BIOTOXINAS MARINAS

BIOTOXINAS MARINASTOXICOLOGIA

CURSO:TOXICOLOGIAPROFESOR:OSCAR SANTIESTEBAN ROJASINTEGRANTES:INGA CACERES, WILLIAMS. (11070154)LLATAS DELGADO FRAN JOEL. (11070061)TANTA VILLAGARAY, MONICA. (10070164)VILLENA ANDRES, MIGUEL. (10070210)TURNO:VIERNES 5 9PMVIERNES 12 DE SETIEMBRE DEL 2014BIOTOXINAS MARINASUNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOSFACULTA DE QUIMICA E INGENIERIA QUIMICAE.A.P. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

INDICE1.RESUMEN33.OBJETIVOS44.MARCO TERICO44.1.BIOTOXINAS MARINAS44.2.TOXINA PARALIZANTE DE LOS MOLUSCOS (PSP)- Marea Roja54.3.INTOXICACIN DIARREICA DE LOS MOLUSCOS (DSP)64.4.INTOXICACIN NEUROTXICA DE LOS MARISCOS (NSP)64.5.INTOXICACIN AMNSICA DE LOS MARISCOS (ASP)64.5.1.Sntomas64.6.CIGUATERA74.6.1.Sntomas74.7.TETRADOTOXINA74.7.1.Sntomas74.8.DETERMINACION DE LAS TOXINAS74.9.PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE NITRGENO BSICO VOLTIL84.9.1.Fundamento85.MATERIALES Y REACTIVOS106.PROCEDIMIENTO (Moluscos bivalvos)106.1.EXPERIENCIA N1:106.2.EXPERIENCIA N2:126.2.1.Fundamento126.2.2.Instrumental136.2.3.Reactivos146.2.4.Indicador146.2.5.Procedimientos147.RESULTADOS158.DISCUSIN DE RESULTADOS199.CONCLUSIONES2010.RECOMENDACIONES2011.BIBLIOGRAFA2112.ANEXO21

1. RESUMENLa primera practica consiste en la determinacin de biotoxinas en mariscos mediante el bioensayo con ratones machos de peso 20g y 30g, se prepar un extracto de musculo de mejillones luego se acidifico con HCl 0.1N y luego se calent con la finalidad de estabilizar toxinas y desnaturalizar protenas en el extracto. Luego se centrifugo, el sobrendate que se obtuvo se aplic al reactivo biolgico en ampollas de 1ml por va intraperitoneal, de las aplicaciones, el primero en el ratn de bajo peso se aplic de manera correcta a los primeros minutos se observ efectos en el cmo picazn, dolores ventrales, Descoordinacin motora, complicacin al respirar, disminucin motora ,estos dos ltimos efectos se observ en los minutos 5 y 7 , luego de 15 minutos el ratn empez a mostrar signos de recuperacin de la actividad motora, por lo que no se concluy su muerte. En el ratn de peso mayor sea aplico mal el extracto acido, aunque si se hubiera colocado de la manera correcta tambin habra presentado una alta probabilidad de vivir, ya que los de mayor pesos son ms resistentes a la dosis de toxinas en fin los factores que evitaron la mortandad de los roedores fueron el peso , sexo y el estado de los mejillones en este caso fueron frescos con bajo contenido de contaminantes. Para esta prctica se recomienda trabajar con ratones que cumplan las caractersticas que registra la gua, saber aplicar la inyeccin en el roedor y usar mejillones contaminados, ya que permitirn determinar mejor el clculo de toxicidad para luego comparar con tablas, como el de sommer-mayer.

En la prctica de N.B.V de pescado se aplic el mtodo por destilacin de arrastre de vapor donde se coloc en un baln Kjendahl 10 g de la muestra preparada, y se agreg 2 g de Mg (OH)2, 300 mL de agua, unas gotas de antiespumante. Calentamos el baln, hasta destilar por arrastre con vapor de agua todas las bases voltiles, las que recogimos en una solucin de cido brico. A un matraz de Erlenmeyer de 250 mL aadimos 50 mL de solucin de cido brico al 2% y varias gotas del indicador. Se conect el aparato y colocamos el Erlenmeyer receptor de tal manera que la punta o extremo del refrigerante qued sumergido en la solucin de cido brico. Se calent el baln Kjendahl de manera tal que el lquido contenido entre en ebullicin en exactamente 10 min. Luego de destilar durante 25 min mantuvimos la misma intensidad de calentamiento. Enjuagamos el refrigerante con agua destilada recogiendo tambin en el matraz Erlenmeyer. No obstante este mtodo tiene limitaciones en su uso, porque solo reflejan la prdida del grado de frescura del pescado en estadios avanzados de deterioro, y son generalmente poco fiables para medir adecuadamente el grado de frescura del pescado almacenado en hielo durante los primeros das , por tal motivo no se obtuvo el % adecuado de recuperacin de bases absorbida en la solucin acida, evitando su valoracin y calculo en esta prctica no se recomienda trabajar con pescado congelado ms de 12 das ya que este es un factor que limita la aplicacin del destilado por arrastre de vapor.

