lp biochimie generala

8/16/2019 Lp Biochimie Generala

1/67

BIOCHIMIE

GENERAL

A

LP 1


2/67

LP 1

PROBLEME DECONCENTRATII

PROCENTUALE,MOLARE,

NORMALE,DILUTII

!!!


3/67

Probleme de concentratii procentuale, molare, normale,

dilutii

1. Determinarea masei moleculare

M H2SO4 = 2X1+32+4X16 = 98 u au u!a!m! "unitati atomice de maa#

2. Determinarea numarului de moli (n)

n= m$M

%ati moli e &aec in 49 & H2SO4'n = 49(98 = )!* moli

3. Concentratia procentuala (c%): grame de substanta dizolvate in 100 g solutie

m = md+mH2O

m = maa olutiei

md = maa ubtantei diolate

%-="md$m#X1))

Problema 1( %e concentratie are olutia obtinuta prin diolarea a 3) & are in 2.) & H 2O'

md = 3) &

mH2O = 2.) &

m = 3) + 2.) = 3)) &

%- = "3) ( 3))# X 1)) = 1)-

!!!


4/67


dilutii

Problema 2( %oncentratia procentuala de critalo/idrati e raporteaa la area an/idra!0( %e concentratie procentuala a aea olutia obtinuta prin diolarea a 2* & %uSO4X*H2O in 2.* & H2O'

md = 2* &

mH2O = 2.* &

M %uSO4X*H2O = M %uSO4 + M H2O = 16) + 9) = 2*) u!a!m!

2*) & %uSO4X*H2O!!!!!!!!!! 16) & %uSO42* & %uSO4X*H2O! & %uSO4

= 16 & %uSO4m= 2* + 2.* = 3)) &

%- = "16(3))#X1))= *!33 -

Problema 3( Solubilitatea iodurii de potaiu ete 4*&$1))& H2O! %are e concentratia procentuala a olutiei'

md = 4* &

MH2O = 1)) &

m = 14* &c- = "4*(14*# X 1))= 31!)3-

Problema 4( Preparati o olutie de 2- a&aroa in 4)) & olutie inala!

c- = 2

c- = "md(m# X 1)) 2= "md(4))# X 1)) md = 8 & a&aroa!

!!!


5/67


dilutii

Problema *!

Preparati o solutie de 1! % glucoza in 200 g "2#.

5ormulata in acet mod problema e a reola atel(

c- = "md $ m# 1))

m = md + mH2O = m = md + 2))

1,* = "md $ md + 2))# 1)) = 1,* "md + 2))# = 1)) md = 98,*md = 3)) = md = 3,)4 & &lucoa 7plicabilitatea acetei probleme in laborator ete mai redua deoarece maa olutiei inale nu ete cunocuta!

5recent in laborator ne preapram olutii ale caror mae inale dorim a le cunoatem, e(

Preparati o solutie de 1!% glucoza in apa ast$el incat masa $inala a solutiei sa $ie 200 g.

c- = "md $ m# 1))

m = 2)) & olutie "&lucoa in apa#md = "c- m# $ 1)) = md = "1,* 2))# $ 1)) = md = 3 & &lucoa

7tel ormulata, problema conduce la un reultat dierit, dierentele intre reultate iind cu atat mai mari cu cat

concentratia de olutie dorita "c-# ete mai mare!

!!!


6/67

Problema 6! %e concentratie procentuala are olutia obtinuta prin diolarea a 1) & &lucoa in 24) & H2O'

c- = "md $ m# 1))

m = md + mH2O

md = 1) & &lucoa mH2O = 24) &

m = 1) + 24) = 2*) & olutiec- = "1) $ 2*)# 1)) = 4-


dilutii!!!


7/67


dilutii

. Concentratia molara (&olaritatea): numarul de moli dizolvati intr'un litru de solutie

C& n:s

n m:&

C& m : (&*s)

Problema 1( Se diola 8) & aOH in 4 l olutie! eterminati % M!

M aOH = 4) u!a!m!cM = "8)(4)#(4 = )!* M

Problema 2( %alculati cantitatea de aOH neceara obtinerii unei olutii 2 M intr:un olum de 3 l!

2 = m ( "4)X3# m = 24) &

7lternati(

; Maa moleculara M< "Molecular


8/67


dilutii

Problema 3! %alculati cantitatea de a%l neceara obtinerii unei olutii 4M intr:un olum de *))

ml!

cM = m $"M >#= m = cM M > = m = 4 *8,* ),* "?# = 11. & a%l

M a%l = 23 + 3*,* = *8,* uam

!!!


9/67


dilutii

!. +c,ivalentul c,imic (ec,ivalentul gram) ete cantitatea de ubtanta ce reactioneaa cu 1 & H 2 i 8 & O2!

?e&ea ec/ialentilor c/imici( 2 ubtante reactioneaa intre ele in cantitati proportionale cu ec/ialentii lor c/imici!

0& metal = M ( alenta metal

0( 0& %a@@ = 4) ( 2 = 2) &

0& acid = M ( alenta radicalului

0( 0& H2SO4 = 98 ( 2 = 49 &

0& baa( M ( nr de &rupari OH

0& 5e"OH#3 = 1). ( 3 = 3*!66 &0& are = M ( alenta metal X indice metal

0( 0& 5e@@@2"SO4#3 = 4)) ( "3 X 2# = 66!6. &

-. Concentratia normala (c)( numarul de ec/ialenti &ram la 1 l de olutie

%= e ( >!

e = nr de ec/ialenti &rame = md ( 0&

% = md ( "0& X >#

Problema( Se obtin 2 l olutie prin diolarea in apa a 3. & %a"OH#2! Sa e determine c a olutiei!

md = 3. &

> = 2 l

0& %a"OH#2 = .4 ( 2 = 3. &% = 3. ( "3.X2# = )!*

!!!


10/67


dilutii

/. egula dreptung,iului (egula amestecurilor)

a c A b "2):* = 1* & = #

b a A c "3):2) = 1) & = #

c

Problema( %ate &rame de aOH trebuie ametecate pentru a e obtine 2)- aOH dintr:o olutie

de aOH 3)- i o olutie de aOH *-'

Bapun( Se ameteca 1) & aOH *- i 1* & aOH 3)- i e obtin 2* & aOH 2)-!

>eriicare( + = a:b 1*+1) = 3):*=2*

3)

2)

*

a = 3)

b = *

c = 2)

!!!


11/67


dilutii

. Dilutii:

Problema 1! %e olum de a%l ete necear pentru a prepara 2,* ? de olutie de a%l 2 M, aand la

dipoitie o olutie toc de a%l 1) M!

