1. MinidefinitieII. Incadrare taxonomicaIII. HabitatIV. Implicare in patologia umanaV. Microbiologie - principalele caractere si implicatii in patogeneza si

diagnosticul microbiologieVI. Factori de patogenitateVII. PatogenieVIII. Raspunsul imunIX. Notiuni de epidemiologie si profilaxie a infectiilor nosocomialeX. Diagnosticul de laborator

Curs xv. Genus Staphylococcus

Cuvinte cheie: coci gram pozitivi, dispoziţie În ciorchine, halofili, catalazăpozitivi, fermentează glucoza fără producere de gaz;S. aureus: coagulază pozitiv, proteină A pozitiv, DNA-ză termostabilă pozitiv,leziuni purulente, toxinoze, toxiinfecţii;Stafilococi coagulază negativi (SCN): kit-uri (galerii multitest), infecţii de corpstrăin, infecţii urinareInfecţii nosocomiale, rezistenţa la meticilină (oxacilină)

1. Minidefinitie

Stafilococii sunt coci Gram pozitivi condiţionat patogeni, cu dispoziţiecaracteristică "în ciorchine", care pot fi implicaţi în infecţii invazive purulente şi/sau detip toxinoze/toxiinfecţii, uşoare sau de gravitate medie până la severă, ameninţătoare deviaţă

II. Încadrare taxonomică şi clasificare

Manual Bergey 2004:Domeniu: BacteriaPhylum: B XIII, FirmicutesClasa: III, BacilliOrdin: BacillalesFamilie: VIII StaphylococacceaeGenul Staphylococcus - este compus până în prezent din 40 de specii, dintre care 20 auputut fi izolate de la om.

Stafilococii sunt apropiaţi filogenetic de streptococi, enterococi, lactobacili ŞI GenulBacillus.

2

III. Habitat

Stafilococii fac parte dintre bacteriile ubiquitare (prezente peste tot În mediulÎnconjurător).

Colonizează vestibulul nazal şi mucoasele organelor cavitare cu comunicare laexterior (colon, vagin) şi contaminează frecvent tegumentul, preferând zonele cuumiditate ridicată (axile, perineu, plici interdigitale etc.)

IV. Implicare în patologia umană:

Staphylococcus aureus poate fi implicat în infecţii invazive cu caracter purulent,În toxinoze (afecţiuni cauzate de toxine bacteriene) şi toxiinfecţii (afecţiuni mixte de tipinvaziv şi toxic).

Infecţii invazive:• Infecţii superficiale ale tegumentelor şi mucoaselor (inclusiv

anexele pielii - foliculită, furuncul, carbuncul, panariţiu,hidrosadenită etc.)Abcese profunde

• Osteomielite• Infecţii ale organelor interne

Infecţii generalizate, sistemice etc.Toxinoze şi/sau toxiinfecţii:

• Toxinoze şi/sau toxiinfecţii alimentare• Necroliza toxică epidermică• Sindromul de şoc toxic• Enterocolita postantibiotice

Stafilococii coagulază negativi (SCN) fac parte din microflora tegumentarănormală, exercitând în condiţii normale un rol protector (vezi curs VII).

Nu dispun de factori de patogenitate suficienţi pentru a putea depaşi barieracutanată intactă, dar pot pătrunde în organism ca urmare a unor intervenţii invaziveconstând în introducerea de catetere, implante, proteze vasculare etc. De obicei,colonizează mai întâi cateterele sau dispozitivele protetice, de unde ulterior pot diseminaşi cauza infecţii generalizate şi/sau determinări infecţioase la nivelul endocardului,seroaselor etc. Speciile de stafilococi coagulază-negativi cel mai frecvent implicate Înastfel de infecţii sunt: S. epidermidis, S. capitis, S. lugdunensis, S. haemolyticus, S.warneri etc.