2. INTRODUCCION:

Las biotoxinas marinas son sustancias txicas acumuladas en los organismos marinos, principalmente por ingestin de fitoplancton, es decir, algas microscpicas capaces de producir dichas toxinas. Los moluscos bivalvos, los equinodermos, los tunicados y los gasterpodos marinos, con origen en la pesca, marisqueo o la acuicultura, son susceptibles de acumular biotoxinas y de ser consumidos por el ser humano. Los episodios txicos que constituyen en nuestro mbito geogrfico un problema de salud pblica se producen como incremento significativo de la concentracin de una poblacin de alguna de las especies txicas en las aguas marinas, de tal manera que se origine una acumulacin de biotoxinas en los organismos marinos o exista una alta probabilidad de que sta se produzca. Los moluscos que estn ms frecuentemente implicados son las almejas, los mejillones y, ocasionalmente, las vieiras y las ostras. En este grupo de moluscos se han descrito las intoxicaciones paralizante (PSP), diarreica (DSP), neurotxica (NSP) y amnsica (ASP). Todas las toxinas son de naturaleza no proteica y extremadamente estables. As, el cocinado, ahumado, secado o salado no las destruye, y tampoco puede determinarse por el aspecto del producto si el alimento es o no txico.

3. OBJETIVOS Realizar la prueba de bioensayo de ratn para descartar la presencia de toxinas en mariscos

Determinar el grado de frescura de una muestra de pescado mediante la prueba de determinacin del Nitrgeno Bsico Voltil (N.B.V) a travs del Mtodo de Antonacopoulus.

4. MARCO TERICO4.1. BIOTOXINAS MARINAS

Las biotoxinas marinas son responsables de un nmero importante de enfermedades asociadas a los productos pesqueros. Entre ellas pueden citarse: la intoxicacin paralizante por moluscos (PSP), la intoxicacin diarreica por moluscos (DSP), la intoxicacin neurotxica por moluscos (NSP), la intoxicacin amnsica por moluscos conocida tambin como intoxicacin por cido domoico (ASP), la ciguatera y la tetradotoxina.

En general, estas toxinas son producidas por algas del fitoplancton (diatomeas, dinoflagelados). No todos los dinoflagelados del plancton marino elaboran toxinas. Los moluscos bivalvos que se alimentan por filtracin de agua, incorporan el plancton y acumulan la toxina. En el caso del caracol de mar (no es filtrador sino predador), acumula la toxina al alimentarse con bivalvos txicos. El hombre al ingerir moluscos txicos manifiesta un cuadro de intoxicacin cuya gravedad depender de la cantidad de toxina ingerida.

La toxina es resistente a altas temperaturas (resiste la coccin casera), estable en medio cido (vinagre, limn), no genera inmunidad y no se conoce antdoto. Los moluscos txicos no pueden identificarse por evaluaciones organolpticas ya que la toxina no altera su color, olor ni sabor.

4.2. TOXINA PARALIZANTE DE LOS MOLUSCOS (PSP)- Marea Roja

Producida por dinoflagelados del gnero Alexandrium, Gymnodinium y Pyridinium.

Los dinoflagelados tienen la capacidad de enquistarse y depositarse en el fondo marino cuando las condiciones ambientales son adversas. Frente a condiciones favorables (temperatura del agua, luz, salinidad, presencia de nutrientes) pierden su cobertura protectora y desarrollan un ciclo reproductivo exponencial llamado florecimiento.

Comnmente se la conoce como Marea Roja debido a la descoloracin del agua de mar donde se ha producido la multiplicacin del plancton. Sin embargo, no siempre las mareas rojas txicas estn acompaadas con la presencia de color en el agua y tambin .se han reportado casos de florecimientos de especies inocuas que producen descoloraciones.

