infezioni da hpv: prime esperienze nel campo della

Infezioni da HPV:

prime esperienze nel campo della

Biologia Molecolare

Taranto, 3 Novembre 2004

Dott.ssa Rosa Tripaldi

Dr.ssa Rosa Tripaldi 2

HPV


Papovaviridae

• 2 Genera:

– Papillomaviruses:

• Human, Rabbit, Bovine, Canine, Equine

– Polyomaviruses:

• Mice, BK & JC viruses (man), RK virus (rabbit), SV40

(monkey)

• ds DNA, 45nm, non-enveloped, icosahedral

• Cyclic, infectious when separated from capsid

http://www.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/papillo.html

Human Papillomavirus (HPV)

General:

• Ether-resistant, acid & heat stable

• Circular dsDNA ~8kb, non-enveloped

• Icosahedral,72 capsomeres, 55nm diameter

• Surface Antigen

• Over 100 genotypes*, High & Low Risk strains

• Causes warts; transforms cells

• Polycistronic, 8 ORF

• Genome: 3 Regions

• Replicates in Nucleus

• Plasmid-like state




Incidenza e distribuzione dei tumori da HPV


Il primo tumore solido che è stato

riconosciuto essere di origine virale è

il carcinoma della cervice …

e l’ HPV ne è l’agente causale


Ruolo dell’HPV nel tumore cervicale“ A partire dalla seconda metà degli anni ‘90 numerosi studi hanno dimostrato che il Papilloma Virus Umano (HPV) è presente nella quasi totalità dei tumori cervicali

“ La persistenza di alcuni tipi virali aumenta la probabilità di sviluppo di un tumore cervicale

“ Attualmente sono stati identificati 200 tipi di HPV, di cui 85 genotipi ben caratterizzati

“I genotipi HPV coinvolti nelle infezioni genitali sono circa una trentina, distinti in basso e alto rischio oncogeno


La prevalenza dell’HPV nei Carcinomi

della cervice è praticamente totale: 99.8%

Una relazione più forte di quella

tra tabacco e CA polmonare

tra epatite B e CA epatico


A livello mondiale il carcinoma cervicale è la prima causa di morte per tumore nella popolazione femminile:

470 mila nuovi casi/233 mila decessi all’anno

In Europa è la seconda, dopo il tumore al polmone:

65 mila nuovi casi/28 mila decessi all’anno

Struttura del virus

3 Regioni:LLR=Long Regulatory Region (non coding)E=Early Region (encodes proteins)L=Late Region (encodes capsid proteins)

HPV: virus a dsDNA circolare di circa 8000 bp con capside proteico


HPV: Life Cycle

Copyright © 1999 Academic Press



HPV Genome: Proteins

• E1: Initiation of DNA replication (helicase)

• E2: Transcriptional regulation/DNA replication

• E4: Late NS protein; Disrupts cytoskeleton

• E5: Transforming protein, interacts with growth

factor receptors, e.g. PDGF

• E6: Transforming protein, binds to p53 leading to

degradation

• E7: Transforming protein, binds to pRB

• L1: Major capsid protein (capsomeres)

• L2: Minor capsid protein



La persistenza dell’infezione da HPV

è condizione necessaria allo sviluppo

del cervicocarcinoma

Progressione a Carcinoma indotta da HPV“ L’HPV è responsabile della alterata regolazione del ciclo cellulare

che conduce alla trasformazione maligna “ La presenza persistente di HPV è condizione essenziale……anche se da sola non basta allo sviluppo del Carcinoma cervicale

HPV

infezione

HPV

infezione

persistente

Alterata

regolazione

cellulare

CIN

“High grade

Carcinoma

Invasivo

Fattori

Immunologici Co-carcinogeni


Progressione della malattia: dall’infezione HPV a Cervicocarcinoma : > 10 anni

Infezione

Clearance

Progressione

Regressione

Invasione

Cervice

con

Infezione

HPV

6-13 anni

Persistenza

(oltre 1 anno)

Cervice

normaleCancro

Anormalità citologiche

moderate

Risoluzione spontanea

nell’ 80 % delle infezioni

Lesione

precancerosa


“Lo sviluppo del tumore cervicale è preceduto dalla comparsa di lesioni pre-cancerose che impiegano molti anni ad evolvere in carcinoma invasivo

“poiché sono lesioni asintomatiche possono essere rilevate solo grazie a programmi di screening

“se rilevate per tempo possono essere eliminate con intervento ambulatoriale di efficacia quasi del 100%

UN CORRETTO PROGRAMMA DI SCREENING POTREBBE ELIMINARE COMPLETAMENTE IL TUMORE CERVICALE

Terminologia“ CIN: cervical intraepithelial neoplasia, di grado I, II o III stabilito in seguito a prelievo bioptico ed esame istologico