O categorie aparte de infecţii cauzate de stafilococii coagulază-negativi suntinfecţiile urinare cu S. saprophyticus

-----------------------------------------------------------------------------------------~--------------~

toxicshock syndrome

Fig. 1 - Principalele localizări ale manifestărilor infecţioase şi/sau toxicedeterminate de stafilococi

bons, carbun.:::Ies---"""\.,_+ ~sinusltis

fur uneI es ------,~, ,.,--

""iI_---+---hlcmatogilnolis spread

endocar d! ti s

emilsjs-----+----+1r---=-~" ""'* 1mpetlgo

~H--+--- diarr hea

scatded ski FI syndrom

ost eomyet itls --------'-~_---t----uti

cystitl s

Aspecte clinice particulare în infecţiile, toxinozele şi/sau toxiinfecţiile cauzate destafilococi şi toxinele stafilococice

Afecţiuni cauzate de Staphylococcus aureus

Infecţii purulente localizate sau generalizate:• .Impetigo: infecţie superficială la nivelul feţei şi membrelor, care afectează mai

ales copilul mic. Se manifestă prin apariţia de macule, vezicule, pustule, cruste pefond eritematos. În 20% din cazuri este posibilă asocierea S.aureus custreptococul de grup A.

• Foliculită: infecţie piogenă la nivelul foliculului pilos• Orgelet - infecţie piogenă afectând un folicul pilos la nivelul pleoapelor

(denumire populară ulcior sau urcior)• Furuncul: extinderea infecţiei foliculului pilos la glandele sebacee, colecţie

apreciabilă de puroi, Însoţită de ţesuturi necrozate, durereCarbuncul (Fig. 2): rezultat al extinderii infecţiei la mai multe glandepilosebacee şi la nivelul ţesuturilor subcutanate profunde, cu necroză lanivelul tegumentelor şi ţesurilor subiacente. Denumirea de "carbuncul" sau"furuncul antracoid" provine de la culoarea neagră a ţesuturilor necrozate, care seaseamană cu cea a leziunilor produse de Bacillus anthracis la nivel cutanat,antraxul cutanat, cunoscut sub denumirea populară de "cărbune", .xlalac" sau"bubă neagră". În cazul S. aureus, necroăa cutanată se datorează producerii deleucocidină Panton Valentine sau "toxina dermonecrotică". Pacienţii cu infecţii

3

4

cauzate de tulpini producătoare de toxină dermonecrotică prezintă risc de infecţiipulmonare necrotizante, mai ales în cazul în care dezvoltă în paralel infecţii viralerespiratorii (mai ales cu virus gripal).

Fig. 2 - Carbuncul

• Hidrosadenita: infecţie a glandelor sudoripare cu localizare la nivel axilar,perineal, sau În zonele genitaleCelulita: infecţie a hipodermului, cu tendiţă la extindere prin contiguitate(din aproape În aproape, ca o pată de ulei), care apare în special la pacienţi cudeficienţe imunitare sau la care se asociază un factor traumatic local.Celulita care evoluează la nivelul feţei (Fig. 3), mai ales cu localizare deasupra

buzei superioare, constituie o urgenţă medicală, ca urmare a faptului ca se poateextinde la nivelul sinusurilor cavemoase. Se evită orice traumatism local şi seinstituie rapid tratamentul cu antibiotice de elecţie (oxacilina, cu efectuarea recoltăriişi antibiogramei înainte de începerea tratamentului, pentru a depista eventualeletulpini rezistente la meticilină şi a schimba antibioticul În caz de rezistenţă lameticilină).

Fig. 3 - Celulita cu localizare la nivelul feţei

• Mastita: infecţie a glandei mamare; apare la 1-3% din femeile care alăptează şise manifestă ca un nodul eritematos, cu formarea unui abces canalicular

Infecţii ale plăgilor: pot apare post traumatic sau post chirurgical; se manifestăprin edem şi eritem local, durere şi acumulare de puroi

• Bacteriemia şi endocardita: sunt dobândite în proporţie de cel puţin 50% înmediul spitalicesc, după proceduri chirurgicale, utilizare de catetere intravenoasecare devin contaminate etc.; se asociază frecvent cu diseminare septică secundară,de obicei la nivelul endocardului şi apariţia endocarditelor acute, infecţii severe,cu o mortalitate de aproximativ 50%.