Foto de Gymnodinium catenatum (fuente Instituto Nacional de Pesca del Uruguay (http://www.inape.gub.uy/)Foto de Alexandrium catenella (Fuente: Instituto de Fomento Pesquero de Chile http://www.ifop.cl/marearoja/index.cfm)

Los moluscos alimentados de dinoflagelados txicos pueden retener la toxina por perodos variables de tiempo, algunos son txicos durante el florecimiento y otros durante muchos aos. Sntomas (segn la gravedad) pueden aparecer luego de 20 o 40 minutos de la ingestin, e incluso en algunos casos 5 minutos despus. Parlisis perifrica, sensacin de hormigueo, somnolencia, entumecimiento, movimientos voluntarios con dificultad, ataxia e incoordinacin, reflejos normales y mente clara, vrtigo, sensacin constrictiva en garganta, andar tambaleante, cefalea, aumento de la secrecin salivar, taquicardia, sed intensa, ligera hipotermia, visin borrosa, vmitos, diarrea, dolor abdominal.

Muerte (12 horas) por parlisis respiratoria y colapso cardiovascular.

4.3. INTOXICACIN DIARREICA DE LOS MOLUSCOS (DSP)

Producida por dinoflagelados del gnero Dinophysis y AurocentrumSntomas. Aparecen de 30 minutos hasta 12 horas despus del consumo de mariscos alimentados de algas txicas. Los pacientes tienen diarrea, nuseas, vmitos, dolor abdominal y escalofros. Las vctimas se recuperan dentro de los 3 a 4 das, sin dejar secuelas.

4.4. INTOXICACIN NEUROTXICA DE LOS MARISCOS (NSP)

Producida por el dinoflagelado Ptychodiscus breve.

Esta intoxicacin est causada por las breves toxinas de las que han sido diferenciadas por lo menos nueve. Parece ser que las toxinas actan fijndose a los nervios y abriendo los canales de los iones de Na en circunstancias en las que normalmente estaran cerrados, originando varios efectos neurotxicos en las personas.

Los sntomas aparecen poco despus del consumo del marisco txico y generalmente remiten en un plazo de horas, a lo sumo, transcurridos unos pocos das. Consisten en hormigueo y entumecimiento de los labios, de la lengua, de la garganta y de la zona perioral, dolores musculares, trastornos gastrointestinales y vrtigo. En esta intoxicacin tampoco se han descripto secuelas. Raramente es fatal.

4.5. INTOXICACIN AMNSICA DE LOS MARISCOS (ASP)

Debida al cido domoico, un aminocido producido por la diatomea Pseudonitzschia pungens.

A esta intoxicacin se le denomina generalmente intoxicacin por cido domoico, ya que este cido es la nica toxina que se sabe est implicada. En dosis bajas, este compuesto originara trastornos gastroentricos, pero en dosis ms elevadas puede ocasionar una lesin grave a clulas cerebrales provocando sntomas neurolgicos que incluyen la prdida de memoria. El cido domoico interrumpe la transmisin neuroqumica normal en el cerebro fijndose a los receptores de glutamato, hecho que causa la mayor excitacin de las neuronas y la rotura final de las clulas. Por esta razn, es una toxina nociva que puede provocar la muerte cuando se ingiere en dosis elevadas.

4.5.1. Sntomas

Los sntomas incluyen nuseas, vmitos, espasmos abdominales, diarrea, cefalalgia, anorexia, prdida de equilibrio, vrtigo y prdida de memoria. En la mayora de los casos, los sntomas son benignos y desaparecen a las 24 horas, pero en algunos pacientes de edad avanzada los efectos han persistido durante varios meses.

4.6. CIGUATERA

Producida principalmente por el dinoflagelado Gambierdiscus toxicus.

Este dinoflagelado crece alrededor y en el interior de los arrecifes tropicales de coral. El envenenamiento por ciguatera resulta de la ingestin de pescados de aguas tropicales o clidas alimentados con este dinoflagelado.

4.6.1. Sntomas

Gastrointestinales y neurolgicos. Pueden durar 2 o 3 das o persistir por semanas. La muerte puede producirse por colapso nervioso.

4.7. TETRADOTOXINA

No es producida por algas. La tetradotoxina se encuentra en el hgado, ovarios e intestinos varias especies de pez globo, siendo los ms txicos los de la familia Tetraodontidae, pero no todas las especies de esta familia contienen la toxina. El mecanismo por el cul la toxina es producida es desconocido, aunque aparentemente estaran involucradas bacterias.

4.7.1. Sntomas

Aparecen de 10 a 45 minutos despus de la ingesta.

Hormigueo en rostro, extremidades, parlisis, colapso respiratorio y cardiovascular.

4.8. DETERMINACION DE LAS TOXINAS

En algunos pases, la vigilancia de las aguas permite dar el primer aviso de mariscos potencialmente txicos.

Esto se consigue mediante la observacin directa del color del agua (marea roja), examen microscpico del fitoplancton para identificar las especies sospechosas e incluso monitoreo de manchas marinas con tecnoloa satelital.

