osgradoen ciencias biolÓgicas · héctor gabriel mukul lópez en opción al título de maestro en...
TRANSCRIPT
* CICY
•
SOSGRADOEN
CIENCIAS ( BIOLÓGICAS
Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.
Posgrado en Ciencias Biológicas
Evaluación del perfil proteico extracelular en suspensiones celulares Coffea spp.
Tesis que presenta
Héctor Gabriel Mukul López
En opción al título de
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓ.GICAS Opción Bioquímica y Biología Molecular
Mérida, Yucatán, México Mayo 2010
UJ Cl
* CICY ( POSGRADO EN
) CIENCIAS ( BIOLÓGICAS
Centro de Investigación Científica de Yucatán , A.C.
Posgrado en Ciencias Biológicas
Evaluación del perfil proteico extracelular en
suspensiones celulares Coffea spp.
Tesis que presenta Héctor Gabriel Mukul López
En opción al título de
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Opción Bioquímica y Biología Molecular
Mérida, Yucatán, México Mayo 2010
~ ::; CICY
RECONOCIMIENTO
Por medio de la presente, hago constar que el trabajo de tesis titulado Evaluación
del perfil proteico extracelular en suspensiones celulares Coffea spp fue realizado
en los laboratorios de la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas del
Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. bajo la dirección del (los) Dr.
Víctor Manuel Loyola Vargas, dentro de la Opción Bioquímica y Biología Molecular
de Plantas, perteneciente al Programa de Posgrado en Ciencias Biológicas de
este Centro.
Atentamente,
Dr. Osear A. Moreno Valenzuela
Director Académico
•
Declaración de Propiedad
Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos
Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento provienen de las
actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para
desarrollar mi trabajo de tesis en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación
Científica de Yucatán y que dicha información le pertenece en términos de la ley de
propiedad industrial , por lo que no me reservo ningún derecho sobre ello.
(IBQ. Héctor Gabriel Mukul López)
•
DEDICATORIAS
Le agradezco mucho a Dios por haberme permitido llegar hasta este punto y haberme dado salud para lograr mis metas.
A mis padres que me dieron la vida y han estado conmigo en todo momento, aunque hemos pasado momentos difíciles siempre han estado apoyándome. paa, maa gracias por todo y este sueño hecho realidad es el fruto de todos los sacrificios que ustedes hicieron por mi. Los quiero con todo mi corazón .. .
A mi abue que me cuida desde el cielo.
A Sauri , a mi sobrino que es la alegría de la familia y que quiero mucho.
Y a ti mi Ana Tere, que te puedo decir, muchas gracias por todo este tiempo y por todos los momentos en los cuales hemos compartido tantas cosas maravillosas y que han cambiado mi vida, por todo el apoyo que me has dado. Gracias por estar conmigo preciosa y recuerda que eres muy importante para mí y lo serás por siempre.
RECONOCIMIENTOS
Este trabajo se realizó en la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas del Centro de Investigación Científica de Yucatán bajo la dirección del Dr. Víctor Manuel Loyola Vargas.
Este trabajo fue apoyado por una beca de Maestría del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (no. 213455) para Héctor Gabriel Mukul López un apoyo del Fondo de Ciencia Básica (no. 61451) .
•
AGRADECIMIENTOS
Al Centro de Investigación Científica de Yucatán y la Unidad de Bioquímica y Biología
Molecular de plantas por el uso de sus instalaciones para la realización de este trabajo.
Al Dr. Víctor M. Loyola Vargas, que fue el director de este trabajo de investigación, así
como por sus consejos brindados y por preocuparse siempre 'para tener la mejor
formación .
A la M. C Rosa M. Galaz Ávalos por todo el apoyo técnico y por la paciencia de haberme
enseñado todo lo relacionado al cultivo de tejidos.
Al Dr. Eliel Ruiz May por enseñarme la parte de electroforesis en 2D y por su amistad
Al comité evaluador conformado por los Drs: Nancy Santana Buzzy, Rafael Rojas Herrera,
Felipe Barahona y Javier Mijangos Cortés por sus comentarios y críticas para el
enriquecimiento de este trabajo.
A mis compañeros y amigos que de alguna manera u otra han contribuido en la
realización de este trabajo , así como por sus comentarios y consejos que han hecho más
ameno el trabajo y la estancia en este centro .
Gracias a todos ...
ii
•
Índice
ÍNDICE
RECONOCIMIENTOS
AGRADECIMIENTOS 11
ABREVIATURAS VIl
ÍNDICE DE FIGURAS IX
ÍNDICE DE CUADROS XIII
RESUMEN XV
ABSTRACT XVII
INTRODUCCIÓN
REFERENCIAS 3
CAP~ULO IANTECEDENTES 5
1.1 El cafeto 5
1.2 Embriogénesis somática 6
1.3 Embriogénesis somática directa e indirecta 7
1.4 Embriogénesis somática en Coffea spp. 8
1.5 Cultivos de suspensiones celulares 9
1.6 Compuestos excretados por los cultivos vegetales 11 1.6.1 Compuestos involucrados en la inhibición de la embriogénesis somática 11
1.6.2 Compuestos involucrados en la embriogénesis somática 12
1.9 OBJETIVO GENERAL 19
2. OBJETIVOS PARTICULARES 19
REFERENCIAS 20
iii
•
Índice
CAPÍTULO 11 MATERIALES Y MÉTODOS 33
2.1 Inducción de los callos embriogénicos 33
2.2 Cultivo de las suspensiones celulares 33
2.3 Caracterización de las suspensiones celulares 33 2.3.1 Número de células 34
2.3.2 Paquete celular 34
2.3.3 Peso fresco y peso seco 34
2.3.4 Conductividad y pH 35
2.4 Inducción a la embriogénesis somática 35 2.4.1 C. canephora 35
2.4.2 C. arabica 35
2.5 Recolección del medio de cultivo 36
2.6 Cuantificación de proteínas extracelulares 36
2. 7 Electroforesis de doble dimensión en geles de poliacrilamida 37 2. 7.1 Electroenfoque 37
2.7.2 Etapa de equilibrio 38
2.7.3 Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) 38
2.7.4 Tinción con nitrato de plata para geles 2D-PAGE 38
2.8 Análisis de las proteínas reveladas en los geles 39
REFERENCIAS 40
CAPÍTULO 111 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 41
3.1 Obtención de callos a partir de explantes foliares de las dos especies de Coffea . 41
3.2 Establecimiento de las suspensiones celulares 42
3.3 Caracterización de las suspensiones celulares 44 3.3.1 Número celular 44
3.3.2 Paquete celular 45
3.3.3 Peso fresco y peso seco 45
3.3.4 Conductividad eléctrica del medio de cultivo 47
iv
•
Índice
3.3.5 pH del medio de cultivo 47
3.4 Establecimiento de un sistema de embriogénesis somática 48 3.4.1 Inducción a la embriogénesis somática en C. canephora 48
3.4.2 Inducción a la embriogénesis somática en C. arabica 49
3. 5 Cuantificación de proteínas en el medio de cultivo 52
3.6 Análisis electroforético de las proteínas excretadas por los cultivos de C. canephora y C. arabica bajo condiciones no embriogénicas 53
3.7 Proteínas diferenciales en los diferentes días de cultivo y bajo condiciones embriogénicas y no embriogénicas. 59 3.7.1 C. canephora 60
3.7.2 C. arabica 60
3. 8 Análisis de las proteínas presentes en los diferentes días de cu ltivo en 3D 67
3.9 Discusión 70
REFERENCIAS 73
CAPÍTULO IV CONCLUSIONES 79
CAPÍTULO V PERSPECTIVAS 81
V
Índice
vi
•
ABREVIATURAS
Ácido 2,4-diclorofenoxiacético
Arabi nogalactoproteí nas
Embriogénesis somática
No embriogénico
Embriogénesis somática directa
Embriogénesis somática indirecta
Alcohol hidroxibencílico
Benciladenina
Masa molecular
Segunda dimensión
Ácido tricloroacético
Oitiotreitol
Sulfato dodecyl de sodio
Punto isoeléctrico
Ácido naftalenoacetico
Cinetina
Abreviaturas
2,4-0
AGPs
ES
NE
ESO
ESI
4-HBA
BA
MM
20
TCA
OTT
sos
pi
ANA
KIN
vii
•
viii
•
Índice de figuras
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Inducción de callos a partir de explantes foliares de las dos especies
de Coffea. A) C. canephora. B) C. arabica. Con un tiempo de cultivo de 42 días. 42
Figura 2. Explante con callo de C. arabica agregado en el medio de cultivo para
suspensiones celulares. Mantenidas en constante movimiento e incubados a
oscuridad.
Figura 3. Curva de crecimiento de las suspensiones celulares de C. canephora.
A) número de células (o), paquete celular ( ¿ ). B) peso fresco (•) , peso seco
( • ), en un tiempo de cultivo de 26 días.
Figura 4. Curva de crecimiento de las suspensiones celulares de C. canephora.
A) conductividad eléctrica del medio de cultivo (t.) y peso fresco (•) . B)
comportamiento del pH durante el crecimiento de las suspensiones celulares,
43
46
durante un tiempo de cultivo de 26 días. 48
Figura 5. Callos de C. arabica fragmentados en medio de cultivo en
condiciones de mantenimiento a los 42 días de cultivo en condiciones no
embriogénicas.
Figura 6. Proceso embriogénico de las especie C. arabica. A) 42 días en medio
de mantenimiento para suspensiones celulares. B) 21, C) 42 , D) 98 días en
medio de inducción a la ES.
Figura 7. Cuantificación de las proteínas secretadas al medio de cultivo en C.
arabica y C. canephora, en condiciones no embriogénicas (NE) y embriogénicas
(ES). Los días NE evaluados fueron 14 y 42 . ES, fueron 21 , 42 , 98. En C.
canephora solo se analizó el día 14.
50
51
53
ix
•
Índice de figuras
Figura 8. Comparación de los patrones electroforéticos en geles de
poliacrialamida en segunda dimensión de las proteínas excretadas en medio de
mantenimiento para suspensiones celulares a los 14 d de cultivo. Los geles
fueron cargados con 250 ¡.Jg de proteína y teñidos con nitrato de plata . A) C.
arabica, se visualizaron 523 proteínas. B) C. canephora, se visualizaron 173
proteínas.
Figura 9. Perfil proteico las proteínas excretadas de C. arabica al medio de
cultivo en condiciones mantenimiento y en condiciones embriogénicas
observadas en un gel de poliacrilamida en segunda dimensión . El gel se cargó
con 250 ¡.Jg de proteína y fue teñido con nitrato de plata. A) 42 días en medio de
mantenimiento, se visualizaron 440 proteínas. B) 21 días en medio de
inducción, se contabilizaron 379 proteínas.
Figura 10. Perfil proteico las proteínas excretadas de C. arabica al medio de
cultivo en condiciones embriogénicas observadas en un gel de poliacrilamida en
segunda dimensión . El gel se cargó con 250 ¡.Jg de proteína y fue teñido con
nitrato de plata . A) 42 días en medio de inducción , se contabilizaron 409
54
57
proteínas. D) 98 días en medio de inducción, se contabilizaron 175 proteínas. 58
Figura 11. Análisis comparativo de las proteínas diferenciales en los diferentes
días de cultivo en las dos especie de Coffea, en estado embriogénico y no
embriogénico. A) C. canephora a los 14 días en condiciones no embriogénicas.
B) C. arabica a los 14 días en condiciones no embriogénicas. Las flechas rojas
representan la proteína presente en ese día y las flechas azules la ausencia de
esa proteína.
Figura 12. Análisis comparativo de las proteínas diferenciales en los diferentes
días de cultivo de las dos especie de Coffea , en estado embriogénico y no
embriogénico. A) C. arabica a los 42 días en condiciones no embriogénicas. B) ,
C. arabica en condiciones embriogénicas a los 21. Las flechas rojas
62
X
Índice de figuras
representan la proteína presente en ese día y las flechas azules la ausencia de
esa proteína.
Figura 13. Análisis comparativo de las proteínas diferenciales en los diferentes
días de cultivo de las dos especie de Coffea, en estado embriogén ico y no
embriogénico. A) C. arabica a los 42 días en condiciones no embriogénicas. B)
C. arabica a los 98 días en condiciones no embriogénicas. Las flechas rojas
representan la proteína presente en ese día y las flechas azules la ausencia de
esa proteína.
Figura 15. Análisis en 3D de las proteínas 6 y 10 presentes en el medio de
cultivo en condiciones embriogénicas y no embriogénicas de la especie C.
arabica reveladas en el gel de poliacrilamida, utilizando el software Melanie
63
64
lmage Master. A) 42 días en NE. B) 21 , C) 42, D) 98 días en ES. 68
Figura 16. Análisis en 3D de las proteínas 33, 35, 38 y 39 presentes en el
medio de cultivo en condiciones embriogénicas y no embriogénicas de la
especie C. arabica reveladas en el gel de poliacrilamida, utilizando el software
Melanie lmage Master. A) 42 días en NE. B) 21, C) 42, D) 98 días en ES. 69
Figura 17. Análisis en 3D de las proteínas 16 y 17 presentes en el medio de
cultivo en condiciones embriogénicas y no embriogénicas de la especie C.
arabica reveladas en el gel de poliacrilamida, utilizando el software Melanie
lmage Master. A) 42 días en NE. B) 21, C) 42, D) 98 días en ES. 70
xi
xii
•
Índice de cuadros
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Comparación de las proteínas presentes en el proceso
embriogénico y no embriogénico de las dos especies de Coffea en los
diferentes días del cultivo en el medio.
Cuadro 2. Análisis de las proteínas diferenciales en las dos especies de
Coffea , en los distintos días de cultivo, en condiciones no embriogénicas y
embriogénicas, indicándose la masa molecular (MM), el punto isoeléctrico
(p/) y el número otorgado a dicha proteína. (+) representa la presencia de la
proteína y(-) la ausencia de la proteína.
59
65
xiii
xiv
•
Resumen
Resumen
La embriogénesis somática (ES) se ha convertido en una herramienta de gran utilidad en
el estudio de los procesos celulares, bioquímicos y moleculares que se llevan a cabo
durante el desarrollo de los embriones. Sin embargo, este proceso no siempre es fácil de
reproducir en el laboratorio , ni todas las especies responden igual a él. El género Coffea
es un ejemplo de ello; las dos especies de importancia económica mundial de este género
presentan respuestas diferentes en su capacidad embriogénica. La especie C. arabica
produce embriones somáticos, pero en una cantidad muy pequeña comparada con el
número de embriones que se obtienen en la especie C. canephora. Diversos estudios han
demostrado que en estos sistemas se excretan proteínas que pueden funcionar como
promotores o inhibidores de diferentes procesos biológicos. El objetivo de este trabajo fue
analizar las proteínas secretadas al medio de cultivo y se utilizaron suspensiones
celulares de las dos especies de Coffea. Se utilizaron dos tipos de cultivos, uno para la
multiplicación de las células y otro para la inducción de la embriogénesis somática, los
días evaluados fueron 14 y 42 para condiciones no embriogénicas (NE) y 21 , 42, 98 para
la inducción de la ES. Se analizaron las proteínas secretadas en el medio de cultivo de
propagación y en el de inducción. En C. canephora se contabil izó un total de 173
proteínas a los 14 días. En C. arabica se contabilizaron 523 manchas a los 14 días y 440
manchas a los 42 días bajo condiciones no embriogénicas y 379, 409 y 175 proteínas en
condiciones embriogénicas. Se observaron proteínas que son exclusivas de las
condiciones embriogénicas y otras proteínas que lo son de la condición no embriogénica y
se encontraron proteínas que probablemente están involucradas en la inh ibición (1 1 y 12
kDa) y otras relacionadas a la ES (28, 32, 42 kDa) .
XV
•
xvi
•
Abstract
Abstract
The somatic embryogenesis (SE) has been used as an important tool for the study of
molecular events in plant cell differentiation . However, this process is not always feas ible
to obtain in the laboratory on several species. For instance, in the genus Coffea the two
economically important species, C. canephora and C. arabica showed different
embryogenic response. Both species produce somatic embryos. However, C. arabica had
a reduced number of embryos in comparison with the high production of somatic embryos
of C. canephora. Several studies have revealed that SE systems secrete a vast array of
proteins that could be involved in the regulation of this process. Several of these
molecules have been suggested as inductors and others as inhibitors of the process. In
the present work, suspension cultures of C. canephora and C. arabica were used to study
the population of the secreted proteins. Two types of cultures were used, one for the
multiplication of suspension cultures and another one for the induction of SE, the
evaluated days were 14 and 42 for non embryogenic conditions and 21 , 42, 98 for the
embryogenic cond ition . We analyzed the proteins secreted in the culture media, both
maintenance and somatic embryogenesis induction. In C. canephora medium 173 proteins
were founded after 14 days of culture. In C. arabica 523 and 440 proteins in the medium
were founded after 14 and 42 days, respectively under non embryogenic conditions. Under
embryogenic conditions we founded 379, 409 and 175 proteins after 21 , 42 and 98 days,
respectively. Proteins that are secreted exclusively under embryogenic conditions and
other under non-embryogenic conditions were observed. Proteins that are probably
involved in inhibition (11 and 12 kDa) and other related to the ES (28, 32 , 42 kDa) .
xvii
Introducción
INTRODUCCIÓN
El cultivo de tejidos de plantas juega un papel importante en la agricultura asistida por la
biotecnología. La producción de embriones somáticos a gran escala en biorreactores, la
producción de semilla sintética, la crioconservación, la variación somaclonal y la
transformación genética son las áreas de mayor importancia que se encuentran bajo
investigación 1. Sin embargo, los altos costos de la micropropagación limitan el uso de esta
aplicación a plantas ornamentales, a la forestería, etc. Cuando la embriogénesis somática
(ES) se integra con programas de mejoramiento genético convencional y técnicas de
biología celular y molecular provee un instrumento invaluable para el mejoramiento
genético de especies vegetales2.
La ES se ha convertido en una herramienta de gran utilidad en el estudio de los procesos
celulares, bioquímicos y moleculares que se llevan a cabo durante el desarrollo de los
embriones3. Sin embargo, este proceso no siempre es fácil de lograr en el laboratorio, ni
todas las especies responden igual a él. El género Coffea es un ejemplo de ello; las dos
especies de importancia económica mundial de este género presentan respuestas
diferentes en su capacidad embriogénica.
La especie C. arabica produce embriones somáticos, pero en una cantidad muy pequeña
comparada con el número de embriones que se obtienen en la especie C. canephora4 El
estudio de las causas bioquímicas y moleculares de una diferencia en la respuesta
embriogénica en el mismo género a la manipulación in vitro, puede permitirnos identificar
algunos de los factores involucrados en el proceso de diferenciación celular y aportar
elementos que nos permitan mejorar nuestra compresión de los procesos morfogénicos
que llevan a cabo las células vegetales, permitiendo de esta forma su manipulación
genética con fines de mejoramiento.
En el presente trabajo se analizaron las diferencias en los patrones proteicos de secreción
de las dos especies de Coffea bajo condiciones de inducción y no inducción a la
embriogénesis somática y el análisis de las proteínas que probablemente estén
•
Introducción
involucradas en el proceso embriogénico ya sea inhibiéndolo o promoviéndolo, ya que
hasta el momento se conocen muy pocas relacionadas a este proceso.
2
Introducción
REFERENCIAS
1. Santana-Buzzy,N., Rojas-Herrera,R., Galaz-Avalos,R.M., Ku-Cauich ,R. , Mijangos
Cortés,J ., Gutiérrez-Pacheco,L.C., Canto-Fiick,A. , Quiroz-Figueroa,F.R. , & Loyola
Vargas,V.M. Advances in coffee tissue culture and its practica! applications. In Vitro
Ce//. Oev. Biol. -Piant 43, 507-520 (2007).