• Pneumonia şi empiemul pulmonar sunt întâlnite mai ales la vârstele extreme• Osteomielita şi artrita septică: rezultat al diseminării septice secundare unor

infecţii stafilococice cu alte localizări, sau postraumatic; localizarea este diferităla copii, unde afectează mai ales metafizele oaselor lungi şi la adulţi, undelocalizarea este mai frecventă la nivel vertebral

• Artrite septice după infiltraţii intra -articulare

Toxinoze şi/sau toxiinfecţii:

• Toxinozele şi/sau toxiinfecţiile alimentare cu S. aureus apar după consumul dealimente contaminate cu stafilococi producători de enterotoxine stafilococice(carne de porc În saramură, şuncă, salate de cartofi, Îngheţate) sau/şi numai dupăingerarea unui aliment prelucrat termic, în care au rămas numai enterotoxinelestafilococice, care sunt termorezistente; acest tip de toxinoze/toxiinfecţii apar maifrecvent în sezonul cald (iulie-august), ca rezultat al contaminării produsuluialimentar de către purtători şi/sau indivizi cu infecţii purulente. Alimentulcontaminat nu are aspectul sau gustul alterat. Incubaţia este de 1-8 ore, debutuleste brusc, evoluţia rapidă, 12-24 de ore, caracterizată prin: diaree apoasă, greţuri,vărsături, dureri abdominale, cefalee. Este un toxinoză/toxiinfecţie spontanautolimitată, care dispare odată cu eliminarea toxinei. Cazurile sunt de obiceiuşoare sau cel mult de gravitate mediu, dar pot apărea şi cazuri grave, la pacienţiaflaţi la vârste extreme (sugari, persoane de vârsta a treia), care prezintăinstabilitate hemodinamică şi hidroelectroliticăDermatita exfoliativă (sindromul pielii opărite stafilococice, maladia Ritter sauimpetigo bulos stafilococic) - este o toxiinfecţie care apare de obicei la nou-născut şi se manifestă cu eritem perioral, care în decurs de 2 zile cuprinde întregcorpul. Se formează vezicule cu lichid clar, fără microorganisme şi leucocite, caurmare a clivajului straturi lor intraepidermice. Are loc descuamarea epiteliului,iar refacere epiteliului are loc în 7-10 zile, când apar anticorpii protectoriSindromul de şoc toxic stafilococic a fost descris ca urmare a unor evenimentecare au avut loc în 1978 şi a fost atribuit eliberării unei toxine care a primitdenumirea de Toxina Sindromului de Şoc Toxic - 1 (TSST-l). Se manifestă prinfebră, hipotensiune, eritem scarlatiniform. Evoluţia poate fi fatală sau se terminăcu descuamarea epitelului şi vindecare. TSST-l stimulează macrofagele, care vorelibera cantităţi mari de mediatori chimiei, cauză a sindromului şocului toxic.Este superantigen, adica determină activarea limfocitară policlonală (numonoc1onaIă, aăa cum fac antigenel obişnuite)Episodul din 1978 a apărut la femei tinere, care au utilizat tampoaneintravaginale. Toxina se absoarbe şi stimulează macrofagele care secretă

•

•

5

6

interleukină-I, prostaglandine şi TNF-a (vezi cursuri imunologie). Aceste citokinesunt reponsabile de manifestările clinice.• În cazul infecţiilor nosocomiale (apărute în unităţi de îngrijire), dar mai recent şi

în cazul infecţiilor care evoluează În afara unităţilor de Îngrijire (infecţiicomunitare), sunt de temut infecţiile cu S.aureus rezistent la meticilină(SAMRJengl. MRSA). Transmiterea se face mai ales prin contact direct, prinintermediul purtătorilor sănătoşi de germeni (portaj nazal, prin mâini contaminate,etc). Localizările pot fi: cutanată, respiratorie, renală, digestivă, osoasă, articulară,generalizată etc.

Stafilococii coagulaza-negativi (SCN)

Endocardita - se poate instala pe valvele cardiace lezate prin malformaţiicardiace, reumatism articular acut etc., dar mai ales pe valve artificiale.Stafilococul coagulază negativ este introdus în organism în timpul tehnicilor dechirurgie cardiovasculară. Debutul este lent, la aproximativ 1 an de laintervenţia chirurgicală, la nivelul suturii valvei de ţesutul cardiac; seînsoţeşte de formarea de abcese cardiace şi separarea valvelor la nivelul liniilor desutură, cu tulburări de dinamică cardiacă. Prognosticul este rezervat.Infecţii ale materialelor de implant: în funcţie de unitatea de îngrijire, o cincimepână la peste 50% din infecţiile secundare implanturilor de dispozitive, catetere,şunturi, tuburi de dren sunt cauzate de SCN, mai frecvent S. schleiferi şiS.lugdunensis). Capsula polizaharidică a SCN asigură ataşarea la niveluldispozitivelor protetice, protejându-i astfel de acţiunea antibioticelor şi a celulelorfagocitareInfecţii ale tractului urinar sunt mai frecvent diagnosticate la femeile de vârstăfertilă. Infecţia urinară cu S. saprophyticus se poate instala ca urmare a colonizăriipe cale ascendentă, de la nivelul intestinului sau al tractului genital, putândrecunoaşte deci şi un mecanism de transmitere pe cale sexuală.Alte infecţii: abcese cerebrale, meningite, infecţii vasculare, peritonite, septicemiietc. Majoritatea au caracter nosocomial şi pot fi produse de speciile de SCN maisus menţionate.

