Metodica fu ideata nel 1983

Questa tecnica, utilizzando i principi della duplicazione del DNA,

permette di ottenere in poco tempo notevoli quantità di materiale specifico

ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993).

PCR - Polymerase Chain Reaction

Science. 1988 Jan 29;239(4839):487-91.

Related Articles, LinksPrimer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.

Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA.

Cetus Corporation, Department of Human Genetics, Emeryville, CA 94608.

A thermostable DNA polymerase was used in an in vitro DNA amplification procedure, the polymerase chain reaction. The enzyme, isolated from Thermus aquaticus, greatly simplifies the procedure and, by enabling the amplification reaction to be performed at higher temperatures, significantly improves the specificity, yield, sensitivity, and length of products that can be amplified. Single-copy genomic sequences were amplified by a factor of more than 10 million with very high specificity, and DNA segments up to 2000 base pairs were readily amplified. In addition, the method was used to amplify and detect a target DNA molecule present only once in a sample of 10(5) cells.

PCR schema

• DNA bersaglio• Primers• Enzima• Nucleotidi trifosfati• Ioni Mg++

CampioneDNA bersaglio

Oligonucleotidi sintetici complementari a sequenze fiancheggianti il tratto di DNA da studiare 20 – 25 bp

Primers

Nucleotidi trifosfati

DNA polimerasiEnzima

Denaturazione del DNA (94°C)

Ibridazione dei primers al bersaglio(40°C – 60°C)

Sintesi del DNA(72°C)

Termociclatori

RT-PCRReverse transcription-PCR

• Si può evitare l’uso di tecniche più laboriose. Velocità di esecuzione

• Si possono analizzare campioni di poche cellule (anche 1 cellula). Elevata sensibilità

Vantaggi

Biopsie

Analisi prenatale e Analisi preimpianto

Tracce di infezioni virali

Malattia mimima residua

Medicina forense

End Point PCR

Il campione si sottopone al numero di cicli stabiliti (30-40), alla fine della reazione un’aliquota si sottopone ad elettroforesi su gel di agorosio per

verificare:

1. la lunghezza dell’amplificato (controllo del peso molecolare in bp mediante ladder);

2. La quantità di amplificato ottenuto (proporzionale all’intensità della banda);

3. L’assenza di frammenti aspecifici.

La PCR end-point non è un metodo quantitativo

Alla fine della reazione non sempre la quantità di DNA del campione d’origine è proporzionale all’intensità della banda ottenuta.

Utilizzando particolari accorgimenti può diventare un metodo semi-quantitativo.

•Ricerca di mutazioni note;•Ricerca di mutazioni non ancora identificate.

Log[

DN

A]

N° ciclitermici

EsponenzialEsponenzialee

LineareLineare

PlateauPlateau

Prodotto Prodotto variabilevariabile

Polymerase Chain Reaction: plateau

Resa effettiva: effetto plateau

Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”, esso è limitato da:

Quantità dei primersAttività della Taq polimerasiReannealing dei filamenti

Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti

Perché Real-Time?

Misura l'amplificazione in tempo realedurante la fase esponenziale dellaPCR, quando cioè l'efficienza dia m p l i f i c a z i o n e è i n f l u e n z a t aminimamente dal le var iabi l i d ireazione, permettendo di ottenererisultati molto più accurati rispetto allaP C R t r a d i z i o n a l e " e n d p o i n t "

Real Time PCR

Si utilizzano particolari termociclatori in grado misurare la fluorescenza emessa da particolari fuorofori ad ogni ciclo.

La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata utilizzando uno strumento quantitativo ma anche dei marcatori

fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR

•La fluorescenza si genera durante la PCR pereffetto di diverse possibili reazioni chimiche

•Le chimiche principali sono basate sia sullegame di coloranti fluorescenti che si intercalanonella doppia elica di DNA, come il SYBR Green,sia sul l ' ibr idazione di sonde speci f iche.