2. Nguyen,Q.T., Kozai ,T. , Heo,J. , & Thai,D.X. Photoautotrophic growth response of in
vitro cultured coffee plantlets to ventilation methods and photosynthetic photon fluxes
under carbon dioxide enriched condition. Plant Ce// Tiss. Org. Cult. 66, 217-225
(2001) .
3. Stasolla,C. & Yeung,E.C. Recent advances in conifer somatic embryogenesis:
improving somatic embryo quality . Plant Ce// Tiss. Org. Cult. 74, 15-35 (2003) .
4. Quiroz-Figueroa,F.R. , Fuentes-Cerda,C.F.J. , Rojas-Herrera,R. , & Loyola-
Vargas,V.M. Histological studies on the developmental stages and differentiation of
two different somatic embryogenesis systems of Coffea arabica. Plant Ce// Rep. 20,
1141-1 149 (2002).
3
•
Introducción
4
•
1.1 El cafeto
Capítulo 1
ANTECEDENTES
Capítulo 1
El café actualmente constituye uno de los productos comerciales de mayor importancia en
el ámbito internacional y es el cultivo perenne más extendido en las regiones tropicales
puesto que es cu ltivado en 80 países del mundo, obteniéndose la mayoría de la
producción de pequeños granjeros 1 .
El género Coffea comprende más de 100 especies, entre las que destacan Coffea arabica
y Coffea canephora, las cuales se cultivan en diversos países de América, África y Asia .
C. canephora (2n = 22) variedad Robusta constituye la segunda especie en importancia
económica, no sólo por el volumen de producción sino por el área cultivable. Cabe
mencionar que esta variedad posee un alto grado de resistencia al estrés hídrico y a las
temperaturas elevadas, así como a las enfermedades2; además, tiene un gran contenido
de cafeína, siendo ampliamente utilizada para la producción de café soluble. C. arabica
(2n = 44), es menos resistente a las enfermedades, pero produce una bebida de muy
buena calidad y se cultiva en regiones elevadas.
Desde hace varios años, el mejoramiento de los cafetos ha estado orientado hacia la
creación de híbridos interespecíficos para enfrentar los problemas que amenazan a la
cafeticultura . La tendencia actual es la creación de híbridos intra e interespecíficos, con
exigencias agronómicas y ecológicas similares o mejores a las variedades comerciales.
La creación de una variedad estable utilizando el cultivo convencional, necesita alrededor
de 30 años3. Frente a este plazo tan largo y debido a problemas fitosanitarios importantes
existentes o potenciales, varios países productores se han visto en la necesidad de
implementar nuevos métodos para la producción de café, ya sea por métodos
tradicionales o con el empleo de nuevas tecnologías. La aplicación de métodos
biotecnológicos (embriogénesis somática , microesquejes, cultivo en biorreactores, etc.) en
este cultivo posibilitan la multiplicación a gran escala de los genotipos seleccionados4•5
.
5
•
Capítulo 1
1.2 Embriogénesis somática
La regeneración de plantas en cultivo de tejidos se produce a través de dos procesos de
desarrollo morfológicamente divergentes: (a) la organogénesis (brotes y raíces) y (b) la
embriogénesis somática (ES)6. La organogénesis comprende el desarrollo de yemas o de
meristemos radiculares directamente a partir de los explantes o a partir de los callos. Para
que la organogénesis ocurra a partir de un callo, se debe producir cambios que
conduzcan a la organización celular. Thorpe7 propuso que este proceso involucra
diferenciación e interacción celular y reacción a señales específicas. El termino
organogénesis de novo se refiere en el cultivo de tejidos a la diferenciación dentro del
explantel La capacidad morfogénica de algunos tejidos puede pasar desapercibida
debido a la asociación de éstos con tejidos diferenciados que están dentro de un sistema
organ izado. En contraste, la organogénesis a partir de callos subcultivados no ocurre
generalmente en asociación con las estructuras preexistentes. En algunas especies se
producen ambos procesos regenerativos, mientras que en otros, la morfogénesis ocurre
preferentemente por uno de los dos procesos.
La ES el proceso mediante el cual las células somáticas, bajo condiciones de inducción
genera células embriogénicas, las cuales sufren una serie de cambios morfológicos,
bioqu ímicos y moleculares produciendo embriones somáticos8-10
. Estas estructuras son
capaces de crecer y formar plantas normales11; sin embargo, tanto in vivo como in vitro
pueden ocurrir algunas anormalidades durante el desarrollo. Estos embriones se
caracterizan porque no provienen de la fusión de los gametos. Es un proceso semejante
al de la embriogénesis cigótica, pero aquí solo una o un grupo de células somáticas son
los precursores de los embriones 12
La ES presenta ventajas sobre la embriogénesis cigótica como modelo de estudio, ya que
en la ES se puede manipu lar una gama muy diversa de factores, tanto del medio de
cultivo como de las condiciones de incubación. Factores como las fuentes de nitrógeno y
carbono, la concentración y el tipo de reguladores del crecimiento, la temperatura y
régimen de luz bajo las cuales se incuban los explantes y el gran número de embriones
que pueden ser obtenidos8·13
, así como la presencia de diversas sustancias secretadas
6
Capítulo 1
por las mismas células en cultivo juegan un papel central en la inducción de la ES y en el
posterior desarrollo de los embriones somáticos y su establecimiento como plantas
vigorosas.
La ES puede usarse como herramienta para la propagación clonal. Cuando se integra con
programas de mejoramiento genético convencional y técnicas de biología celular y
molecular, provee una invaluable herramienta para el mejoramiento genético de especies
de cultivos comerciales 13.
1.3 Embriogénesis somática directa e indirecta
Se pueden distingu ir dos patrones generales de desarrollo de la ES: (a) ES directa y (b)
ES indirecta. En la ES directa, los embriones se originan directamente del explante sin
que haya proliferación de callo 14 y la ES indirecta, cuando los embriones se obtienen de
un tejido embriogénico desdiferenciado (callo) . La embriogénesis directa procede de
células proembriogénicas determinadas, mientras que la embriogénesis indirecta requiere
de la rederterminación de células desdiferenciadas de la proliferación de callo y de la
inducción de células embriogénicas determinadas. Se ha especulado que las células
proembriogénicas determinadas requieren de la síntesis de una sustancia inductora o de
la eliminación de una sustancia inhibidora para reanudar su actividad mitótica y su
desarrollo embriogénico. La primera caracterización de embriogénesis de baja y alta
frecuencia fue llevado a cabo por Sondahl et al. , 15.
La ES esta dividida en dos fases: inducción y expresión . La fase de inducción es la más
importante del proceso. La inducción incluye dos etapas, la primera de ellas, es la
desdiferenciación de la célula somática o especializada en una célula no diferenciada. La
fase de expresión corresponde a la evolución de las masas proembriogénicas, células
embriogénicas o células predeterminadas en embriones somáticos 16. La fase de inducción
requiere de la presencia de reguladores del crecimiento exógenos, especialmente auxinas
o combinaciones de auxina-citocinina. La fase de expresión es estimulada por una
disminución de la concentración de auxina en el medio. Halperin y Welherell17
caracterizaron el "choque auxínico" como el estímulo decisivo de la ES. Bajo la presencia
7
•
Capítulo 1
continua de la auxina, las masas proembriogénicas sintetizan todos los productos de los
genes necesarios para completar el estadio globular. Muchos cultivos de zanahoria son
capaces de desarrollar embriones globulares pero sólo en presencia de auxina 17 y se ha
demostrado que lo embriones son capaces de sintetizar su propia auxina 18
La ES es un sistema modelo para el estudio de los aspectos moleculares durante el
desarrollo de las plantas. Varios estudios han demostrado que en estos sistemas se
secretan proteínas que pueden funcionar tanto como promotores 19·20 o inhibidores21
·22 en
diferentes procesos biológicos.
1.4 Embriogénesis somática en Coffea spp.
Para la regeneración in vitro de café se ha utilizado como herramienta a la ES, y el primer
reporte de la ES en C. canephora fue publicado por Staritsky23 y en C. arabica por
Sóndahl y Sharp (1977). Aunque algunos estudios reportan el origen de las células
embriogénicas, muchos de los principios del proceso del desarrollo de la ES del café
siguen siendo poco claros, especialmente los relacionados con la regulación de la
inducción de la ES y los factores que modifican los patrones de desarrollo de los
embriones somáticos 14·24
·2s.
Para inducir la ES en el café se han utilizado tejidos tales como ramas ortotrópicas y
plagiotrópicas26, hojas 14
·27
, tegumento ovular8, anteras29 y perispermo30
. Las hojas son
hasta ahora la fuente de explantes más utilizada debido a la gran accesibil idad durante
todo el año y pueden ser fácilmente obtenidas en diferentes estadios de desarrollo.
Hatanaka et a/. ,31 reportaron un método simple, fácil y rápido para la inducción de la ES
directa en C. canephora , obteniendo embriones diferenciados 8 semanas después de la
inducción en secciones de hoja.
Se ha inducido callo embriogénico de café de explantes pertenecientes a diversas
especies. Se ha observado que la proliferación de callo se produce durante los primeros
25 días de cultivo25·32
. Berthouly33 observó que las células perivasculares de los haces
vasculares de las hojas, así como las células del mesófilo son las primeras en dividirse.
En la zona de la herida se observa una rápida división celular en todos los tipos de
explantes estudiados, que dan origen a la generación del callo. Durante los primeros días,
8
•
Capítulo 1
el callo está formado principalmente de células meristemáticas; a medida que crecen
comienzan a diferenciarse y adquirir características similares a las células del
parénquima. Las agrupaciones de las células embriogénicas se pueden ver en la periferia.
Estas células producen hasta cinco veces más proteína que las célu las no
embriogénicas34.
La composición del medio de cultivo juega un papel importante en el cultivo in vitro35. Se
han desarrollado una gran cantidad de fórmulas para la regeneráción de plantas por
medio de la ES, sin embargo, en café, como en la mayoría de las especies, se ha util izado
el medio desarrollado por Murashige y Skoog36 o las modificaciones de esta formulación 11.
Sóndahl y Sharp37, reportaron la embriogénesis en C. arabica, usando secciones de
diferentes órganos de plantas en medio MS en el que adicionaron diferentes
concentraciones de auxinas y citocininas. Sin embargo la ES puede inducirse solamente
con citocininas38. Fuentes-Cerda et a/., 39 reportaron que al aumentar la concentración tota l
de nitrógeno, la respuesta a la embriogénesis somática disminuye, mientras que al
disminuir la concentración de nitrógeno la respuesta embriogénica de C. arabica aumenta.
Fuentes et a/., 40 demostraron el efecto del AgN03 sobre la inducción de la embriogénesis
somática en C. canephora, que a concentraciones de 30-60 ~M de AgN03, la producción
de embriones incrementa, mientras que a concentraciones mayores tiene un efecto
negativo. Estos resultados sugieren que el etileno está involucrado en la respuesta
embriogénica.
En el cafeto , el desarrollo de embriones somáticos es continuo, sin embargo, histológica y
morfológicamente se puede identificar los diferentes estadios de desarrollo. Estos
estadios incluyen el preglobular, globular, oblongo, corazón , torpedo y el cotiledonar14.
1.5 Cultivos de suspensiones celulares
En las últimas décadas se han desarrollado diferentes sistemas para el cultivo de
suspensiones celulares, que es un método eficiente para mantener y propagar células
vegetales. Las suspensiones celu lares consisten en células libres y agregados celulares
distribuidos en un medio líquido en movimiento y deben ser mantenidas mediante
9
•
Capítulo 1
suministro continuo de nutrientes41. Este tipo de cultivo ofrece múltiples ventajas: la tasa
de crecimiento es mayor que en un medio semi-sólido, se puede tener un mejor control de
los componentes del medio de crecimiento, el efecto de cualquier sustancia que se añada
es más evidente, pues la mayoría de las células están rodeadas por el medio y
generalmente el material es fisiológicamente más uniforme. Las suspensiones celulares
se inician generalmente mediante la incubación de trozos de callos friables. El mejor
inócu lo para la iniciación de las suspensiones celulares es sin duda un callo friable con un
alto ritmo de división celular. Sin embargo, a veces es necesario utilizar otros tipos de
callos y en esos casos hay que realizar procesos para romper los agregados grandes.
Para estos casos se puede apelar a medios mecánicos, como el uso de frascos con
deflectores o el filtrado42, la adición de pectinasas y celulasas al medio de cultivo también
puede reducir el tamaño de los agregados celulares. La selección de células aptas para
crecer en suspensiones celulares se puede efectuar en un medio sólido, mediante el
plaqueo de una suspensión recién comenzada para continuar únicamente con la
suspensión de colonias celulares friables y de rápido crecimiento43.
En su inicio, las suspensiones celulares constan de grandes agregados y de células
libres, alargadas que no se dividen pero después de subcultivarlas varias veces es factible
obtener una suspensión celular finamente dispersa con un ritmo de crecimiento elevado.
Para mantener las suspensiones celulares se pueden usar diferentes sistemas de cultivo,
los cuales se pueden clasificar básicamente en tres tipos: cerrados, continuos cerrados y
conti nuos abiertos. En los cultivos cerrados, las células producidas se quedan en el medio
y de esta manera se produce un aumento en la densidad celular. Al alcanzar la
suspensión la fase estacionaria, se toman fracciones de ella para subcultivarlas en un
medio fresco nuevo y reiniciar de esta manera el ciclo de crecimiento. En los continuos
cerrados, se suministra a la solución medio fresco en forma continua y simultáneamente
se retira el medio usado. En el continuo abierto hay un suministro de medio fresco pero el
medio utilizado sale junto con las células41.
La presencia de una fase de proliferación en suspensiones embriogénicas, aumenta
fuertemente las potencialidades del proceso de ES44. Los callos se pueden multiplicar a
largo plazo, lo que permite aumentar la tasa de multiplicación del proceso. Asimismo,
10
•
Capítulo 1
durante el crecimiento en un medio líquido las células están inmersas en el medio de
cultivo y por ende expuesto a los nutrientes, reguladores de crecimiento, etc. , lo cual
permite una mayor precisión y uniformidad en la aplicación de las diferentes condiciones
de cultivo, facilita la manipulación de las células y embriones y permite un mejor
seguimiento de su desarrollo. En las suspensiones celulares, los agregados, pro
embriones y embriones están usualmente separados unos de otros flotando libremente en
el medio, por lo que se puede remover fácilmente y traspasar a un medio sólido para la
regeneración de plantas45. Zamarripa et a/.,46 realizaron experimentos sobre los sistemas
de cultivos de suspensiones celulares embriogénicas de café, encontrado que podría ser
un sistema excelente para la propagación de este cultivo.
1.6 Compuestos excretados por los cultivos vegetales
Se ha desarrollado un gran esfuerzo en determinar el tipo de compuestos que las
suspensiones celulares liberan al medio de cu ltivo. Entre éstos ahora pueden enlistarse
polisacáridos, aminoácidos, reguladores del crecimiento, vitaminas, compuestos de baja
masa molecular, polipéptidos, proteínas, etc47. Se desconoce cuál es la función de las
proteínas en el medio de cultivo, sin embargo, se puede especular que una posible
función es la modificación de los polímeros de la pared celular, ya que algunos de estos
compuestos provienen de la pared celular, mientras que otros provienen del interior de la
célula. Por otro lado, se ha observado que estas moléculas juegan un importante papel en
el desarrollo de la ES ya sea como inductores o inhibidores48·49
. Estos compuestos
extracelulares pueden ser clasificados como de baja o alta masa molecular.
1.6.1 Compuestos involucrados en la inhibición de la embriogénesis somática
Los compuestos de baja masa molecular excretados al medio de cultivo pueden inh ibir50'51
o estimular52·53 la ES. Por ejemplo, se ha observado que la ES en zanahoria no avanza a
densidades celulares elevadas54·55
, y Higashi et a/.,50 demostraron que el efecto inhibitorio
no se debe al consumo de nutrientes o a algún daño mecánico causado por la agitación .
Los factores responsables para el efecto inhibitorio se encontraron en el medio de cultivo
y sus masas moleculares se encuentran por debajo de 3.5 kDa. Más tarde, uno de esos
11
•
Capítulo 1
factores fue purificado e identificado como el alcohol 4-hidroxibencílico, el cual es el
principal factor responsable de la inhibición de la ES a densidades celulares elevadas5s_
Recientemente se identificó otro factor presente en cultivos creciendo a elevadas
densidades: el vanilil benci l éter. Este compuesto inhibe la ES en Larix leptolepis,
especialmente el desarrollo del suspensor51. Gavish et a/}1
, utilizando como modelo de
estudio cultivos de Citrus aurantium, determinaron que el desarrollo normal de los
embriones somáticos depende de manera obligatoria de la ausencia de proteínas
glucosiladas de entre 53 y 57 kDa. Por otro lado, Coutos-Thevenot et a/.,57, trabajando con
suspensiones celulares de un híbrido de uva, evidenciaron el mismo efecto inhibitorio en
la ES, concluyendo que son las moléculas extracelulares mayores de 1 O kDa las
involucradas en esta inhibición ; posteriormente se demostró que fue un mecanismo
proteolítico el implicado en su inhibición22.
1.6.2 Compuestos involucrados en la embriogénesis somática
La interacción de las células y el medio extracelular juegan un papel importante durante el
desarrollo de los organismos multicelulares. La estructura y la composición qu ímica de la
pared celular son modificadas considerablemente durante el desarrollo de la planta , por la
síntesis, la acumulación, modificación y degradación de algunos polímeros de la pared
celular. Se ha sugerido que algunos de estos cambios, como los callos y el depósito de
quitina o la expresión de algunas arabinogalactoproteínas, son factores determinantes
para el desarrollo de los eventos morfogénicos durante el desarrollo de la planta58-60
.
En plantas cultivadas in vitro la inducción a la morfogénesis está ligada a la aparición de
un material fibroso en la superficie de las células de los explantes inducidos. El primer
reporte fue en células proembrionarias de C. arabica15 y después durante la formación
proembrionaria de Cichorium61, Drosera rotundifolia y Zea mays62
, Pinus nigra63, Papa ver
somniferum64, Cocos nucifera65 y recientemente en Fagopyrum tataricum66 y Drosera
spathulata67.
12
•
Capítulo 1
La mayoría de las especies vegetales cultivadas in vitro excretan proteínas al medio de
cultivo. Entre las proteínas excretadas por los cultivos se han detectado actividades
enzimáticas de peroxidasa68, fosfatasa69
, fumarasa70, estearasa71
, proteasa72, a
manosidasa y de ¡3-1 , 3-glucanasa73, quitinasa74
. También se han identificado proteínas
tales como inhibidores de proteasas75·76
, una proteína del tipo de la extensina77, proteínas
relacionadas con choque térmico78, una proteína transferidora de lípidos79
, así como
arabinogalactoproteínas80. La mayoría de las proteínas excretadas al medio de cultivo
pertenecen al grupo de proteínas relacionadas con los mecanismos' de defensa de las
plantas. De las proteínas extracelulares las que más se han estudiado han sido las
peroxidasas81.