v. Microbiologie - principalele caractere cu implicaţii În patogeneza şidiagnosticul microbiologic

Stafilococii se definesc prin caracterelele lor morfotinctoriale, de cultivabil itate,metabolice şi enzimatice, rezistenţa la agenţii fizici, chimiei şi biologici.

Caractere morfotinctoriale:Forma: coci rotunzi, dimensiuni: 0,5 - I urn

• Tinctorialitate: gram pozitivi• Dispozitie: caracteristica, grupaţi în grămezi de forma ciorchinelui de strugure

(staphile, gr. = strugure); în prelevate pot exista extra, dar şi intracelular

7

Sunt nesporulaţi, pot prezenta capsulă, mai ales În cazul tulpinilor foarte virulente,recent izolate din Iezi uni purulente şi/sau infecţii sistemice

Caractere de cultivabilitate: sunt nepretentioşi nutritiv, cresc pe medii nutritivesimple.

Adaosul de sânge În mediile nutritive simple se realizează mai mult În scopdiferenţial, pentru a facilita diagnosticul de specie, ştiut fiind că tulpinile de S. aureussunt mai frecvent producătoare de hemolizine.

Pot supravieţui şi se pot multiplica În medii cu concentraţii ridicate de NaCI,proprietate denumită halotoleranţă. Această proprietate este utilizată pentru preparareamediilor selective cu ajutorul cărora se realizează separarea stafilococilor din amestecuricu alte bacterii nehalotolerante (ex. majoritatea bacteriilor enterice din materiile fecale,alte prelevate contaminate etc.)

Tip metabolic: stafilococii au un metabolism HETEROTROF, putând creşte numai Înprezenţa substanţelor organice), facultativ anaerob. Fermentează glucoza fără producerede gaz. S. aureus fermentează manita şi în anaerobioză, spre deosebire de SCN, dintrecare unele specii nu utilizează manita, ira altele o utilizează doar în aerobioză.Sunt catalază pozitivi, oxidază negativi

Rezistenta la agenti fizici, chimiei si biologiei

Stafilococii sunt relativ rezistenţi la agenţi fizici, cum sunt frigul, uscăciunea,variaţii de pH.

Sunt sensibili la dezinfectante din grupa derivaţilor halogenaţi (ex. povidon-iodine, cloramină) şi la derivaţi de amoniu cuaternar.

Natural sensibili la majoritatea antibioticelor, cu excepţia polimixinelor (colistin)quinolonelor de generaţia Întâi (acid nalidixic), la care prezintă rezistenţă naturală. Înultimele decenii, mai ales În spitale s-au selectat clone rezistente la meticilină, atât de S.aureus, cît şi de SCN. În România, tulpini le de S. aureus rezistente la Meticilină suntfrecvent rezistente şi la alte antibiotice (polirezistenţă la antibiotice).

Unele tulpini sunt sensibile la bacteriofagi, ceea ce permite tipizareabacteriofagică (lizotipia), de mai mică valoare În cazul tulpinilor rezistente, care suntfrecvent netipabile prin lizotipie sau sunt sensibile la majoritatea bacteriofagilor din setulinternaţional, ceea ce nu permite Încadrarea lor În grupe fagice distincte, pentrud iferenţi ere. .