Desde el punto de la salud pblica, la clave de la determinacin es la concentracin de toxinas en los pescados o en los mariscos. Esto requiere el muestreo y el anlisis de animales indicadores o de animales representativos. Los mejillones son con frecuencia los animales indicadores de eleccin ya que manifiestan una captacin de toxinas ms rpida, pero se puede analizar otro marisco por razn de su importancia comercial o por la especificidad de la toxina implicada. La prueba ms universal es el bioensayo del ratn y en la mayora de los casos es la nica prueba legalmente admisible para la suspensin de la captura. En los ltimos aos, los anlisis qumicos han adquirido una gran aceptacin porque son ms rpidos, ms exactos y, desde el punto de vista social, menos censurables que las pruebas animales.

Los mtodos especficos de anlisis de la toxina paralizante y neurotxica, se encuentran en la AOAC (1984) y en la FDA (1989). Estos mtodos suponen la extraccin de las toxinas del marisco, la separacin de las protenas y otras sustancias interferentes y la inyeccin del extracto por va intraperitoneal a ratones. Los resultados se evalan como unidades ratn ug/100 g del tejido del marisco.

4.9. PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE NITRGENO BSICO VOLTIL

La frescura de la merluza, merluccius merluccius hubbsi, ya sea entera o en filetes es evaluada, a priori, por medio de la observacin de las caractersticas organolpticas. Ya que sta puede estar afectada por la subjetividad del observador, se realiza la determinacin de las Bases Voltiles Totales.

El personal de laboratorio de una planta pesquera debera realizar, segn el tamao de produccin, al menos tres determinaciones diarias por medio de un muestreo representativo de,

Diferentes lotes de materia prima, Materia prima semi procesada de un da para otro Diferentes etapas del proceso diario de produccin

Se lleva un registro diario de dichos anlisis, indicando origen, hora, resultado y observaciones del producto.

El nivel de NBV mximo de cada producto depende de los requisitos del cliente, el valor mximo admisible para consumo humano en peces magros es de 30 mg/100 g de muestra. Superado ste se debe decomisar el lote.

El deterioro del pescado desde la muerte se manifiesta en los tejidos musculares por procesos de degradacin debidos a la accin de enzimas endgenas y bacterias presentes sobre la piel e intestinos. Se extienden y multiplican en los tejidos por motivo de un medio favorable, pH elevado y abundante materia de bajo peso molecular (aminocidos, aminas) dando lugar a compuestos malolientes, caractersticos en la descomposicin de productos pesqueros; trimetilaminas, amoniaco, etc.

4.9.1. Fundamento

La muestra es tratada con oxido de magnesio disuelto en agua, formndose hidrxido de magnesio.

MgO + H2O => Mg (OH)2

Los iones hidrxidos liberan las bases voltiles de las sales que hubiera.

NH4+ + HO- => H2O + NH3Catin Anin agua amoniaco amonio hidrxido

(CH3)2NH2+ + HO- => H2O + (CH3)2 NH Catin Anin agua dimetilamina dimetilamina hidrxido

(CH3)3NH+ + HO- => H2O + (CH3)3 N Catin Anin agua trimetilamina Trimetilamina hidrxido

Las bases voltiles son destiladas por arrastre con vapor de agua y recogidas en solucin de cido brico.

Las bases voltiles reaccionan con el cido brico, dando las sales correspondientes.

NH3 + H+ => NH4+ amoniaco Catin catin hidrgeno amonio

(CH3)2NH + H+ => (CH3)2 NH2+ dimetilamina Catin Catin hidrgeno dimetilamonio

(CH3)3N + H+ => (CH3)3 NH+ Trimetilamina Catin Catin hidrgeno trimetilamonio

Al valorar la solucin resultante con un cido fuerte, ste desplaza al cido brico de la sal.

H2BO3- + H+ => H3BO3 Anin Catin cido brico de hidrogeno hidrgeno borato

En el punto final, una gota de solucin de cido fuerte hace virar ms al indicador

5. MATERIALES Y REACTIVOSTabla N1: Materiales y reactivos MATERIALESREACTIVOSEQUIPOS

Pipetas de 5 y 10 mLBeaker de 100, 250, 500 mLCocinilla elctricaLicuadoraEsptulaTabla de picarBureta de 10 mLErlenmeyer de 250 mLTuberculina 1 mLRatn blanco (pericote)Carne de pescado frescoCortado en cuadraditosMariscos (mejillones o similares)HCl 5N y 0,1NNaOHMg(OH)2Antiespumante de siliconacido brico al 2%cido sulfrico al 0,1NRojo de metiloVerde de bromo cresolBalanza granatariapH metroCentrfugaEquipo de destilacin simple de conexiones esmeriladas.