La mutante de zanahoria ts11, sensible a la temperatura, ha sido una de las mayores
fuentes de información del papel de las proteínas excretadas al medio de cultivo durante
la ES. Esta mutante que fue generada por mutagénesis química82, produce embriones
somáticos a 24°C, en tanto que a 32°C el desarrollo de los embriones somáticos se
detiene en el estadio globular. Sin embargo, cuando se le agregan las proteínas
excretadas al medio de cultivo por las células cultivadas a 24oC se restaura el desarrollo
de los embriones somáticos, iniciando con la formación del protodermo, de esta forma los
embriones son capaces de pasar del estadio globular y completar su ciclo de
desarrollo83·85
. Una de las proteínas presentes en el medio condicionado fue una
endoquitinasa ácida (EP3), una proteína glucosilada de 32 kDa, la cual fue purificada del
medio de cultivo y es la encargada de restablecer la ES84. Experimentos adicionales han
mostrado que el fenotipo ts11 tiene un mecanismo defectuoso relacionado con la
secreción de esta quitinasa86.
Los cultivos de zanahoria excretan diversas proteínas en ·el medio, proceso que
contribuye al acondicionamiento del mismo. Se ha reportado que el condicionamiento
tiene un efecto que promueve la ES87. El inicio de la ES resulta de los cambios
importantes del patrón proteico extracelular comparado con las proteínas intracelulares88.
Algunas proteínas excretadas podrían estar relacionadas con la formación de células
embriogénicas y embriones somáticos. Las proteínas extracelulares de células
embriogénicas en suspensiones celulares se han observado para varias especies. En
13
•
Capítulo 1
zanahoria, por ejemplo, la ES depende de la presencia de proteínas glucosiladas89·90
.
Entre las proteínas que tienen la capacidad de promover la ES se ha identificado una
peroxidasa, la que es capaz de restablecer la capacidad embriogénica inhibida por la
tunicamicina en suspensiones celulares de D. carota. Esta peroxidasa fue purificada del
medio de cultivo de las líneas silvestres o sin tratamiento con tunicamicina, tiene un punto
isoeléctrico de 7.6 y una masa molecular de 38 kDa91.
La posible función en la ES de las proteínas extracelulares proviene de las siguientes
observaciones: 1) la velocidad de adquisición del potencial embriogénico de células de
hipocotilo de D. carota aumenta considerablemente por la adición de proteínas
extracelulares de una suspensión embriogénica ya establecida88. 2) El defecto en la ES en
líneas celulares con bajo potencial o líneas celulares no embriogénicas puede ser
parcialmente restablecido por la adición de los componentes secretados por líneas
celulares embriogénicas88 En O. carota se ha reportado que el medio de cultivo de los
embriones somáticos pueden promover la ES. Se observó que los cultivos embriogénicos
excretan algunas proteínas específicas que modifican la diferenciación de embriones y
que podían ser utilizadas para caracterizar el potencial embriogénico de diferentes líneas
celulares88·90
. En cultivos de suspensiones celulares de D. carota, Cucumis sativus, V.
vivifera y H. vulgare se ha observado la presencia de proteínas extracelulares específicas
durante la ES57·92
·93
. En H. vulgare se han encontrado 50 polipéptidos, secretados por
suspensiones celulares embriogén icas durante el crecimiento indiferenciado de las
células, los cuales pueden ser agrupados por etapas: a) proteínas expresadas
constitutivamente, b) proteínas que aumentan en concentración durante la ES, e)
proteínas que disminuyen en concentración durante la ES, d) proteínas asociadas con el
tipo de cultivo usado durante la ES, e) proteínas que aumentan durante el crecimiento
indiferenciado sin subcultivo92.
Durante la ES los mayores cambios ocurren en las proteínas de membrana o las que son
excretadas al medio. Se han aislado genes que codifican para proteínas extracelulares
que han sido denominadas: EP1 , EP2, EP3, EP4 y EP5, las cuales influyen sobre el
desarrollo de la ES84·94
. Por ejemplo, se ha aislado una proteína extracelular (EP1 ), que
solamente es excretada por células no embriogénicas89. Sterk et a/.,79 reportaron que otra
14
•
Capítulo 1
proteína extracelular (EP2), la que ha sido identificada como una proteína transferidora de
lípidos, solamente es sintetizada por células embriogénicas y embriones somáticos. EP3-
1 y EP3-2 fueron purificadas y mostraron que tienen diferentes efectos en la formación de
embriones somáticos95.
Para determinar si las proteínas excretadas están directamente involucradas en el
desarrollo de los embriones somáticos, se han desarrollado dos sistemas. En el primero
de estos se usa un antibiótico, la tunicamicina, el cual inhibe la N-gluéosilación de las
proteínas. Su uso inhibe el desarrollo del embrión somático y lo detiene en el estadio
globular. Esta inhibición puede ser revertida por la adición de proteínas glucosiladas al
medio de cultivo90. Con base en la observación de que las células embriogénicas
pequeñas se expanden en presencia de tunicamicina y en la observación de que la
actividad de peroxidasa evita dicha expansión, se ha propuesto un modelo que sugiere
que la restricción en el tamaño de las células por la peroxidasa es un requisito importante
para el éxito de la ES96. El segundo ensayo se basa en la observación de que el
desarrollo de la mutante temperatura sensible (ts11) de las células de zanahoria se
detiene en el estadio globular cuando se eleva la temperatura a 32°C, pero a 24°C el
proceso embriogénico pasa por los diferentes estadios de desarrollo. Sin embargo,
cuando se le agregan las proteínas secretadas al medio de cultivo de las células
cultivadas a 24°C a una línea celular no embriogénica, se observó que la etapa de
desarrollo llegaba hasta la etapa de torpedo, lo que resulta la inducción de la etapa de
desarrollo embriogénico y por lo tanto hasta la formación de plántulas83.
A las proteínas de tipo estructural también se les ha implicado en varios procesos de
diferenciación celular, entre estos la ES97. Kreuger y Van Holst60
, observaron que las
líneas celulares en medio líquido excretan un grupo característico de
arabinogalactoproteínas (AGPs), la composición de éstas cambia con la edad del cultivo98.
Estas constituyen una clase abundante de proteínas glucosiladas, las cuales se
caracterizan por una compleja estructura de carbohidratos, la cual es regulada durante la
ontogénesis de la planta. Las AGPs pertenecen a la familia de las proteínas ricas en
hidroxiprolina, la cual también incluye a las proteínas ricas en prolina y lecitinas. Las
AGPs se encuentran en diferentes taxones de plantas superiores80. La adición de AGPs a
15
Capítulo 1
líneas celulares no embriogénicas promueve la inducción del potencial embriogénico98,
mientras que otro grupo de AGPs no afecta el proceso99. Egertsdotter et a/., 20
, usando
como modelo de estudio al abeto (Picea abies), determinaron que la adición de proteínas
extracelulares de una línea embriogénica normal a una línea embriogénica anormal, tiene
la capacidad de restaurar la morfología de los embriones y que entre las proteínas activas
se encuentran las AGPs.
Las AGPs pueden estar en la pared celular, fuera del plasmalema, en vacuolas, en los
espacios intramembranales o en diferentes secreciones. La participación de las AGPs en
la regu lación de las ES y cigótica se ha empezado a conocer100. Las propiedades físicas
de las AGPs dependen de las estructuras de los polipéptidos y de sus sustituyentes. La
falta de información con respecto a los carbohidratos ligados a estas proteínas y la
organización de estas moléculas, hace difícil predecir sus características físicas. Los
polipéptidos varían de tamaño y pueden constar de una sola cadena o de varios péptidos
entrecruzados.
Existe una correlación entre la secreción de quitinasa en cultivos in vitro de P. abies y la
habilidad de las masas proembriogénicas para formar embriones somáticos 101. Toonen et
a/.,99 propusieron la existencia de células nodriza, las cuales podrían producir los factores
que promueven la ES; el desarrollo de tales células podría ser estimulado por las AGPs.
Pennell et a/.,97 y McCabe et a/., 102 localizaron un epítope, reconocido por el mAb JIM8, en
la pared celular de ciertas células embriogénicas y ausente en células no embriogénicas,
que puede ser usado como un marcador temprano de la ES. Además, cultivos con células
negativas a JIM8 producen embriones cuando se transfieren a un medio condicionado
proven iente de un cultivo con células positivas para JIM8. La única diferencia entre ambas
poblaciones fue la presencia de un tipo celular en la iínea embriogénica. Doman et a/., 103
reportaron que las AGPs podrían generar una molécula señal similar a un oligosacárido a
través de la acción de una quitinasa. En café se ha detectado quitinasa durante la
embriogénesis somática 104. Se sabe que las leguminosas producen quitinasas durante la
interacción con Rhizobium sp. y se ha sugerido que actúan como control de la actividad
biológica de los factores Nod y por ende de la morfogénesis y la división celular105. Varios
de los genes de las quitinasas son inducidos por una infección superficial en la planta . La
16
Capítulo 1
ruta de señalización de los mecanismos moleculares responsables para esta inducción
aún no es clara 106. La respuesta de la planta a la infección involucra respuestas no
específicas provocadas por diferentes patógenos que pueden inducir la producción de
algunas proteínas relacionadas con la patogénesis. La quitinasa cataliza la hidrólisis de
los enlaces ¡3-1, 4 de la quitina, un polímero de N-acetil-0-glucosamina. En búsqueda de
una planta con derivados de sustrato para quitinasa Van Hengel et a/.,107 demostraron que
las AGPs en suspensiones celulares embriogénicas, contienen N-acetil-0-glucosamina y
tienen sitios para la acción de una endoquitinasa.
Sticher et al., 108 utilizaron suspensiones celulares de tabaco y medios de cultivo con una
composición diferente de reguladores del crecimiento para demostrar que las quitinasas
de clase 1 se local izan en la vacuola y no se acumulan en el medio. Esto sugiere que la
localización celular de las quitinasas de clase 1 podría depender de la fuente de la
suspensión celular, la composición de reguladores del crecimiento en el medio o de
ambos factores.
Las estearasas se ha visto estar involucradas en el proceso de germinación de los
embriones somáticos en cereales 109·110
. Se ha reportado la presencia de proteínas
extracelulares en un amplio número de especies vegetales cultivadas in vitro, como por
ejemplo Hordeum vulgare92; se ha reportado una concentración de proteína en el medio
de hasta 105 1-Jg . mL-1en el día de transferencia , mientras que la concentración en el día
25 de inducción de la ES fue de 225 IJg. mL-1 . En suspensiones celulares de Solanum
tuberosum111 se ha reportado la presencia de proteínas extracelulares y su aumento con
la edad del cultivo. Un comportamiento similar se ha observado en Raphanus sativus112.
En suspensiones celulares de C. arabica se ha reportado que durante el cultivo de una
línea celular, la acumulación de proteína extracelular alcanzó una concentración de 63 1-Jg.
mL-1 en el día 24, iniciándose la secreción de una manera lenta, pero ésta aumentó
rápidamente después del día 12 de cultivo. Un comportamiento similar se observó durante
el período de inducción de la ES. Las diferencias notadas en la concentración de la
proteína extracelu lar entre las diferentes especies podría deberse a la especie, a la
densidad del inócu lo inicial , a las características de los agregados celulares y/o al estadio
17
•
Capítulo 1
fisiológico de los cultivos. El análisis del patrón proteico realizado en C. arabica, obtenido
por separación en geles de poliacrilamida de una dimensión, reveló diferencias mínimas
cualitativas. La poza de proteínas estuvo compuesta por polipéptidos con masas
moleculares de entre 15 y 61 kDa, conformada principalmente por proteínas de baja masa
molecular113.
En varias especies de plantas se ha detectado proteínas que pudieran servir como
posibles marcadores de la ES. Sin embargo, solamente en pocos casos se ha
demostrado una verdadera relación entre las proteínas detectadas y este proceso, y los
resultados obtenidos por diferentes grupos de investigación indican que sólo unas pocas
proteínas intervienen en la embriogénesis. En este trabajo se evaluarán los diferentes
patrones proteicos de las proteínas excretadas al medio de cultivo de las dos especies, en
condiciones embriogénicas y no embriogénicas y se observarán las diferencias entre
ambas, ya que una (C. canephora) produce una mayor cantidad de embriones comparada
con la otra (C. arabica) que produce una cantidad muy baja.
18
•
Capítulo 1
1.9 Objetivo general
Evaluar el perfil proteico de las proteínas que son excretadas al medio de cultivo por las
células cultivadas in vitro de las especies C. canephora y C. arabica.
2. Objetivos particulares
• Establecer una línea de suspensiones celulares para cada especie' de Coffea spp.
• Inducir a la ES en Coffea spp. a partir de suspensiones celulares.
• Rea lizar el análisis electroforético de las proteínas excretadas por los cultivos de
Coffea spp.
• Evaluar y comparar las proteínas diferenciales reveladas por los análisis
electroforéticos de los días evaluados.
19
•
Capítulo 1
REFERENCIAS
1. Vinod,K., Naidu ,M.M., & Ravishankar,G.A. Developments in coffee biotechnology
in vitro plant propagation and crop improvement. Plant Ce// Tiss. Org. Cult. 87, 49-
65 (2006) .
2. Bertrand,B., Peña-Durán,M .X., Anzueto,F., Cilas,C. , Etienne,H., Anthony,F., &
Eskes,A. B. Genetic study of Coffea canephora coffee tree resistance to
Meloidogyne incognita nematodes in Guatemala and Meloidogyne sp. nematodes
in El Salvador for selection of rootstock varieties in Central America. Euphytica
113, 79-86 (2000).
3. Carneiro,M.F. Coffee biotechnology and its application in genetic transformation .
Euphytica 96, 167-172 (1997) .
4. Montes,S. , Martínez,M., Rojas,R. , Santana,N. , & Cuba,M . Obtención de embriones
somáticos a partir de suspensiones celulares de Coffea canephora variedad
Robusta. Cultivos Tropicales 16, 77-81 (1995).
5. Nguyen,Q.T., Kozai ,T., Heo,J., & Thai ,D.X. Photoautotrophic growth response of in
vitro cultured coffee plantlets to ventilation methods and photosynthetic photon
fluxes under carbon dioxide enriched condition . Plant Ce// Tiss. Org. Cult. 66, 217-
225 (2001 ).
6. Reinert,J., Bajaj,Y.P.S ., & Zbeii ,B. in Plant tissue and cell culture. Botanical
monographs Vol. 11 , Vol. 11, Edn . 2. ed. Street,H .E. 389-427 (University of
California Press, Berkeley; 1977).
7. Thorpe,T.A. in Perspectives in plant cell and, tissue culture. ed. Vasii ,I. K. 71-111
(Academic Press, Nueva York; 1980).
8. Komamine,A. , Murata,N., & Nomura,K. Mechanisms of somatic embryogenesis in
carrot suspension cultures - morphology, physiology, biochemistry, and molecular
biology. In Vitro Ce/l. Dev. Biol. -Piant 41, 6-1 O (2005) .
20
Capítulo 1
9. Quiroz-Figueroa,F.R. , Rojas-Herrera,R., Galaz-Avalos,R.M. , & Loyola-Vargas,V.M.
Embryo production through somatic embryogenesis can be used to study cell
differentiation in plants. Plant Ce// Tiss. Org. Cult. 86, 285-301 (2006).
1 O. Zimmerman,J .L. Somatic embryogenesis: A model for early development in higher
plants. Plant Ce/15 , 1411-1423 (1993) .
11 . Litz,R.E. & Jarret,R.L. in Cultivo de tejidos en la agricultura . • Fundamentos y
aplicaciones, Edn . 1. eds. Roca,W.M. & Mroginski,L.A. 143-172 (Centro
Internacional de Agricultura Tropica, Colombia ; 1991 ).
12. Ammirato,P.V. in Handbook of plant cell cu lture. vol. l. Techniques for propagation
and breeding. eds. Evans,D.A., Sharp,W.R., Ammirato,P.V. , & Yamada,Y. 82-123
(Macmillan , New York; 1983).
13. Stasolla,C. & Yeung,E.C. Recent advances in conifer somatic embryogenesis:
improving somatic embryo quality. Plant Ce// Tiss. Org. Cult. 74, 15-35 (2003) .
14. Quiroz-Figueroa,F.R., Fuentes-Cerda,C.F.J., Rojas-Herrera,R. , & Loyola-
Vargas,V.M. Histological studies on the developmental stages and differentiation of
two different somatic embryogenesis systems of Coffea arabica. Plant Ce// Rep.
20, 1141-1149 (2002).
15. Sondahi,M .R. , Spahlinger,D., & Sharp,W.R. A histological study of high frequency
and low frequency induction of somatic embryos in cultured leaf explants of Coffea
arabica L. Z. Pflanzenphysiol. 94, 101-108 (1979) .
16. Jimenez,V.M. & Bangerth ,F. Endogenous hormone levels in explants and in
embryogenic and non-embryogenic cultures of carrot. Physiol. Plant. 111, 389-395
(2001 ).
17. Halperin ,W. & Wethereii ,D.F. Ammonium requirement for embryogenesis in vitro.
Nature 205, 519-520 (1965) .
18. Michalczuk,L. , Cooke,T.J., & Cohen ,J.D. Auxin levels at different stages of carrot
somatic embryogenesis. Phytochemistry 31, 1097-1103 (1992).
21
•
Capítulo 1
19. De Vries,S.C. Making embryos in plants. Trends Plant Sci. 3, 451-452 (1998).
20. Egertsdotter,U. & Von Arnold,S . lmportance of arabinogalactan proteins for the
development of somatic embryos of Norway spruce (Picea abies) . Physiol. Plant.
93, 334-345 (1995) .
21 . Gavish ,H., Vardi,A. , & Fluhr,R. Suppression of somatic embryogenesis in Citrus
cell cultures by extracellular proteins. Planta 186, 511-517 (1992).
22. Maes,O., Coutos-Thévenot,P., Jouenne,T. , Boulay,M., & Guern,J. lnfluence of
extracellular proteins, proteases and protease inhibitors on grapevine somatic
embryogenesis. Plant Ce// Tiss. Org. Cult. 50, 97-105 (1997) .
23. Staritsky,G. Embryoid formation in callus tissues of coffee. Acta Bot. Need. 19,
509-514 (1970).
24. Michaux-Ferriére,N ., Dublin,P., & Schwendiman,J. Étude histologique de
l'embryogenése somatique a partir d'explants foliaires de Coffea arabica L. Café
Cacao Thé 31, 103-111 (1987) .
25. Michaux-Ferriére,N., Bieysse,D., Alvard,D., & Dublin,P. Étude histologique del
l'embryogenése somatique chez Coffea arabica, induite par culture sur milieux
uniques de fragments foliaires de génotypes différents. Café Cacao Thé 33, 207-
217(1989).
26. Raghuramulu,Y., Purushotham,K., Sreenivasan,M.S. , & Ramaiah ,P.K. In vitro
regeneration of Coffee plantlets in India. J. Coffee Res. 17, 57-64 (1987) .
27. Quiroz-Figueroa,F.R., Méndez-Zeei ,M., Larqué-Saavedra,A., & Loyola-
Vargas,V.M. Picomolar concentrations of salycilates induce cellular growth and
enhance somatic embryogenesis in Coffea arabica tissue culture. Plant Ce// Rep.
20, 679-684 (2001 ).
28. Lanaud,C. Production of Coffea canephora plantlets by somatic embryogenesis
obtained by in vitro culture of ovules. Café Cacao Thé XXV, 231-236 (1981) .
22
•
Capítulo 1
29. Ascanio, E. C. E. and Arcía, M. M. Haploids from anther culture in Coffea arabica
L. lnternational Congress of Plant Tissue Culture, Tropical Species. 68. 1987.
Bogotá, Colombia.
30. Sreenath,H .L., Shanta,H.M., Babu,K.H., & Naidu,M.M. Somatic embryogenesis
from integument (perisperm) cultures of coffee. Plant Ce// Rep. 14, 670-673 (1995).
31. Hatanaka,T., Arakawa,O. , Yasuda,T., Uchida,N. , & Yamaguchi,T. Effect of plant
growth regulators on somatic embryogenesis in leaf cultures of Coffea canephora .