Chimiche fluorescenti Chimiche fluorescenti per PCR Realper PCR Real--TimeTime

SYBR Green ISYBR Green: principioUtilizza una molecolaUtilizza una molecola fluorescente non specifica che si fluorescente non specifica che si lega al solco minore del DNAlega al solco minore del DNA

Durante l’elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all’ aumento del

numero di copie dell’amplicone

SYBR GreenSYBR Green

SYBR green• Metodica semplice

Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa

• Non costosa

• Non-specifica– La molecola fluorescente si lega random a tutte le

doppie eliche, includendo i dimeri di primers– È necessario ottimizzare la metodica per evitare la

f o r m a z i o n e d i p r o d o t t i a s p e c i f i c i

Curva di dissociazioneDopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati

e la variazione dell'energia di fluorescenza viene monitorata per generare una curva di dissociazione

Tm

82.6 88.1

melting peak

Curva di dissociazione

TaqManLa Real-Time PCR si può realizzare mediante l’impiego: coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si legano

i n m a n i e r a a s p e c i f i c a a t u t t o i l D N A sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento di

i n te r e ss e , m a r ca te c on mol ec o le f l uor es ce n t i

Esistono diversi tipi di sonde:Dual-labeled (come le sonde TaqMan) Molecular beaconsScorpion Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)

Sonde TaqManLa sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i

primers della PCR, viene disegnato per esserecomplementare alla sequenza bersaglio da amplificare

La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all’interno La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all’interno del frammento amplificato nella reazione di PCRdel frammento amplificato nella reazione di PCR

Primer

Primer3’3’

3’3’

3’3’3’3’

5’5’

5’5’5’5’

5’5’

R Q5’5’ 3’3’

Sonda TaqMan

5’ 3’

Presenta all’estremità 5’ un fluoroforo “Reporter”ed all’estremità 3’ una molecola “Quencher”

Reporter-Quencher5’ REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette

fluorescenza 3’ QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che

spegne la fluorescenza del reporter

5’ 3’

R Q

Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q

Real Time PCR FluorescenceFluorescenceresonanceresonance energyenergy

transfertransfer (FRET)(FRET)

Forward primer

Reverse primer

Probe

L’aumento di fluorescenza del Reporter è direttamente proporzionale al numero di ampliconi generati

Curve di amplificazionePlot lineare

Cicli di amplificazione

Fluo

resc

enza

Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui CT(=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla

quantità di template iniziale

Quantificazione

ASSOLUTA i campioni sono quantificati in modo assoluto Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione

assoluta (utilizzo di una standard curve)Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche

quantità di campioni

RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i CT

Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una standard curve)

Gli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro CT con quello del controllo endogeno

Quantitativa relativa: analisi dei dati

Normalizzare il target con un controllo endogeno (r) espresso costitutivamente (CT)

Comparare ciascun CT così ottenuto con il CT di un trattamento di controllo anche detto “calibratore” (cb) (CT)

2- (CT,r- CT,cb)= 2- CT

Il valore così ottenuto permette di determinare lac o n c e n t r a z i o n e r e l a t i v a d e l t a r g e t

Real-Time PCR: applicazioni• Quantificazione virale• Quantificazione dell’espressione

genica • Efficacia della terapia farmacologica• Detenzione dei patogeni• Controllo degli OGM• Genotyping • MRD

DxS TheraScreen®: K-RAS Mutation Kit

(in breve, il kit K-RAS) è un test diagnostico in vitro che consente di

identificare sette mutazioni somatiche sette mutazioni somatiche nell'oncogene K-RAS e di

eseguire una valutazione qualitativa dello stato mutazionale. Deve

essere utilizzato in ambiente di laboratorio su campioni di DNA estratti

da tessuto colorettale fissato in formalina e incluso in paraffina.

MutationMutation detection detection kitskits

DxSDxS TheraScreenTheraScreen®: K®: K--RAS Mutation KitRAS Mutation Kit

Spesso nei carcinomi umani vengono riscontrate mutazioni dell'oncogene

K-RAS. La presenza di tali mutazioni è correlata all'assenza di una

risposta a determinate terapie antitumorali basate sugli inibitori del

recettore del fattore di crescita epidermico (terapie anti-EGFR) nei

pazienti con carcinoma colorettale metastatico.

È possibile identificare sette mutazioni nel gene K-RAS su uno sfondo di

DNA genomico wild-type utilizzando un saggio PCR realsaggio PCR real--time basato sullatime basato sulla

tecnologia tecnologia DxSDxS Scorpions®Scorpions®. Si tratta di un metodo estremamente selettivo.