“ ASC-US: atypical squamous cells of undetermined significance; è la forma più lieve di anomalia citologica

“ LSIL: low-grade squamous intraepithelial lesion (CIN I nel vecchio sistema di classificazione) di solito a regressione spontanea

“ HSIL: high-grade squamous intraepithelial lesion; è l’anomalia non cancerosa più grave e richiede trattamento immediato

“ Displasia: anomalie nella divisione cellulare o nella morfologia

“ Carcinoma in situ: forma di HSIL refertata al Pap test come tumore cervicale


Prevalenza di HPV

010

20

30

40

5060

70

80

90

100

Normal ASCUS Low-CIN High-CIN InvasiveCancer

11.2%

55.0%

88.8%

72.9%

>95%

HPV HPV

DNADNA

%%


Contatto con HPV: quasi sempre regressione spontanea

La persistenza di HPV ‚high risk‛ può condurre a stati pre-cancerosi (CIN)

La presenza di HPV e CIN3 è condizione necessaria per l’accumulo di mutazioni random che possono portare allo sviluppo del tumore cervicale


Sensibilità relativa delle tecniche di analisi

degli acidi nucleici


PCR

1984 Kary Mullis at Cetus


Tipologia di campione

• Materiale istologico

sezioni tagliate al microtomo di materiale fissato

ed incluso

• Materiale cellulare a fresco prelevato in

sede cervico-vaginale

sospensione di cellule prelevate mediante

Bactopick o Cytobrush dall’eso-endocervice,

fornici e vagina


Percorso diagnostico

HPV DNA screening

Se positivo

HPV Genotipizzazione


Fasi del processo analitico

HPV DNA screening

• Estrazione

• Amplificazione

• Rilevazione


Estrazione

• In generale l’acido nucleico è liberato dalla cellula per digestione con proteinasi K, lisi con agenti caotropici, lisi osmotica a caldo o lisi alcalina a caldo.

• A questa prima fase può seguire una purificazione con solventi organici, resine, matrici di silice, precipitazione in alcoli.


Amplificazione

.

• Viene utilizzata una

sequenza della

regione L1, comune a

circa 40 tipi di HPV,

compresi tutti quelli

d’interesse clinico.


HPV Genome

8 ORF



Rivelazione

• La rivelazione degli

amplificati è condotta

mediante elettroforesi

in gel di agarosio, in

tampone TBE 1x,

colorato con bromuro

di etidio


standard interno 600 bp

Frammento

specifico 450 bp


HPV GENOTIPIZZAZIONE

• Sui casi positivi si esegue la tipizzazione:

alto rischio (16,18,31,33,35,45,52,58)

basso rischio (6,11)


Strategie di tipizzazione dell’HPV


HPV – Genotipizzazione


HPV ” Genotipizzazione


1. Organizzazione di

Laboratorio e strumentazione

necessaria

2. Aspetti pre-analitici

3. Fattori interferenti con le procedure

analitiche

4. Il Sistema di Garanzia di

Qualità Totale


Preparazione del campione

Preparazione del reagente e conservazione

Pre-amplificazione reazione iniziale

Amplificazione

Conservazione del kit

Analisi del prodotto della PCR

Stoccaggio concentrato di controlli positivi

conservati

Area priva del prodotto PCR

Area contenente il prodotto PCR

Ricevimento e accettazione del campione

Flusso di lavoro unidirezionale


Abbinamento dello screening con Pap test e conferma con HPV

Citologia cervicale di routine: Pap test

Positivo Negativo

ASC-US: diagnosi citologica

Eseguire Colposcopia

Eseguire Colposcopia citologia cervicaledi screening

citologia cervicale

di screening

* Source: ACCSP Guidelines – JAMA

Risultati Pap Anomali,ASC-USe HPV

positivo

Risultati NormaliPap test

ASC-US Pape HPV

negativo

Ripetere il Pap Test entro 6 mesi

HPV DNA test sui campioni cellulari


Linee guida dell’ESIDOG (European Society for Infectious and Immunological Diseases in Obstetrics and Gynaecology)

L’impiego di test HPV è stato valutato per le seguenti categorie:

“donne > 30 anni: screening primario del tumore cervicale in combinazione con l’esame citologico

“ pazienti con referti citologici indefiniti (ASC-US)

“ pazienti con stadi precancerosi lievi e moderati (LSIL, HSIL) per prevederne la regressione, la persistenza o la progressione

“ pazienti già sottoposte a trattamento per CIN (displasia) e carcinoma cervicale


Attuale utilizzo clinico accettato del test HPV DNA :

“ Conferma dei casi ASCUS ( TRIAGE )“ Follow up dei casi CIN 2, 3 per predire la regressione ”

progressione“ Dopo trattamento per displasia per predire la possibilità di recidive

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