VI. Factori de patogenitate (Fig. 4)

• S. aureus:Factori structurali (endocelulari):

(1) proteine şi/sau mucopolizaharide de suprafaţă - promoveazăcolonizarea tesuturilor gazdei (ex. acidul teichoic, care se ataşează lafibronectină; coagulaza legată care se ataşează la fibrinogen etc.) şi/sauinhibă fagocitoza şi accesul antibioticelor (capsula)

8

(2) pigmenţi carotenoizi localizaţi la nivelul peretelui cellular-supravieţuirea în fagocite - S aureus, pigment galben cu moleculăpolinesaturată - reduce radicalii toxici de oxigen

Factori solubili (exocelulari):

(3) producere de catalază - supravieţuire în fagocite prin reducerearadicalilor toxici de oxigen (ex. apa oxigenată);(4) producere de coagulază - se îmbracă într-un strat de fibrină care îlapără la nivel circulator de atacul fagocitelor şi antibioticelor; când ajungeîn ţesuturi, fibrinolizina descompune fibrina şi eliberează stafilococul,pentru a-şi putea relua multiplicarea(5) invazine - promovează pătrunderea bacteriilor în ţesuturi: leucocidina(citolitică), hialuronidaze (promovează invazia bacteriană prinhidroliza matricei conjunctive tisulare); lipase - tropism spre glandasebacee şi pentru ţesuturile grăsoase etc.(6) toxine cu activitate citolitică (Ieziuni ale membranei celulare eucariote)- hemolizine ( a - hemoliză clară, J3- hemoliză incompletă de tip cald-rece, 0, y ), leucotoxine, leucocidine - inclusiv leucocidina PantonValentine;(7) exotoxine care lezeaza tesuturile gazdei sau provoaca simptome deboala (enterotoxine stafilococice A-G, TSST-l, epidermolizina sau toxinaepidermolitică etc.)

(8) Se consideră, de asemenea că rezistenţa la antibiotioce intrinsecă saudobandită constituie un factor de patogenitate suplimentar.

Fig. 4 - Factori de patogenitate la S. aureus

y;.. IgG

mlcro- P,""'~~,capsute , . ')., .

cellwal~'

InVi!lsi ns:hya! ur ont das estaphylysl n,1eukocl di n,leukoto:1d n<coagul asestaphyl old nase

VII. Patogenie

( Manifestarea infecţiilor stafilococice invazive şi/sau a toxinozelor/toxiinfecţiilorstafilococice presupune derularea mai multor etape:a. Colonizarea tegumentelor şi mucoaselor, prin acţiunea proteinelor şi

polizaharidelor cu rol de adezine. Bacteriile care posedă capsulă şi/sau altestructuri mucopolizaharidice de suprafaţă pot contribui la realizarea biofilmelor,structuri matriceale în interiorul cărora bacteriile se pot integra, evitând şi în acestfel acţiunea factorilor imunitari celulari şi/sau umorali, precum şi a antibioticelor

b. Invazia şi procesul infecţios - proces în care intervin invazinele (hialuronidaza,leucocidine, leucotoxine, coagulaza, stafilokinaza, lipazele etc.) estecaracteristică afecţiunilor stafilococice de tip invaziv

c. Acţiunea toxinelor - se manifestă specific pentru fiecare dintre toxineleenumerate:- acţiune citotoxică pentru hemolizine, leucocidina Panton Valentine;- activitate de serin-proteaze în cazul toxinelor exfoliative, cu acţiune asupra

desmozomilor care constituie structurile de legătură la nivel intercelular;- infiltrat leucocitar la nivelul stomacului şi jejunului şi stimularea mediatorilor

chim ici de la nivelul mastocitelor, cu reacţie inflamatorie şi senzaţie de greaţă încazul enterotoxinelor;

- activarea limfocitară policlonală specifică pentru toate toxinele care aucaracterul de "superantigene": enterotoxine, toxina exfoliativă

- stimularea eliberării de citokine, având ca rezultat creşterea permeabilităţiivasculare sau efect citolitic, la concentraţii înalte, precum şi efecte sistemice mergândpânaă la şoc toxic, în cazul TSST-l

VIII. Raspunsul imun

• Principalul mecanism: fagocitoza• Anticorpi neutralizanti antitoxici

Opsonizare anticorp dependenta

Mecanismele de evitare a raspunsului imun:- Aderenţa de epiteliul mucoasei prin existenţa interrelaţiei receptori - adezine