Plant Ce// Rep. 10, 179-182 (1991) .
32. Menéndez-Yuffá,A. & de Garcia,E.G. Morphogenic events during indirect somatic
embryogenesis in coffee "Catimor". Protoplasma 199, 208-214 (1997) .
33. Berthouly,M. & Michaux-Ferriére,N. High frequency somatic embryogenesis in
Coffea canephora . lnduction conditions and histological evolution . Plant Ce// Tiss.
Org. Cult. 44, 169-176 (1996) .
34. Tahara, M., Nakanishi, T., Yasuda, T., and Yamaguchi , T. Histological and
biological aspects in somatic embryogenesis of Coffea arabica. 16é Colloque
Scientifique lnternationale sur le Café. 860-867. 1995. Paris, Association
Scientifique lnternationale du Café.
35. Tisserat,B. in Plant tissue culture manual. Supplement 3, Edn . 1. ed. Lindsey,K. 1-
14 (Kiuwer Academic Publ ishers, The Netherlands; 1991 ).
36. Mu rashige,T. & Skoog,F. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15,473-497 (1962).
37. Sondahi,M.R. & Sharp,W.R. High frequency induction of somatic embryos in
cultured leaf explants of Coffea arabica L. Z. Pflanzenphysiol. 81 , 395-408 (1977).
38. Quiroz-Figueroa,F.R., Monforte-González,M., Galaz-Avalos,R.M. , & Loyola
Vargas.V.M. in Plant cell culture protocols, Edn . 2nd _ eds. Loyola-Vargas,V.M. &
Vázquez-Fiota,F.A. 111-117 (Humana Press, Totowa, New Jersey; 2006) .
23
•
Capítulo 1
39. Fuentes-Cerda,C.F.J. , Monforte-González,M., Méndez-Zeei ,M. , Rojas-Herrera,R.,
& Loyola-Vargas,V.M. Modification of the embryogenic response of Coffea arabica
by nitrogen source. Biotechnol. Lett. 23, 1341-1343 (2001 ).
40. Fuentes,S.R.L. , Calheiros,M.B.P., Manetti,J ., & Vieira,L.G.E. The effects of silver
nitrate and different carbohydrate sources on somatic embryogenesis in Coffea
canephora . Plant Ce// Tiss. Org. Cult. 60, 5-13 (2000) .
41 . Szabados,M., Mroginski ,L.A., & Roca ,W. in CULTIVO DE TEJIDOS EN LA
AGRICULTURA. Fundamentos y aplicaciones. eds. Roca,W.M. & Mroginski, L.A.
173-195 (CIAT, Cali ; 1993).
42. King ,P.J. in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. ed. Vasii,I.K. 130-
138 (Vol. 1, Academic Press, Orlando; 1984).
43. Wilson,K. in Coffee botany, biochemistry and production of beans and beverage.
eds. Clifford ,M.N. & Wilson ,K.C. 157-207 (AVI , Westport, Conn .; 1975).
44. Etienne, H., Solano, W., Pereira , A., Barry-Etienne, D., Bertrand, B., Anthony, F.,
Coté, F., and Berthouly , M. Utilización de la embriogénesis somática en medio
líquido para la propagación masal de los híbridos F1 de cafés arábicos. 253-261 .
1997. San José, Costa Rica, Promecafé.
45. Sóndahi ,M.R. , Nakamura,T., Medina-Filho,H.P., Carvalho,A. , Fazuol i, L.C ., &
Costa,W.M. in Handbook of plant cell culture Vol. 3. Crop species, Vol. 3. eds.
Ammirato,P.V. , Evans,D.A., Sharp,W.R. , & Yamada,Y. 564-590 (Macmillan
Publishing Company, New York; 1984).
46. Zamarripa,C.A., Ducos,J.P ., Bollon,H ., Dufour,M., & Petiard,V. Production
d'embryons somatiques de caféier en milieu liquide: effects densité d'inoculation et
renouvellement du milieu. Café Cacao Thé XXXV, 233-244 (1 991).
47. Chung,W. , Pedersen ,H., & Chin ,C.-K. Enhanced somatic embryo production by
conditioned media in cell suspension cultures of Daucus carota. Biotechnol. Lett.
14, 837-840 (1992) .
24
Capítulo 1
48. Quiroz-Figueroa,F.R. , Rojas-Herrera,R. , Sánchez-Teyer,F., & Loyola-Vargas,V.M .
in Simposia académico en honor de la Dra. Estela Sánchez Quintanar, Edn. 1.
eds. Bernai-Lugo,l. & Loza,H . 9-19 (Facultad de Química, UNAM, México; 2000) .
49. Matthys-Rochon,E. Secreted molecules and their role in embryo formation in
plants: a mini-review. Acta Biol. Cracov. Ser. Bot. 47, 23-29 (2005).
50. Higashi,K., Daita,M., Kobayashi ,T., Sasaki,K., Harada,H., & Kamada,H. lnhibitory
conditioning for carrot somatic embryogenesis in high-cell-density cultures. Plant
Ce// Rep. 18, 2-6 (1998) .
51. Umehara,M ., Ogita,S. , Sasamoto,H ., Koshino,H., Asami,T. , Fujioka,S., Yoshida,S.,
& Kamada,H. ldentification of a novel factor, vanillyl benzyl ether, which inhibits
somatic embryogenesis of Japanese larch (Larix leptolepis Gordon). Plant Ce//
Physiol. 46, 445-453 (2005).
52 . Yang ,H., Matsubayashi ,Y., Hanai ,H., & Sakagami ,Y. Phytosulfokine-a, a peptide
growth factor found in higher plants: its structure, functions, precursor and
receptors. Plant Ce// Physiol. 41 , 825-830 (2000).
53. lgasaki ,T., Akashi,N ., Ujino-lhara,T., Matsubayashi ,Y., Sakagami,Y., &
Shinohara,K. Phytosulfokine stimulates somatic embryogenesis in Cryptomeria
japonica . P/ant Ce// Physiol. 44, 1412-1416 (2003).
54. Fridborg,E. The effect of activated charcoal on tissue cultures; adsorption of
metabolites inhibiting morphogenesis. Physiol. Plant. 43, 104-106 (1978).
55. Osuga,K., Kamada,H. , & Komamine,A. Cell density is an important factor for
synchronization of the late stage of somatic embryogenesis at high frequency.
Plant Tiss. Cult. Lett. 10, 180-183 (1993) .
56. Kobayashi ,T., Higashi,K. , Sasaki,K. , Asami,T. , Yoshida,S. , & Kamada,H.
Purification from conditioned medium and chemical identification of a factor that
inhibits somatic embryogenesis in carrot. Plant Ce// Physiol. 41 , 268-273 (2000).
25
•
Capítulo 1
57. Coutos-Thevenot,P., Maes,O. , Jouenne,T., Mauro,M.C., Boulay,M., Deloire,A. , &
Guern,J . Extracellular protein pattern of grapevine cell suspensions in embryogenic
and non-embryogenic situations. Plant Sci. 86, 137-145 (1992) .
58. Pedroso MC & Pais MS A scanning electron microscopy and X-ray microanalysis
study during induction of morphogenesis in Camellia japonica L. Plant Sci. 87, 99-
108 (1992).
59. Pedroso,M.C. & Pais,M.S. Direct embryo formation in leaves of Camellia japonica
L. Plant Ce// Rep. 12, 639-643 (1993).
60. Kreuger,M. & Van Holst,G. Arabinogalactan-protein epitopes in somatic
en4bryogenesis of Oaucus carota L. Planta 197, 135-141 (1995).
61. Dubois,T., Guedira,M., & Vasseur,J . Direct somatic embryogenesis in leaves of
Cichorium. A histological and SEM study of early stages. Protoplasma 162, 120-
127 (1991).
62. Samaj,J ., Bobak,M., Blehova,A., Kristin,J. , & Auxtova-Samajowa,O. Developmental
SEM observations on an extracellular matrix in embryogenic calluses of Drosera
rotundifolia and Zea mays. Protoplasma 186, 45-49 (1995) .
63. Jasik J., Salajova T., & Salaj J. Developmental anatomy and ultrastructure of early
somatic embryos in European black pine (Pinus nigra Arn.). Protoplasma 185, 205-
211(1995).
64. Ovecka ,M. & Bobak,M. Structural diversity of Papaver somniferum L. cell surfaces
in vitro depending on particu lar steps of plant regeneration and morphogenetic
program. Acta Physiol. Plant. 21 , 117-126 (1999) .
65. Verdeii,J .L. , Hocher,V., Huet,C., Grosdemange,F., Escoute,J., Ferriere,N., &
Nicole,M. Ultrastructural changes in coconut calli associated with the acquisition of
embryogenic competence. Ann. Bot. 88, 9-18 (2001 ).
66. Rumyantseva,N.I., Samaj,J. , Ensikat,H .J., Salnikov,V.V. , Kostyukova ,Y.A. ,
Baluska,F., & Volkman,D. Changes in the extracellular matrix surface network
26
•
Capítulo 1
during cyclic reproduction of proembryogenic cell complex in the Fagopyrum
tataricum (L.) Gaertn callus. Do/k. Biological Sciencie. 391, 375-378 (2003) .
67. Bobak,M., Samaj,J ., Hlinkova,E., Hlavacka,A. , & Ovecka,M . Extracellular matrix in
early stages of direct somatic embryogenesis in leaves of Drosera spathulata. Biol.
Plant. 47 , 161-166 (2003).
68. Fry,S.C. Gibberellin-controlled pectinic acid and protein secretion in growing cells.
Phytochemistry 19, 735-740 (1980) .
69. Ciarrocchi ,G., Cella,R., & Niels¡h,E. Release of nucleotide-cleaving acid
phosphatase from carrot cells grown in suspension culture. Physiol. Plant. 53, 375-
377 (1981).
70. Kim,S.H. & Lee,W.S. Participation of extracellular fumarase in the utilization of
malate in cultu red carrot cells. Plant Ce// Rep. 20, 1087-1092 (2002) .
71 . Chibbar,R.N. , Plowick,P.L. , Newsted,W.J., Shyluk,J. , & Goerges,F. ldentification
and isolation of a unique esterase from the medium of non-embryogenic cell line of
cultured carrot cells. Plant Ce// Tiss. Org. Cult. 18, 47-53 (1989) .
72. Gavish,H., Vardi ,A. , & Fluhr,R. Extracellular proteins and early embryo
development in Citrus nucellar cell cu ltures. Physiol. Plan t. 82, 606-616 (1991 ).
73. Kunze,l. , Kunze,G., Broker,M., Manteuffei,R. , Meins,F., Jr., & Müntz,K. Evidence
for secretion of vacuolar a-mannosidase, class 1 chitinase, and class 1 P-1 ,3-
glucanase in suspension cultures of tobacco cells. Planta 205, 92-99 (1998) .
74. Esaka,M., Enoki ,K., Kouchi ,B., & Sasaki,T. Purification and characterization of
abundant secreted protein in suspension-cultured pumpkin cells. Abundant
secreted proteini may be a chitinase. Plant Physiol. 93, 1037-1041 (1990).
75. Carlberg,l. , Jonsson,L., Bergenstrahle,A. , & Soderhaii,K. Purification of a trypsin
inhibitor secreted by embryogenic carrot cells. Plant Physiol. 84, 197-200 (1987).
27
Capítulo 1
76. Ojima,A. , Shiota,H., Higashi,K. , Kamada,H., Shimma,Y., Waba,M., & Satto,S. An
extracellular insoluble inhibitor of cysteine proteinases in cell cultures and seeds of
carrot. Plant Mol. Biol. 34, 99-109 (1977) .
77. Kawasaki ,S. Extensin secreted into the culture medium by tobacco cells l.
Purification and sorne properties. Plant Ce// Physiol. 30, 259-265 (1989) .
78. Mita,G., Nocco,G., Leuci ,C., Greco,V., Rampino,P., & Perrotta ,C. Secreted heat
shock proteins in sunflower suspension cell cultures. Plant Ce// Rep. 16, 792-796
(1997).
79. Sterk,P., Booij ,H., Schellekens,G.A., Van Kammen,A. , & De Vries,S.C. Cell-specific
expression of the carrot EP2 lipid transfer protein gene. Plant Ce// 3, 907-921
(1991) .
80. Fincher,G.B., Stone,B.A. , & Clarke,A.E . Arabinogalactan-proteins: structure ,
biosynthesis and function. Annu. Rev. Plant Physiol. 34, 47-70 (1983) .
81 . Shetty,K., Bothra,D. , Crawford,D.L., & Korus,R.A. Extracellular peroxidases as
indicators of growth in plant cell suspension cultures. Appl. Biochem. Biotechnol.
24/25, 213-221 (1990).
82. Giuliano,G. , Lo Schiavo,F., & Terzi ,M. lsolation and developmental characterization
of temperature-sensitive carrot cell variants. Theor. Appl. Genet. 67, 179-183
(1984) .
83. Lo Schiavo,F. , Giuliano,G., De Vries,S.C., Genga,A. , Bollini ,R. , Pitto ,L. , Cozzani,F.,
Nuti-Ronchi,V., & Terzi,M. A carrot cell variant temperature sensitive for somatic
embryogenesis reveals a defect in the glycosylation of extracellular proteins. Mol.
Gen. Genet. 223, 385-393 (1990) .
84. De Jong,A.J ., Cordewener,J., Lo Schiavo,F. , Terzi ,M., Vandekerckhove,J., Van
Kammen,A. , & De Vries,S.C. A carrot somatic embryo mutant is rescued by
chitinase. Plant Ce/14 , 425-433 (1992).
28
•
Capítulo 1
85. Baldan,B., Guzzo,F. , Filippini ,F., Gasparian,M., LoSchiavo,F., Vitale,A. , De
Vries,S.C., Mariani,P., & Terzi,M. The secretory nature of the lesion of carrot cell
variant ts11, rescuable by endochitinase. Planta 203, 381-389 (1997) .
86. De Jong,A.J., Hendriks,T. , Meijer,E.A. , Penning,M. , Lo Schiavo,F., Terzi ,M., Van
Kammen,A. , & De Vries,S.C. Transient reduction in secreted 32 kD chitinase
prevents somatic embryogenesis in the carrot (Daucus carota L.) variant ts11 .
Devel. Genet. 16, 332-343 (1995) .
87. Hari ,V. Effect of cell density changes and conditionated media on carrot cell
embryogenesis. Z. Pf/anzenphysiol. 96, 227-231 (1980) .
88. De Vries,S.C., Booij ,H., Meyerink,P. , Huisman ,G., Wilde,H.D., Thomas,T.L. , & Van
Kammen,A. Acquisition of embryogenic potential in carrot cell-suspension cultures.
Planta 176, 196-204 (1988).
89. Van Engelen,F.A., Sterk,P., Booij,H., Cordewener,J .H.G., Rook,W., Van
Kammen,A. , & De Vries,S.C. Heterogeneity and cell type-specific localization of a
cell wall glycoprotein from carrot suspension cells. Plant Physiol. 96, 705-712
(1991 ).
90. De Vries,S.C., Booij,H. , Janssens,R. , Vogels,R., Saris,L., Lo Schiavo,F ., Terzi ,M.,
& Van Kammen,A. Carrot somatic embryogenesis depends on the phytohormone
controlled presence of correctly glycosylated extracellular proteins. Oevel. Genet.
2, 462-476 (1988).
91 . Cordewener,J ., Booij,H., Van der Zandt,H., Van Engelen ,F.A. , Van Kammen,A. , &
De Vries,S.C. Tunicamycin-inhibited carrot somatic embryogenesis can be restored
by secreted cationic peroxidase isoenzymes. Planta 184, 478-486 (1991 ).
92. Nielsen ,K.A. & Hansen,I.B. Appearance of extracellular proteins associated with
somatic embryogenesis in suspension cultures of barley (Hordeum vulgare L.) . J.
Plant Physiol. 139, 489-497 (1992) .
29
Capítulo 1
93. Fil ipecki,M.K. & Przybecki,Z. Marker proteins of somatic embryogenesis in
cucumber (Cucumis sativus L.) . Plant Gen. 35, 1-9 (1994) .
94. Poulsen,G.B., Frugis,G., Albrechtsen,M ., & Mariotti,D. Synthesis of extracellular
proteins in embryogenic and non- embryogenic cell cultures of alfalfa . Plant Ce//
Tiss. Org. Cult. 44, 257-260 (1996) .
95. Kragh,K.M., Hendriks,T., De Jong,A.J ., Lo Schiavo,F., Bucherna,N., Hojrup,P.,
Mikkelsen ,J.D., & De Vries,S.C. Characterization of chitinases able to rescue
somatic embryos of the temperature-sensitive carrot variant ts11 . Plant Mol. Biol.
31 ' 631-645 (1996).
96. Van Engelen,F.A. & De Vries,S .C. Extracellular proteins in plant embryogenesis.
Trends Genet. 8, 66-70 (1992).
97. Penneii,R.I. , Janniche,L., Scofield,G.N., Booij,H ., De Vries,S.C. , & Roberts,K.
ldentification of a transitional cell state in the developmental pathway to carrot
somatic embryogenesis. J. Ce// Biol. 119, 1371-1380 (1992).
98. Kreuger,M. & Van Holst,G.J. Arabinogalactan proteins are essential in somatic
embryogenesis of Daucus carota L. Planta 189, 243-248 (1993).
99. Toonen,M.A.J., Schmidt,E.D.L., Van Kammen,A. , & De Vries,S.C. Promotive and
inhibitory effects of diverse arabinogalactan proteins on Daucus carota L. somatic
embryogenesis. Planta 203, 188-195 (1997) .
1 OO. Van Hengei ,A.J ., Van Kammen,A., & De Vries,S .C. A relationship between seed
development, arabinogalactan-proteins (AGP) and the AGP mediated promotion of
somatic embryogenesis. Physiol. Plant. 114, 637-644 (2002).
101. Mo,L.H., Egertsdotter,U., & Von Arnold,S . Secretion of specific extracellular
proteins by somatic embryos of Picea abies is dependent on embryo morphology.
Ann. Bot. 77, 143-152 (1996).
30
•
Capítulo 1
102. McCabe,P.F., Valentine,T.A. , Scott,F.L., & Penneii,R.I. Soluble signals from cells
identified ar the cell wall establish a developmental pathway in carrot. Plant Ce// 9,
2225-2241 ( 1997) .
103. Domon,J.M., Neutelings,G., Roger,D. , David,A. , & David,H. A basic chitinase-like
protein secreted by embryogenic tissues of Pinus caribaea acts on arabinogalactan
proteins extracted from the same cell lines. J. P/ant Physiol. 156, 33-39 (2000).
104. Rojas-Herrera,R. & Loyola-Vargas,V.M. lnduction of a class lll ' acidic chitanse in
foliar explants of Coffea arabica L. during somatic embryogenesis and wounding.
Plant Sci. 163, 705-711 (2002).
105. Staehelin,C., Granado,J ., Müller,J., Wiemken,A. , Mellor,R.B., Felix,G.,
Regenass,M., Broughton,W.J., & Boller,T. Perception of Rhizobium nodulation
factors by tomato cells and inactivation by root chitinases. Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 91 , 2196-2200 (1994) .
106. Graham,L.S. & Sticklen,M .B. Plant chitinases. Can. J. Bot. 72, 1057-1083 (1994) .
107. Van Hengei ,A.J ., Tadesse,Z. , lmmerzeei ,P., Schols,H ., Van Kammen,A. , & De
Vries,S.C. N-acetylglucosamine and glucosamine-containing arabinogalactan
proteins control somatic embryogenesis. Plant Physio/. 125, 1880-1890 (2001 ).