6. PROCEDIMIENTO (Moluscos bivalvos) 6.1. EXPERIENCIA N1:

EVALUACIN DE LA TOXICIDAD AGUDA POR VA INHALATORIA.

Preparacin de la muestra Lavar cuidadosamente el exterior del marisco con agua dulce. Abrir cortando el msculo aductor, Se lava el interior con agua dulce para eliminar arena y otras sustancias extraas. Se separa la carne de las valvas. Se recoge de 100 g y se coloca en un tamiz para dejar escurrir 5 min. El lquido filtrado se desecha. Se procesa en una licuadora hasta consistencia homognea.

Preparacin del extracto cido Se coloca 100 g del material bien mezclado en un recipiente resistente al calor. Se aade solucin acuosa 0.1N de HCl: 100 mL. Se calienta la mezcla y se hierve suavemente, al hervir controlar 5 min. Se deja enfriar, Se toma pH del lquido. Debe ser menor de 4.5 con papel medidor del pH. Si se necesita disminuir el pH: utilizar una solucin 5 N HCl gota a gota. Si se necesita aumentar el pH: utilizar una solucin 0.1 NaOH gota a gota. Se traslada la mezcla a una probeta graduada y se completa a 200 mL con agua pura o levemente acidulada. Se agita, se coloca en tubos de centrfuga y se centrifuga a 3000 rpm durante 5 minutos. El lquido sobrante es el extracto cido.

Prueba en ratones (Respuesta biolgica- SOMMER- MAYER 1957)

Extracto cido de moluscos: pH 3-4 Unidad Ratn: Cantidad de toxina para matar un ratn de 20 g de peso en 15 min. Estandarizacin: tiempo de muerte 5-7 min. Se utilizan ratones sanos, hembras, de 19- 21 g, cepa CF1. Si pesan menos de 19 o ms de 21 se aplica el factor de correccin de masa del mismo (tabla de SOMMER) Va intraperitoneal: 1 mL de extracto cido. Se anota el momento de inoculacin y el tiempo de muerte (ltimo movimiento respiratorio). Si el tiempo de muerte es menor a 5 min de varios ratones, se diluye con solucin fisiolgica acidulada pH 3 para obtener un tiempo de 5 a 7 min.

Clculo de toxicidad

Determinar tiempo medio de muerte de los ratones y usar tabla de SOMMER Clculo para determinar unidades ratn

VALOR TIEMPO MUERTE * FACTOR DE CORRECCIN DE PESO * 200= U.R. (si se realizan diluciones se agrega el FACTOR DE DILUCIN)

Tabla N2: Tolerancia y Mtodo de Anlisis de las toxinas.

6.2. EXPERIENCIA N2:

DETERMINACIN DEL ESTADO DE FRESCURA DE LOS PRODUCTOS DE LA PESCA POR MEDIO DE LA DETERMINACIN DEL NITRGENO BSICO VOLTIL (N.B.V.) A TRAVS DEL MTODO DE ANTONACOPOULUS.

6.2.1. Fundamento

Al tratar la muestra con oxido de magnesio disuelto en agua, este pasa a hidrxido de magnesio, cuyos iones hidroxilos liberan las bases voltiles de las sales que pudieran existir (amoniaco, dimetil y trimetil amina).

Estas bases voltiles son destiladas por arrastre con vapor de agua y recogidas en una solucin de cido brico, reaccionando con este cido, formando las sales correspondientes (cationes amonios, dimetil y trimetil amonio).

Al valorar la solucin resultante con un cido fuerte, este desplaza al cido brico de la sal dando el viraje de color del indicador.

6.2.2. Instrumental

Equipo de destilacin simple con conexiones esmeriladas (Ampolla para la muestra, puente y refrigerante) Cocinilla elctrica (manto calefactor) Trozos de material porosos (perlas de vidrio, cuentas de vidrio) Erlenmeyer de 250 mL de cuello ancho Cuchillo para extraer muestra de filete Tabla de acrlico (tabla para picar verduras) Vaso de precipitado pequeo (100 o 250 mL) Varilla de vidrio Pipetas Balanza de 0,1 g Micro bureta de 5 cm3 o bureta comn

Esquema del Equipo para determinacin de NBV

Foto del Equipo para determinacin de NBV

6.2.3. Reactivos

Agua destilada Oxido de magnesio P. A. Antiespumante de silicona Solucin de cido brico al 2% Solucin de cido sulfrico al 0,1 N

6.2.4. Indicador

Mezclar un volumen de rojo de metilo 0,2% ms 3 volmenes de verde de bromocresol 0,1%, o en su defecto Tshiro (mezcla de colorantes).