(acizi teichoici, alte adezine) inpiedică mecanismele de curăţire a mucoaselor- Capsula, microcapsula, proteina A interferă cu fagocitoza- Biofilmul de la suprafata materialelor străine introduse în organism jenează

fagocitoza- Carotenoizii, catalaza constituie mecanismele de rezistenţă intrafagocitară: prin

neutralizarea speciilor reactive de oxigen, care constituie mecanismele primare debactericidie intrafagocitara la nivelul fagolizozomului

- Leucocidinele, hemolizinele etc. reduc eficienţa răspunsului antifagocitar

9

10

r

IX. Elemente de epidemiologie şi profilaxie a infecţiilor nosocomiale

Stafilococii sunt microorganisme ubiquitare. SCN nu lipsesc de la nivlultegumentelor, iar Saureus colonizează cel puţin tranzitoriu zonele tegumentare saumucoase umede.

Atât Saureus cât şi SCN pot fi izolaţi din orofaringe, tract gastro-intestinal,urogenital.

Colonizarea nou-născutului cu Saureus începe la nivelul bontului ombilical,suprafeţelor tegumentare, ariei perineale.

Din totalul indivizilor, se consideră că 15 - 25% din adulţii sănătoşi sunt purtătorinazofaringieni persistenţi, 50% purtători intermitenţi şi un procent de 15 - 25% nuvor fi niciodată purtători, în relaţie cu particularităţile receptorilor celulari careconstituie marca proprie a fiecărui individ. Portajul de scurtă durata este frecventnazofaringian. La pacienţii îndelung spitalizaţi, personal medical etc., portajul poateajunge la 40-70, până la 90%. Portajul este tegumentar sau nazofaringian şi poate firesponsabil pentru apariţia infecţiilor nosocomiale.

Stafilococii pot fi implicaţi Însă şi în etiologia infecţiilor extraspitaliceşti(comunitare). Se consideră că tulpinile cu tropism pulmonar şi capacitatedermonecrotică, producătoare de leucocidină Panton Valentineîţi au oroginea încomunitate, dar pot fi introduse şi îăn spital, unde se propagă după mecanismeleinfecţiilor nosocomiale.

Posibilitati de profilaxie si/sau tratament:Vaccin experimental bivalent anti S aureus - conferă imunitate de aprox.40 zile pacienţilor hemodializati - compus din polizaharide capsulare deS aureus tip 5 si 8Ser hiperimun - nu se mai utilizeazăIncercări de antagonizare a factorilor de colonizare

X. Diagnosticul de laborator

Recoltarea şi transportul probelor

În diagnosticul infecţii lor/toxiinfecţii lor putem fi confruntaţi cu orice tip de probă:secreţie purulentă, LCR, saâge, exsudat nasofaringian, biopsie din leziuni cutanate, lichidarticular, secreţie conjunctivală, spută etc.

Pentru recoltare se ţine seama de precauţiile generale, dintre care cele maiimportante sunt: recoltarea înaintea începerii terapiei cu antibiotice, respectarea regulilorde antisepsie, reprezentativitatea probei etc.

Transportul trebuie realizat cât mai rapid sau cu asigurarea mediului de tranport,în cazurile în care se anticipează prelungirea timpului de transport. Transportul la distanţătrebuie Tacut cu respectarea regulilor internaţionale, respectiv împacheterea triplă:recipient primar, recipient secundar din material incasabil şi nedeformabil şi învelişterţi ar, din carton, marcat cu simbolul caracteristic pentru "pericol biologic".

II

Examenul direct

Examenul macroscopic ajută la selectarea porţiunilor reprezentative, purulente,sanguinolente etc. Aspectul caracteristic este acela de secreţie sau lichid purulent, cutentă galbenă.

Examenul bacterioscopic se face după colorare cu coloratia adecvată scopuluiurmărit: Gram pentru bacterii, albastru metilen sau May-Grunwald-Giemsa pentruobservarea celulelor inflamatorii, a relaţiei lor cu bacterii le, respectiv detaliilor detinctorialitate celulară.

Citologia cantitativă (numărătoarea celulelor) şi calitativă furnizează informaţiiprivind reacţia inflamatorie şi fagocitară, relaţia bacteriilor cu celulele fagocitare etc

Izolarea

Pentru izolarea stafilococilor din produse normal sterile (sânge, LCR etc.) seutilizează medii nutritive simple, însămânţate şi incubate timp de 24-48 h, la 36 ± lOC;adaosul de sânge înlesneşte observarea caracterelor hemolitice.