Se il numero di copie di DNA è sufficiente, è possibile determinare circa, è possibile determinare circa

l'1% dei mutanti su uno sfondo di DNA genomico l'1% dei mutanti su uno sfondo di DNA genomico wildwild--typetype.

Il kit K-RAS è in grado di identificare sette mutazioni K-RAS

nei codoni 12 e codoni 12 e 13 13 dell'oncogenedell'oncogene KK--RASRAS

Il kit K-RAS utilizza i saggi PCR real-time

associando due diverse tecnologie: ARMS®ARMS® e e Scorpions®Scorpions®.

La tecnologia ARMS (tecnologia ARMS (Amplification Refractory Mutation System)Amplification Refractory Mutation System) supporta

l'amplificazione di specifici alleli o mutazioni.

La Taq DNA polimerasi è estremamente efficace per distinguere tra un

appaiamento corretto e un appaiamento errato all'estremità in 3’ di un

primer per PCR. È possibile eseguire un'amplificazione selettiva di

specifiche sequenze mutate anche in campioni in cui le sequenze non

mutate sono la maggioranza, in quanto:

• Quando il primer è perfettamente appaiato, l'amplificazione procede

con la massima efficienza.

• Quando la base in 3’ presenta un appaiamento errato, si osserva

soltanto un'amplificazione di basso livello sullo sfondo.

La ARMS (ARMS (AmplificationAmplification RefractoryRefractory MutationMutation System) System) PCR è un sistema per

identificare mutazioni. Essenzialmente si fanno due PCR in parallelo, una con un

primer specifico per l'allele normale e l'altra per quello mutato; il secondo

primer è uguale per entrambe. I primer sono fatti, ovviamente, per legarsi solo

alla variante allelica di interesse, in modo da non legarsi con l'altra. A questo

punto puoi avere 3 casi (supposto che la reazione 1 sia con l'allele normale e la

2 con il mutato): 1) amplifico in 1 ma non in 2 -> omozigote wt

2) amplifico in 2 ma non in 1 -> omozigote mutato

3) amplifico in 1 e in 2 -> eterozigote

La tecnologia tecnologia ScorpionsScorpions consente di identificare il risultato

dell'amplificazione. Il termine Scorpions è utilizzato per descrivere

molecole a doppia funzione che contengono un primer per PCR legato

covalentemente a una sonda. Il fluoroforo in questa sonda

interagisce con un colorante quencher, anch'esso incorporato nella

sonda, che sopprime la fluorescenza. Quando si verifica una

reazione PCR e la sonda si lega all'amplicon, il fluoroforo e il

quencher si separano, determinando un aumento della fluorescenza

proveniente dalla provetta della reazione.

http://www.biosearchtech.com/support/applications/real-time-pcr-probe-animation-video

Analisi dei dati: metodo Analisi dei dati: metodo ΔCtΔCt

Nei saggi realreal--time time ScorpionsScorpions, il numero di cicli di PCR necessari per

rilevare un segnale fluorescente al di sopra del segnale dello sfondo è il

parametro con cui vengono misurate le molecole bersaglio presenti

all'inizio della reazione. Per conoscere i valori ΔCt dei campioni si

calcola la differenza tra il valore Ct del saggio di mutazione e il valore

Ct del saggio di controllo per lo stesso campione. I campioni vengono

classificati come positivi alla mutazione se restituiscono un valore ΔCt

inferiore al valore ΔCt 1% per il saggio.

Il kit K-RAS contiene otto saggi.

• Un saggio di controllo.

• Sette saggi di mutazione.

Tutte le miscele di reazione contengono un saggio di controllo esogeno, o

controllo interno, marcato con HEX (rilevato dal colorante JOE nel sistema

ABI7900). In questo modo viene monitorata la presenza di eventuali

inibitori, che potrebbero indurre risultati falsi negativi. Il saggio di controllo,

marcato con FAM, serve per ottenere una valutazione del DNA totale in un

campione. Il saggio di controllo amplifica una regione

dell'esone 4 del gene K-RAS.

Ogni saggio di mutazione, marcato con FAM, contiene una molecola

Scorpion e un primer ARMS che consentono di distinguere il DNA wild-

type dall'eventuale DNA mutante rilevato con il saggio PCR real-time.