108. Sticher,L. , Hofsteenge,J., Neuhaus,J.M., Boller,T. , & Meins,F. Posttranslational
processing of a new class of hydroxyproline-containing proteins. Plant Physiol.
101 , 1239-1 247 (1993).
109. Rao,R.K. & Gnanam,A. lnhibition of nitrate and nitrite reductase activities by salinity
stress in Sorghum vulgare. Phytochemistry 29, 1047-1049 (1990) .
110. Bapat,S.A. , Rawai,S.K., & Mascarenhas,A.F . lsozyme profiles during ontogeny of
somatic embryos in wheat (Triticum aestivum L) . Plant Sci. 82, 235-242 (1992) .
111. Bredemeijer,G.M.M., Burg,H .C.J. , Sree Ramulu ,K., & Dijkhuis,P. Release of
peroxidases by cultured potato cells. Acta Bot. Need. 34, 325-335 (1985).
31
/
Capítulo 1
112. Moreno-Valenzuela,O.A., Vazquez-Duhalt,R. , & Ochoa,J.L. Peroxidase activity in
calluses and cell suspension cultures of radish Raphanus sativus var. Cherry Bell.
Plant Ce// Tiss. Org. Cult. 18, 321-327 (1989) .
113. Quiroz-Figueroa,F.R. , Kú-Rodríguez,S.C. , & Loyola-Vargas,V.M. Patrón proteico
extracelular durante la embriogénesis somática en suspensiones celu lares de
Coffea arabica L. Rev. Soc. Quím. Méx. 46, 259-263 (2002).
32
) /
•
Capítulo 11
MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Inducción de los callos embriogénicos
Capítulo 11
Se utilizaron las hojas de las plantas mantenidas in vitro de C. arabica y C. canephora ,
fueron cortadas las orillas y se colocaron en medio MS1 para la inducción de los callos con
29.6 IJM de tiamina-HCI, 550 iJM mio-inositol, 210 iJM L-cisteína, 87.7 mM de sacarosa,
4.5 iJM 2,4-D, 9.2 iJM Kin y 0.1% (p/v) de gelrite, pH 5.8, como describieron previamente
Sondahl y Sharp 2. Después de colocar los explantes al medio, se incubaron a oscuridad y
se dejaron así durante un mes. Luego de obtener los callos, se cambiaron a un medio
fresco y se subcultivaron cada cuatro semanas
2.2 Cultivo de las suspensiones celulares
Luego de obtener los callos, se pesaron dos gramos incluyendo hasta el tejido original y
se colocaron en matraces de 250 mL conteniendo 50 mL de medio para suspensiones
celulares. El medio contenía lo siguiente: sales MS a la mitad de su fuerza iónica, 29.6 iJM
de tiamina-HCI, 550 J..! M de myo-inositol, 21 O J..! M L-cisteína, 87.7 mM de sacarosa, 4.4 J..! M
de BA, 13.6 iJM de 2,4-D, pH 5.8. Las suspensiones fueron mantenidas a 25 .±. 2°C e
incubadas a oscuridad y con una agitación de 100 rpm. La resiembra se realizó cada 15
días, inoculando 2 g de las células en 50 mL del medio fresco.
2.3 Caracterización de las suspensiones celulares
Para caracterizar el crecimiento de las suspensiones celulares, se tomaron en cuenta los
siguientes parámetros: número de células, peso fresco y seco, conductividad, paquete
celular y pH . Cada experimento se realizó por triplicado.
33
Capítulo 11
2.3.1 Número de células
Para el conteo de las célu las, se requiere una separación previa de las células que forman
los agregados o en grupos de no más de 1 O células. Para esto se utilizó la técnica de
maceración de células con una solución al 10% de trióxido de cromo3 Para ello se tomó
un mL de la muestra (suspensiones celulares) y se le adicionaron 2 mL de trióxido de
cromo al 10% (p/v). Las muestras se llevaron a la campana de extracción por que el
trióxido de cromo es muy tóxico. Se calentó a 70oc durante 15 minutos. Después de
calentar la muestra, se agitó durante 20 minutos en un vortex con la finalidad de que los
aglomerados celulares se separaran. Una vez transcurrido el tiempo, se observaron al
microscopio con la ayuda de un hemocitómetro, Bright-line y en éste se contaron cinco
cuadrantes (los cuatro de los extremos y el del centro). Los cálculos se realizó sumando el
número de células de los cinco cuadrantes del hemocitómetro, después se multiplicaron
por 104 y luego por tres (esta es la relación muestra trióxido de cromo, 1 :3).
2.3.2 Paquete celular
Se determinó transfiriendo 1 O mL de las suspensiones celulares a un tubo graduado
cónico de 15 mL y se centrifugó a 200 x g durante 5 minutos, después se medió el
paquete celular para conocer el porcentaje celular durante los días de cultivo. Para
calcular el porcentaje, se dividió el volumen de células obtenido en el tubo entre el
volumen total utilizado (10 mL) y luego se multiplico por 100.
2.3.3 Peso fresco y peso seco
Para la medición del peso fresco, las células fueron filtradas utilizando papel filtro
(Whatman No. 42) drenado bajo vacío y pesado posteriormente. Para el peso seco, se
realizó de manera similar a como se determinó el peso fresco, pero antes de pesar las
células se liofilizaron y posteriormente se pesaron.
34
•
Capítulo 11
2.3.4 Conductividad y pH
Este parámetro fue utilizado para poder determinar la toma de nutrientes del medio de
cultivo de las suspensiones de Coffea spp. Y se realizó sumergiendo el conductímetro al
medio de cultivo ya libre de células. Para la medición de pH se realizó de la misma
manera sumergiendo el potenciómetro al medio. El pH se ajustó inicialmente a 5.8. Estas
mediciones se realizaron a lo largo del ciclo del cultivo.
2.4 Inducción a la embriogénesis somática
2.4.1 C. canephora
Para la inducción a la ES en C. canephora, se pesaron 0.25 g de células y se agregaron
en 100 ml de medio de inducción con sales MS a mitad de su fuerza iónica, 29.6 1-1M de
tiamina-HCI , 550 1-JM de myo-inositol, 21 O 1-JM L-cysteina, 87.7 mM de sacarosa. 0.27 1-JM
de ANA, 2.3 1-JM de KIN , a pH 5.8. Fueron mantenidas a 25 :t 2°C e incubadas a oscuridad
y con una agitación de 100 rpm
2.4.2 C. arabica
Para la inducción de la ES en C. arabica, primero se pesó 2 g de callo incluyendo hasta el
tejido original y se agregaron a un medio para suspensiones celulares conteniendo: sales
MS a la mitad de su fuerza iónica, 29.6 1-JM de tiamina-HCI, 550 1-JM de myo-inositol, 210
1-JM L-cisteína, 87.7 mM de sacarosa, 4.4 1-JM deBA, 13.61-JM de 2,4-D, pH 5.8, durante 42
días cambiado el medio por uno fresco cada 15 días. Al cabo de ese tiempo se
transfirieron a uno de inducción con : sales MS a mitad de su fuerza iónica, 29.6 1-1M de
tiamina-HCI, 550 1-JM de myo-inositol, 210 1-JM L-cysteina, 87.7 mM de sacarosa. 0.27 1-JM
de ANA, 2.3 1-JM de KIN, a pH 5.8. Se utilizó 50 ml de medio en cada matraz. Los cultivos
fueron mantenidos a 25 :t 2oc e incubados a oscuridad a 100 rpm y también fueron
cambiados a medio fresco cada 15 días.
35
•
Capítulo JI
2.5 Recolección del medio de cultivo
El medio de los cultivo de C. canephora y C. arabica se pasó a través de una membrana
de nylon de 0.45 IJm, el medio de cultivo que se iba filtrando permaneció en hielo para
evitar que la proteína se degradara. Se congeló en un ultracongelador a -80°C y luego se
liofil izó para eliminar el agua al medio de cultivo, ya liofilizado se le agregaron inhibidores
de proteasas (1 O mM, r.!.-Mercapto 7 mM [v/v] y PMSF 1 mM) y se dejó descongelar. Ya
descongelado se sometió a precipitación de proteínas con TCA. A la muestra se le añadió
una solución de DOC al 3% (p/v) se agitó con la ayuda de un vortex Thermolyme para
homogenizar y se dejó 1 O m in a temperatura ambiente, seguidamente se le agrego el
TCA al 10% (p/v) del volumen total del medio de cultivo y se agitó con la ayuda de un
vortex para homogenizar y se dejo 15 minutos a -20°C y se centrifugó en una centrífuga
Legend Mach 1.6 G a 3,500 x g durante 15 min a 4°C y se desechó el sobrenadante
cuidando de no perder la pastilla. El precipitado se lavó con 1 O ml acetona ( -20°C) que
contenía 0.07% r..-mercapto (v/v), se centrifugó en una centrífuga Legend Mach 1.6 G a
3,500 x g durante 15 min a 4°C y se repitió el lavado con acetona otras dos veces. Las
proteínas precipitadas con TCA y lavadas con acetona se dejaron secar toda lo noche, se
resuspendieron con 500 IJL de amortiguador de lisis [urea 9 M, CHAPS 4% (p/v) , DTT 1%
(p/v) y anfolitos (pH 3-1 O, 5-7) 0.4% (v/v)] , se centrifugaron en una centrífuga Hermle
Z233 MK-2 a 15,000 x g durante 15 mina 24°C; fraccionándose en alícuotas.
2.6 Cuantificación de proteínas extracelulares
Después del precipitado de las proteínas y fraccionados en alícuotas. El siguiente paso
fue la cuantificación y se determinó por el método de Peterson4 y se utilizó albúmina
sérica bovina para elaborar la curva estándar (1 mg 1 ml), utilizando un rango de
concentraciones de 1 O a 100 IJg de la proteína y se llevó a 1 ml de volumen final con
agua destilada. Se tomó 15 IJL de las alícuotas obtenidas y también fue aforado a un
volumen final de 1 ml con agua destilada colocándolos en tubos de ensaye. Después a
las curva patrón y a las muestras se les agregaron 100 IJL de DOC 0.15% (p/v) y se
agitaron en el vórtex Thermolyme y se dejaron reposar 1 O m in a temperatura ambiente.
Después de los 1 O m in se adicionaron 100 IJL de TCA 72% (p/v) frío , se agitaron y se
36
•
Capítulo 11
dejaron 15 min a -20°C. Se centrifugaron en una Legend Mach 1.6 G a 3,500 x g durante
15 min a 4°C y se desechó el sobrenadante cuidando de no perder la pastilla. La pastilla
precipitada se resuspendió en 1 mL de agua destilada y se agitó en el vórtex.
Seguidamente se le adicionó 1 mL del reactivo A que contiene CTC [CuS04.5H20 0.1 %
(p/v), NaC03 10% (p/v), 0.2% (p/v)], Na OH 0.8 N (p/v), SOS 10% (p/v) y H20, se agitó en
un vórtex y se dejó reposar 1 O m in a temperatura ambiente. Se le adicionaron 500 ~L del
reactivo B que contiene el reactivo Folin-Ciocalteau 1 :5 (v/v), se agitó y se dejó reposar
por 30 min a temperatura ambiente para permitir el desarrollo del color. Por último, para
determinar la concentración de proteína la absorbancia de las muestras fue medida en un
espectrofotómetro Genesis 1 O UVa 750 nm.
2.7 Electroforesis de doble dimensión en geles de poliacrilamida
2.7.1 Electroenfoque
La primera dimensión se llevó a cabo en tiras de 24 cm (ReadyStrip™ IPG Strip, pH 4-7,
810-RAD), bajo condiciones desnaturalizantes. El primer paso fue preparar el
amortiguador de lisis [7 M urea, 4% CHAPS (p/v), 1% DTT (p/v), 2% de anfolitos (pH 3-10)
(v/v) y 0.002.% azul de bromofenol] . En viales se agregaron la cantidad apropiada de
proteína (250 l!g) de la muestra más el amortiguador de lisis haciendo un total de 450 J!L y
se agitaron con la ayuda de un vórtex. Luego se adicionaron las muestras del cátodo
hacia el ánodo en las celdas de rehidratación evitando que se formen burbujas y
posteriormente se colocaron las tiras lentamente. Posteriormente se adicionaron 2.5 mL
de aceite mineral sobre la superficie de cada tira con el fin de evitar la evaporación
durante el proceso de rehidratación . La rehidratación se llevó a cabo de manera pasiva.
Finalizado el proceso de rehidratación se continuó con el electroenfoque de las muestras
proteicas (20 m in a 250 V, 1 h a 500 V, 1 h a 1000 V, 1 O,dOO - 60, 000 V- h). Las
separación de proteínas, según su punto isoeléctrico, se llevó a cabo en el equipo de
electroenfoque (PROTEAN /FE Cell, 810-RAD)
37
Capítulo 11
2.7.2 Etapa de equilibrio
Finalizado el electroenfoque las tiras fueron extraídas y sumergidas primeramente en un
amortiguador de equilibrio que contenía: 6 M urea, 0.375 M Tris HCI, pH 8.8, 2% (p/v)
SOS, 1% (p/v) OTT, 30% glicerol (p/v) y 0.05% (p/v) azul de bromofenol, a temperatura
ambiente por 15 min y en agitación, posteriormente fueron sumergidas nuevamente en un
segundo amortiguador de equilibrio que contiene: 6 M urea, 0.375 M Tris HCI, pH 8.8, 2%
(p/v) SOS, 2.5% (p/v) iodoacetamida, 30% glicerol (p/v) y 'o. OS% (p/v) azul de bromofenol,
a temperatura ambiente por 15 min y en agitación.
2.7.3 Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)
La electroforesis se realizó con base en el sistema discontinuo propuesto por Laemmli5 .
Se ensambló el equipo de electroforesis (ProteanR plus Oodecell , de Bio-rad) según las
instrucciones del fabricante. Previamente los cristales se limpiaron con etanol al 70% (v/v)
ya que se encuentran en contacto directo con el gel y evitar manchas. Se preparó la
solución para los geles de poliacrilamida SOS-PAGE (12.5% con 1 mm de espesor), se
vertió en los cristales, y se agregó isopropanol al 50% (v/v) y se dejó polimerizar por 30
min. Utilizando una probeta de 100 ml, las tiras fueron sumergidas por 30 segundos en el
amortiguador de corrida que contiene: 3.02% Tris-HCI , 14.4% glicina y 1% SOS.
Posteriormente las tiras se colocaron de manera horizontal sobre el gel de separación
uniforme de poliacrilamida al 12.5%, evitando la formación de burbujas y colocando el
marcador molecular, para después rellenarlo con una solución de agarosa al 1% y 0.05%
de azul de bromofenol y corridos a 120 voltios por 12 horas. Finalizado el tiempo de
corrida los geles fueron fijados en una solución que contiene 57.55% (v/v) de metanol ,
42.35% (v/v) de ácido acético y 0.09% (v/v) de formaldehído, durante un periodo de 12
horas.
2.7.4 Tinción con nitrato de plata para geles 20-PAGE
Primero se hidrataron los geles durante una hora con tres cambios de etanol al 30% (v/v)
cada 20 min. Posteriormente los geles se pre-trataron con una solución al 0.02% (p/v) de
38
Capítulo 11
tiosulfato de sodio por un periodo de 1.5 min, inmediatamente los geles fueron
enjuagados con agua por un minuto con tres cambios cada 20 s. Luego los geles fueron
incubados en una solución de nitrato de plata al 0.2% (p/v) y formaldehído al 0.03% (v/v)
por 20 min. Después del periodo de incubación, la solución de plata fue eliminada y los
geles se enjuagaron con agua dos veces por 20 s. después se llevó a cabo el revelado
con una solución de carbonato de sodio al 6% (p/v), formaldehído al 0.019% (p/v) y 0.4
mM de tiosulfato de sodio. Una vez que la solución reveladora se oxidó fue necesario
cambiarla por otra porción de solución reveladora fresca . Es de suma importancia llevar a
cabo el revelado con la solución completamente transparente. Después de adquirir la
intensidad de tinción deseada se eliminó la solución reveladora y el revelado fue detenido
con una solución de EDTA al 1.5%, posteriormente se adicionó ácido acético al 12% (v/v)
y metanol al 50% (v/v). Los geles teñidos fueron almacenados en ácido acético al 1% (v/v)
a 4°C hasta llevar a cabo los siguientes análisis. Todo este proceso se realizó en un
equipo de agitación Stovall a 30 rpm y cada gel se realizó por triplicado de experimentos
diferentes.
2.8 Análisis de las proteínas reveladas en los geles
Para el análisis , primero si digitalizaron las geles en un scanner HP scanjet 4670 a una
resolución de 300% que se limpió muy bien con etanol para evitar que el gel se manche al
momento de digitalizar, El gel se colocó de manera muy cuidadosa para evitar que esta se
rompiera . Para el conteo de las proteínas se utilizó el programa CoreiDraw X4. Las
imágenes obtenidas se enumeraron para que el análisis sea más entendible y para saber
que proteína(as) se está hablando. Para el anál isis de las proteínas en gel en 3D, se
utilizó un software llamado Melanie imagen Master. Este software tiene la finalidad de
analizar las proteínas presentes en el gel que a simple vista no se puede percibir y a
observar las diferencias que estas presentan mediante picos.
39
Capítulo 11
REFERENCIAS
1. Murashige,T. & Skoog,F. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).
2. Sondahi,M.R. & Sharp,W.R. High frequency induction of somatic embryos in cultured
leaf explants of Coffea arabica L. Z. Pflanzenphysiol. 81, 395-408 (1977) .
3. Street,H.E. in Plant tissue and cell culture , Vol. 11 , Edn. 2. ed. Street,H.E. (University
of California Press, Oxford; 1977) 1-10.
4. Peterson,G.L. A simplification of protein assay method of Lowry et al. which is more
generally applicable. Anal. Biochem. 83, 346-356 (1977) .
5. Laemmli,U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature 227, 680-685 (1970).
40
Capítulo 111
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Capítulo 111
3.1 Obtención de callos a partir de explantes foliares de las dos especies de Coffea.
Para cumplir con los objetivos previamente establecidos y para la obtención de una
suspensión celular de las dos especies, se utilizaron explantes foliares de las dos
especies de Coffea mantenidas in vitro, para la inducción de cállos como se puede
observar en la Figura 1. Los explantes fueron colocados en medio MS1 y luego fueron
incubados a oscuridad.
Los callos obtenidos consistieron de una masa amorfa de células generadas a partir del
tejido original. Un callo permanece en desarrollo durante cierto tiempo (dos hasta tres
semanas) y al final de este tiempo, su tamaño máximo y su crecimiento se ven afectados
por la reducción de los nutrientes o también por la misma deshidratación del medio de
cultivo y para esto fue necesario subcultivarlos. El callo se dividió y se transfirió a un
medio de cultivo fresco con el fin de mantener y aumentar la disponibilidad de material , en
este caso se realizó cada cuatro semanas.
Los callos difieren en crecimiento, morfología y textura y para mantenerlos en desarrollo,
sólo se transfiere a un medio de cultivo fresco la masa más friable. En algunos casos los
medios óptimos para la inducción y crecimiento de callos a partir de explantes primarios
no son los mismos que para la generación de las suspensiones celulares; el nivel de
auxinas y citocininas puede ser diferente. Sondahl y Sharp2 describieron un protocolo para
la obtención de callo embriogénico de alta frecuencia a partir de explantes foliares de
Coffea arabica. Van Boxtel y Berthouly3, reportaron un eficiente protocolo para la
inducción y proliferación y regeneración de callo embriogénico a partir de explantes
foliares de C. arabica, C. canephora y el híbrido de Arabusta (C. arabica x C. canephora)
y Congusta (C. congensis x C. canephora).