În cazul prelevatelor cu floră mixtă )materii fecale, alimente contaminte etc.) seutilizează medii selective, ca de exemplu agarul hiperclorurat tip Chapman

Identificarea se realizează în scopul managementului cazului clinic individual,dar şi în scop epidemiologic, pentru confirmarea cazului şi furnizarea de informaţiimicrobiologice cu valoare epidemiologică.

Pentru confirmarea cazului este necesară identificare până la nivel de gen şispecie, prin: aspectul microscopic, caracterele de cultură (vezi descriere anterioară),caractere biochimice şi enzimatice.

Diagnosticul de gen în cazul cocilor Gram pozitivi facultativ anaerobi constă îndiferenţierea între Staphylococcus şi Streptococcus pe baza capacităţii de producere acatalazei (Staphylococcus este pozitiv).

Diagnosticul diferenţial de specie constă în :- diferenţierea Între S. aureus de SCN cu ajutorul testelor pentru: coagulază,

termonuclează, eventual evideţiera prezenţei proteinei A şi/sau a unor polizaharidecapsulare specifice (reactivi de diagnostic rapid)

- diferenţierea speciilor de SCN Între ele - În cazul secţiilor de chirurgie cardio-vasculară sau În care se fac protezări etc.; sau în infecţii urinare. Se poate face cu ajutorulkit-urilor sau galeriilor multitest

În scop epidemiologic poate fi necesară evidenţierea unor markerimicrobiologiei care să diferenţieze tulpinile din aceeasţi speeie, pentru a puteaevidenţia sursa şi calea de transmitere.

Diferenţierea intraspecifica: se face prin metode de tipizare cu sunt: tipizarabacteriofagică (Iizotipie), tipizare moleculară

La examenul microscopic se evidenţiază coci gram pozitivi, cu diametrul de 0,5-1,5 um , dispuşi în grămezi, imobili, nesporulati, de regulă necapsulaţi. În prelevate,stafilococii pot fi evidenţiaţi şi izolaţi sau în grupuri de mici dimensiuni, cu defecte decolorabilitate, mai ales în produse provenite de la pacienţi deja trataţi cu antibiotice.

rFig. 5. Frotiu colorat C4 albastru de metilen din cultură pură coci dispuşi în grămezi

~@, ,."'1. '1Si

Fig. 6. Imagine obţinută prin microscopie electronică de baleiaj - coci în ciorchine destruguri

Caractere de cultivare: se dezvoltă atât în aerobioză, cât ŞI In anaerobioză(facultativ anaerobi), sunt mezofili (se dezvoltă între 10-42°C, cu dezvoltare optimă la37°C). Cresc pe medii uzuale (agar nutritiv cu sau fără adaos de sânge) şi/sau pe mediiselective hiperclorurate de tip Chapman. Formează colonii rotunde, convexe, frecventpigmentate galben auriu la S. aureus, care produc frecvent o hemoliză completă sauincompleta pe geloză sânge (Fig. 7, 7 bis). Stafilococii sunt capabili să crească pe mediisuplimentate cu 10% NaCI. Pe acest mediu, S. aureus utilizează manita (virarea culoriiroz a mediului la galben), în timp ce numai unii SCN utilizează manita (Fig. 8).

12

Fig. 7. S. aureus Ca) şi S. epidermidis - aspectul coloniilor pe agar nutritiv simplu cuadaos de sânge

a. b.

Fig. 7 bis - S. aureus: culturi pe agar nutritiv simplu cu adaos de sânge şi frotiu coloratGram

13

--------------------------------------------------------------,

14

Fig. 8 - Mediu selectiv si diferential hiperclorurat cu manitol- izolare din produsecontaminate cu germeni Gram negativi. S. aureus apare sub forma coloniilor de culoaregalbenă şi îngălbeneşte mediul

Testul catalazei, utilizat pentru diferenţierea stafilococilor de streptococi seefectuează punând în contact o cultura pe mediu fără sânge cu apă oxigenată 3%. Reacţiapozitivă constă în apariţia efervescenţei, prin eliberarea oxigenului (Fig. 9).