6.2.5. Procedimientos

Ensayo en blanco

Preparacin de muestra

a) Si se trata de filete se raspa el msculo por el tercio medio inferior hasta llegar a la piel. Deben obtenerse unos 50 gramos de muestra que se los mezcla lo mejor posible.b) Si se trata de pescados enteros se corta un filete del tercio medio y se raspa como se indic en el paso anterior.c) Si se trata de pescado congelado se sacan 3 cilindros con el sacabocado, empleando el taladro elctrico a no menos de 10 cm. de los bordes y luego se cortan en pedazos no mayores de 1 mm. Deben obtenerse 50 gramos de muestra.

Proceso

a) Pesar 10 gramos de pescado. b) Preparacin para la destilacin: se vierte en el baln 10 g de pescado ayudados por una varilla, 2 g de xido de magnesio y 1 - 2 gotas de antiespumante de silicona. Luego se hace arrastre con agua destilada con ayuda de una piseta.c) Se coloca en un Erlenmeyer 50 mL de cido brico al 2%, un mL de indicador y 100 mL de agua destilada.

Destilacin

a) Se calienta el baln con la llave del embudo del baln abierta, para evitar la condensacin de agua en el aparato.b) Se lleva a ebullicin dejando la llave abierta hasta que salga un chorro continuo de vapor.c) Se cierra la llave del embudo y se comienza a contar el tiempo.d) Se destila durante 17 minutos con el vstago del refrigerante sumergido en el Erlenmeyer y 3 minuto ms con el vstago si sumergir. La regulacin del calentamiento debe ser tal que recoja un volumen de destilado de 130 a 150 ml en los 20 minutos de destilacin.e) Se desconecta y se retira el manto calefactor f) Se abre la llave del embudo del balng) Se desarma el equipo an calienteh) Se lavan exteriormente el tubo de conexin, el refrigerante y el extremo exterior del vstago del mismo con agua destilada, recogiendo el agua de lavado en el Erlenmeyer

Valoracin

a) Se valora con la solucin de cido sulfrico agitando el Erlenmeyer continuamente.b) En la cercana del punto final deben lavarse las paredes del Erlenmeyer y el pico de la bureta con chorros de agua destilada, valorando gota a gota hasta alcanzar el punto final.

Punto final:

Se considera que se ha llegado a este cuando el color de la solucin vira de verde a gris azulado. Si llega a rojo violceo es ndice que se ha pasado el punto final.

Clculos

N.B.V. = 0,01401 x 1000 x V x N x 100m

0,01401 = mili equivalentes del nitrgeno

V = volumen de la solucin valorada de cido sulfrico 0,1 N gastado en la titulacin (mL). N: normalidad de la solucin de cido sulfrico. m: masa de pescado (gramos)

EL VALOR MXIMO PERMITIDO PARA LA MERLUZA EN NUESTRO PAS ES DE 30 MG. %

7. RESULTADOS

TABLA N3: Procedimiento para la administracin del medicamentoPROCEDIMIENTO PARA LA ADMINISTRACIN DE UN MEDICAMENTO EN ANIMALES: RATAS

PRUEBA DE MANIPULACIN DE ANIMALES

Vencer el miedo a las ratasSacar la el reactivo biolgico(rata) de la caja

Intentar vencer el miedo y la ansiedad. Si el sujetador no est tranquilo, tampoco lo est el animal.

Sujetar a la rata del extremo de la punta de la cola

Dejar a la rata libre, que se acostumbre al ambiente de laboratorio.

NOTA Animal suficientemente agresivo para atacar a alguien. Huele si la persona tiene miedo o no. Nunca se intente llevar a cabo un procedimiento en un animal hasta que este se encuentre completamente sujetado y relajado. Al tratar de sujetar a una animal extrao, usar guantes de cuero cuando haya peligro de ser mordido.

CARGA DEL LQUIDO QUE SE VA A INYECTAR

Tomar el extracto cidoTomamos los tubos centrifugados con el extracto de cido, observando el sobrenadante lo cual usaremos.

Cargar con la jeringaTome la jeringa que previamente haba preparado con la aguja de carga e inserte en el tubo de ensayo que contenga el extracto cido.

AspirarAspirar con la jeringa

Sacar la jeringaUna vez cargada toda la medicacin, saque la aguja del tubo.