41
Capítulo 111
Figura 1. Inducción de callos a partir de explantes foliares de las dos especies de Coffea.
A) C. canephora. B) C. arabica. Con un tiempo de cultivo de 42 días.
3.2 Establecimiento de las suspensiones celulares
A partir de los cultivos de callos obtenidos de las dos especies de Coffea, se inició la
generación de las suspensiones celulares, que consistió en colocar 2 g de callo en un
matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 50 ml de medio líquido e incubados en un
orbitador a 100 rpm en oscuridad. Cabe mencionar que los callos fueron agregados al
medio de cultivo incluyendo hasta el tejido original donde fueron obtenidos como se puede
observar en la Figura 2, para las dos especies. El mejor inóculo para la iniciación de
42
Capítulo 111
suspensiones celulares es un callo friable con un ritmo de división celular elevado. Sin
embargo, a veces es necesario utilizar otros tipos de callos, porque no todo callo friable
puede responder a la ES y en esos casos hay que realizar frecuentemente operaciones
para romper los agregados. En su inicio, las suspensiones celulares constan de grandes
agregados y de células libres, alargadas, que no se dividen; pero después de repetir los
subcultivos es factible obtener una suspensión celular finamente dispersa con alto ritmo
de crecimiento.
Figura 2. Explante con callo de C. arabica agregado en el medio de cultivo para
suspensiones celulares. Mantenidas en constante movimiento e incubados a oscuridad.
Los callos de C. canephora, se disgregaron de una manera mucho más rápida, esto fue al
cabo de tres semanas de haberlos transferido al medio de cultivo, con el resultado de que
los callos que se obtuvieron fueron friables. Una vez que las células se liberaron al medio
de cultivo, se filtraron a través de una malla de acero inoxidable de 60 mesh (250 ¡.¡m),
con el propósito de eliminar los grumos que se formaron y también los restos de los callos
que se liberaron al medio de cultivo para poder iniciar con el cultivo de las suspensiones
celulares. En el caso de C. arabica, al cabo de las tres semanas aún no se observaban
células libres en el medio de cultivo.
43
Capítulo 111
Después de un mes de haber transferido los callos de esta especie al medio de cultivo y
no observar células libres, se realizó lo siguiente ; con una pinza estéril, se disgregó el
callo en fragmentos más pequeños con la finalidad de que se liberaran las células al
medio y así obtener las suspensiones celulares, pero tampoco con esta alternativa se
pudo lograr que los callos liberaran las células al medio de cultivo. En el laboratorio se
contaba con cultivos de suspensiones celulares de las dos especies pero ya eran cultivos
viejos. Se ha reportado que cuando los cultivos ya son demasiado viejos éstos pierden su
capacidad embriogénica4. Esta fue la razón por la cual que s~ decidió generar una nueva
línea celular de estas dos especies. Pero esto de generar otra línea tampoco dio
resultado, ya que no se obtuvo la ES en la especie C. canephora.
3.3 Caracterización de las suspensiones celulares
Cuando los callos de C. canephora se colocaron en el medio para generar las
suspensiones celulares, se disgregaron fácilmente, originando una suspensión densa
formada por agregados de callo de color beige. El crecimiento de las suspensiones fue
evaluado con los siguientes parámetros: número de células, peso fresco, peso seco,
paquete celular, conductividad y pH. Cada parámetro se realizó por triplicado.
3.3.1 Número celular
En la Figura 3A (o), se observa la curva de crecimiento de las suspensiones celulares de
la especie C. canephora, donde el mayor número de células alcanzado fue de 7.11 x 106
ml-1 a los 22 días de cultivo. Hermoso-Gallardo y Menéndez-Yuffá5 reportaron 1.35 x 106
ml-1 célu las en cultivos de la especie C. arabica en un tiempo de cultivo de 1 O días. Los
datos obtenidos en este trabajo y de los reportados, ya se encuentran en la etapa final de
la fase exponencial, por lo que se decidió resembrar a los 15 días (fase exponencial). El
número de células comienza a aumentar al final de la fase de retraso, mientras que la
frecuencia de la división celular es baja durante esta fase.
44
•
Capítulo 111
3.3.2 Paquete celular
En la Figura 3A (.&.) , se observan los resultados del porcentaje de paquete celular. El
valor más alto se obtuvo al día 20, que fue de 38%. Este valor se obtuvo cuando el ciclo
de cultivo ya se encontraba en la fase estacionaria, relacionándolo con las curvas de
crecimiento de peso fresco, peso seco, el número de células donde el mayor valor se
obtuvo ya en la fase estacionaria. El incremento del porcentaje del paquete celular
durante los días, señala el incremento en biomasa del cultivo .
3.3.3 Peso fresco y peso seco
El crecimiento de los cultivos presentan las siguientes fases: la fase de adaptación , en
esta fase las células se preparan para dividirse y los cultivos crecen lentamente durante
uno a tres días. Después se observa una fase lineal en donde las células comienzan a
dividirse, luego en la fase exponencial la división celular es máxima. En la fase progresiva
de desaceleración, la división se hace lenta y baja. Por último en la fase estacionaria , el
crecimiento se detiene completamente y no hay aumento neto en la síntesis de biomasa o
en el número de células6.
Estas fases se puede observar en cada resiembra que se realice del cultivo. En la Figura
38 (•) , se observa la curva de crecimiento de las suspensiones células de C. canephora
expresado en peso fresco y en la Figura 38 ( •) en peso seco. En el peso fresco se
observa que durante los primeros 8 días, el crecimiento es lento pero a partir del décimo
día se observa un claro aumento en el peso. El máximo peso fue de 9.6 g a los 24 días,
cuando el ciclo del cultivo ya se encontraba en la fase estacionaria . En el peso seco se
puede observar la misma tendencia de crecimiento como se observa en el peso fresco.
Este parámetro nos permite observar también el crecimiento de las células conforme
aumenta el ciclo del cu ltivo.
También se han reportado ciclos de cultivo de suspensiones celulares de Platycerium
coronarium7, Carya illinoiensis8
, lpomea y Daucus9 que presentan una tendencia similar al
obtenido. El crecim iento es lento si se compara con los resultados obtenidos por Van
45
Capítulo 111
Boxtel y Berthouly3 donde se observó un incremento en el peso fresco desde 20 g/L hasta
75 g/L en suspensiones celulares de C. canephora.
8
"'o
X 6
~ E <Ji <V 3 :¡jj 4 <.)
Q) "O
e "' .§ 2 z
o 1(1
9
8
7
§ 6
o ~ 5 Q)
.1:: o
4 "' "' a.. 3
2
o
T
• /' .. f ; ~:/
/!/
if'"¡/~ ,// ... ~
Q--"- • _..-Á.....- . ...
·-. -· --!-t-!
•
,f !-/ .
1 , ....... , / :
±/'-t/
o 5 10 15 20 25
Tiempo de cultivo (dlas)
A' _;;
' 8 .
30
45
40
35
30 ~ .D
25 ; <D n
20 CD e ¡¡;
15 ..:.
10
5
o 0.6
0.7
0.6
~
0.5 ~ 111 o
0.4 g¡ g
0.3 §:
0.2
0.1
0.0
Figura 3. Curva de crecimiento de las suspensiones celulares de C. canephora. A)
número de células (o), paquete celular ( • ). B) peso fresco (• ). peso seco ( • ), en un
tiempo de cultivo de 26 días.
46
•
Capítulo 111
3.3.4 Conductividad eléctrica del medio de cultivo
En la Figura 4A (t.) se puede apreciar el comportamiento de la conductividad durante el
tiempo de cultivo, teniéndose una conductividad inicial de 3.1 mS, y ésta fue
disminuyendo conforme avanzaban los días de cultivo, llegando a una conductividad de
0.63 mS. El rango de conductividad eléctrica requerido para un adecuado crecimiento del
cultivo se encuentra entre 1.5 a 3.0 mS, en función de la especie y de la conductividad del
agua con que es preparada la solución 10. En la Figura 4A, se puede observar que
conforme disminuye la conductividad (t.) a lo largo del ciclo de cultivo, el crecimiento de
las células aumenta, en este caso representado por el peso fresco (•) . Estos datos
sugiere la toma continua de los nutrientes a lo largo del ciclo de cultivo.
3.3.5 pH del med io de cultivo
El pH del medio de cultivo es un parámetro importante. El pH del medio fue ajustado
inicialmente a 5.8, después de la esterilización se midió de nuevo y la lectura fue de 5.0,
sufriendo una pequeña acidificación . En la Figura 48, se observa que el pH disminuye
hasta un valor de 3.6 en el día 14. Después aumenta a 5.8 para el día 20 y se mantiene
en ese pH hasta el final del ciclo de cultivo. En la gráfica se pueden observar claramente
los cambios que sufre el pH durante el transcurso del cultivo. Estos cambios de pH
durante el cultivo puede deberse por la absorción diferencial de las fuentes de nitrógeno,
la absorción de N0 3- conduce hacia un pH alcalino, mientras que la absorción de NH/
resulta en un cambio hacia la acidez 11. Es decir las células liberan W cuando toman
NH/12. Cuando las células toman N03- liberan oH- en el medio de cultivo, alcalinizándolo.
Estos mecanismos le garantizan a la planta a tolerar una gama de pH en el cultivo in vitro.
Por otro lado, Martín y Rose13 reportaron que la mejor toma de amonio y azúcar en
suspensiones de lpomea fue a pH 4.8 que a pH 5.6. Sin embargo, en raíces de
Azadirachta indica, cuando se ajustó el pH a 5.8 antes de esterilizarlo, éstas
incrementaron significativamente 14.
47
•
J: Q.
3
l .1.
j' ¡ ·
/ ~¡· • / l
~-·-·-· ·-·
·-·-· A 10
9
8
7
-o 6 ~ 5 ;'
(/)
4 8 §
3
2
0+-----------------------------------~0 B
6.0 1 ., 1
5.5 ., j !
5.0
4.5 T r ., ., .,
!J 4.0
3.5 T
o 5 10 15 20 25 30
Tiempo de cultivo (dfas)
Capítulo 111
Figura 4. Curva de crecimiento de las suspensiones celulares de C. canephora. A)
conductividad eléctrica del medio de cultivo (ll) y peso fresco (•). B) comportamiento del
pH durante el crecimiento de las suspensiones celulares, durante un tiempo de cultivo de
26 días.
3.4 Establecimiento de un sistema de embriogénesis somática
3.4.1 Inducción a la embriogénesis somática en C. canephora
Luego de haber obtenido las suspensiones celulares de C. canephora y después de
caracterizarlas, el siguiente paso fue a la inducción a la ES. Se agregó 0.25 g de células a
48
•
Capítulo 111
100 ml de medio de cultivo en matraces Erlenmeyer de 250 ml, Después de haber
inoculado las células se llevaron a un orbitador para mantenerlos a movimiento constante
a 100 rpm bajo condiciones de oscuridad a 25 .:!:. 2°C. Al cabo de un mes de haber
inducido a la ES, no se observaba algún cambio morfológico a las células, pero se dejó
durante un mes más y ni así se lograba ver algún cambio. Entonces se decidió disminuir
la cantidad del inoculo, ya que la ES puede ser inhibida a causa de una densidad elevada
del inóculo y lo recomendable es utilizar una tasa baja para contrarrestar esta inhibición 15
es con base en esto, se decidió disminuir la cantidad del inóculo. La cantidad de inóculo
se redujo a 0.20 y luego a 0.15 g. Osuga 16 reportó que la densidad celular afecta en la ES
de manera negativa, por las altas densidades del inoculo. Sin embargo, la inhibición
puede ser parcialmente suprimida, renovando periódicamente el medio de cultivo. Por otro
lado, la inhibición a la ES se ha relacionado con la presencia de compuestos que son
liberados al medio de cultivo, como es el caso del 4-hidroxibencílico (4-HBA), que suprime
la embriogénesis cuando la densidad del cultivo es alto17, el vanilil bencil éter, que inhibe
la ES de Larix leptolepis afectando al suspensor e impide el suministro de los nutrientes 18.
Sin embargo, las proteínas han demostrado tener también un efecto en la inhibición de la
ES19. Pero la estrategia de disminuir la cantidad del inoculo, no dio resultado y por lo tanto
no se obtuvo la embriogénesis en esta especie a partir de las suspensiones celulares.
3.4.2 Inducción a la embriogénesis somática en C. arabica
Como se mencionó anteriormente, el callo de C. arabica no se pudo disgregar para poder
obtener la suspensión celular que se había planteado en los objetivos, esto se debió a
que el callo obtenido de los explantes no era friable como fue el caso de C. canephora ,
que al cabo de un mes ya se tenía las suspensiones celulares. Con el paso del tiempo
esto fue benéfico, ya que al no liberar células al medio de cultivo y como se mencionó
anteriormente, después de resembrarlo y utilizar una pinza estéril con la intención de
fragmentar los callos, éstos no liberaron células pero si formaron estructuras como la que
se muestra en la Figura 5. Al observar esto, el siguiente paso fue de cambiar el medio de
cultivo a uno de inducción a la ES, utilizando el mismo medio que se probó para las
suspensiones de celulares de C. canephora, para conocer si estas estructuras formadas
49
Capítulo 111
eran capaces de formar embriones y así comprobar si también es útil el medio de cultivo
para la inducción embriogénica.
Figura 5. Callos de C. arabica fragmentados en medio de cultivo en condiciones de
mantenimiento a los 42 días de cultivo en condiciones no embriogénicas.
Al llevar a cabo la inducción, se utilizaron 100 ml de medio de cultivo. Pero conforme
avanzaban los días de cultivo, las estructuras globulares que se observaron antes de la
inducción (Figura 6), adoptaban una apariencia extraña, se tornaban oscuras y el
desarrollo se detenía, por lo que el proceso embriogénico no se desarrollaba.
Seguidamente se disminuyó el volumen del medio de cultivo a 50 ml por matraz. La
reducción del volumen del medio nos permitió obtener muy buenos resultados, ya que con
este volumen se llevó a cabo el proceso embriogénico.
Al cabo de 21 días de haber inducido a la ES, en el cultivo se comenzaron a observar
estructuras globulares ya de manera más separada y también en estadio corazón como
se muestra en la Figura 68. Después de 42 días de la inducción, el cultivo ya era un poco
más heterogéneo y en él se podían observar embriones en estadio globular, corazones y
torpedos (Figura 6C). Conforme avanzaba el tiempo de cultivo y después de 98 días a la
inducción, en el cultivo ya se observaban embriones cotiledonares muy bien formadas
(Figura 60) . Al finalizar el proceso embriogénico (98 días) , se obtuvieron 200 embriones
en 50 ml, lo que hace un total de 4,000 embriones por litro de medio de cultivo.
50
Capítulo 111
Figura 6. Proceso embriogénico de las especie C. arabica. A) 42 días en medio de
mantenimiento para suspensiones celulares. 8) 21 , C) 42, D) 98 días en medio de
inducción a la ES.
Zamarripa et al. ,20 reportaron un protocolo para la propagación masiva de café en medio
líquido. El desarrollo de embriones somáticos de C. canephora en matraces Erlenmeyer o
en biorreactor produjo hasta 200,000 embriones somáticos. Duces et a/.,21, reportaron una
producción de 600,000 embriones por litro de medio de C. canephora en biorreactor. Van
Boxtel y Berthoull, obtuvieron 120,000 embriones por gramo de inóculo para C.
canephora, 92,300 para Arabusta y 12,300 para C. arabica. Noriega y Sondhal22 lograron
9,000 embriones por litro utilizando biorreactores para el cultivo de suspensiones
celulares de C. arabica, Hermoso-Gallardo y Menendez-Yuffá5 obtuvieron 1,884
embriones en 50 ml de medio de cultivo en la especie C. arabica. Estos datos reportados
son mayores al reportado en el presente trabajo, pero hasta el momento esos datos no
han podido ser repetidos ya que se ha intentado realizar utilizando las mismas
condiciones de cultivo pero no responden . Los datos de este trabajo, presenta una ventaja
a los anteriores reportes, porque de las tres veces que se realizó, respondió de igual
51
•
Capítulo 111
forma . Los cultivos que no fueron inducidos a la embriogénesis y que fueron mantenidos
en medio de propagación, solamente siguieron aumentando en tamaño.
3.5 Cuantificación de proteínas en el medio de cultivo
Se cuantificó el contenido de las proteínas excretadas en el medio de cultivo utilizando la
técnica de Peterson23. En las suspensiones celulares de C. canephora , la concentración
de proteína fue de 6.5 ¡.Jg ¡..JL-1 a los 14 días de cultivo y en la especie C. arabica, la
concentración fue de 2.025 ¡.Jg ¡.JL-1. La concentración de proteína a los 42 días en
condiciones de propagación en la especie C. arabica, fue de 1.21 ¡.Jg ¡.JL-1. Durante la
inducción de la ES en C. arabica, la concentración de proteína fue de 2.84 ¡.Jg iJL-1 en el
día 21 , de 2.21 ¡.Jg ¡..JL-1 a los 42 días y de 1.4 ¡.Jg ¡..JL-1 a los 98 días. Estos datos se
presentan en la Figura 7. Quiroz-Figueroa et a/., 24 reportó la concentración de proteína en
condiciones embriogénicas y no embriogénicas en suspensiones celulares de C. arabica,
donde la concentración de proteína incrementaba conforme los días de cultivo
aumentaba. En condiciones no embriogénicas (14 días) la concentración fue de 0.02405
¡.Jg ¡..JL-1 , que es menor al obtenido en este trabajo. En condiciones embriogénicas (24
días) la concentración fue de 0.00998 ¡.Jg ¡..JL-1 y comparando con el obtenido también es
menor ya que en el día 21 la concentración de proteína fue de 2.84 ¡.Jg ¡.JL-1 .
En un gran número de especies vegetales cultivadas in vitro se ha reportado la presencia
de proteínas extracelulares, como en Hordeum vulgare25 en donde se ha reportado una
concentración de 0.105 ¡.Jg ¡..JL-1 en el día de la resiembra, mientras que en el día 25 de
inducción a la ES la concentración fue de 0.225 ¡.Jg ¡.JL-1. Estos datos son menores a los
reportados en este trabajo. En suspensiones celulares de So/anum tuberosum, se ha
reportado la presencia de proteína extracelular la cual aumenta con la edad del cultivo26.
En Raphanus sativus se observó un comportamiento similar27. Se puede notar claramente
las diferencias en la concentración de proteína extracelular entre las especies
mencionadas, esto hace pensar que estas diferencias podría deberse a la densidad del
inoculo inicial, a las características de los agregados celulares o al estadio fisiológico y
sobre todo a la especie.
52
Capítulo 111
7.0
6.5
6.0
~ 5.5
; 5.0 ::1.. ;;- 4.5 e:
4.0 ]í e 3.5 a. Q) 3.0 "O e: 2.5 :Q
~ 2.0 e:
1.5 ~ e: 1.0 8 0.5
-,...:..
c:J NE C. arabica -C. canephora
- ES c. arabica
0.0 ¡---.. 'T-1- r- -o 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
Tiempo de cultivo (días)
Figura 7. Cuantificación de las proteínas secretadas al medio de cultivo en C. arabica y C.
canephora, en condiciones no embriogénicas (NE) y embriogénicas (ES) . Los días NE
evaluados fueron 14 y 42. ES, fueron 21 , 42, 98. En C. canephora solo se analizó el día
14.