Fig. 9. Diagnostic diferenţial Staphylococcus # Streptococcus utilizând testul catalazei(Genul Staphylococcus este catalază pozitiv)

Pentru diferenţierea S. aureus de SCN putem utiliza în concluzie urmatoarelecaractere:

- caracterele culturale• colonii pigmentate galben-auriu la S. aureus, spre deosebire de S.

epidermidis şi S. saprophyticus care prezintă pigment albS. aureus produce pe agar sânge mai frecvent o hemoliză clară sauo hemoliză incompletă

- producerea de coagulază liberă de către S. aureus - enzimă care are proprietatea dea coagula plasma oxalatată prin activarea protrombinei (Fig. 10). Restulstafilococilor sunt denumiţi SCN

15

- S. aureus produce dezoxiribonuclează termostabilă, care rămâne activă pnnfierberea supernatantului de cultură (Fig. 11 şi 12).

- prezenţa proteinei A în structura peretelui celular - cu ajutorului reactivului rapid(Fig. 13)

Fig. 10 - Testul coagulazei pozitiv (sus) şi negativ (jos)

Fig. 11 - Testul termonucleazei - metoda cu HCl- clarificarea mediului cu acizinucleici în vecinătatea culturii pozitive pentru dezoxiribonuclează prin solubilizareaacizi lor nucleici depolimerizaţi în acid clorhidric

Medtoda cu H CI

Fig. 12. Testul termonucleazei - metoda Lachica, cu albastru de bromtimol (ABT) -schimbarea culorii complexelor acizi nucleici - ABT, de la albastru la roz, caurmare a modificării structurii spaţiale după digestia acizilor nucleici

În Fig. 13 este reprezentată metoda rapidă de identificare a S. aureus prinaglutinare cu latex sensibil izat cu imunoglobuline (reacţionează cu Proteina A dinperetele S. aureus), fibrinogen (reacţionează cu coagulaza legată din peretele S. aureus)şi anticorpi monoclonaJi anti antigene capsulare de S. aureus

Fig. 13. Metoda rapidă de identificare aS. aureus

Pentru diferenţierea SCN Între ei, utilizăm kit-uri sau galerii de microteste (ex.API 20 (Fig. 14) sau API ID 32 STAPH.

16

Fig. 14. Identificarea SCN cu ajutorul galeriei API 20

Dintre metodele de tiprzare, lizotipia poate oferi informaţii utile pentrudiferenţierea în focar (Fig. 15).

Fig. 15. Lizotipia utilizată pentru diferenţierea tulpini lor într-un focar de infecţiistafilococice

Există metode de tipizare moleculară potrivite pentru diferenţierea în focar, saupentru urmărirea evoluţiei tulpini lor la o scară mai largă temporospaţială.

Testarea de rutină a sensibilităţii la antibiotice se face prin metoda disc difuziei.Principalele mecanisme de rezistenţă la stafilococi sunt:- elaborarea de beta-Iactamaze - codificate plasmidic, inhibate de inhibitorii de [3-

lactamaze ca: acid c1avulanic (augmentin= amoxicilină cu acid clavulanic), sulbactam,care pot inactiva aceste beta-Iactamaze

Tulpinile MRSA posedă gena mecA. Cele de provenienţă nosocomială înRomania sunt de obicei multirezistente.

17

18

Tulpinile MRSA din comunitate sunt mai sensibile la alte antibiotice.Rezistenţa prin apariţia unei noi proteine de legare a penicilinei, cu ajinitate joasă

pentru beta-lactamine (tulpini meticilino-rezistente MRSA sau Meti-R),apariţia unei PBP adiţionale şi se manifestă faţă de toate beta-lactaminele(peniciline, cefalosporine, carbapeneme). Singurele antibiotice active faţăde aceste tulpini sunt glicopeptidele (vancomicina). Dar şi faţă de acesteaau apărut tulpini rezistente. Antibiograma este deci obligatorie.

Testarea sensibilitatii la oxacilina - screening difuzimetric cu disc de cefoxitin, însoţitde al doilea test: evidenţierea PLP2a sau PCR pentru gena mecA

Test D pentru detectarea rezistentei inductibile la MLSb (Macrolide, Lincozamide,Streptogramine b): discuri Eritromicina si Clindamicina la o distanta de 10 mm:Eritro R si turtirea zonei de sensibilitate Ia Clindamicina (antagonism) - Fig. 16.

Fig. 16. Testul D pentru rezistenţă inductibilă la macrolide, lincosamide,streptogramine