Apuntar hacia arribaSostenga la jeringa con la aguja apuntando hacia arriba para que el lquido se asiente en el fondo de la primera

Golpear la jeringaGolpee la jeringa con un dedo para favorecer que asciendan las burbujas de aire que se puedan haber aspirado

Empujar el emboloEmpuje suavemente el embolo hacia arriba para expulsar el aire, procurando que no se pierda nada del liquido

Ya tiene la medicacin cargada

ADMINISTRACIN DEL LQUIDO QUE SE VA A INYECTAR

Tcnica de sujecinMtodo de inmovilizacin

Sujetar a larataSujete de manera firme si apretar demasiado a la rata, detrs de las orejas y la cola (usar las dos manos), de manera que la cabeza quede inmvil.

Va de administracin: intramuscularEstirar piernaEstirar la patita de la rata

IntroduciragujaIntroducir la aguja en forma paralela al fmur.

Administrar el liquidoAdministrar el medicamento, esperar unos segundos antes de retirar la aguja (slo 0,5 mL.)

Soltar a la rataSoltar al animal y realizar apuntes de sntomas y comportamiento inusual de la rata.

Fuente: elaboracin propia

TABLA N4: Procedimiento para la determinacin de frescura en un productoPROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DEL ESTADO DE FRESCURA DE UN PRODUCTO(MTODO DE ANTONACOPOULUS)

Pesar muestraPesar muestra usando la balanza de precisin analtica

Colocar muestra en un balnColocar muestra en un baln abierta

Preparar equipo de destilacin simplePreparar equipo de destilacin simple con conexiones esmeriladas.

Colocar en el balnColocar 2 g de leche de magnesia, 1 a 2 gotas de antiespumante de silicona y un poco de agua destilada.

Al otro extremo un ErlenmeyerSe coloca un Erlenmeyer 50 mL de cido brico al 2%, un mL de indicador y 100 mL de agua destilada.

Encender cocinilla y abrir pileta de aguaDETALLES DE LA OPERACIN Ebulle el solvente que se evapora hasta un condensador a reflujo.

El condensado cae sobre un recipiente que contiene la muestra en su interior

Ascenso del nivel del solvente cubriendo la muestra hasta un punto en que se produce el reflujo que vuelve el solvente con el material extrado al baln.

Se vuelve a producir este proceso la cantidad e veces que sea necesaria para que la muestra quede agotada.

Apagar cocinilla y piletaDesconectar y retirar el manto calefactor, se abre la llave del embudo del baln y se desarma el equipo an caliente.

Concentrar muestra-solventeLavamos exteriormente el tubo de conexin, el refrigerante con agua destilada y recogemos en el Erlenmeyer.

ValoracinSe valora con la solucin de cido sulfrico agitando el Erlenmeyer continuamente.

Punto finalSe considera que se ah llegado a este cundo el color de la solucin vira de verde a gris azulado.

ErrorSi llega a rojo violceo es ndice que se ha pasado el punto final

TABLA N5: Datos del reactivo biolgico PESAJE DE MUESTRA

MuestrasPesos

Ratn 120 g

Ratn 230 g

Mariscos92,0777 g

Extracto cido350 mL

Pescado10,3250 g

cido Brico5,1486 g

TABLA N6: Comportamiento del reactivo biolgico.

Reactivo biolgicoTiempo (min)Comportamiento

Ratn 100:10Camina, presenta irritacin nasal.

00:30Detiene su movimiento.

00:45Presenta contraccin del vientre.

01:00Presenta movimiento de cabeza y su respiracin es acelerada.

01:30Presenta contraccin del vientre.

02:00Inicia su movimiento con pasos lentos, presenta agitacin.

02:50Presenta agitacin y detiene su movimiento.

03:15Presenta contraccin del vientre.

03:50Se mantiene en el mismo lugar y se coloco sobre la superficie de la mesa.

04:00Se levant, presenta irritacin en los ojos.

04:40Presenta agitacin, irritacin nasal.

05:00Movimiento de cabeza.

05:21Camina lentamente, la contraccin disminuye.

06:00Se coloco sobre la superficie de la mesa y presenta contraccin del vientre.

06:28Presenta contracciones del vientre.

06:42La intensidad de las contracciones del vientre va disminuyendo.

07:00No presenta nuevos cambios.

08:00Se recupera, camina lentamente.

08:40No presenta cambios.

09:20La irritacin de los ojos disminuye.

10:00Abre los ojos, presenta picazn en la oreja y presenta movimiento ms acelerado.

13:15Presenta un comportamiento normal.

Ratn 2El comportamiento no se observo, ya que la administracin del xenobiotico no fue adecuada y el reactivo biolgico no presento cambios importantes en su comportamiento.