3.6 Análisis electroforético de las proteínas excretadas por los cultivos de C.
canephora y C. arabica bajo condiciones no embriogénicas
Se utilizó la técnica de geles en doble dimensión para observar la presencia de las
proteínas extracelulares en el medio de cultivo bajo condiciones embriogénicas y no
embriogénicas de las dos especies estudiadas. En las condiciones no embriogénicas, los
días analizados fueron de 14 para C. canephora y 14 y 42 para C. arabica. En la Figura
8A, se observa un gel de poliacrilamida al 12.5% en doble dimensión de las proteínas
excretadas en el medio de cultivo a los 14 días en medio de propagación de la especie C.
arabica, en el que se contaron 523 proteína distribuidas en todo el gel con una masa
molecular de 6.5 a 200 kDa y en un rango de pH de 4 a 7.
53
•
Capítulo 111
(~ r PI
\...:_:; MM 4 5 8 7
200
97.4
-66..2 ... . . . 12.5%
31 .. li
21.5 kDa-
• • • 14.4k0a
6.5
® ll => PI
MM 5 • 7 1 1 1
' 12.5%
•
• • •
Figura 8. Comparación de los patrones electroforéticos en geles de poliacrialamida en
segunda dimensión de las proteínas excretadas en medio de mantenimiento para
suspensiones celulares a los 14 d de cultivo. Los geles fueron cargados con 250 ¡.~g de
proteína y teñidos con nitrato de plata. A) C. arabica, se visualizaron 523 proteínas. B) C.
canephora, se visualizaron 173 proteínas.
54
Capítulo 111
En la especie C. canephora bajo las mismas condiciones y en el mismo día se observaron
173 manchas en el gel (Figura 88). Al comparar el perfil proteico de estas dos especies se
puede observar claramente las diferencias en la secreción de proteínas y por lo tanto
presentan perfiles proteicos muy diferentes.
Para los geles de poliacrilamida, se utilizaron tiras de pH de 4 - 7. La razón de utilizar este
rango fue que se realizaron geles preliminares en un rango de pH 3 - 1 O y pH 4 - 7, y se
observó que las manchas se encontraban en la zona de 4 - 7, por IÓ que para tener una
mejor resolución y observar las manchas más separadas se utilizó el rango de pH 4- 7. El
otro punto analizado fue el de 42 días de la especie C. arabica, y se contabilizaron 440
proteínas en todo el gel (figura 9A) .
Quiroz-Figueroa et a/.,24 reportaron el patrón proteico de suspensiones celulares de la
especie C. arabica bajo condiciones embriogénicas y no embriogén icas. Los días
evaluados fueron 14 días en condiciones no embriogénicas, 12, 16 y 24 días en
condiciones embriogénicas. El número de manchas contabilizadas por Quiroz-Figueroa et
a/., 24 en el día 14 bajo condiciones no embriogénicas fue de 22, mientras que los
contabilizados en este presente estudio fue de 523 a los 14 días. Estas diferencias
podrían deberse a la concentración de proteína utilizada, ya que la concentración de
proteína cuantificada era menor al obtenido en este trabajo o de proteasas existentes en
el medio, también pudo ser la manera de precipitar las proteínas, ya que este punto es
importante, porque en el caso de la ad ición de TCA y acetona que fue la técnica que se
utilizó en el presente trabajo, provoca la inactivación y precipitación de la mayoría de las
proteína presentes en el medio de cu ltivo, además de ser un método que presenta la
ventaja de mantener solubles otros componentes celulares que pueden inferir en el
manejo de las prote ínas como sales y compuestos fenólicos.
Los siguientes puntos que se analizaron fueron bajo condiciones embriogénicas. Los días
que se analizaron fueron : 21 , 42 y 98 días y los patrones proteicos se pueden observar en
la Figura 98 (21 d), Figura 10A (42 d) y Figura 108 (98 d). En el día 21 se contabilizaron
379 proteínas, una cantidad menor al contabilizado a los 42 días en condiciones no
embriogén icas. A los 42 días de inducción, se contabilizaron 409 proteínas en todo el gel.
55
•
Capítulo 111
Cuando se compara con el día 21, se observa un aumento en el número de proteínas. El
medio analizado en este día (42) , se observaron embriones en estadio corazón , torpedo y
globulares (Figura 6C) , caso contrario al del día 21 , en el que se observaron embriones
globulares y corazones (Figura 68). A los 98 días de inducción, se contabilizaron 175
proteínas, un número de proteínas menor a los contabilizados en los días anteriores. En
este día los embriones se encuentran en estadio cotiledonar (Figura 60). Quiroz-Figueroa
et a/.,24 contabilizaron 22 proteínas en el día 14 de propagación, pero en los días 16 y 24
de inducción a la ES contabilizaron unas proteínas adi'cionales pero que son muy
inferiores en número a los contabilizadas en este trabajo.
56
0 ,..-----'
PI -~ MM 4
200 kDa
116.25kDa
97.4kDa
66.2 kDa
45kDa
31 kDa
14.4kDa
® r PI
MM
116.25kDa- _
97.4k0a
66.2 kDa
45k0a
21.5 kDa-
14.4kDa-
•
• •
5
5
i
•
Capítulo 111
6 7
12.5%
6 7 '
12.5%
Figura 9. Perfil proteico las proteínas excretadas de C. arabica al medio de cultivo en
condiciones manten imiento y en condiciones embriogénicas observadas en un gel de
poliacrilamida en segunda dimensión . El gel se cargó con 250 ~g de proteína y fue teñ ido
con nitrato de plata . A) 42 días en medio de mantenimiento, se visualizaron 440 proteínas.
B) 21 días en medio de inducción , se contabilizaron 379 proteínas.
57
Capítulo 111
..------'
PI
0 ,_
MM 4 1
200 kDa-
5 6 7
116.25kDa
97.4 kOa
66.2 kOa .. . • •
45 kOa- • 12.5%
• 31 kOa-- ..
• • 21.5 kOa--
14.4 kOa-·
6.5 kOa
® r~ PI
MM 4 5 6 7
200 kOa-
116.25k0a-
97.4 kOa
.. 66.2 kOa
• 45 kOa-
' 12.5%
• 31 kDa·· •
21.5 kOa-
14.4 kOa-
6.5 kOa
Figura 10. Perfil proteico las proteínas excretadas de C. arabica al medio de cultivo en
condiciones embriogénicas observadas en un gel de poliacrilamida en segunda
dimensión. El gel se cargó con 250 ¡Jg de proteína y fue teñido con nitrato de plata . A) 42
días en medio de inducción, se contabilizaron 409 proteínas. O) 98 días en medio de
inducción, se contabilizaron 175 proteínas.
58
Capítulo 111
Ayii-Gutiérrez28, contabilizó 209 proteínas utilizando explantes foliares de C. canephora
para la inducción de la ES. Este número es superior a la cantidad de proteínas secretadas
por las suspensiones celulares de esta misma especie a los 14 días en condiciones
propagación que fue de 173. Hasta el momento no existe otro trabajo reportado sobre las
proteínas extracelulares en el género Coffea en 20-PAGE. En el cuadro 1, se muestran el
número total de proteínas contabilizadas en las distintas condiciones de cu ltivo
(embriogénicas y no embriogénicas) de las dos especies.
Cuadro 1. Comparación de las proteínas presentes en el proceso embriogénico y no
embriogénico de las dos especies de Coffea en los diferentes días del cultivo en el medio.
No. total de proteínas contabil izadas
NE ES
14 d 42 d 21 d 42 d 98 d
C. canephora 173 - - - -
C. arabica 523 440 379 409 175
3.7 Proteínas diferenciales en los diferentes días de cultivo y bajo condiciones
embriogénicas y no embriogénicas.
Después de contabilizar el número de proteínas totales de las dos especies de Coffea , en
los diferentes días de cultivo evaluados tanto en estado embriogénico como no
embriogénico, solamente se analizaron 51 proteínas con un rango de masa molecu lar de
6.5 - 79 kDa, para poder comparar con los distintos días, ya que son las que mostraron
una diferencia en los perfiles proteicos, como se observan en las Figuras 11-13. Cada
proteína está marcada con una flecha en el gel de poliacrilamida en segunda dimensión.
Las flechas en color rojo representan la proteína presente en ese día de cultivo, mientras
que la flecha de color azul representa que la proteína está ausente en ese día. Para
entender y observar estas diferencias, en el Cuadro 2 se enlistan todas las proteínas
59
Capítulo 111
diferenciales que se analizaron con sus respectivas masas moleculares y p/, señalando la
presencia (+) y la ausencia (-) en los diferentes días. En el Cuadro 2, se puede observar
claramente como una proteína se expresa en los diferentes días y en las condiciones
embriogénicas y no embriogénicas. Así como la manera en que una proteína puede estar
presente en una condición y no expresarse en otra, o también , estar presente en las dos
condiciones.
3.7.1 C. canephora
De la cantidad total de proteínas analizadas, solamente 18 estuvieron presentes en C.
canephora y de esa cantidad , tres son exclusivas de esa especie con una masa molecular
de 6.5 kDa pero con diferente punto isoeléctrico.
3.7.2 C. arabica
En C. arabica se encontraron 25 proteínas en estado NE a los 14 días y también a los 42
días en la misma condición . A los 21 días de inducción se observaron 23 proteínas, 20 a
los 42 días y 18 a los 98 días de la inducción .
Se observo que conforme aumentaba los días de cultivo en la condición embriogénica, la
secreción de proteínas reveladas en el gel disminuía, haciendo referente a trabajos
publicados donde señalan que la cantidad de proteínas excretadas durante la
embriogénesis disminuye conforme se van pasando a los diferentes estadios de
desarrollo (globular, corazón , torpedo, cotiledonar) . Solamente dos de las proteínas se
expresaron constitutivamente en esta especie y fueron las proteínas marcadas con los
números 7 y 8. Las proteínas 11 , 12, 19 y 20, son exclusivas en condiciones NE. Se
encontraron 16 proteínas exclusivas en condiciones de inducción.
Las proteínas marcadas con los números 33, 34, 35, 36, 37, 38 y 39 se encontraron
presentes solamente en condiciones no embriogénicas incluyendo hasta C. canephora .
En el caso de las proteínas 43, 44, 45 y 47 se observaron a las 42 días en NE, pero
también se observó en C. canephora. Las proteínas 21 , 41 , 42, 50 y 51 , son proteínas
exclusivas del día 14 en la misma condición . Las proteínas 9, 11 , 19, 20 y 23, son
exclusivas en condiciones NE, el 18 se expresa en el día 42 y por lo tanto ausentes en
60
Capítulo 111
condiciones embriogénicas, en cambio el 40 con una masa molecular de 27 kDa, se
encontró solo en el día 21 de inducción. De igual modo existen proteínas que se
expresaron desde el inicio del cultivo, pero conforme avanzó los días disminuyó su
expresión hasta llegar estar ausente, como es el caso de las proteínas 1 O y 22, que
desapareció en el día 98 en ES.
De las proteínas analizadas, se encontraron unas que de acuerdo con la literatura,
pueden estar relacionados con el proceso embriogénico. Unas proteínas de 28 y 32 kDa
que han sido reportados por participar en los mecanismos de' defensa en plantas.
También proteínas que van de 22 a 33 kDa que se encontraron presentes exclusivamente
en condiciones no embriogénicas.
Esta comparación nos proporción una idea más clara de cómo las proteínas están
participando durante el proceso embriogénico y el papel que puedan desempeñar.
61
Capítulo 111
Figura 11 . Análisis comparativo de las proteínas diferenciales en los diferentes días de
cultivo en las dos especie de Coffea, en estado embriogénico y no embriogénico. A) C.
canephora a los 14 días en condiciones no embriogénicas. 8) C. arabica a los 14 días en
condiciones no embriogénicas. Las flechas rojas representan la proteína presente en ese
día y las flechas azules la ausencia de esa proteína.
62
•
PI J,
MM 4 5
200 kDa
116.25kDa
97.4kDa
66.2 kDa
15 45 kDa ,,,
40 24
1 31 kDa 3D
21 .5 kDa-
32 1 1 n2r 25
)~ 1 2& 1 • 1 1
14.4 kDa
6.5 kDa
200 kDa
116.25kDa
97.4 kDa
66.2 kDa
27 25
26
l
43 44 45-
IH 46 0:7 49
1 ,y
'"
. 23
1
23
• '6 ~ 1
1 1 18
1 " • \ •
22 /
5' 52
1 1
ta '9
2! 1 1 \
Capítulo 111
6 7
.. "' 12.5%
•9
1 2Q
1
®
12.5%
2~
1
Figura 12. Análisis comparativo de las proteínas diferenciales en los diferentes días de
cultivo de las dos especie de Coffea , en estado embriogénico y no embriogénico. A) C.
arabica a los 42 días en condiciones no embriogénicas. B) , C. arabica en condiciones
embriogénicas a los 21 . Las flechas rojas representan la proteína presente en ese día y
las flechas azules la ausencia de esa proteína.
63
\
Capítulo 111
r- PI
MM 5 6 7 . 200 kDa 0 116.25kDa
' ..... 97.4 kDa
3
11 L . 66.2 kDa '/
7 8 i ¡· 'f,,.) " 14 15 •
45 kDa 6 • ,,. \ •o
/ ·e 12.5%
•o 1 17
1 36:>.: ,, 1 31 kDa- \ 1' 32¡ r \ ,.
3& 35 39 1 1 1 l' zs ¡s 18 19
1 / 33 29j • 23 21 1 ' 20 / 1 í \ 1 21.5 kDa-22 ., /
14.4 kDa- 1 ., 50
1 .;3 .u 45 •• .!1 ..:g 11' 1 11 1 ,y 6.5 kDa
200 kDa B
97.4 kDa
66.2 kDa
78 q , , ..
45 kDa " 11 ~ / '' 15 .. , / ' 0 ,,
16 12.5%
1 •7 '0
' 1 j\ . 1 ,. • \ • 30
393 35 1 1 1 1 27 .. ..
32 . 28 1 25 ,, ' 1 / '3 1 312S f 2(; 1 23 .o . \ 1 ,.,
1 . / 22
41 14.4 kDa- 1 42 ir 1 43 ~~S •• '' ~SI
6.5 kDa· llf 1 l'i
Figura 13. Análisis comparativo de las proteínas diferenciales en los diferentes días de
cultivo de las dos especie de Coffea , en estado embriogénico y no embriogénico. A) C.
arabica a los 42 días en condiciones no embriogénicas. B) C. arabica a los 98 días en
condiciones no embriogénicas. Las flechas rojas representan la proteína presente en ese
día y las flechas azules la ausencia de esa proteína.
64
•
Capítulo 111
Cuadro 2. Análisis de las proteínas diferenciales en las dos especies de Coffea , en los
distintos días de cultivo, en condiciones no embriogénicas y embriogénicas, indicándose
la masa molecular (MM), el punto isoeléctrico (p/) y el número otorgado a dicha proteína.
(+)representa la presencia de la proteína y(-) la ausencia de la proteína.
C. arabica MM p/ No. de C. NE ES k Da proteína canephora 14 42d 21 42 98 d
14 d NE .
d d d 79 4.55 1 - - - + + + 79 4.6 2 - - - + + + 63 4.55 3 - - - + + + 63 4.6 4 - - - + + + 34 4.15 5 - - - + - -40 4.52 6 - + + + + -48 4.52 7 - + + + + + 48 4.55 8 - + + + + + 48 4.65 9 - + + - - -39 4.55 10 - + + + + -48 4.67 11 - + + - - -50 4.75 12 + + + - - -48 4.7 13 + + + - - -39 5.3 14 - - - + + + 42 5.32 15 - - - + + + 32 5.4 16 - - - + + + 28 5.52 17 - - - + + + 16 5.97 18 - - + - - -16 6.12 19 - + + - - -15 6.6 20 - + + - - -15 5.97 21 + + - - - -15 5.50 22 - + + + + -17 5.42 23 - + + - - -33 5.20 24 + + + - - -23 5.35 25 - - - + + + 18 5.25 26 - - - + + + 26 5.1 27 - - - + + + 21 5.02 28 - - - + + + 19 4.97 29 - - - + + + 29 4.87 30 - - - + + + 20 4.8 31 - - - + + + 23 4.8 32 - - - + + + 22 4.55 33 + + + - - -33 4.57 34 + + + - - -25 4.55 35 + + + - - -
65
Capítulo 111
32 4.5 36 + + + - - -33 4.5 37 + + + - - -25 4.45 38 + + + - - -24 4.45 39 + + + - - -27 4.25 40 - - - + - -12 4.07 41 - + - - - -11 4.32 42 - + - - - -6.5 4.57 43 + - + - - -6.5 4.7 44 + - + - - -6.5 4.72 45 + - + - - -6.5 4,97 46 + - - - - -6.5 5.2 47 + - + - - -6.5 5.35 48 + - - - - -6.5 5.3 49 + - - - - -7.2 5.65 50 - + - - - -6.9 5.72 51 - + - - - -
De Jong et a/., 29 reportaron una proteína con actividad de quitinasa con una masa
molecular de 32 kDa y un punto isoeléctrico de 3.6, que es capaz de restaurar la ES en la
mutante ts11 , a 24°C, el proceso de la ES es normal , pero a 32°C, la ES se detiene. Se
ha reportado la presencia de proteínas de 25, 30, 32 y 33 kDa con actividad de
quitinasa30. Las quitinasas liberadas al medio de cultivo en O. carota y en P. abies influyen
en el desarrollo del embrión29·31 y podrían estar jugando un papel central en la defensa de
las plantas ya que se han relacionado con los mecanismos de defensa. Ciarrocchi et a/.,32
reportaron una proteína de 40 kDa, una fosfatasa, en suspensiones celulares de
zanahoria. La proteína con número 6, tiene la misma masa molecular al reportado pero
con un p/ distinto.
Se ha reportado que proteínas de masa molecular entre 9 y 1 O kDa, participan en la
embriogénesis, estas proteínas se han relacionado con las proteínas transferidoras de
lípidos33·34
, en cebada y trigo se han detectado pr~teínas con una masa molecular de 7
kDa35·36
. Ayii-Gutierrez28, encontró 19 proteínas de masa molecular pequeña
comprendidas en un rango de 7 a 30 kDa en C. canephora. En este trabajo se
encontraron 11 proteínas de baja masa molecular en un rango de 6.5 a 12 kDa, esto hace
también pensar que algunas de estas proteínas correspondan a las ya mencionadas. Las
proteínas con masa molecular de 6.9 y 7.2 kDa, son exclusivas en C. arabica a los 14
días en condiciones NE. Solamente se analizaron dos proteínas de masa molecular de 79
66
•
/
Capítulo 111
kDa y las dos presentan las misma masa pero con distinto p/. Estas dos proteínas son
exclusivas en C. arabica con ES.
3.8 Análisis de las proteínas presentes en los diferentes días de cultivo en 3D
Para tener una mejor diferenciación entre una proteína y otra expresadas en los diferentes
días de cultivo y bajo condiciones embriogénicas y no embriogénicas, los geles se
analizaron con el software Melanie lmage Master. Este software permite mostrar de
manera tridimensional una proteína que se encuentra en el gel y nos permite a la vez
observar como ésta cambia de concentración por medio de picos en los diferentes
tratamientos.
Con esta herramienta permitió visualizar manchas que a simple vista no se logró observar
y tener una idea más clara de cómo las proteínas va cambiando en concentración así
como su expresión a lo largo de un ciclo de cultivo. También se puede analizar con mayor
exactitud cuando las proteínas se encontraron en una sola condición y nos ayudó a
entender el papel central que éstas puedan tener durante la ES.
En la Figura 15, se pueden observar claramente las diferencias de las proteínas presentes
en el medio de cultivo, en donde las proteínas marcadas con el número 6 y 10 claramente
desaparecen a los 98 días en el medio de inducción, pero es a los 21 días en medio de
inducción, donde la concentración se hace más notable. Así también, se pueden observar
otras proteínas que cambian en concentración en los diferentes días de cultivo.