%i >i = % >

%i = 1) M >i necunocut % = 1) M > = 2,* ?

1) >i = 2 2,* = >i = ),* ? a%l

au

1) M = 2 M = olutia concentrata trebuie diluata de 1)(2 = *X

1 parte "?# olutie concentrata :::::: 4 parti "?# H2O :::::: * parti "?# olutie diluata

parti "?# olutie concentrata::::::: parti "?# H2O :::::: 2,* ? olutie diluata

= "1 2,*# $ * = ),* ? olutie concentrata 1) M

C = "4 2,*# $ * = 2 ? H2O

!!!


12/67


dilutii

Problema 2( iluati un anticorp 1(1) intr:un olum de 2 ml olutie tampon!

1(1)

1 Dl anticorp9 Dl olutie tampon1) Dl olutie inala

Dl anticorp Dl olutie tampon2))) Dl olutie inala

= 2)) Dl anticorp i pana la 2 ml e adau&a olutie tampon " = 2))):2))= 18)) Dl olutie tampon#!

Problema 3(Se da o olutie 2M a%l! Preparati o olutie )!* M a%l intr:un olum de *)) ml!

2M )!*M "2 ( )!* = 4 olutia initiala e dilueaa de 4X#

1 ml a%l 2 M3 ml H2O!4 ml olutie )!* M a%l

ml a%l 2 M ml H2O!*)) ml olutie )!* M a%l

= "1X*))#(4 = 12* ml a%l 2M

= "3X*))#(4 = 3.* ml H2O

Problema 4( 7metecati trei ubtante in raport de 1(*(12 intr:un olum de 1 l!

1 ml ubtanta 7!!* ml ubtanta E!12 ml ubtamta %!18 ml olum total

ml ubtanta 7!! ml ubtanta E!! ml ubtanta %1))) ml olum total

= **!*6 ml 7 = 2..!.8 ml E = 666!6. ml %

!!!

!!


13/67

DETERMINAREACONCENTRATIEI UNEIPROBE DE INTERES

(PROTEINA, GLUCIDA,LIPIDA)

UTILIZAND

CURBA ETALON(CURBA STANDARD)

!!!

!!


14/67

F Curba etalon se realizeaza pentru a determina un parametru (ex.concentratia) pentru o proba de interes, care poate f o proteina, oglucida, o lipida, etc.

F Exemplu: Deem"#$e$ %%e#$"e" u#e" p&e"#e 'e "#eeF Se utilizeaza un blanc (numit uneori si Reerinta, Standard sau

Martor): substanta de reerinta ata de care se realizeaza celelaltemasuratori, care contine toate substantele prezente si in celelalteprobe, mai putin proteina

F Se realizeaza dilutii seriale de proteina standard, ale caror concentratiisunt cunoscute (ex. 0. mg!ml, ". mg!ml, mg!ml, #. mg!ml, $0mg!ml)

F %n masurarea proteinelor se utilizeaza de regula ca proteina standard&lbumina Serica 'oina &'S ('oine Serum &lbumin * 'S&)

F'lancul, proteinele standard de concentratie cunoscuta si proteina deinteres sunt amestecate cu acelasi reacti de analiza si sunt procesatein acelasi timp.

F +entru realizarea unei determinari cat mai precise a concentratieiproteinei de interes se recomanda pregatirea unui numar cat maimare de dilutii seriale de proteina standard (*$0 dilutii pentru o

determinare exacta a concentratiei)F -umarul minim de dilutii seriale de proteina standard utilizat in

Curba etalon (standard)!!!

C b t l ( t d d)!!


15/67

F Reactiul ormeaza impreuna cu probele proteice (proteinelestandard, proteina de analizat) complexe care absorb lumina pe uninteral al lungimilor de unda din spectrul 12!2%S, ex. /3 (densitateaoptica) 4 00*#0 nm.

F 5ste recomandabil ca probele sa se masoare la lungimea de unda lacare prezinta absorbanta maxima, ex 60 nm.

F /e asemenea, proteinele care au aminoacizi aromatici in structura

lor, pot absorbi lumina 12, putand f masurate la "70 nm ara a fnecesara amestecarea lor cu un alt reacti.F &bsorbanta (&) sau 5xtinctia (5) probelor se masoara cu a8utorul unui

spectrootometru.F &bsorbanta nu prezinta unitate de masura.F &bsorbanta este direct proportioanla cu concentratia probelor

(conorm 9egii 9ambert*'eer), permitand astel determinareaconcentratiei probei de interes.F +robele de analizat nu trebuie dizolate intr*o solutie tampon care

absoarbe la aceeasi lungime de unda ca si complexele proteina*reacti, deoarece absorbanta solutiei tampon interera cu cea acomplexelor proteice, conducand la identifcarea eronata a

concentratiei proteiceF /upa prepararea probelor se masoara la spectrootometru


C b t l ( t d d)!!


16/67

F Masurarea la spectrootometru trebuie sa aiba in edere urmatoareleaspecte:

F Spectrootometrul sa aiba un fltru 12 sau 2%S care sa permitamasurarea la lungimea de unda doritaF Spectrootometrul sa permita masurarea absorbantei

corespunzatoare probelor de analizat (ex sa permita determinareaabsorbantei pana la ")

F Se utilizeaza cuete de cuart cu drum optic de $ cm (care se spala

dupa fecare masuratoare) sau cuete de unica olosintaF Cuetele trebuie umplute cu solutia de analizat pe cel putin "!

din olumF 9ic;idul din cuete nu trebuie sa contina bule de aer sau spuma,

care pot inuenta masurareaF Cuetele nu trebuie sa fe umede sau murdare pe supraata

exterioaraF Masurarea la spectrootometru se realizeaza astel:

F +ornirea aparatuluiF Setarea lungimii de unda la care se realizeaza masuratoarea (ex.

60 nm)F Selectarea parametrului care se a masura la spectrootometru:

&bsorbantaF


C b t l ( t d d)!!


17/67

+roba Concentratie (mg!ml) &bdorbanta la /360nm

+rot standard $ 0. 0.$"

+rot standard " ". 0."#

+rot standard .0 0.70

+rot standard 6 #. 0.60

+rot standard $0 0.

+rot de interes < 0.0

5xemplu:F %n urma masuratorilor la o anumita lungime de unda (ex. /360nm), se

obtin urmatoarele alori ale absorbantelor:

Curba etalon (standard)

F /atele obtinute arata ca absorbanta probei de interes (0.0) se

gaseste intre alorile absorbantelor probelor standard (0.$"*0.),deci aceste date pot f olosite pentru determinarea concentratieiproteinei de interes.

F 1neori complexele proteice sunt colorate, apt care permiteestimarea izuala a concentratiei probei.

