentielle pour (i) maitriser l’expression d’un transgène dans le cadre d’un

transfert de gène et (ii) mieux comprendre l’absence/la perte de l’expression du virus de l’immunodéficience

humaine de type 1 (VIH-1) observé en cas de latence virale après infection. Dans ce contexte, les facteurs

cellulaires impliqués dans la reconnaissance et la réparation des cassures de l'ADN, activés dès les étapes

précoces du cycle viral, pourraient participer au contrôle de l’expression rétrovirale.

Dans la première partie de cette étude, nous avons généré une collection de vecteurs lentiviraux

codant le transgène green fluorescent protein (gfp) avec des design variés : promoteur du VIH-1 [long

terminal repeat (LTRs)] ou d’origine hétérologue [e.g., promoteur viral CMV (cytomegalovirus), ou humain

PGK (phosphoglycerate kinase)], intégrase native ou mutée, LTRs natifs ou self inactivating (SIN). En

particulier, nous avons caractérisé l’impact de l’insertion de différentes séquences hétérologues au sein des

SIN-LTRs sur l’expression du transgène gfp au cours du temps dans un contexte compétent ou déficient pour

l’intégration. Nous avons mis en évidence un phénomène de modulation du niveau d’expression du transgène

(d’un facteur 0,3 à 1,8; comparé aux vecteurs sans insertion) qui est dépendant de la séquence insérée et de

son orientation. L’expression transgénique résulterait donc d’une balance coûts/bénéfices associés à

l’insertion d’éléments aux extrémités des vecteurs qui pourrait déterminer le niveau d’expression du

transgène à partir de vecteurs modifiés.

Dans la seconde partie, nous avons réalisé une analyse systématique et comparative de l’expression

lentivirale au sein des cellules humaines de carcinome de côlon HCT 116 déplétées pour le complexe Ku. Ce

complexe, qui est essentiel à la survie chez l’homme et est impliqué dans les processus de réparation de

l’ADN, a été identifié comme une cible anti-VIH potentielle. Nous avons mis en évidence que la déplétion en

Ku induit une diminution de l’expression précoce du VIH-1 de façon spécifique du LTR et indépendante de

Tat. Même si l’action de Ku nécessite l’intégration du VIH-1, sa déplétion ne modifie pas l’efficacité

d’intégration virale mais agit plutôt au niveau transcriptionnel. Da façon importante, la réactivation de

l’expression du transgène après traitement par l’activateur de NF-κB (Nuclear Factor κB), le TNF tumor

necrosis factor ) ou un inhibiteur des déacétylases d’histones, la trichostatine A est favorisée par la

déplétion en Ku. A l’inverse, en présence d’un niveau normal en Ku, les cellules exprimant le VIH-1 seraient

contre-sélectionnées dans le temps. Ainsi, la déplétion en Ku pourrait promouvoir l’établissement d’un état

(reactivable) de latence transcriptionelle associé à une moindre contre-sélection des cellules transduites.

Les résultats issus de ce travail de thèse démontrent que l’expression lentivirale varie en fonction de

nombreux paramètres, dont (i) le design des vecteurs, (ii) le type cellulaire transduit et son fond génétique, et

(iii) le temps écoulé depuis la transduction, reflétant ainsi des interactions différentielles entre le vecteur et

son hôte.