67
•
Capítulo JI/
Figura 14. Análisis en 30 de las proteínas 6 y 1 O presentes en el medio de cultivo en
condiciones embriogénicas y no embriogénicas de la especie C. arabica reveladas en el
gel de poliacrilamida, utilizando el software Melanie lmage Master. A) 42 días en NE. 8)
21 , C) 42, D) 98 días en ES.
En la Figura 16, se pueden observar las proteínas analizadas en las dos condiciones
(embriogén icas y no embriogénicas). Las proteínas 33, 35, 38, 39, se encuentran
presentes a los 42 días en medio de propagación, mientras que en los días 21 , 42 y 98 de
inducción se encuentran ausentes, por lo que puede sugerirse que estas proteínas se
expresan sólo bajo condiciones no embriogénicas. Por el contrario, en la Figura 17
podemos ver que las proteínas 16 y 17 se encuentran ausente a los 42 días en medio de
propagación, pero están presentes en los días de inducción (21 , 42 y 98) . Se puede ver
68
Capítulo 111
que la proteína 16 se encuentra en mayor concentración en el día 21 , pero conforme los
días aumentan comienza a disminuir. La proteína 17, al día 42 en el medio de inducción,
disminuye ligeramente, pero al día 98 aumenta de nuevo. Estas proteínas se expresan
exclusivamente en la ES.
\:.35
38 '
\ ~ 39
39 33
1 ~ 39
33 :¡
Figura 15. Anál isis en 3D de las proteínas 33, 35, 38 y 39 presentes en el medio de
cultivo en condiciones embriogénicas y no embriogénicas de la especie C. arabica
reveladas en el gel de poliacrilamida, utilizando el software Melanie lmage Master. A) 42
días en NE. 8) 21, C) 42, D) 98 días en ES.
69
•
Capítulo 111
Figura 16. Análisis en 30 de las proteínas 16 y 17 presentes en el medio de cultivo en
condiciones embriogénicas y no embriogénicas de la especie C. arabica reveladas en el
gel de poliacrilamida, utilizando el software Melanie lmage Master. A) 42 días en NE. B)
21 , C) 42 , D) 98 días en ES.
3.9 Discusión
Una amplia cantidad de especies de plantas excretan proteínas al medio de cultivo y se
han detectado que estas proteínas pudieran servir como posibles marcadores a la ES,
pero en pocos casos se ha demostrado una verdadera relación entre las proteínas
detectadas y el proceso embriogénico, por lo tanto algunas de estas proteínas juegan un
papel importante en el desarrollo de la ES ya sea promoviéndolo o inhibiéndolo37. Entre
70
•
Capítulo 111
las proteínas que tiene la capacidad de promover la ES, esta una con actividad
peroxidasa38, las quitinasas que se han observado estar relacionadas durante la
embriogénesis39, las arabinogalactoproteínas son excretadas al medio de cultivo y
promueven la inducción a la ES4.
En H. vulgare se han encontrado 50 proteínas entre 1 O y 90 kDa secretados por
suspensiones celulares embriogénicas25. Mo et al., 31 reportó 28 proteínas entre 16 y 96
kDa en dos líneas de P. abies, una embriogénica y otra no embriogénica de las cuales el
50 % de las proteínas analizadas se expresan constitutivamente en las dos líneas, el 11%
son proteínas que exclusivas de la línea embriogénica, 25% de la NE y 15% según el tipo
de cultivo uti lizado. De las 51 proteínas analizadas y que se enlistan en el cuadro 2, el
10% son proteínas que se expresan constitutivamente, el 35 % se expresan
exclusivamente en condiciones embriogénicas y 55% en condiciones NE. Como se puede
notar, la mayor cantidad de las proteínas analizadas se expresan en condiciones NE,
caso contrario al reportado por Mo et a/., 31 donde la mayor cantidad de proteínas
analizadas se expresan constitutivamente.
De las proteínas que inhiben la ES, Coutos-Thevenot et a/., 40 observaron un efecto de
inh ibición en la embriogénesis somática util izando como modelo de estudio suspensiones
celulares de uva, concluyendo que son las moléculas extracelulares mayores de 1 O kDa
las involucradas. De las proteínas enlistadas en el cuadro 2, dos de ellas presentaron
pesos de 11 y 12 kDa y se expresaron exclusivamente en el día 14 en la especie C.
arabica en condiciones no embriogénicas lo que hace pensar que estas proteínas podrían
también tener un efecto en la inhibición de la embriogénesis ya que solamente se
expresan en condiciones NE. También se ha reportado que masas moleculares por
debajo de 3.5 kDa inhiben la ES17, en este caso de las 51 proteínas analizadas (cuadro 2)
la de menor masa molecular fue de 6.5 kDa y la masa más alta fue de 79 kDa. Gavish et
a/.,19 utilizando cultivos de Citrus aurantium, determinaron que la presencia de proteínas
glucosiladas de entre 53 y 57 kDa afectan el desarrollo normal de los embriones por lo
tanto se requiere de la ausencia de estas proteínas, pero encontraron una de 42 kDa
relacionada con el desarrollo de los embriones, aquí se reporta una con la misma masa
molecular y que también podría estar asociada con el proceso embriogénico ya que se
encontró exclusivamente durante la inducción a la embriogénesis somática. En el caso de
71
Capítulo 111
las proteínas que promueven la ES, se ha reportado una proteína glucosilada de 32 kDa y
que después fue purificada del medio de cultivo en suspensiones celulares de zanahoria
resultando ser una endoquitinasa ácida29. En este trabajo, la proteína número 16 con
masa molecular de 32 kDa se expresa exclusivamente durante la embriogénesis
somática , lo que hace especular que probablemente esta proteína sea una quitinasa.
También se enlista otra proteína con la misma masa molecular pero con diferente punto
isoeléctrico (número 36) , esta solo se expresa en condiciones NE, pero si la relacionamos
con la otra de la misma MM, se puede concluir que esta proteina está presente en las dos
condiciones y que está relacionada en la ES como ha sido demostrado en trabajos ya
reportados. También se puede observar dentro de las proteínas analizadas una de 18 kDa
encontrada únicamente en condiciones embriogénicas, Menéndez et a/.,4 1 reportó una
proteína de 18 kDa y que también se encuentra exclusivamente en la ES.
Mo et a/.,31, analizó una proteína de 28 kDa que se expresa solamente en la línea
embriogénica de P. abies y que está relacionada con los mecanismos de defensa en la
planta. En las proteínas analizadas en este trabajo, también se analizó una de 28 kDa y
de la misma manera a la reportada, solo se expresa durante la ES, entonces lo más
probable es de que también esté involucrada en la defensa de la planta así como también
se le ha relacionado a la quitinasa.
Con base a lo anterior, hasta ahora se conoce que son pocas las proteínas que
intervienen en ES y es por ello que grupos investigación se ha dedicado a estudiar las
proteínas que son excretadas por los vegetales con el objetivo de conocer que otras están
realmente involucradas con la embriogénesis somática y así tener un panorama más
amplio sobre el papel que estas puedan tener durante este proceso y para que estas
puedan ser adicionadas a los medios de cultivo a especies que no respondan a la
embriogénesis como se han reportado, como por · ejemplo Egertsdotter et al. ,42
determinaron que la adición de proteínas extracelulares de una línea embriogénica normal
a una línea embriogénica anormal, tiene la capacidad de restaurar la morfología de los
embriones.
72
Capítulo 111
REFERENCIAS
1. Murashige,T. & Skoog,F. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).
2. Sondahi ,M.R. & Sharp,W.R. High frequency induction of somatic embryos in cultured
leaf explants of Coffea arabica L. Z. Pflanzenphysiol. 81 , 395-408 (1977) .
3. Van Boxtei ,J. & Berthouly,M. High frequency somatic embryogenesis from coffee
leaves. Factors influencing embryogenesis, and subsequent proliferation and
regeneration in liquid medium. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 44, 7-17 (1996).
4. Kreuger,M. & Van Holst,G.J. Arabinogalactan proteins are essential in somatic
embryogenesis of Daucus carota L. Planta 189, 243-248 (1993) .
5. Hermoso-Gallardo,L. & Menéndez-Yuffá,A. Multiplicación masiva del cate (Coffea
arabica L. cv. Catimor) mediante cultivo de suspensiones celulares embriogénicas.
Botanica 51 , 90-95 (2000) .
6. Thomas,E. & Davey,M.R. From Single Cells to Plants. (Wykeham Publications
(London) LTD, London; 1975).
7. Kwa,S.H. , Wee,Y.C., Lim,T.M., & Kumar,P.P. Establishment and physiological
analyses of photoautotrophic callus cultures of the fern Platycerium coronarium
(Koenig) Desv under C02 enrichment. J. Exp. Bot. 46, 1535-1542 (1995) .
8. Burns,J.A. & Wetzstein,H.Y. Development and characterization of embryogenic
suspension cultures of pecan. Plant Ce/1 Tiss. Org. Cult. 48; 93-102 (1997) .
9. Rose,D. & Martin,S.M. Parameters for growth measurement in suspension cultures
of plant cells. Can. J. Bot. 52, 903-912 (1974).
10. Carrasco,G. & lzquierdo,J. La empresa hidroponica a mediana escala: la técnica de
la solución nutritiva recirculante ("NFT") . (Chile; 1996).
73
Capítulo 111
11. George,E.F. in Plant propagation by tissue culture. Part 1, Vol. 1, Edn. 2"d. ed.
George,E.F. 3-36 (Exegetics Limited, England; 1993).
12. Schubert,K.R. Products of biological nitrogen fixation in higher plants: synthesis,
transport, and metabolism. Annu. Rev. Plant Physiol. 37, 539-574 (1986).
13. Martin,S.M. & Rose,D. Growth of plant cell (lpomoea) suspension cultures at
controlled pH levels. Can. J. Bot. 54, 1264-1270 (1976). •
14. Gautam,V.K., Nanda,K. , & Gupta,S.C. Development of shoots and roots in anther
derived callus of Azadirachta indica A. Juss. A medicinal tree. Plant Ce// Tiss. Org.
Cult. 34, 13-18 (1993) .
15. Szabados,M., Mroginski ,L.A., & Roca,W. in CULTIVO DE TEJIDOS EN LA
AGRICULTURA. Fundamentos y aplicaciones. eds. Roca ,W.M. & Mroginski,L.A.
173-195 (CIAT, Cali; 1993).
16. Osuga,K. , Kamada,H., & Komamine,A. Cell density is an important factor for
synchronization of the late stage of somatic embryogenesis at high frequency. Plant
Tiss. Cult. Lett. 1 O, 180-183 ( 1993).
17. Kobayashi,T., Higashi,K., & Kamada,H. lhibitory effects of p-hydroxybenzyl alcohol
on somatic embryogenesis in carrot cell cultures. Plant Biotechnology 17, 87-92
(2000).
18. Umehara,M. , Ogita,S ., Sasamoto,H., Koshino ,H., Asami ,T. , Fujioka,S., Yoshida,S., &
Kamada,H. ldentification of a novel factor, vanillyl benzyl ether, which inhibits
somatic embryogenesis of Japanese larch (Larix . leptolepis Gordon). Plant Ce//
Physiol. 46, 445-453 (2005).
19. Gavish,H., Vardi,A., & Fluhr,R. Suppression of somatic embryogenesis in Citrus cell
cultures by extracellular proteins. Planta 186, 511-517 (1992).
20. Zamarripa,C.A. , Ducos,J.P. , Tessereau,H., Bollon,H., Eskes,A.B., & Pétiard ,V. in 14é
Colloque Scientifique lnternationale sur le Café 392-402 (Association Scientifique
lnternationale du Café, Paris; 1991 ).
74
Capítulo 111
21 . Ducos, J. P., Zamarripa, C. A., Eskes, A. B., and Pétiard, V. Production of somatic
embryos of coffee in a bioreactor. 15é Colloque Scientifique lnternationale sur le
Café. 89-96. 1993. Paris, Association Scientifique lnternationale du Café.
22. Noriega, C. and Sóndahl , M. R. Arabica coffee micropropagation through somatic
embryogenesis via bioreactors. 15é Colloque Scientifique lnternationale sur le Café.
73-81 . 1993. Paris, Association Scientifique lnternationale du Café.
23. Peterson,G.L. A simplification of protein assay method of Lowry et al. which is more
generally applicable. Anal. Biochem. 83, 346-356 (1977) .
24. Quiroz-Figueroa,F.R., Kú-Rodríguez,S.C., & Loyola-Vargas,V.M. Patrón proteíco
extracelular durante la embriogénesis somática en suspensiones celulares de Coffea
arabica L. Rev. Soc. Quím. Méx. 46, 259-263 (2002).
25. Nielsen,K.A. & Hansen,I.B. Appearance of extracellular proteins associated with
somatic embryogenesis in suspension cultures of barley (Hordeum vulgare L.). J.
Plant Physiol. 139, 489-497 (1992).
26. Bredemeijer,G.M.M. , Burg,H.C.J., Sree Ramulu,K., & Dijkhuis,P. Release of
peroxidases by cultured patato cells. Acta Bot. Need. 34, 325-335 (1985).
27. Moreno-Valenzuela,O.A., Vazquez-Duhalt,R. , & Ochoa,J.L. Peroxidase activity in
calluses and cell suspension cultures of radish Raphanus sativus var. Cherry Bell.
P/ant Ce// Tiss. Org. Cult. 18, 321-327 (1989) .
28. Ayii-Gutierrez,B.A. Estudio del secretoma de Coffea canephora durante su
embriogénesis somática. Tesis maestria (CICY, Mérida; 2009) .
29. De Jong,A.J., Cordewener,J ., Lo Schiavo,F. , Terzi ,M., Vandekerckhove,J., Van
Kammen,A., & De Vries,S.C. A carrot somatic embryo mutant is rescued by
chitinase. Plant Ce/14, 425-433 (1992).
30. Jayasankar,S. & Litz,R.E. Characterization of embryogenic mango cultures selected
for resistance to Colletotrichum gloeosporioides culture filtrate and phytotoxin . Theor.
Appl. Genet. 96, 823-831 (1998).
75
Capítulo 111
31 . Mo,L.H., Egertsdotter,U., & Von Arnold,S. Secretion of specific extracellular proteins
by somatic embryos of Picea abies is dependent on embryo morphology. Ann. Bot.
77, 143-152 (1996).
32. Ciarrocchi,G., Cella,R., & Nielsen,E. Release of nucleotide-cleaving acid
phosphatase from carrot cells grown in suspension culture. Physiol. Plant. 53, 375-
377(1981).
33. Blanckaert,A., Belingheri,L., Vasseur,J., & Hilbert,J .L. Changes in lipid composition
during somatic embryogenesis in leaves of Cichorium. Plant Sci. 157, 165-172
(2000).
34. Coutos-Thevenot,P., Jouenne,T., Maes,O., Guerbette,F., Grosbois,M ., Le Caer,J.F.,
Boulay,M., Deloire,A., Kader,J.C., & Guern ,J. Four 9-kDa proteins excreted by
somatic embryos of grapevine are isoforms of lipid-transfer proteins. Eur. J.
Biochem. 217, 885-889 (1993) .
35. Désormeaux,A., Blochet,J .E., Pézolet,M ., & Marion,D. Amino acid sequence of a
non-specific wheat phospholipids transfer protein and its conformation as revealed
by infrared and Raman spectroscopy: role of disulfide bridges and phospholipids in
the stabilization of the a-helix structure. Biochim. Biophys. Acta 1121, 137-152
(1992).
36. Kalla,R. , Shimamoto,K., Potter,R., Nielsen,P.S. , Linnestad,C., & Olsen,O.A. The
prometer of the barley aleurone-specific gene encoding a putative 7 -kDa lipid
transfer protein confers aleurone cell-specific expression in transgenic rice. Plant J.
6, 849-860 (1994) .
37. Van Engelen,F.A. & De Vries,S.C. Extracellular proteins in plant embryogenesis.
Trends Genet. 8, 66-70 (1992).
38. Cordewener,J., Booij ,H., Van der Zandt,H ., Van Engelen,F.A. , Van Kammen,A. , &
De Vries,S .C. Tunicamycin-inhibited carrot somatic embryogenesis can be restored
by secreted cationic peroxidase isoenzymes. Planta 184, 478-486 (1991 ).
76
•
Capítulo 111
39. Rojas-Herrera ,R. & Loyola-Vargas,V.M. lnduction of a class 111 acidic chitanse in
foliar explants of Coffea arabica L. during somatic embryogenesis and wounding.
P/ant Sci. 163, 705-711 (2002).
40 . Coutos-Thevenot,P. , Maes,O., Jouenne,T., Mauro,M.C., Boulay,M ., Deloire,A. , &
Guern ,J. Extracellular protein pattern of grapevine cell suspensions in embryogenic
and non-embryogenic situations. Plant Sci. 86, 137-145 (1992) .
41. Menéndez,A. , de Garcia,E.G., & Nieto,M.S. Comparative study of protein
electrophoretic patterns during embryogenesis in Coffea arabica cv Catimor. Plant
Ce// Rep. 13, 197-202 (1994).
42 . Egertsdotter,U. & Van Arnold ,S. lmportance of arabinogalactan proteins for the
development of somatic embryos of Norway spruce (Picea abies). Physio/. Plant. 93,
334-345 (1995) .
77
•
Capítulo 111
78
•
Capítulo IV
CONCLUSIONES
Capítulo IV
Las dos especies de Coffea responden de manera diferencial a la inducción de la ES. El
número de embriones somáticos obtenidos de C. arabica es menor al reportado en la
literatura
El número de proteínas secretadas por los cultivos de C. arabica es superior al de las
proteínas secretadas por C. canephora bajo las mismas condiciones de cultivo, y se
encontraron proteínas en arabica relacionadas a la inhibición de la embriogénesis (11 y 12
kDa) , lo que hacer pensar que probablemente estas proteínas estén afectando el
desarrollo embriogénico en esta especie. También se encontraron proteínas relacionadas
con los mecanismos de defensa, otras relacionadas a la ES y que las otras encontradas
en este trabajo y que se expresan exclusivamente en las condiciones embriogénicas de
arabica se podrían relacionar a este proceso como los reportados en la literatura.
Bajo condiciones embriogénicas las proteínas secretadas por C. arabica al medio de
cultivo disminuyen en cantidad y concentración conforme avanza el proceso embriogénico
y se logró observar que existen proteínas que se secretan al medio de cultivo en forma
exclusiva tanto en condiciones embriogénicas como no embriogénicas.
Con los resultados obtenidos en este trabajo nos permite conocer como el perfil proteico
en coffea spp. cambia de acuerdo con los días de cultivo en las condiciones
embriogénicas y NE y ser de utilidad para poder identificar una proteína o varias proteínas
de interés que estén relacionados a la ES e incluirlo en el sistema de arabica para
conocer si adicionando estas promovería la embriogénesis y obtener los resultados como
se ha real izado en otros sistemas no embriogénicos.
79
Capítulo IV
80
Capítulo V
PERSPECTIVAS
Capítulo V
Con base a los resultados obtenidos en este trabajo y con los diferentes perfiles proteicos
observados en las dos especies estudiadas, el siguiente paso deberá ser la identificación
de las proteínas que son secretadas en los diferentes días y en las diferentes condiciones
embriogénicas. Ya que se pudo ver que existen proteínas exclusivas en el proceso
embriogénico y otras que solamente se encuentran presentes en el sistema no
embriogénico. La identidad de las proteínas servirá para comparar con las proteínas ya
reportadas en la literatura y que se han sugerido que pueden estar involucradas en la
inducción de la ES como son las quitinasas, peroxidasas, glucanasas por mencionar
algunas. También inducir a la embriogénesis de C. canephora.
81