biochimie appliquée

Biochimie appliquée

Université Dr. Moulay Tahar de SAIDA

Préparé par:

Mr. HALLA Noureddine

II- Biochimie des substances d’origine animale (2)

Culture de cellules animales (eucaryotes):

L'hybridation cellulaire - application à la production d'anticorps monoclonaux

Culture de cellules animales : anticorps monoclonaux

Introduction

Anticorps

Antigène Protéine


Introduction

Utilisation en diagnostic dans pratiquement tout le domaine du monde vivant : agroalimentaire,

vétérinaire, microbiologique.

Une action ciblée sur un antigène spécifique d’une cellule responsable du processus pathogène

assurant sa destruction.

Historique


1975

1984

1986

1989

1994

Présent

Georges Köhler et César Milstein:la technique d’obtention des anticorps monoclonaux

premier Ac monoclonal mis sur le marché: Muromomab (anti-CD3)

Ac monoclonaux humanisés

production d’Ac monoclonaux humains par des souris transgéniques ou transchromosomiques

Plusieurs progressions

Ac monoclonaux chimériques souris/homme

Définition


Ils sont très largement utilisés en biologie et en médecine, à la fois comme outils de diagnostic

et dans des buts thérapeutiques.

Ils sont homogènes contrairement aux anticorps polyclonaux.

Ils reconnaissent un type unique de site antigénique,

Les anticorps monoclonaux ou monoclonal antibody sont identiques car produits par un

clone de cellules spécialisées du système immunitaire (les plamocytes).


Rappel

Lorsque les immunoglobulines lient une molécule ou une particule virale ou bactérienne, les immunoglobulines sont

toutes désignées sous le nom d’anticorps, et l’entité reconnue est appelée antigène.

Deux propriétés :- capacité de lier spécifiquement un ou plusieurs ligands, et

- participation à une ou plusieurs fonctions effectrices (activation du complément, stimulation de la phagocytose,

sécrétion d’amines …)

Anticorps

Caractérisation

L’Ac joue un rôle essentiel dans la réponse immunitaire :- c’est le récepteur, à la surface des lymphocytes B ou en

solution dans le sérum,- c’est le transmetteur ou l’activateur de signaux

physiologiques.

Rôles


Rappel

Structure

Production


Deux principales techniques sont utilisées dans la plupart des laboratoires producteurs des anticorps

monoclonaux

la technique de transformation

lymphoblastoide par le virus d’Epstein Barr EBV

La technique des hybridomes

Production



fusiondes

cellules

sélectiondes

hybridomes

isolementdes

hybridomes

testdes

hybridomes

productiondes

hybridomes

Déroulement de la production des hybridomes

obtention des cellules

Production



Obtention des cellules1

+

Immunisation de la souris avec l’antigène étudié

Obtention des lymphocytes spécifiques

Utilisation de cellules myélomateuses

HGPRT

Obtention des cellules immortelles

Fusion

Production



Fusion des cellules2

+

Par méthode chimique Par méthode physique

fusion des membranes cellulaires avec poly éthylène glycol

fusion des membranes cellulaires par électroporation

sélection

Production



Sélection des hybridomes3

+

Culture sur milieu HAT (Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine)

MORT CELLULAIRE

Impossibilité de se diviser

Cellule myélomateuse HGPRT-

HYBRIDOME SELECTIONNE

Lymphocyte B

MORT CELLULAIREdisparition après quelques

divisions

Production



Isolement des hybridomes4

+

Dès que la croissance est suffisante, il faut propager les cultures d'hybridomes productrices de l'anticorps désiré

(transferts des puits de 0,3 à 2 ml, puis à des bouteilles de 25 ml), les conserver et les cloner. Deux méthodes sont

utilisées pour obtenir un clone à partir d'une cellule :

Production



Isolement des hybridomes4

+

Sur milieu gélosé

Par dilution limite

Une colonie = une cellule initiale Une ou zéro cellules par puit

Production



Test des hybridomes5

+

Test sur le surnageant de chaque puits

de la présence des anticorps monoclonaux par la méthode ELISA

du type d’anticorps produit par des méthodes d’immunoprécipitation

Production



Production des ACM6

+

Amplification des hybridomes

obtention des anticorps monoclonaux

Conservation des hybridomes

Production par

cultures cellulaires

Production dans

les liquides d'ascites

Production



Hypoxanthine IMP

AMP

GMP

Synthèse endogène

TMPThymidine

HGPRT

Thymidine Kinase

AzasérineAminoptérine

Aminoptérine

Milieu HAT : Hypoxanthine, aminoptérine, thymidineMilieu Haza : Hypoxanthine, azasérine

Production


la technique de transformation lymphoblastoide par le virus d’Epstein Barr EBV

Il s’agit de transformer et de rendre cancéreux un lymphocyte humain sécréteur d’un anticorps donné en y introduisant le

virus d’Epstein-Barr EBV.

L’EBV possède la propriété remarquable d’induire la prolifération continue des

lymphocytes B infectés.

Production



Le virus est un membre de la famille des herpès virus. Il infecte 90 % à 95 % des adultes.

Il est responsable de la mononucléose infectieuse et du lymphome de Burkitt.

Production



Les lymphocytes sécréteurs d’un anticorps obtenus chez un sujet immunisé suite à une infection ou à une transfusion, sont séparés des

autres éléments figurés du sang sur gradient de densité 1.077.

Ils sont ensuite incubés en présence du virus selon différents protocoles.

Applications


Ils sont utilisés pour la détermination des groupes sanguins ABO et Rhésus, pour les groupages tissulaires HLA et pour l’immunomarquage des

leucémies aigues.

la compréhension de nombreux processus biologiques.

Pour distinguer plusieurs sous-populations lymphocytaires.

la protéomique et les tests de dépistage biologiques en masse.

D’une façon générale, les anticorps monoclonaux sont utilisés en diagnostic dans pratiquement tout le domaine du monde vivant :

agroalimentaire, vétérinaire, microbiologique.

Une action ciblée sur un antigène spécifique d’une cellule responsable du processus pathogène assurant sa destruction.

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Documents

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