F Cu cat culoarea probei este mai intensa, cu atat concentratia

acesteia este mai mare.F %n exemplul de mai sus intensitatea culorii proteinei de interes,

!!!

C b t l ( t d d)


18/67


0

F Pe $*$ e*ul$el& &"#ue e %u"ee %u$e$l pe +$"e m"l"me"%$

F +e axa x se marc;eaza concentratiile proteinelor standard(mg!ml)

F+e axa = se marc;eaza alorile absorbantelorcorespunzatoare concentratiilor proteinelor standard

F 1nde aloarea absorbantei probei $ intalneste aloareaconcentratiei probei $ se marc;eaza primul punct de pegrafc

F %n mod similar se marc;eaza restul punctelorcorespunzatoare probelor standard ", , 6,

F Se traseaza o dreapta care trece prin sauprintre punctele obtinute, dreapta care nu

trebuie neaparat sa treaca prin punctul 0de intersectie al axei x cu =.

F /reapta se traseaza astel incat sa treacaprin cat mai multe puncte, iar daca treceprintre puncte, acestea sa se ae, pe catposibil, la distante egale de*o parte si dealta a dreptei.

F 9a trasarea dreptei prin!printre puncte seomit punctele prea indepartatecomparati cu celelalte (outliars).

F Se marc;eaza pe grafc aloareaabsorbantei proteinei de analizat si printr*o paralela la axa x se marc;eaza punctul

de intersectie cu dreapta. /in acest punctse traseaza o paralela la axa = care a

!

C b t l ( t d d)!!


19/67


F C$#' %%e#$""le p&e"#el& $#'$' $u $l&"$p&p"$e (ex. 0. mg!ml, ". mg!ml, mg!ml, #. mg!ml, $0mg!ml), punctele de pe grafc sunt unite, pentru simplitate,printr*o dreapta (regresie liniara).

F C$#' %%e#$""le p&e"#el& $#'$' $u $l&""#'ep$$e sau pentru determinarea concentratiei cu preciziemai mare, grafcul este o ;iperbola (regresie curbilinie).

!!!

C b l ( d d)


20/67

F Deem"#$e$ %%e#$"e" p&e"%e p&$e - e$l"*$$ u"l"*$#'p&.$mul Ex%el

F C$#' .$-%ul ee & e.e"e l"#"$$:

F %n cazul regresiei liniare, ecuatia matematica care descrie relatia dintreabsorbanta si concentratie este = 4 ax>b 4? x 4 (=*b)!a

F = 4 absorbanta (cunoscuta pentru proba de interes)F x 4 concentratia (necunsocuta pentru proba de interes)F a, b 4 alori numerice care dau inormatii despre pantaF R" 4 cat de aproape sunt punctele de linie (corectitudinea experimentului)

F R"

4 $ * caz ideal, grafcul este perect, linia trece prin punctele de pegrafcF R" 4 0.*0. alori oarte buneF R" 4 0.6*0.7 alori acceptabileF R" 4 0.76 masuratorile contin erori si trebuie repetate, determinarea

concentratiei probei de analizat nu e recomandabila utilizand acesteexperiment

F @utorial 5xcel: ;ttps:!!AAA.=outube.com!Aatc;


21/67


C$l%ul$e$ %%e#$"e" p&e"#e" 'e "#ee:

= 4 este aloarea absorbantei probei necunsocute (determinata

experimental ca 0.0)x (conc probei necunoscute) este calculata ca:= 4 ax > bR" 4 0.#6" (masurare oarte buna)= 4 0.066x > 0.$60.0 4 0.066x > 0.$6x / 02 m.3ml

P&$ # A%

(m.3ml)+rot st $ 0,$" 0,+rot st " 0,"# ",+rot st 0,7 +rot st 6 0,6 #,+rot st 0, $0+rot deinteres 0, 6,7

) 2 4 6 8 1) 12

)

)!1

)!2

)!3

)!4

)!*

)!6

"# = )!)4 + )!13BG = )!9.

&etoda 4iuret ' regresie liniara

concentratia (mg5ml)

6bsorbanta la D#!0 nm

2alorile proteinei standard au ost bine alese simasuratorile au ost realizate corect dacaconcentratia proteinei de interes se aa in interaluldin mi8loc al dreptei

C b t l ( t d d)


22/67

F C$#' .$-%ul ee & e.e"e %u"l"#"e:

F C$#' %%e#$""le p&e"#el& $#'$' $u $l&" "#'ep$$e sau pentrudeterminarea concentratiei cu precizie mai mare, grafcul este o ;iperbola (regresie

curbilinie).F %n cazul regresiei curbilinii, ecuatia matematica care descrie relatia dintre absorbanta siconcentratie este:

= 4 ax">bx>c. +entru determinarea concentratiei se determina x.

F Realizeaza un tabel in 5xcel cu alorile de concentratie si alorile corespunzatoare aleabsorbantelor

F C;art*Scatter*MarDed Scatter * ClicD dreapta Select /ata * &dd Series * x alues *Selecteazaconcentratiile din tabelul acut in excel * = alues * Selecteaza aloarea absorbantelor dintabelul acut in 5xcel 3E * +e grafc apar punctele de intersectie ale alorilor deconcentratie si absorbanta * Sterge FseriesG de pe grafc (select, delete) * Sterge liniileorizontale de pe grafc (Select, /elete) * C;art la=out *Horizontal axis title * @itle beloA axis */enumeste axa x (concentratie mg!ml) *2ertical axis * Rotate title * /enumeste axa =(&bsorbanta 60 nm) * C;art title */enumeste titlul grafcului (Metoda 'iuret) * ClicD dreaptape unul din punctele de pe grafc * &dd trendline P&l4#&m"$l 3rder " sau sau 6 pana

cand se obtine o curba care trece cel mai bine prin!printre puncte * 3ptions C;ecD /ispla=ecuation on c;art si /ispla= R * sIuared alue on c;art


P&$ # A%

(m.3ml)

+rot st $ 0,$" 0,+rot st " 0,"# ",+rot st 0,7 +rot st 6 0,6 #,+rot st 0, $0+rot deinteres 0, x

) 2 4 6 8 1) 12

)

)!1

)!2

)!3

)!4

)!*

)!6

"# = : )2 + )!). + )!)9BG = 1

&etoda 4iuret ' regresie curbilinie

concentratia (mg5ml)

6bsorbanta la D#!0 nm

R"40.76$ (masurare oarte buna)=4*0.00"x">0.0#$7x>0.07

=40., se calculeaza x.

C b t l ( t d d)

!!


23/67

F /aca aloarea absorbantei proteinei de interes este mai mica sau mai maredecat absorbantele proteinei standard, atunci experimetrul trebuie repetat.

F %n urmatorul experiment se are in edere alegerea unor concentratii aleproteinei standard care sa includa concentratia probei de interes.

F /aca timpul sau cantitatea probelor nu permit repetarea experimentului seopteaza pentru determinarea concentratiei proteice prin urmatoarele metode,care insa scad din precizia determinarii concentratiei:

F /aca se obtine o absorbanta a proteinei de interes mai mare (0.#0) decatcea mai mare aloare a absorbantei proteinei standard (0.), atunciproteina de interes se dilueaza (ex. de "x), se masoara absorbanta (ex. se

obtine 0."), se determina concentratia corespunzatoare absorbantei de0.", iar la fnal se determina aloarea reala a concentratiei inmultind*o cuactorul de dilutie (ex. x".)

F /aca se obtine o absorbanta a proteinei de interes mai mica (0.$00) decatcea mai mica aloare a absorbantei proteinei standard (0.$"), atunciproteina de interes se concentreaza (ex. pana la 8umatate din olum,utilizand tuburi preazute cu membrane care retin proteina si lasa sa treaca

solutia tampon), se masoara absorbanta proteinei concentrate (ex. seobtine 0.00), se determina concentratia corespunzatoare absorbantei de0.00, iar la fnal se determina aloarea reala a concentratiei impartindaloarea obtinuta la ", conorm modalitatii in care a ost concentrata.

F 1neori se preera realizarea unei masuratori estimatie a concentratiei proteicela "70 nm, iar dupa determinarea concentratiei estimatie a proteinei se alegalori ale concentratiei proteinelor standard care sa o includa si se opteazapentru o metoda colorimetrica precisa (ca metoda 'radord sau 9oAr=) in



24/67

DOZARE DE

PROTEINEMETODA BIURET

& t d d d ( ti$i ) t i l


25/67

&etode de dozare (cuanti$icare) a proteinelor

C$#"$e$ &$l$ 'e p&e"#$

Cantitatea de proteina prezenta intr*o ractie este obtinuta prindeterminarea concentratiei unei parti din ractie si apoi multiplicandcu olumul total al ractiei

Me&'e 'e '&*$e $ p&e"#el&$. Masurarea absorbantei 12 la "70 nm a aminoacizilor aromatici

din compozitia proteinelor * metoda de dozare estimatia aconcentratiei proteice". Metoda 'iuret * metoda de dozare a proteinelor aate in

cantitati de ordinul mg!ml in proba de analizat. Metoda de dozare cu acidul bicinconinic ('C&)6. Metoda &mido 'lacD

. Metoda 'radord * metoda exacta de dozare a proteinelor aatein cantitati de ordinul Jg!ml in proba de analizat

. Metoda 9oAr= * metoda exacta de dozare a proteinelor aate incantitati de ordinul Jg!ml in proba de analizat

D t i l i & t d 4i t


26/67

P"#%"p"ul me&'e"F Metoda de determinare a cantitatii de proteina totala din solutieF Concentratia de proteina totala este eidentiata prin sc;imbarea

culorii probeiF %n conditii alcaline compusii care contin legaturi peptidice ormeaza

un complex "&le cu sarurile de cupru din compozitia Reactiului'iuret, care se masoara spectrootometric la 60 nm.

F %ntensitatea culorii este proportionala cu aloarea concentratieiproteinelor: cu cat culoarea iolet a complexului ormat este mai

intensa, cu atat mai concentrata este proteina de analizat.F /enumirea metodei proine de la compusul c;imic biuret, care

prezinta legatura peptidica C3*-H si da acelasi raspuns ca sipeptidele si proteinele.

F Metoda 'iuret sau Reactiul 'iuret nu contin compusul c;imic biuret.

'iuret

Dozarea proteinelor prin &etoda 4iuret

F A$#$6eF Metoda rapidaF Reactia nu este dependenta de tipul aminoacizilor care compun

peptidele sau proteinele de analizat.F De*$$#$6e

F Metoda de cuantifcare a peptidelor si proteinelor mai putinsensibila in raport cu alte metode (9oAr=, 'radord)



27/67


Cu78SO087N$OH

Cu78(OH)78N$7SO0

+eptida sauproteina

+

legaturapeptidica

Reacti'iuret

P&e"#$ 'e %upu:complex colorat iniolet, in care ionul Cu8 este unit prin legaturicoordinatie cu

;eteroatomi aiaminoacizilor anga8ati

Lormarea proteinatuluide cupru prin reducereaCu78 (din sulatul decupru, in mediu alcalin),la Cu8 prin ormarea de

complexe cu legaturilepeptidice din proteine

78

8



28/67

Re$%"" u"l"*$9"

$)Reacti 'iuret: g CuS36 x H"3 si g tartrat de sodiu i potasiu in $00 ml solutie -a3H0," M, la care se adauga g E% si se aduce la un litru cu solutie -a3H 0,"

MN

") Solutie standard proteica (solutie stoc):&lbumina serica boina * &'S ('oine serum albumin 'S&) $0 mg!mlN

) +roba de interes (poate f reprezentata de: peptide, proteine purifcate,

extract proteic total) a carei concentratie trebuie determinata




29/67

M&' 'e lu%u

4lancProteina

de analizatProteina standard (476)


8

ozarea pro e ne or pr n e o a ure


30/67

ozarea pro e ne or pr n e o a ureM&' 'e lu%u

F %n # eprubete se pipeteaza urmatorii reactii:F +roba $ * 'lanc : &pa > Reacti 'iuretF +robele "* * /ilutii seriale de +roteina Standard ('S&):

F +roba ": (&pa > +roteina standard) c40. mg!ml > Reacti 'iuretF +roba : &pa > +roteina standard) c4". mg!ml > Reacti 'iuretF +roba 6: (&pa > +roteina standard) c4 mg!ml > Reacti 'iuretF +roba : (&pa > +roteina standard) c4#. mg!ml > Reacti 'iuretF +roba : (&pa > +roteina standard) c4$0 mg!ml > Reacti 'iuret

F +roba #: +roteina de interes, de concentratie necunoscuta > Reacti 'iuretF

Cele # probe se omogenizeaza prin agitare energicaF Cele # probe se incalzesc $0 min la #0C, pentru a permite ormarea complexelorde proteinat de Cu

F Se masoara la spectrootometru la /360nm, ata de blanc, probele "* (dilutiiseriale de proteina standard) si proba # (proteina de interes)

F 5xemplu:F 'lanc40 Culoare albastra de la Reactiul 'iuretF &+roba "(0.mg!ml)4 0.$"F &+roba (".mg!ml)4 0."#F &+roba 6(.0mg!ml)4 0.6#F &+roba (#.mg!ml)4 0.00

F &+roba ($0mg!ml)4 0.#0F &+roba #(proteina de analizat, de concentratie necunoscuta)4 0.0

F Creste intensitatea culorii iolet, care e directproportionala cu concentratia de proteina din proba

F +robele au culoare iolet, datorita ormariiproteinatului de cupru prin reactia dintre proteina siReactiul 'iuret +roba are culoare iolet, a carei

intensitate sa poata f plasataintre probele "* (pt exemplul dat

ElancProteina+

Beacti Eiuret



31/67

Dozarea proteinelor prin &etoda 4iuretepe$e$ e*ul$el&

F +e baza rezultatelor obtinute se construieste curba etalon(curba standard) pe ;artie milimetrica

F +e axa x se marc;eaza concentratiile proteinelor standardF +e axa = se marc;eaza alorile absorbantelor

corespunzatoare concentratiilor proteinelor standardF 1nde aloarea absorbantei probei " intalneste aloarea

concentratiei probei " se marc;eaza primul punct de pegrafc

F %n mod similar se marc;eaza restul punctelor

corespunzatoare probelor , 6, , F Se traseaza o dreapta care trece prinsau printre punctele obtinute, dreaptacare nu trebuie neaparat sa treaca prinpunctul 0 de intersectie al axei x cu =

F Se marc;eaza pe grafc aloareaabsorbantei probei # (proteina deinteres) si printr*o paralela la axa x se

marc;eaza punctul de intersectie cudreapta. /in acest punct se traseaza oparalela la axa = care a intalni axa xintr*un punct care reprezinta aloareaconcentratiei probei de analizat(exprimata, in cazul exemplului dat, in

mg!ml).F 2aloarea concentratiei si grafcul

4

x


32/67

BIOCHIMIE

GENERAL

A

LP ;


33/67

DOZARE DE

PROTEINEMETODA LO


34/67

P"#%"p"ul me&'e" > L&?4, 1@0

F Metoda de determinare a cantitatii de proteina totala din solutieF Concentratia de proteina totala este eidentiata prin sc;imbarea

culorii probeiF +roteinele ormeaza un complex cu ionii de Cu"> in solutie alcalina

(Reactia biuretului)F %onii de Cu"> din complex sunt redusi la Cu>, iar acestia ormeaza un

complex instabil de culoare albastra cu reactiul Lolin*Ciocalteu.F &cest complex sereste ca o masura a concentratiei proteinei: cu cat

proteina este mai concentrata, cu atat culoarea este mai intensa

F &anta8e:F

5ste de aproximati $00 de ori mai sensibilO decPt reacQia 'iuretF Metoda optima pentru determinarea unei concentratii proteice intre:0.0$ * $.0 mg!m9.

F /ezaanta8e:F Mai laborioasa ca metodele 'iuret sau 'radord

Dozarea proteinelor prin &etoda 9or


35/67



36/67

Dozarea proteinelor prin &etoda 9orM&' 'e lu%u$. Se prepara dilutii seriale de proteina standard ('S&) conorm tabeluluide mai 8os, aand la dispozitie o solutie stoc de $00 Jg!ml. 2olumul

fnal al fecarei probe este $ ml.

". %n blanc ($ml apa distilata), in fecare proba proteica continand proteinastandard ($ml) si in proteina de analizat ($ml) se adauga $ ml Re$%"$l%$l"# 'e %upu (inainte de utilizare se amesteca $0 parti reacti & cu $parte reacti ' ) si se omogenizeaza. %ncubare $0 min la temperatura camerei pentru ormarea proteinatuluide cupru in probele proteice.+rin incubarea Reactiului alcalin de cupru cu probele proteice, ionul deCu"> din reacti este redus la Cu> deoarece se ormeaza complexe cu



37/67

M&' 'e lu%u


6. %n fecare proba (blanc, probe proteice standard, proteina de analizat) seadauga ml reacti Lolin*Ciocalteu (diluat $:$0 cu min inainte de utilizare) sise omogenizeaza

. %ncubare $0 min la 00C, se raceste aproximati min la temperaturacamereiReactia dintre +roteinatul de cupru si Reactiul Lolin Ciocalteu:F ReacVia de reducere a acidului osomolibdenic*osotungstenic (reactiul

Lolin*Ciocalteu) de cOtre %&mplexele Cu8 > le.u$ $m"'"% Kn principal,dar i de cOtre eu"le 'e "&*"#$ " "p&5$# '"# p&e"#$.

F %n timpul acestei reacQii Cu> este oxidat la Cu> care reacQioneazO maideparte cu sc;eletul peptidei i ormeazO imino peptide (R$*C3*-4C(R")*C3*R) i Cu">, iar reactiul Lolin*Ciocalteu este redus la molibden*Aolram, deculoare albastra, detectat spectrootometric la 0 nm (sau alta aloare dininteralul 00*#0 nm).

. Masurarea absorbantei proteinelor standard si a proteinei de analizat la 0

nm ata de blanc.#. Se realizeza o curba etalon trasand pe abscisa µg!ml proteina, iar peordonata absorbanta (&) probelor. 2aloarea absorbantei corespunzatoareproteinei de analizat este extrapolata pe grafcul curbei etalon pentru aareaconcentratiei acesteia (pe ;artie milimetrica) sau se poate determina utilizand5xcel.

!!


38/67

PROTEINE TOTALE SERICE > ALORINORMALE ADULTF >2F .3'l

2ariatii patologice:F 2alori crescute ale proteinelor totale sunt intalnite in bolile

inectioase, in pierderi de apa (diaree, arsaturi), poliurie,des;idratare, diabet insipid, mielom multiplu, boala UaldenstrWm

F 2alorile scazute ale proteinelor sunt intalnite in edeme nerotice,anemii, ;emoragii, inanitie, supuraQii cronice, ciroze ;epatice, tumorimaligne.

!


39/67

BIOCHIMIE

GENERAL

A

LP 0


40/67

METODA DESEPARARE A

PROTEINELORDINTR>UN

AMESTECSDS>PAGE

;e,nici de separare a proteinelor


41/67

ELECTROOREZA

ectrooreza natia (nedenaturanta: in absenta unui agent denaturant pentru prectrooreza denaturanta in gel de poliacrilamida (S/S*+&X5):

a. ara gradient de concentratie de acrilamidab. in gradient de concentratie de acrilamidac. electrooreza discontinua (disc electrooreza)




42/67

Ele%&5&e*$ 'e#$u$#$ "# .el 'e p&l"$%"l$m"'$S&'"um D&'e%"l Sul5$e>P&l4$%4l$m"'e Gel

Ele%&5&e" (SDS>PAGE)

+rincipiul electroorezei:F /eplasarea moleculelor cu o anumita sarcina electrica catre polul opus

sub actiunea unui camp electric.

F Campul electric este aplicat astel incat proteinele migreaza de laelectrodul negati spre electrodul poziti, miscarea realizandu*se deobicei pe erticala.

Xelul de poliacrilamida:F 5lectrooreza proteinelor se realizeaza de regula intr*un gel subtire de

poliacrilamida.F Xelul de poliacrilamida: polimerii de acrilamida ormeaza o retea




43/67

F %nainte de incarcarea in gelul de poliacrilamida,

probele proteice trebuie denaturate (se distrugestructura lor secundara, tertiara, cuaternara)pentru a se putea deplasa cu usurinta prin poriigelului de poliacrilamida.

F /enaturarea proteinelor se realizeaza prinincubarea lor cu o solutie tampon care contineS/S, βM5 (sau /@@), urmata de incalzire:

$. S/S (dublu rol):- a. +articipa la denaturarea proteinelor natie,

prin distrugerea interactiilor necoalente;idroobe din structura acestora

- b. S/S este un detergent anionic careFimbracaG proteinele (indierent de incarcarea

lor anterioara) intr*o sarcina electrica negatia,acandu*le sa migreze catre polul poziti intimpul electroorezei.

- I# %$*ul SDS>PAGE p&e"#ele m".e$*$ 'el$ (>) l$ (8)

- S/S care s*a legat de proteine are o masamoleculara mica, ce nu modifca masa

moleculara a acestora*



p p



44/67



F I# %'""" 'e#$u$#e, p&e"#eleu# ep$$e pe $*$ m$e" l&m&le%ul$e

F +roteinele mici se misca mai repede

prin gel comparati cu proteinelelargi.

F +roteinele largi raman in parteasuperioara a gelului, aproape depunctul de incarcare

F +rocenta8 poliacrilamida in solutie: creste




45/67



F 2izualizarea benzilor proteice din gelul de poliacrilamida princolorarea gelului de +&&:

$. Colorare cu Coomassie 'rilliant 'lue R*"0 sau X*"0Senzitiitate: 0.$ Jg proteina banda distincta pe gel

&l&$e %u $."# me&'$ m$" e#*""$ 'e%$ C&&m$"eenzitiitate: 0.0" Jg proteina banda distincta pe gel

. Au&$'"&.$-e3m$%$e u&e%e#$ "# %$*ul "# %$ep&e"#ele %"# #u%le&"'e m$%$e $'"&$%"3u&e%e#

MarDeri proteici:&mestec de proteine cumase moleculare cunoscute,care a8uta la identifcareamasei moleculare aproteinei de interes

F S/S*+&X5 distinge proteine care diera prin $0 aa



46/67



47/67


Ele%&5&e" (SDS>PAGE)Ele%&5&e*$ '"%"#u$

ariatii experimentale comparati cu electrooreza conentionala:$) " straturi de gel: un gel de concentrare (sus) si un gel de migrare (8os)") Solutiile tampon olosite pentru a prepara cele " straturi de gel au

tarii ionice si pH*uri dierite) Xelul de concentrare (sus) are o cantitate mai scazuta de acrilamida,

deci are porii mai largi decat gelul de migrare (8os).&ceste ariatii cauzeaza ormarea unor benzi proteice oarte concentratein gelul de sus, in timp ce cand a8ung in gelul de migrare proteinele aparsub orma unor benzi clare.


+lectro$oreza discontinua ' Protocol


48/67

@ampon gel de migrare: $. M @ris HCl pH 7.7, 0.6 S/S2t 4 00 ml0.7 g @ris

" g S/Sadauga "0 ml H"3stabileste pH 7.7adauga H"3 pana la 00 ml

@ampon gel de concentrare: 0. M @ris HCl pH .7, 0.6 S/S2t 4 00 ml0." g @ris

" g S/Sadauga "0 ml H"3stabileste pH .7adauga H"3 pana la 00 ml

@ampon de migrare

(din camera electrooretica): 0.$" M @ris, 0. M Xlicina, 0. S/S, pH 7.2t 4 $000 ml$ g @ris#" g Xlicina g S/Sadauga H"3 pana la $000 ml(Loloseste $ pentru migrarea gelului)

@ampon de incarcare (pentru denaturarea probei):

@ampon gel de concentrare: mlS/S: $ gβ*mercaptoetanol ". mlglicerol: ". ml

bromenol: ". mg

@ampon de colorare cu

Coomassie 'rilliant 'lue:2t 4 $000 ml0 %zopropanol (Metanol, 5tanol): 00 ml#. &cid acetic: # ml0." Coomassie R"0: " gadauga pana la $000 ml H"3

Solutie de decolorare gel %:60 5tanol$0 &cid acetic

Solutie de decolorare gel %%:$0 &cid acetic

+lectro$oreza discontinua Protocol



49/67

Se poate utiliza un sistem de electrooreza de la B"&>R$'

$. Se prepara gelul de migrare- Solutiile componente se pipeteaza de preerat in ordinea indicata mai sus- @5M5/ si &+S realizeaza initierea si cataliza reactiei de polimerizare a acrilamidei si -,

-Y bis*acrilamidei, cu ormarea retelei tridimensionale de poliacrilamida.- &tentie: /upa adaugarea &+S si @5M5/ gelul polimerizeaza in scurt timp (aprox $

min), asadar compozitia trebuie turnata rapid intre cele " geamuri (asamblate cuspaceri de 0.# mm), inainte ca acesta sa polimerizeze

". Cu o pipeta se adauga apa dupa turnarea gelului de migrare, pentru a il ace sapolimerizeze drept la limita dintre cele " geluri. /upa polimerizarea gelului de migrare se arunca apa6. Se prepara gelul de concentrare si se toarna intre geamuri, deasupra gelului demigrare. Se adauga pieptanul in gelul de concentrare, aand gri8a sa nu se ormeze bule de aerin gel

. /upa polimerizarea gelului de concentrare se scoate pieptanul#. Xeamurile care contin in interior gelul polimerizat se monteaza in camera de

Pep$$e$ " u#$e$.elulu"

Xel de migrare $"2t 4 0." ml$. H"3: $0. ml

". @ampon gel de migare pH 7.7: #. ml. &crilamida!'isacrilamida: $" ml6. @5M5/: $00 Jl. +ersulat de amoniu (&+S) $0: $00 Jl

el de concentrare t 4 $".77 ml. H"3: # ml

. @ampon gel de concentrare pH .7: ml. &crilamida!'isacrilamida: " ml

. @5M5/: 7 Jl

. +ersulat de amoniu (&+S) $0: 70 Jl

/aca se doreste realizarea unuigel cu alta concentratie decat$", de ex $, se calculeazaprin regula de trei simplaconcentratia corespunzatoare de

acrilamida ($ml), se scadeconcentratia de apa (#.ml),olumele pentru celelaltecomponente ramanandnesc;imbate, iar olumul fnalramane acelasi (0,"ml).



50/67

F +roba proteica: poate f extract proteic total, proteina pura, peptidaF 5xemplu

F Se prepara dilutii seriale de albumina serica boina dintr*o solutie stoc $0mg!ml (0. g 'S& si pana la 0 ml apa distilata) conorm urmatorului tabel:

N p&$3Re$%"(ml)

1 7 ; 0

'S& ($0 mg!ml) 0.$ 0. $ $.

H"3 $. $. $ 0.Conc proteica 0. mg!ml ". mg!ml mg!ml #. mg!ml

I#%$%$e$ " m".$e$p&el&

F /enaturarea probelor proteice:F "0 Jl din fecare proba proteica se transera in

cate un tub 5ppi si se amesteca cu . Jl tamponde incarcare

F +robele proteice > tampon incarcare aate intuburile 5ppi se incalzesc *$0 min la 0CF +robele proteice denaturate (", Jl) se incarca, cu o

seringa Hamilton in godeurile gelului de poliacrilamidaF Camera electrooretica este conectata la sursa de curentF Conditii de migrare a proteinelor in gel: #0*70 2, timp de

migrare $*" ;, in unctie de dimensiunea proteinei deinteres (de regula migrarea se intrerupe cand linia albastra* *



51/67

I#epe$e$ e*ul$el&$. Xelul este scos dintre geamuri si introdus intr*o solutie de colorare (ex.

Coomassie 'rilliant 'lue), 0*0 min, cu agitare usoara. Reactiul Coomassie

se leaga la proteine, permitand izualizarea acestora, dar nu le modifcastructura sau dimensiunea.". Xelul este introdus in solutia de decolorare, cu agitare usoara. Xelul este decolorat pana cand benzile proteice de interes sunt izualizate6. /upa decolorare, gelul poate f stocat $* saptamani in apa distilata sau

poate f uscat

P&e"#ele m".e$*$ 'e l$ (>)l$ (8) pe $*$ m$e"m&le%ul$e:F +roteinele cu masa moleculara

mica (ex. *" D/) migreazaprimele si se gasesc in marteade 8os a gelului

F +roteinele cu masa molecularaintermediara ("*$00 D/) segasesc in partea din mi8loc agelului

F +roteinele cu masa molecularamare($00*"0 D/) se gasesc inpartea de sus a gelului,aproape de punctul de



52/67

Xodeuri $, 7: MarDer de greutate molecularaXodeuri ", : +roteina purifcataXodeuri 6, : &mestec de proteine, purifcatpartialXodeuri , #: 5xtract proteic total (amestecde proteine), una din proteine, cu masamoleculara mica, este in exces

T"p:$. Complexele proteice sau proteinele cu structura cuaternara sunt denaturate si

or migra intr*un gel S/S*+&X5 ca benzi separate. /e exemplu, un complexproteic ;omotrimeric, cu masa moleculara 0D/ a migra pe gel sub orma de benzi suprapuse de 0D/. 1n complex proteic ;eterodimeric, alcatuit dintr*oproteina cu masa de 60 D/ si o proteina cu masa de 70 D/, aand o masamoleculara totala de $"0 D/, a migra pe un gel S/S*+&X5 sub orma a "benzi distincte cu masa moleculara de 60 D/ si 70 D/

". 3 proteina cu masa moleculara mica (7D/) se a separa mai bine de alteproteine din amestec daca este migrata pe un gel cu concentratie mare depoliacrilamida ($#). &lternati, o proteina cu masa moleculara mare ("00D/), se a separa mai bine daca este migrata pe un gel S/S*+&X5 cu o

concentratie mica de poliacrilamida (7). 3 proteina cu masa molecularaintermediara (0 D/) se recomanda sa sa migreze pe un gel de $0*$"

BIOCHIMI


53/67

BIOCHIMIE

GENERAL

A

LP


54/67

IDENTIICARE

GLUCIDEMETODA

BENEDICT


55/67

g p

P"#%"p"ul me&'e"F &cesta metoda este utilizata pentru testarea za;arurilor reducatoare,

care reduc ionii de Cu"> la Cu>, conducand la ormarea unui precipitat

rosu de oxid de cupru.F Xlucide reducatoare:F Xlucide care au o grupare alde;idica sau cetonica liberaF &ceste glucide contin grupari libere la atomii de C anomericiF 5xemple: glucoza, ructoza, maltoza, lactoza, etc.

Xlucide nereducatoare:

F Xlucide care nu au o grupare alde;idica sau cetonica liberaF &ceste glucide nu contin grupari libere la atomii de C anomericiF 5xemple: za;aroza, tre;aloza, etc.

Za;aroza

9actozaXlucoza Lructoza

Glu%"'e e'u%$&$e Glu%"'$ #ee'u%$&$

capatreducator


56/67

g p

Re$%"" u"l"*$"$. Reacti 'enedict:

F Se dizola $.# g citrat de sodiu si $0 g carbonat de sodiu inaproximati 70 ml apa distilata, solutia rezultata se fltreaza si seaduce la un olum fnal de 7 ml cu apa distilata.

F %ntr*un alt as se dizola $.# g sulat de cupru in $ ml apa.F Cele doua solutii se amesteca sub agitare.". Solutii de glucide reductoare si nereducatoare:

F Xlucoza $F Lructoza $F 9actoza $F Za;aroza $

(0. g glucida si pana la 0 ml apa distilata)

M&' 'e lu%uF %n trei eprubete, cu cate $ ml din solutiile de testat (glucoza, ructoza,

lactoza, za;aroza) se adauga cate " ml Reacti 'enedict si seincubeaza timp de minute pe o baie de apa la ferbere.


57/67

F +rezenta unui precipitat rosu sau galben indica prezenta za;arurilorreducatoare.CuS36 > " -a3H Cu(3H)" > -a"S36

Reacti 'enedict (solutie albastra)Reactie generala:RCH3 > " Cu78(OH)7 RC33H > " H"3 > Cu87OXlucida

reducatoare, cugr. alde;idica

libera

&cid aldonicCompus dinReactiul'enedict

3xid de Cu (%) sau 3xid cupros 4precipitat de culoare rosie, galbena, in unctie de tipulglucida 4marDer pentru prezenta unei glucide reducatoare+rezenta unui precipitat de Cu"3 in urma reactiei cu o glucida 4 solutie Le;li

5xemplu * Reactia glucozei cu Reactiul 'enedict:CH$"3 > " Cu78(OH)7 CH$"3# > " H"3 > Cu87O

Xlucoza4Xlucida

reducatoare

&cid gluconicCompus dinReactiul'enedict

3xid de Cu (%) sau 3xid cupros 4precipitat de culoare &"e4marDer pentru prezenta unui glucid reducator

epe$e$ e*ul$el&

J H""#$Bue%u

1 2 3 $. Xlucoza". Lructoza. 9actoza6. Za;aroza 4 Xlucida nereducatoareN in tub

se ormeaza un precipitat albastru

deoarece precipita compusii din reactiul'enedict

Xlucide reducatoare, in tub seormeaza un precipitat deculoare rosie, datoritaprezentei Cu"3

!!!


58/67

GLUCOZA > ALORI NORMALE ADULTF F>1 m.3'l

HIPOGLICEMIE

F K m.3'lHIPERGLICEMIE (DIABET ZAHARAT)F 17 m.3'l

!

BIOCHIMI


59/67

BIOCHIMIE

GENERAL

A

LP


60/67

Dozarea colesterolului total seric


61/67

C&lee&lul

F C"#H63

F Sterol sintetizat in organism

F 5ste transportat prin sange de la intestin sau fcat catre organele careau neoie de el in procesele metabolice

F +entru ca transportul sa fe efcient, colesterolul se uneste culipoproteine:

F LDL (l&? 'e#"4 l"p&p&e"#) $u %&lee&l $u:transporta colesterolul nou ormat de la fcat catre toate celuleleorganismului. &cest tip de colesterol se numeste si colesterol rau

deoarece cand depaseste nielul acceptat normal in sange sedepoziteaza pe peretele arterelor ateroscleroza

F HDL (+".+ 'e#"4 l"p&p&e"#) $u %&lee&l u#:preiau excesul de colesterol ramas neutilizat si il transporta lafcat pentru depozitare sau pentru eacuarea lui in bila

!!!


62/67

COLESTEROL > ALORI NORMALE >ADULTF COLESTEROL TOTAL: K 7 MG3DLF LDL: K 1 MG3DL

F HDL: MG3DLF RAPORT NOMAL STABILIT INTRE

COLESTEROLUL TOTAL SI HDL ESTE:COLESTEROL TOTAL:HDL/;,:1

TRIGLICERIDE > ALORI NORMALE >ADULT:

F K1 MG3DL

!



63/67

P"#%"p"ul me&'e"F

Colesterolul ormeaza cu an;idrida acetica, acidul acetic glacial siacidul suluric concentrat un complex colorat in albastru.F %ntensitatea culorii complexului rezultat are un maxim de absorbtie

la $ nm si este direct proportionala cu concentratia colesteroluluiseric.

Re$%"" u"l"*$"F Reacti de culoare:F $. acid acetic glacial ($00): 6 mlF ". an;idrida acetica: mlF . acid suluric concentrat (*#): "0 mlF substantele se adauga in aceasta ordine si se amesteca usor

F Standard de colesterol: "00 mg!dl (mg sau mg!$00ml) in acidacetic glacialF Ser obtinut din sange enos



64/67

M&' 'e lu%u 'up$ Me&'$ L"em$##>Bu%+$'

$. %n eprubete se pipeteaza urmatorii reactii:

Re$%" (ml)Bl$#%(ml)

S$#'$' %&lee&l(ml)

P&$ 'e$#$l"*$ (ml)

Re$%" 'e %ul&$e " " "S&lu"e $#'$'

%&lee&l * 0.$ *Se * * 0.$

2! 7&itare puternica pana la aparitia culorii albatre

3! Bepau 1) min!

4! Probele e citec la 61* nm ata de Elanc

*! Beactia ete poitia pentru Standardul de coleterol i pentru

Proba de er, care e coloreaa in albatru:erui



65/67

$ $le#$"$ 'e '&*$e $ %&lee&lulu" e"%:e lu%u 'up$ Me&'$ R$pp$p&>E"%++&#

P&$ (ml) Bl$#%(ml)

S$#'$'%&lee&l (ml)

P&$ 'e $#$l"*$ >e (ml)

&pa distilata 0.$ * *

Standardcolesterol

* 0.$ *

Ser * * 0.$&cid sulosalicilic 0. 0. 0.

&n;idrida acetica $. $. $.

3mogenizare sirepaus $0 min.

H"S36 0." 0." 0."3mogenizare sirepaus $0 min.

Citire $0 nmata de 'lanc

Dozarea colesterolului total seric!!!


66/67

I#epe$e$ e*ul$el& %u $6u&ul 5$%&ulu" 'e p$#$F Metoda actorului de panta este o curba etalon simplifcata, deoarece se

utilizeaza un singur standard, a carui concentratie este apropiata dealoarea pe care ne asteptam sa o obtinem pentru proba de analizat.

F Metoda recent olosita in clinicaF %n exemplul de mai 8os a ost utilizata o concentratie de colesterol

standard de "00 mg!dl, aloare descrisa ca find limita maxima aconcentratiei normale de colesterol seric la adult.

F 5xemplu:5s (la /3$nm) ****************** Cs4"00 mg!dl5p (la /3$nm) ****************** Cp4< mg!dlCp (m.3'l) / Ep x (C : E)

F Cp: Concentratia probei de colesterol de analizatF 5p: &bsorbanta probei de analizat

F Cs: Concentratia de colesterol standard ("00 mg!dl)F 5s: &bsorbanta probei de colesterol standardF (Cs : 5s) 4 (5$%& 'e p$#$)

F +entru a se elimina erorile de identifcare se recomanda realizarea induplicat sau triplicat atat a probei de colesterol standard, cat si a probeide ser de analizat.

F /aca s*au realizat mai multe determinari de absorbanta pentru proba

!



67/67

5xemplul $:5s: 0."Cs: "00 mg!ml5p: 0."$Cp4<

Cp (mg!dl) 4 5p x (Cs : 5s)Cp (mg!dl) 4 0."$ x("00:0.") 4 $70 mg!dl

%ndiidul are o aloare normala a colesterolului total seric (["00mg!dl).

5xemplul ":5s: 0.00Cs: "00 mg!ml

5p: 0.Cp4<

Cp (mg!dl) 4 5p x (Cs : 5s)Cp (mg!dl) 4 0. x("00:0.00) 4 " mg!dl%ndiidul are ;ipercolesterolemie (aloarea colesterolului total seric

lp biochimie generala

Documents