8. DISCUSIN DE RESULTADOSEn la evaluacin de toxinas de mariscos, los puntos ms importante en la preparacin del extracto toxico es el calentamiento y el pH acido 3-4, los cuales estabilizan las toxinas y desnaturalizacin de protenas en el extracto, las toxinas paralizantes de los maricos (PSP) son termoestables en pH acido, pero inestables en condiciones alcalinas, oxidndose fcilmente (Rojas,2014). No se logr causar la muerte de los ratones en el rango de tiempo registrado, ya que los reactivos biolgicos no presentan las mismas caractersticas descritas en la gua, como el peso y sexo, adems en una de las aplicaciones del extracto acido en los ratones no fue lo correcto, no obstante este resultado permito garantizar la baja contaminacin de los mejillones y aunque no se obtuvo datos cuantitativos se logr observar los efectos que causan las biotoxinas de marisco, como las toxinas paraliticas de marisco (PSP), toxinas de mariscos diarreicas (DSP) cuales causan, escalofros, picazn, debilidad muscular, falta de coordinacin motora y dismetra, sensacin de ahogo (Rojas, 2014) estos efectos se presenta en el ratn de menor peso.En el anlisis de NBV en el pescado los resultados del % de recuperacin de amonaco por destilacin por arrastre de vapor se puede decir que fue muy baja a comparacin de otros mtodos como ejemplo el mtodo de destilacin automtica, ya que para el mtodo de arrastre de vapor tiene limitaciones en su uso, porque solo reflejan la prdida del grado de frescura del pescado en estadios avanzados de deterioro, y son generalmente poco fiables para medir adecuadamente el grado de frescura del pescado almacenado en hielo durante los primeros das (UM.2010) , por lo que no se pudo valorar las bases absorbidas ya que el pescado era congelado. Sin embargo este concepto incluye la determinacin de compuestos nitrogenados de carcter voltil que se librean como consecuencia del proceso de degradacin post-mortem como: Trimetilamina (producida por deterior bacteriano), Dimetilamina (producida por enzimas autolticas durante el almacenamiento en congelacin), Amonaco (producido por desaminacin de aminocidos y catabolitos de nucletidos) y otros compuestos voltiles nitrogenados asociados con el deterioro de los productos pesqueros.

9. CONCLUSIONES

La prueba del ratn result fallida, ya que el ratn no muri y no pudo realizar el clculo de toxicidad.

Despus de colocada la inyeccin se pudieron observar ciertos comportamientos en el animal, no se puede establecer el tipo de biotoxina marina que estaba presente en la muestra de conchas de abanico al no contar con los equipos y el mtodo adecuado, podemos descartar algunas toxinas y dejar abierta dos posibilidades al observar al ratn; se vio que este evacuaba con frecuencia podramos deducir que se podra tratarse de la toxina diarreica de los moluscos (VDM)por ejemplo, pero este sntoma tambin se ve reflejado en otras toxinas, as que es muy difcil establecer el tipo de toxina contenida.

Las causas para que el ratn no haya muerto tambin podran ser debido a la baja concentracin y/o ausencia de la toxina en de las conchas de abanico.

En la actualidad, la mayora de los programas de control de la toxicidad en mariscos an utilizan el bioensayo en ratn.

10. RECOMENDACIONES

No es necesario lavar cuidadosamente las conchas para evitar prdidas de la toxina.

La pasta a base de las conchas de abanico debe estar homognea para que la extraccin de la biotoxina sea adecuada y eficiente.

Se debe centrifugar el extracto cido para evitar que hallan partculas slidas al inyectar al animal.

Observar detenidamente al ratn luego de ser inyectado

11. BIBLIOGRAFA

0. Miguel Andrs Cap Mart, Toxinologa clnica, alimentaria y ambiental, 1era edicin, 2007, Editorial COMPLUTENSE, S.A. Pg. 156 158.0. http://mapaperills.grisc.cat/pdf/perills/261_QuimTmarina-Biotoxinas.pdf0. http://www.gencat.cat/salut/acsa/html/es/dir3226/acsabrief04-2011_biotoxinas_marinas.pdf0. http://www.clearwater.ca/site/media/Parent/706631%20CW%20Spanish%20Web%20Site_Sell%20sheets%20Marine%20Biotoxins%20P1.pdf0. http://www.mincetur.gob.pe/comercio/otros/penx/pdfs/Conchas_de_Abanico.pdf12. ANEXODebido que no se logro determinar o calcular las bases nitrogenadas adsorvidas por el metodo de arrastre de vapor, debido al uso de pescado congelado por mayor a 12 dias, en este documento se presenta un trabajo realizado por INTI Mar Del Plata donde comparan metodos para la determinacion de nitrogeno basico volatil en merluza comun. 2UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS