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Cintica y termodinmica de trigo desgrasada reaccin enzimlisis protenas degermen con pretratamiento ultrasnico Wenjuan Qu la , Haile Ma la , , ! , in

"iu la , #ong$ai %l la , &$ongli Pan la , 'rnest '(o) *+ano una, do la 'scuela de*limentos e ngeniera iolgica de la -ni.ersidad de /iangsu, 01 2ue3u #oad,&$enjiang, /iangsu 41410, C$ina segundo "a+oratorio cla.e paraprocesamiento 3sico de los productos agrcolas, &$enjiang, /iangsu 41410,C$ina do 5epartamento de ngeniera *grcola de la -ni.ersidad de CapeCoast, Cape Coast, 6$ana articlein3o "a $istoria del artculo7 #eci+ido 0 dediciem+re 414 #eci+ido en 3orma re.isada 18 de a+ril 410 *ceptado 49 dea+ril 410 5isponi+le en lnea 9 de mayo 410 Pala+ras cla.e7 Protenas degermen de trigo "os polipptidos -ltrasonido Cintica :ermodinmica a+stracto'sta in.estigacin e;plora el mecanismo de pre? 'l enzymolysiscintica de la reaccin y la termodinmica se estudiaron despus deultrasonidos pretratamientos usando un sonicador de tipo sonda y un +a@o delimpieza por ultrasonidos, y los resultados 3ueron com< comparado conenzimlisis tradicional? "os resultados mostraron Aue tanto la pre tradicional yultrasnica tratado enzimlisis adaptarse +ien a una cintica de primer orden?

:anto la temperatura y el ultrasonido tenan un positi.o e3ectuar en elenzimlisis de 5W6P, con la temperatura juega un papel dominante? ajo elcon< optimizado condiciones de concentracin 5W6P de 1B =) .>, laconcentracin de *lcalase de 4? - g, el tiempo de 1 min y la temperaturaperatura de 8 D C, tanto la sonda y la limpieza de cu+as para enzimlisispretratados mostr alta concentraciones de polipptido =401?19 y 401?04 lg ml> y de +aja energa reAuisitos? 'n comparacin con enzymolysis

tradicional, estos mtodos aumentaron signiEcati.amente la constante de.elocidad de reaccin =(> por 1FF,GB y 1,B, 94,9B y I8,GB, 4I,B y4I,B, 1F,1B y 14,9B a los 4, 0, y 8 D C, y disminucin de la energa deacti.acin =' la >, 'ntalpa de acti.acin = re H>, energa li+re de 6i++s deacti.acin = re 6> y la entropa de la acti.acin = re J> por FI?FB y F4?B,G?1B y FG?8B, 0?0B y 01?4B, 1?B y 1?0B? 'llo se puede concluir Aue eltratamiento pre.io de ultrasonidos de 5W6P puede mejorar nota+lemente laeEciencia enzimlisis eEciencia y, en consecuencia conduce a la produccin deun mayor rendimiento del polipptido? K 410 'lse.ier :odos los derec$osreser.ados? 1? ntroduccin 'l germen de trigo, rico en contenido de protenas=0B>, es un pro< potencial protena de recursos para producir polipptidos

+iolgicos L1? :radicin cional polipptido produccin mtodos incluir autolisis,la 3ermentacin y la $idrlisis enzimtica L4

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adecuado? Por lo tanto, $ay una gran la demanda para el desarrollo de mtodosms eEcientes a enzimlisis superar estas deEciencias? #ecientemente, $ayestudios realizados so+re la enzima estructural cam+ios y mejoras en laeEciencia enzimlisis usando un ultra< tecnologa de sonido LI,9? Por ejemplo,Ma et al? L1 $an in3ormado Aue el ultrasonido aumenta la acti.idad especEcade la enzima de+ido a la *lcalase superEcie cam+io estructural al aumentar elnNmero de tript3ano y reducir el nNmero de espiral al azar? J$a$ y 6upta L11$an indicado Aue el pretratamiento ultrasnico mejorado la acti.idad especEcade la enzima y por lo tanto acelera la en< &yme 1I estudiar los e3ectos de "a sonday el +a@o de limpieza pretratamientos ultrasnicos en la enzi< cintica de lareaccin molysis a di3erentes temperaturas y tiempos, =4> determinar losparmetros termodinmicos de la sonda y limpieza ing +a@o enzimlisis

pretratados ultrasnica a di3erente temperatura turas, y =0> comparar lacintica de reaccin y termodinmica parmetros de ultrasonidos pretrataronenzymolysis con la de tradicin enzimlisis cional? 'sta in.estigacin se utilizpara e;plicar el meca< nismo de accin de ultrasonido en la reaccinenzymolysis de 5W6P y predecir la produccin de polipptidos, Aue puedeproporcionar la t$eoret< +ase ical y apoyo tecnolgico para nue.asin.estigaciones en poli< la produccin de pptidos? 4? Materiales y mtodos 4?1?Materiales y reacti.os 6ermen de trigo desgrasado =5W6> se o+tu.o de *n

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yang Hom+re< tian;ue Sood Manu3acturing Co?, "td? =Henan, C$ina>? *lcalasa4?"S6, con la acti.idad de 4?FG - g y recomend temperatura tura de 8 DC y pH 9, .alor, se adAuiri en To.ozymes Co?, "td =:ianjin, C$ina>? *l+Nminade suero +o.ino =J*>, diastasa, so< cloruro de cido 5ium =TaCl>, $idr;ido desodio =TaH>, clor$drico =HCl>, car+onato de sodio =Ta 4 C 0 >, Jul3ato deco+re penta$idratado =CuJ *8H 4 >, tartrato de sodio, tungstato de sodio=Ta 4 W *4$ 4 >, moli+dato de sodio =Ta 4 Mugir *4$ 4 >, cido3os3rico =H 0 correos >, "it$< sul3ato de ium ="i 4 *J Q-' *H 4 >, y el+romo lAuido se adAuirieron de Jinop$arm *gentes Aumicos Co?, "td=J$ang$ai, C$ina>? :odo all< agentes 3ueron de grado analtico? #eacti.o deSolin

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ultrasonidos utilizando un tipo de sonda de ultrasonidos y un +a@o de limpiezapor ultrasonidos? -n .olumen de 1 " de 4B =) .> de solucin 5W6P se pusoen un 18 " cu+as para limpieza eAuipado con el superior y el in3erior emisoresde ultrasonido planas =distancia de G cm>? 'sta limpieza ultrasnica +a@o, Aue3ue 3a+ricado por la -ni.ersidad de /iangsu, tiene 3uncin modos de operacin3recuencia de +arrido y el 3uncionamiento por impulsos? por ejemplo, laoperacin de 3recuencia de +arrido se reEere al +arrido cuencia ciclo cuenciade aumentar periodo del 44 al 4F (Hz y decreciente ing del 4F al 44 (Hz con lamisma .elocidad lineal en el 3orma de un tringulo issceles? Por lo tanto la3recuencia de +arrido es re< portado como 4 4 (Hz y un perodo de aumentode ms una disminucin perodo se deEne como un tiempo de ciclo de la3recuencia de +arrido en este re< +uscar? "a operacin pulsada denota Aue elultrasonido se genera ado en un modo pulsado con un tiempo de encendido yun tiempo 3uera? 'l 5W6P solucin se someti a ultrasonidos a 4 D C durante0 min +ajo las siguientes condiciones7 potencia de 14 W, 3recuenciacom+inacin de 4 4 (Hz y FI (Hz 4, tiempo de ciclo de la 3recuencia de+arrido de 1 s, y pulsado a tiempo y 3uera de tiempo de 8 y 1 s? * 1?FFG

ml de .olumen de solucin 5W6P 4B se puso en un ml 4 interruptor y lasolucin de muestra se sometieron a ultrasonidos en un tipo de sondaultrasonidos =6*94 con unemisor de ultrasonidos de sonda =dimetro de 4 cm> sumergido 4 cm porde+ajo de la solucin de muestra en el interruptor? "a solucin de la muestracin se trat a 4 D C durante 1 min en las condiciones7 Potencia de F W,3recuencia Eja de 4 (Hz, y se pulsan a tiempo y oX< tiempo de 4 y 4 s? 'lcontrol 3ue sometido al mismo proceso y actu en las mismas condiciones perosin ultrasonidos pretratamiento? 4?4?0? 5esgrasada protenas de germen detrigo =5W6P> reaccin enzimlisis :anto las soluciones 5W6P 4B con y sin preultrasnica tratamientos se diluyeron $asta 1B de soluciones antes de la

reaccin enzymolysis cin? "uego 1B soluciones de muestra se sometieron a lasonda y limpieza pretratamientos de ultrasonidos de +a@o se ajustaron porseparado para .a< pH "ue 9, utilizando solucin 1 M de TaH y se $izoreaccionar con *lcalase a@adi a 4 - g 5W6P en un +a@o de agua a 4,0, , y 8 D C durante 4, , F, I, y 1 min, respecti.amente? "a solucin en elproceso de enzi< molysis se control a pH 9,? 5espus de la $idrlisis, elenzima en $idrolizado se inacti. con el mismo .olumen de FB de cidotricloroactico y luego se $ier.en en un +a@o de agua para 1 minutos? *continuacin, el $idrolizado se en3ri a D C, centrolo 3uged desde el slido a1? rpm a temperatura am+iente durante 18 min, y se analizaron? Jerealiz el enzymolysis tradicional utilizando el mismo procedimiento con

enzymolysis pretratado ultrasnica de la solucin de control como el sustrato?4?4?? Cintica de la reaccin enzymolysis 'l modelo de primer orden cinticain3ormado por :a(a$as$i et al? L1G se aplic en el estudio de la cintica deenzymolysis 5W6P? 'l (i< modelo ntico 3ue escrito como7 corriente continua tdt Y de un VC t Z1[ donde ( es la constante de .elocidad de reaccin total Auein.olucra la tasa de con< stants de ultrasonido ( u y la temperatura ( do ='c?=> >, \ C t es el W? Qu et al? -ltrasonidos Jonoc$emistry 4 =410> 1I

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5W6P concentracin en solucin de reaccin en un momento dado t min = lgramo ml>? ? 5espus de integrar la ecuacin =1>, modelo cintico se e;prescomo7 'n C t Y ] (t ^ 'n C Z4[ donde C es la concentracin inicial en5W6P solucin de reaccin = l gramo ml>? Como es di3cil para medir la

disminucin de 5W6P, la reaccin la tasa puede ser determinado por elaumento de la cantidad de polipptidos marea pu+licado por 5W6P? 'l modelocintico de primer orden en el marco del condiciones de reaccin t _ 'n contra de t? 'n comparacin con enzymolysistradicional, el pre ultrasnica enzymolysis reaccin tratada puede serin`uenciada por el ultrasonido e3ectuar adems del e3ecto trmico? Por lo tanto,

la ( en ultra< sonic enzymolysis pretratada se e;pres como7 ( Y ( do ^ ( u Z[donde ( do es la constante de .elocidad de reaccin inducida por e3ectotrmico en enzymolysis tradicional, y ( u se induce la constante de .elocidadde reaccin por e3ecto del ultrasonido en enzymolysis pretratado ultrasnica?4?4?8? :ermodinmica enzimlisis 'cuacin de *rr$enius se aplic en ladescripcin de la relacin entre ( constante de .elocidad de reaccin y latemperatura :, Aue era escrita como L1I7 ( Y *e ] 'a #: Z8[ donde * es el3actor pre, ' la es el energa de acti.acin=/ mol>, # es la constante uni.ersal de los gases =I,01 / mol V>, y : es latemperatura a+soluta =V>? "a trama de ln ( 3rente a 1 : se utiliz para elclculo de ' la ? 'yring teora del estado de transicin =:J:> se utiliz para

entender la e3ecto de la temperatura so+re enzymolysis y tam+in elmacroscpica cam+ios o+ser.ados en este estudio L1? "a ecuacin :J: 3ueescrito como7 ( Y ( segundo : marido e;p ] re 6#*M #: Y ( segundo :marido e;p ] re M*#5 #: ^ re J # ZF[ donde ( segundo es la constante deoltzmann =1?0I a 1 *40 / V>, $ es la Constante de Planc( =F,F48F 1 *0 / s>, re 6 es la energa li+re de 6i++s de la acti.acin =/ mol>, re H es laentalpa de acti.acin =/ mol>, y re J es la entropa de acti.acin =/ mol V>?5espus de la trans3ormacin logaritmo, la ecuacin :J: se e;pres como7 ln (

: Y ] re M*#5 # "* 1 : re J # ] ln marido ( segundo ZG[ "a trama de ln =V :> 3rente a 1 : se utiliz para los clculos de re 6, re H, y re J? 4?4?F?5eterminacin de la concentracin de polipptido "a concentracin depolipptido, l g ml, se determin utilizando un in3ormaron Solin

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do 0 o do o do 8 o do ln =R =a> el tiempo enzimlisis =min> 1 40 8 F G I 9 1 11 8? 8?1 8?4 8?0 8? 8?8 4 o do 0 o do o do 8 o do ln =R =+> el tiempo enzimlisis =min> 1 4 0 8 F G I 9 1 11 8? 8?1 8?48?0 8? 8?8 4 o do 0 o do o do 8 o do ln =R =c> enzymolysistiempo =min> Sig? 1? "os ln =Q 1 ] Q t > Srente a .eces en .alores tradicionales=a>, la sonda =+> y limpieza +a@o =c> enzymolysis pretratado ultrasnica adi3erentes temperaturas? "a regresin coeEcientes de las cur.as o+tenidas alos 4, 0, y 8 D C son ,9F, ,98, ,9I y ,98 en =a>, ?9F, ?9F, ?9F y?99 en =+>, y ,9F, ,9F, ,9F y ,99 en =c>, respecti.amente?1simultneamente con los ensayos por triplicado de las muestras con el En decalcular las concentraciones de polipptido de muestras? 4?0? 'l anlisisestadstico :odos los e;perimentos se realizaron en muestras por triplicado? "osdatos se presentan como media? Je realiz anlisis de .arianza =*TR*> paracomparar el e3ecto de los ultrasonidos +ajo el ni.el de signiEcacin de p b,8?

:odos los grEcos y el clculo se pre3ormados con el rigen Pro G?8J#1 yMicroso3t ce ';cel 40, respecti.amente? 0? #esultados y discusin 0?1?'3ecto del pretratamiento ultrasnico so+re la cintica de reaccin enzymolysis

'l .alor de la constante de .elocidad es un parmetro importante de la cinticade la reaccin Aumica, Aue es independiente so+re el sustrato concentracin?'l cam+io de enzimlisis de 5W6P inducida por pretratamiento ultrasnicodar como resultado el cam+io de la constante de .elocidad? Sig? 1 muestra lasparcelas de ln =Q 1 ] Q t > Rersus t en el tradicional, la sonda y +a@o delimpieza por ultrasonidos pretratado enzimlisis a di3erentes temperaturas? Jepuede o+ser.ar a partir de la Sig? 1 =a> Aue los ln =Q 1 ] Q t > tenido una +uenarelacin lineal con el tiempo a di.ersas temperaturas, como re< re.elado por elcoeEcientes de correlacin superior a ,98? 'ste resultado representa Aue elproceso tradicional de 5W6P enzymolysis o+edecida cintica de primer orden?5e+ido a Aue los coeEcientes de correlacin en la Egura? 1 =+> y =c> 3ueron

mayores Aue ,9F, el +a@o y la limpieza de sonda de ultra< snica pretratadoenzimlisis tam+in encaja +ien con la cintica de primer orden? 'n tanto elenzymol< pretratados tradicional y ultrasonidos generales analysis o+edecicintica de primer orden dentro del rango de temperatura #T' '5? "osparmetros cinticos de reaccin ( y Q 1 se determinaron de la pendiente y lainterseccin trazando ln =Q 1 ] Q t > Contra t, usando rigen Pro G?8J#1, y seenumeran en la :a+la 1? Je puede o+ser.ar a partir de la :a+la 1 Aue el .alor (3ue la ms alta, seguido por ( t y ( u a todas las temperaturas pro+adas? 'lmayor Aue ( ( t a cualAuier temperatura indicado Aue el tipo de ultrasonido siel +a@o de sonda y limpieza no result signiEcati.amente mejorado pro+ la.elocidad de reaccin de 5W6P enzimlisis compara con tra< enzimlisis

condicional? 5el mismo modo, /ia et al? L4 $an encontrado Aue lapretratamiento ultrasnico con una potencia de a 1I W y $ora de 4 minpuede 3acilitar la $idrlisis enzimtica de 5W6P y pro< Mote la li+eracin depolipptidos de 5W6P? 'sto es porAue el intensas presiones altas, lastemperaturas y las 3uerzas de corte generadas por ecogra3a eEcacias deca.itacin pueden cam+iar el 5W6P y *lca< estructuras lase L41 ? "ae;posicin del centro acti.o causada por la ultra< sonido $ara Aue la enzima secom+inan 3cilmente con 5W6P y e;posiciones mayor capacidad de reaccin

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L44,40 ? "iu et al? L4 $an conErmado Aue 'structura 5W6P 3ue cam+iado portratamiento ultrasnico con poder de F W y tiempo de 1 min determinadospor S:# y ùorescencia espectros, y sus cam+ios estructurales 3ueron+eneEciosas para promo.er $idrlisis enzimtica de alta eEciencia? /ia et al?L48,4F tiene tam+in encontr Aue la estructura 5W6P 3ue alterada por lostratamientos de ultrasonido utilizando sul3$idrilo y disul3uro contenidos de+onos gratis, ultra.ioleta espec< trum, y espectros de ùorescencia y por lotanto su EsicoAumica propiedades cam+ian? Por otra parte, Ma et al? L1 $anin3ormado de Aue la estructura *lcalase determinado por espectroscopia deùorescencia y espectroscopa de dicrosmo circular =C5> mejor comoresultado de aplicacin de ultrasonido, Aue a3ect positi.amente su acti.idad?'n *dems, la mayor ( t Aue ( u a todas las temperaturas Aue se indica latemperatura juega un papel preponderante tanto en la sonda y limpieza +a@oultrasnico enzimlisis pretratados aunAue la constante de .elocidad se mejormediante la aplicacin de ultrasonidos? :am+in se o+ser. Aue tanto (y( taumentado a medida Aue la temperatura aument de 4 D C a 8 D C? Por lotanto, se puede concluir Aue el e3ecto trmico dominado e inùenciado

positi.amente la reaccin enzimlisis de 5W6P? 'sta es de+ido a la capacidadde aumento de la temperatura para aumentar la en< la acti.idad y de lacolisin enzima de 3recuencia entre enzima y sustrato $aciendo la reaccinJtrate, enzima ms rpido L4G ? 'sta conErmado el in3orme de V\"*, la concentracin de*lcalase 4 - g, el tiempo de 1 min, y la temperatura de 8 D C, lo Aue diouna alta concentracin de polipptido de 401?19 l g ml o 401?04 l gramoml para la sonda o la limpieza de ultrasonido +a@o? 0?4? '3ecto del tratamientopre.io de ultrasonidos en la termodinmica enzimlisis "os parmetros

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Aue los descensos, tanto en el re H y re J eran +eneEciosos para el re 6descenso, mientras Aue el cam+io en la re H tu.o muc$a ms in`uencia en re6 de+ido a la mayor tasa decreciente de re H de re J? 'n ge< ral, los resultadoso+tenidos demostraron claramente Aue por ultrasonidos pretratamiento conindependencia del tipo era +eneEcioso para el enzi< molysis reaccin de 5W6PporAue de sus +ajo energa reAuisitos? ? Conclusiones "os resultadosmostraron Aue tanto la pre tradicional y ultrasnica tratado enzimlisisadaptarse +ien a una cintica de primer orden? -ltrasonido [email protected] promo.ido la .elocidad de reaccin de 5W6P enzimlisis endi.ersas temperaturas especialmente a una temperatura +aja, pero no se@ale3ecto so+re la concentracin de sig< polipptido Enal? Comparado conenzymolysis tradicional, las constantes de .elocidad de la sonda y a@o delimpieza por ultrasonidos enzimlisis pretratados 3ueron respecti.amenteaument en 1FF,GB y 1,B, 94,9B y I8,GB, 4I,B y 4I,B, 1F,1B y 14,9Ba los 4, 0, y 8 D C? 'l e3ecto trmico jug un papel dominante tanto en lasonda y la limpieza de +a@o de pre ultrasnica enzymolysis tratados encomparacin con el e3ecto de ultrasonido? *m+os sonda y del +a@o de limpieza

ultrasonidos mostraron signiEcati.a positi.a e3ectos so+re la termodinmica de5W6P enzimlisis cuando com< comparacin con enzymolysis tradicional, en laAue el ' la , re H, re 6, y re J 3ueron respecti.amente redujeron en FI,FB yF4,B, G,1B y FG,8B, 0,0B y 01,4B, 1,B y 1,0B? 'n general, tanto lasonda y la limpieza de +a@o ultrasnico enzimlisis pretratados era eEcientemtodos para producir polipptidos de 5W6P? ajo el reco< concentracin reco, *lcalase concentracin cin de 4 - g, el tiempo de1 min y la temperatura de 8 D C, estos mtodos mostraron altasconcentraciones de polipptido =401?19 y 401?04 l g ml> y de +aja energareAuisitos? 0? 0?1 0?4 0?0 0? 0?8 laI?48 =G,1B> ]4I1?91F =0,0B> 98,GG =1,B> Cu+as para limpiezaenzimlisis pretratados 14?IF8 =F4,B> 1?09 =FG,8B> ]4G8?08I =01,4B>98,1F =1,0B> la "os .alores entre parntesis son las tasas decrecientes deparmetros termodinmicos en enzimlisis pretratados ultrasonidos encomparacin con enzimlisis tradicional? 114 W? Qu et al? -ltrasonidosJonoc$emistry 4 =410> 1I

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';presiones de gratitud "os autores desean e;tender su agradecimiento a laTacional Sundacin de Ciencias Taturales C$ina =01G184>, el Pu+< Tacionallic ienestar ndustria =*gricultura> Ciencia y :ecnologa 'special C$ina=4100G1>, la Sundacin de Ciencias Taturales de /iangsu Pro.incia

=V414GI> y la prioridad del Programa *cadmico rrollo rrollo =5PP*> de/iangsu nstituciones de 'ducacin Juperior para su apoyo Enanciero $acia elestudio? #e3erencias L1 #? *mado, '? *rrigoni, nt? Sood ngredients =1994>0 G89 $asta GF0? L8 PW :ardioli, #J 6iordano /r?, #C6iordano, 6iordano #"C, 'nzyme Micro+? :ec$nol? 0F =48> 888 GI 141 F8 19 a 4? L11 J? J$a$, MT 6upta, C$em?Centa.o? /? 4 =4I> 1?9? L14 '? #iera, \? 6olas, *? lanco, /* 6allego, M?lasco, *? Mulet, -ltrason? Jonoc$em? 11 =4> 41, Jcience Press, eijing, 40, pp? 89 4F1a 4FF ? L40 :/ Mason, "? Pani)ny(, /P "orimer, -ltrason? Jonoc$em? 0 =199F>480 18 10 G1 100 1F

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simultneamente con los ensayos por triplicado de las muestras con el fin decalcular las concentraciones de polipptido de muestras.2.3.El anlisis estadsticoTodos los experimentos se realizaron en muestras por triplicado. Los datos se

presentan como media. Se realiz anlisis de varianza (ANOA!para comparar el efecto de los ultrasonidos "a#o el nivel de si$nificacindep%&'&. Todos los $rficos y el clculo se preformados con elOri$en )ro *.S+, y -icrosoft Office xcel /&&0' respectivamente.3. Resultados y discusin

3.1.Efecto del pretratamiento ultrasnico sobre la cintica de reaccin

enzymolysisl valor de la constante de velocidad es un parmetro importante de lacintica de la reaccin 1u2mica' 1ue es independiente so"re el sustratoconcentracin. l cam"io de enzimlisis de 345) inducida por

pretratamiento ultrasnico dar como resultado el cam"io de la constante develocidad.6i$.,muestra las parcelas de ln (Q,7 Qt

! ersus ten el tradicional' la sonday "a8o de limpieza por ultrasonidos pretratado enzimlisis a diferentestemperaturas. Se puede o"servar a partir de la Fig.1(a! 1ue los ln (Q,7 Qt

! tenidouna "uena relacin lineal con el tiempo a diversas temperaturas' como re9revelado por el coeficientes de correlacin superior a &':. ste resultadorepresenta 1ue el proceso tradicional de 345) enzymolysis o"edecidacintica de primer orden. 3e"ido a 1ue los coeficientes de correlacin en lafigura.1("!y (c! fueron mayores 1ue &':;' el "a8o y la limpieza de sonda de ultra9snica pretratado enzimlisis tam"in enca#a "ien con la cintica de primerorden.n tanto el enzymol9 pretratados tradicional y ultrasonidos $enerales
https://translate.googleusercontent.com/translate_f#3https://translate.googleusercontent.com/translate_f#3https://translate.googleusercontent.com/translate_f#3https://translate.googleusercontent.com/translate_f#3https://translate.googleusercontent.com/translate_f#3https://translate.googleusercontent.com/translate_f#3https://translate.googleusercontent.com/translate_f#3https://translate.googleusercontent.com/translate_f#3https://translate.googleusercontent.com/translate_f#3https://translate.googleusercontent.com/translate_f#3https://translate.googleusercontent.com/translate_f#3https://translate.googleusercontent.com/translate_f#3https://translate.googleusercontent.com/translate_f#3https://translate.googleusercontent.com/translate_f#3

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analysis o"edeci cintica de primer orden dentro del ran$o de temperaturaontra tusandoOri$en )ro *.S+,' y se enumeran en la Tabla 1.Se puede o"servar a partir de la Tabla 11ue el valor kfue la ms alta'se$uido por kt

y ku

a todas las temperaturas pro"adas. l mayor 1ue kk

t

a cual1uier temperatura indicado 1ue el tipo de ultrasonidosi el "a8o de sonda y limpieza no result si$nificativamente me#orado

pro" la velocidad de reaccin de 345) enzimlisis compara con tra9enzimlisis condicional. 3el mismo modo' ?ia et al. [20]@an encontrado 1ue la

pretratamiento ultrasnico con una potencia de & a ,&& 4 y @ora de

/& min puede facilitar la @idrlisis enzimtica de 345) y pro9-ote la li"eracin de polipptidos de 345). sto es por1ue elintensas presiones altas' las temperaturas y las fuerzas de corte $eneradas

por eco$raf2a eficacias de cavitacin pueden cam"iar el 345) y Alca9estructuras lase [21]. La exposicin del centro activo causada por la ultra9sonido @ar2a 1ue la enzima se com"inan fcilmente con 345) y exposicionesmayor capacidad de reaccin [22,23]. Liu et al. [24]@an confirmado 1uestructura 345) fue cam"iado por tratamiento ultrasnico con poderde ;&& 4 y tiempo de ,& min determinados por 6T=+ y fluorescenciaespectros' y sus cam"ios estructurales fueron "eneficiosas para promover

@idrlisis enzimtica de alta eficiencia. ?ia et al. [25,26]tiene tam"inencontr 1ue la estructura 345) fue alterada por los tratamientos de ultrasonidoutilizando sulf@idrilo y disulfuro contenidos de "onos $ratis' ultravioleta espec9trum' y espectros de fluorescencia y por lo tanto su fisico1u2mica

propiedades cam"ian. )or otra parte' -a et al. [10]@an informado de 1uela estructura Alcalase determinado por espectroscopia de fluorescenciay espectroscop2a de dicro2smo circular (>3! me#or como resultado de
https://translate.googleusercontent.com/translate_f#4https://translate.googleusercontent.com/translate_f#4https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#4https://translate.googleusercontent.com/translate_f#4https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6

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aplicacin de ultrasonido' 1ue afect positivamente su actividad. nAdems' la mayor kt

!ueBu

a todas las temperaturas 1ue se indicala temperatura #ue$a un papel preponderante tanto en la sonda y limpieza

"a8o ultrasnico enzimlisis pretratados aun1ue la constante de velocidadse me#or mediante la aplicacin de ultrasonidos. Tam"in se o"serv 1uetanto kykt

aumentado a medida 1ue la temperatura aument de /& C > a& C >. )or lo tanto' se puede concluir 1ue el efecto trmico dominadoe influenciado positivamente la reaccin enzimlisis de 345). staes de"ido a la capacidad de aumento de la temperatura para aumentar la en9la actividad y de la colisin enzima de frecuencia entre enzima y sustrato@aciendo la reaccin Strate' enzima ms rpido [27]. sta confirmadoel informe de DELA9)u@#u et al. [28]1ue @ay una lineal positivacorrelacin entre la actividad enzimtica y la temperatura. >omparadocon enzimlisis tradicional' las crecientes tasas de ken la sondaultrasnica pretratado enzymolysis a los /&' 0&' F& y & C > eran,;;'*G' :/':G' /'&G y ,;',G' respectivamente' con los correspondientesaumento de las tasas deB en el "a8o de limpieza por ultrasonido como ,FF'FG''*G' /'&G y ,/':G' respectivamente. )or otra parte' la k

udisminucincon el aumento de la temperatura enzymolysis' 1ue esta"a enfrenteaB y kt

. sto indic 1ue los efectos de la sonda de ultrasonidoy limpieza tipos de "a8o contri"uyeron en $ran medida a la constante develocidada temperaturas ms "a#as pero muy poco a temperaturas ms altas. losdisminucin de k

use de"e a la disminucin de la solu"ilidad del $as en el $ruesode fluido y el aumento de la presin de vapor de e1uili"rio de la maT- como la temperatura aument [29].La variacin de la tasa de con9constante ku

con la temperatura esta"a de acuerdo con el resultado de
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reportado por DadB@odaee y )ovey [30].Los resultados mostraron 1ueaplicacin de ultrasonidos a "a#a temperatura afect ms impor9tant venta#a de 1ue a altas temperaturas. Se puede o"servar a partir deTa"la ,que el Q,valor no fue influenciada si$nificativamente por la

pretratamiento ultrasnico cuando se compara con enzymol9 tradicionalanalysis. Al tener en cuenta la eficiencia enzimlisis y el polipptidola produccin' el mtodo recomendado de"e ser el ultrasnicaenzymolysis pretratado con independencia del tipo de ultrasonido parala concentracin 345) de ,G (H I v!' la concentracin de Alcalase/&&& J I $' el tiempo de ,& min' y la temperatura de & C >' lo 1ue dio unaalta concentracin de polipptido de /0,.&,:l$ I ml o /0,.0/&l$ramoIml para la sonda o la limpieza de ultrasonido "a8o.3.2.Efecto del tratamiento pre"io de ultrasonidos en la termodinmicaenzimlisis

Los parmetros termodinmicosEla

' yre

#re$yre%erandeterminado a partir de las pistas y intercepta trazando ln kfrenteMesa 1

Las constantes de velocidad de reaccin en tradicional' sonda y de limpieza "a8ode ultrasonidos pretrataron enzymolysis a diferentes temperaturas.scri"e

Temperatura (C >!k (1I min!k

do

(, minuto!k

u
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(, minuto!Q

,(l

$ I mL!nzimlisis Tradicional/&&'&&:&'&&:&/F0.:00&&'&,F&'&,F&/F0.;,F&&'&/&'&/&/0./F&&'&0,&'&0,&/F.*F;Sonda ultrasnica enzimlisis pretratados/&&.&/F (,;;'*G!la&'&&:&'&,/F*.,*;

0&&.&/* (:/':G!&'&,F&'&,0/FF.&*F&&.&0/ (/'&G!
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&'&/&'&&*//.*/,&&.&0; (,;',G!

&'&0,&'&&/0,.&,:>u"as para limpieza enzimlisis pretratados/&&.&// (,FF'FG!&'&&:&'&,0/F:./0;0&&.&/; ('*G!&'&,F&'&,//F.&F&&.&0/ (/'&G!&'&/&'&&//./*&&&.&0 (,/':G!&'&0,&'&&F/0,.0/&laLos valores entre parntesis son las crecientes tasas de velocidad constante enenzimlisis pretratados ultrasonidos en comparacin con enzimlisis tradicionalreaccin

Pgina 1

>intica y termodinmica de tri$o des$rasada reaccin enzimlisisprote2nas de $ermen con pretratamiento ultrasnico4en#uan Kula' aile -a

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la, B,!'

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tratado enzimlisis adaptarse "ien a una cintica de primer orden. Tanto latemperatura y el ultrasonido ten2an un positivoefectuar en el enzimlisis de 345)' con la temperatura #ue$a un papeldominante. ' tanto la sonda y la limpieza de cu"as para enzimlisispretratados mostr altaconcentraciones de polipptido (/0,.&,: y /0,.0/&l$ I ml! y de "a#a ener$2a re1uisitos. n comparacincon enzymolysis tradicional' estos mtodos aumentaron si$nificativamente laconstante de velocidad de reaccin (k7por,;;'*G y ,FF'FG' :/':G y '*G' /'&G y /'&G' ,;',G y ,/':G a los /&' 0&'F& y & C >' ydisminucin de la ener$2a de activacin (Ela

!' ntalp2a de activacin (re

$7ener$2a li"re de 5i""s de activacin (re#7

y la entrop2a de la activacin (re%7por ;.;G y ;/.FG' *F.,G y ;*.G' 0F.0G y 0,./G' ,.FG y ,.0G. llose puede concluir 1ue el tratamiento previo de ultrasonidos de 345) puedeme#orar nota"lemente la eficiencia enzimlisiseficiencia y' en consecuencia conduce a la produccin de un mayor rendimientodel polipptido. /&,0 lsevier Todos los derec@os reservados.1. Introduccin

l $ermen de tri$o' rico en contenido de prote2nas (0&G!' es un pro9 potencialprote2na de recursos para producir polipptidos "iol$icos [1].Tradicincional

polipptidoproduccinmtodosincluirautolisis'la fermentacin y la @idrlisis enzimtica [2-4]' n la 1ue elmtodo enzimlisis se utiliza por lo $eneral de"ido a la reaccin moderada

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condiciones y alta especificidad para sustratos [5,6]. Sin em"ar$o'enzimlisis tradicionales e#erce al$unas limitaciones en aplicacin prcticacationes tales como la "a#a tasa de conversin del sustrato' "a#o utiliza9la tasa de la enzima' y la "a#a eficiencia enzymolysis [7]. stase de"e principalmente a la "a#a frecuencia de contacto entre enzima y sustratoStrate' y la estructura de la prote2na no adecuado. )or lo tanto' @ay una $ranla demanda para el desarrollo de mtodos ms eficientes a enzimlisissuperar estas deficiencias.+ecientemente' @ay estudios realizados so"re la enzima estructuralcam"ios y me#oras en la eficiencia enzimlisis usando un ultra9tecnolo$2a de sonido [8,9].)or e#emplo' -a et al. [10]@an informado1ue el ultrasonido aumenta la actividad espec2fica de la enzima de"ido a laAlcalase superficie cam"io estructural al aumentar el nPmero detriptfano y reducir el nPmero de espiral al azar. S@a@ y

5upta [11]@an indicado 1ue el pretratamiento ultrasnico me#oradola actividad espec2fica de la enzima y por lo tanto acelera la en9yme9reaccin catalizada. stos cam"ios se atri"uyen a alta

presiones' temperaturas y fuerzas de cizallamiento $eneradas por la ultra9onda snica' 1ue puede resultar en una mayor frecuencia de contacto

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Jniversidad de ?ian$su' 0&, uefu +OA3-' @en#ian$' ?ian$su' /,/&,0'>@ina.

4ireccin de correo [email protected](. -a!.Jltrasonidos Sonoc@emistry /& (/&,0! ,F&9,F,0Listas contenidos ofrecidos en SciVerse ScienceDirectJltrasonidos Sonoc@emistryrevista p$ina He"Q HHH.elsevier.comIlocateIultson

Pgina 2

Los o"#etivos de esta investi$acin fueron (,! estudiar los efectos deLa sonda y el "a8o de limpieza pretratamientos ultrasnicos en la enzi9cintica de la reaccin molysis a diferentes temperaturas y tiempos' (/!determinar los parmetros termodinmicos de la sonda y limpiezain$ "a8o enzimlisis pretratados ultrasnica a diferente temperaturaturas' y (0! comparar la cintica de reaccin y termodinmica

parmetros de ultrasonidos pretrataron enzymolysis con la de tradicinenzimlisis cional. sta investi$acin se utiliz para explicar el meca9nismo de accin de ultrasonido en la reaccin enzymolysis de 345) y

predecir la produccin de polipptidos' 1ue puede proporcionar la t@eoret9"ase ical y apoyo tecnol$ico para nuevas investi$aciones en poli9la produccin de pptidos.2. Materiales y mtodos

2.1.8ateriales y reacti"os5ermen de tri$o des$rasado (345! se o"tuvo de An9yan$ om"re9tianxue 6ood -anufacturin$ >o.' Ltd. (enan' >@ina!. Alcalasa/.FL65' con la actividad de /.;*& J I $ y recomend temperaturatura de & C > y p :'& valor' se ad1uiri en Novozymes >o.'Ltd (Tian#in' >@ina!. Al"Pmina de suero "ovino (l!' @idrxido de sodio (NaO!' clor@2drico(>l!' car"onato de sodio (Na/>O0!' Sulfato de co"re penta@idratado

(>uSOFA/O!' tartrato de sodio' tun$stato de sodio (Na/4OF
mailto:[email protected]://dx.doi.org/10.1016/j.ultsonch.2013.04.012https://translate.google.com/translate?hl=es&prev=_t&sl=en&tl=es&u=http://www.sciencedirect.com/science/journal/13504177https://translate.google.com/translate?hl=es&prev=_t&sl=en&tl=es&u=http://www.elsevier.com/locate/ultsonmailto:[email protected]://dx.doi.org/10.1016/j.ultsonch.2013.04.012https://translate.google.com/translate?hl=es&prev=_t&sl=en&tl=es&u=http://www.sciencedirect.com/science/journal/13504177https://translate.google.com/translate?hl=es&prev=_t&sl=en&tl=es&u=http://www.elsevier.com/locate/ultson

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A/@/O!'moli"dato de sodio (Na/

-u$irFA/@/O!' cido fosfrico (0correosF!' Lit@9sulfato de ium (Li/AS= KJFA/O!' y el "romo l21uido se ad1uirieron deSinop@arm A$entes 1u2micos >o.' Ltd (S@an$@ai' >@ina!. Todo all29a$entes fueron de $rado anal2tico. +eactivo de 6olin9fenol A fue precomparacin en el d2a de la prue"a' 1ue consta de &', - Na/>O0en &'&: - NaO mezcla con &'0:0 m- >uSOFA/O en&.;:F tartrato de sodio m-. 6olin9fenol reactivo < se preparde acuerdo con los si$uientes procedimientos. Jna mezcla de ,&& $ Na

/4OF9A/@/O' / $ Na/

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-u$irFA/@/O' *&& ml de a$ua 3=' & ml G

0correosFy >l ,&& ml se separ por destilacin durante ,& @ en un aparatoSox@let. 3espusla adicin de ,& $ Li/AS= KJFA/O' & ml destilados (3=!' y unos pocos$otas de "romo l21uido' la mezcla se @irvi a"ierto en un a$ua

"a8o (S9A' Taican$ de La"oratorio 1uipos de f"rica' ?ian$su'>@ina! durante , min y despus se enfri a temperatura am"iente (/ C >!.La solucin se diluy @asta ,&&& ml usando a$ua 3= y centr2olofu$ed (ian$yi =nc.' >@an$s@a' unan' >@ina! a temperatura am"ientea ,&.&&& rpm durante min' y se almacenaron en un refri$erador a F> @asta suuso.2.2.8todosl experimento se esta"leci de acuerdo con el si$uiente

pasosQ n primer lu$ar' la prote2na de $ermen de tri$o des$rasada (345)! fuepre9en comparacin con el mtodo descrito en la Seccin 2.2.1.Se$undo'la solucin 345) se trat previamente con dos tipos de ultrasonidosde acuerdo con el mtodo descrito en la Seccin 2.2.2. )or Pltimo' elSoluciones 345) con y sin tratamientos previos ultrasnicos eran@idrolizado con Alcalase "asado en el mtodo descrito en elSeccin 2.2.3.

2.2.1.4esrasada protenas de ermen de trio (49#67 preparacinl 345) fue preparado "asado en un mtodo reportado [16]. LASe @a a8adido el volumen de ,&&& ml de a$ua 3= a ,&& $ 345 con parti9>L tama8o de &', mm y lue$o se mezcla con ,G (H I v! en solucin de Na>lun "a8o de a$ua a & C > durante 0& min. A continuacin' la solucin se a#ust avalor de p :'& utilizando solucin , - de NaO y se a$it continuamentedurante
https://translate.googleusercontent.com/translate_f#2https://translate.googleusercontent.com/translate_f#2https://translate.googleusercontent.com/translate_f#2https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#2https://translate.googleusercontent.com/translate_f#2https://translate.googleusercontent.com/translate_f#2https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6

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0& min a & C >. l l21uido se separa del slido por una "a#acentr2fu$a de velocidad (L39,&@ina! 1ue funciona a &&& rpm a temperatura am"iente durante /& min.)osteriormente' el l21uido se a#ust a p ;' con , -

Solucin de >l y lue$o se @ace reaccionar con diastasa a8adieron a /& J I $345)(contenido en prote2nas calculado por el mtodo D#elda@l! a & C > durante 0 @.La solucin se deposita mediante el a#uste al valor de p F'& usandoSolucin de >l , -. l slido depositado se separ de la li91uid por centrifu$acin a &&& rpm a temperatura am"iente durante/& min y lue$o el polvo 345) mediante secado por pulverizacin se almacenen un desecador para su posterior anlisis.2.2.2.4esrasada protenas de ermen de trio (49#67 pretratamientosAntes de enzymolysis reaccin' la 345) se trat previamente en dostipo de tratamientos previos de ultrasonidos utilizando un tipo de sonda deultrasonidos yun "a8o de limpieza por ultrasonidos.Jn volumen de ,& L de /G (H I v! de solucin 345) se puso en un , Lcu"as para limpieza e1uipado con el superior y el inferioremisores de ultrasonido planas (distancia de * cm!. sta limpieza ultrasnica

"a8o' 1ue fue fa"ricado por la Jniversidad de ?ian$su' tiene funcinmodos de operacin frecuencia de "arrido y el funcionamiento por impulsos. pore#emplo' la operacin de frecuencia de "arrido se refiere al "arrido cuenciaciclo cuencia de aumentar periodo del // al /; Bz y decrecientein$ del /; al // Bz con la misma velocidad lineal en elforma de un trin$ulo issceles. )or lo tanto la frecuencia de "arrido es re9

portado como /F U / Bz y un per2odo de aumento de ms una disminucinper2odo se define como un tiempo de ciclo de la frecuencia de "arrido en este re9"uscar. La operacin pulsada denota 1ue el ultrasonido se $eneraado en un modo pulsado con un tiempo de encendido y un tiempo fuera. l345)solucin se someti a ultrasonidos a /& C > durante 0& min "a#o las si$uientescondicionesQ potencia de ,/&& 4' frecuencia com"inacin de

/F U / Bz y ; Bz U /' tiempo de ciclo de la frecuencia de "arrido de,&& s' y pulsado a tiempo y fuera de tiempo de && y ,& s.A ,.;;* ml de volumen de solucin 345) /G se puso en un ml /&&&interruptor y la solucin de muestra se sometieron a ultrasonidos en un tipo desondaultrasonidos (5A:/9== 3

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/ cm por de"a#o de la solucin de muestra en el interruptor. La solucin de lamuestracin se trat a /& C > durante ,& min en las condicionesQ )otenciade ;&& 4' frecuencia fi#a de /& Bz' y se pulsan a tiempo y off9tiempo de / y / s. l control fue sometido al mismo proceso

y actu en las mismas condiciones pero sin ultrasonidospretratamiento.2.2.3.4esrasada protenas de ermen de trio (49#67 reaccin enzimlisisTanto las soluciones 345) /G con y sin pre ultrasnicatratamientos se diluyeron @asta ,G de soluciones antes de la reaccinenzymolysiscin. Lue$o ,G soluciones de muestra se sometieron a la sonda y limpieza

pretratamientos de ultrasonidos de "a8o se a#ustaron por separado para va9 pLue :'& utilizando solucin , - de NaO y se @izo reaccionar con Alcalasea8adia /&&& J I $ 345) en un "a8o de a$ua a /&' 0&' F&' y & C > durante /'F' ;' ' y ,& min' respectivamente. La solucin en el proceso de enzi9molysis se control a p :'&. 3espus de la @idrlisis' elenzima en @idrolizado se inactiv con el mismo volumen de;G de cido tricloroactico y lue$o se @ierven en un "a8o de a$ua para,& minutos. A continuacin' el @idrolizado se enfri a F& C >' centr2olofu$ed desde el slido a ,&.&&& rpm a temperatura am"iente durante, min' y se analizaron. Se realiz el enzymolysis tradicionalutilizando el mismo procedimiento con enzymolysis pretratado ultrasnicade la solucin de control como el sustrato.2.2.:.intica de la reaccin enzymolysisl modelo de primer orden cintica informado por TaBa@as@i et al. [17]se aplic en el estudio de la cintica de enzymolysis 345). l Bi9modelo ntico fue escrito comoQcorriente continua

t

dt

V de unD>t

W,XdondeB es la constante de velocidad de reaccin total 1ue involucra la tasa decon9stants de ultrasonido ku

y la temperatura kdo

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(c. (4)!' E t

es el9. Qu et al.; *ltrasonidos %onoc0emistry 2, (2,137 1:,&es la concentracin inicial en 345) solucin de reaccin (l$ramoIml!.>omo es dif2cil para medir la disminucin de 345)' la reaccinla tasa puede ser determinado por el aumento de la cantidad de polipptidosmarea pu"licado por 345). l modelo cintico de primer orden en el marco delcondiciones de reaccin t >&9,' t

Z Q,7 Qt

E ,

Z Q,fue escritocomoQLN3 Q,7 Qt

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X V 7 ktY ln Q,W0Xdonde Q,

es la concentracin de polipptido Pltimo en la reaccin desolucin (l$ I ml!' y Qt

es la concentracin del polipptido en elsolucin de reaccin en un momento dado tmin (l$ I ml!.l? y Q,Los valores pueden determinarse experimentalmente a partir dela pendiente y la interseccin trazando ln (Q,7 Qt

! n contra de t.n comparacin con enzymolysis tradicional' el pre ultrasnicaenzymolysis reaccin tratada puede ser influenciada por el ultrasonidoefectuar adems del efecto trmico. )or lo tanto' la ken ultra9sonic enzymolysis pretratada se expres comoQkV kdo

Y ku

WFXdondeBdo

es la constante de velocidad de reaccin inducida por efecto trmico en

enzymolysis tradicional' y kuse induce la constante de velocidad de reaccin

por efecto del ultrasonido en enzymolysis pretratado [email protected] enzimlisiscuacin de Arr@enius se aplic en la descripcin de la relacinentre kconstante de velocidad de reaccin y la temperatura A1ue era

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escrita como [18]:kV&e7Ea

A

WXdondeA es el factor pre9exponencial o de colisin (, I min7la

es elener$2a de activacin (? I mol7+ es la constante universal de los $ases ('0,F ? Imol D!'yT es la temperatura a"soluta (D!.La trama de ln kfrente a ,;T se utiliz para el clculo deEla

.yrin$ teor2a del estado de transicin (TST! se utiliz para entender laefecto de la temperatura so"re enzymolysis y tam"in el macroscpicacam"ios o"servados en este estudio [10].La ecuacin TST fue escritocomoQkVk

seundo

A

marido

exp 7re

#&8BA

Vk

seundo

A

marido

exp 7re

8&'4B

AYre%

W;XdondeB
https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6

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seundo

es la constante de

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2.2.C.4eterminacin de la concentracin de polipptidoLa concentracin de polipptido'l$ I ml' se determin utilizando uninformaron 6olin9fenol mtodo colorimtrico [19].=nicialmente' un volumen

F ml de reactivo de 6olin9fenol A se mezcl con &' ml de muestra en unatu"o de vidrio. La solucin se incu" durante ,& min a tempe9 @a"itacinratura' despus de lo cual &' ml de reactivo de 6olin9fenol < se a8adi a cadatu"o de vidrio' y la a"sor"ancia se ley a && nm en un espectrofotmetrofotmetro (Jnic */&&' Jnocal >orporation' S@an$@ai' >@ina! despus0& min de incu"acin. Jn espacio en "lanco se prepar usando a$ua 3= enlu$ar de la muestra. Normas de &9&l$ I ml de

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&odoln (9ermont!

(a! el tiempo enzimlisis (min!&,/0F;*:,&,,.&.,./.0.F./&odo0&odoF&odo&

odoln(9ermont!("! el tiempo enzimlisis (min!&

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,/0F

;*:,&,,.&.,./.0.F./&odo0&odoF&odo&odoln (9ermont!(c! enzymolysis tiempo (min!Fig.1.Los ln (Q,

7 Qt! 6rente a veces en valores tradicionales (a!' la sonda ("! y limpieza

"a8o (c! enzymolysis pretratado ultrasnica a diferentes temperaturas. Lare$resincoeficientes de las curvas o"tenidas a los /&' 0&' F& y & C > son &':;' &':' &':y

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&': en (a!' &.:;' &.:;' &.:; y &.:: en ("!' y &':;' &':;' &':; y &':: en (c!'respectivamente.,F,&9. Qu et al.; *ltrasonidos %onoc0emistry 2, (2,137 1:,

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n tanto el enzymol9 pretratados tradicional y ultrasonidos $eneralesanalysis o"edeci cintica de primer orden dentro del ran$o de temperaturaontra tusandoOri$en )ro *.S+,' y se enumeran en la Tabla 1.Se puede o"servar a partir de la Tabla 11ue el valor kfue la ms alta'se$uido por kt

y ku

a todas las temperaturas pro"adas. l mayor 1ue kk

t

a cual1uier temperatura indicado 1ue el tipo de ultrasonidosi el "a8o de sonda y limpieza no result si$nificativamente me#orado

pro" la velocidad de reaccin de 345) enzimlisis compara con tra9enzimlisis condicional. 3el mismo modo' ?ia et al. [20]@an encontrado 1ue la

pretratamiento ultrasnico con una potencia de & a ,&& 4 y @ora de/& min puede facilitar la @idrlisis enzimtica de 345) y pro9-ote la li"eracin de polipptidos de 345). sto es por1ue elintensas presiones altas' las temperaturas y las fuerzas de corte $eneradas

por eco$raf2a eficacias de cavitacin pueden cam"iar el 345) y Alca9estructuras lase [21]. La exposicin del centro activo causada por la ultra9sonido @ar2a 1ue la enzima se com"inan fcilmente con 345) y exposicionesmayor capacidad de reaccin [22,23]. Liu et al. [24]@an confirmado 1uestructura 345) fue cam"iado por tratamiento ultrasnico con poderde ;&& 4 y tiempo de ,& min determinados por 6T=+ y fluorescencia

espectros' y sus cam"ios estructurales fueron "eneficiosas para promover@idrlisis enzimtica de alta eficiencia. ?ia et al. [25,26]tiene tam"inencontr 1ue la estructura 345) fue alterada por los tratamientos de ultrasonidoutilizando sulf@idrilo y disulfuro contenidos de "onos $ratis' ultravioleta espec9trum' y espectros de fluorescencia y por lo tanto su fisico1u2mica

propiedades cam"ian. )or otra parte' -a et al. [10]@an informado de 1uela estructura Alcalase determinado por espectroscopia de fluorescencia
https://translate.googleusercontent.com/translate_f#4https://translate.googleusercontent.com/translate_f#4https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#4https://translate.googleusercontent.com/translate_f#4https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6

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y espectroscop2a de dicro2smo circular (>3! me#or como resultado deaplicacin de ultrasonido' 1ue afect positivamente su actividad. nAdems' la mayor kt

!ueBua todas las temperaturas 1ue se indicala temperatura #ue$a un papel preponderante tanto en la sonda y limpieza

"a8o ultrasnico enzimlisis pretratados aun1ue la constante de velocidadse me#or mediante la aplicacin de ultrasonidos. Tam"in se o"serv 1uetanto kykt

aumentado a medida 1ue la temperatura aument de /& C > a& C >. )or lo tanto' se puede concluir 1ue el efecto trmico dominadoe influenciado positivamente la reaccin enzimlisis de 345). staes de"ido a la capacidad de aumento de la temperatura para aumentar la en9la actividad y de la colisin enzima de frecuencia entre enzima y sustrato@aciendo la reaccin Strate' enzima ms rpido [27]. sta confirmadoel informe de DELA9)u@#u et al. [28]1ue @ay una lineal positivacorrelacin entre la actividad enzimtica y la temperatura. >omparadocon enzimlisis tradicional' las crecientes tasas de ken la sondaultrasnica pretratado enzymolysis a los /&' 0&' F& y & C > eran,;;'*G' :/':G' /'&G y ,;',G' respectivamente' con los correspondientesaumento de las tasas deB en el "a8o de limpieza por ultrasonido como ,FF'FG'

'*G' /'&G y ,/':G' respectivamente. )or otra parte' la kudisminucincon el aumento de la temperatura enzymolysis' 1ue esta"a enfrenteaB y kt. sto indic 1ue los efectos de la sonda de ultrasonidoy limpieza tipos de "a8o contri"uyeron en $ran medida a la constante develocidada temperaturas ms "a#as pero muy poco a temperaturas ms altas. los

disminucin de kuse de"e a la disminucin de la solu"ilidad del $as en el $ruesode fluido y el aumento de la presin de vapor de e1uili"rio de la maT- como la temperatura aument [29].La variacin de la tasa de con9constante ku
https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6

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con la temperatura esta"a de acuerdo con el resultado dereportado por DadB@odaee y )ovey [30].Los resultados mostraron 1ueaplicacin de ultrasonidos a "a#a temperatura afect ms impor9tant venta#a de 1ue a altas temperaturas. Se puede o"servar a partir deTa"la ,que el Q,valor no fue influenciada si$nificativamente por la

pretratamiento ultrasnico cuando se compara con enzymol9 tradicionalanalysis. Al tener en cuenta la eficiencia enzimlisis y el polipptidola produccin' el mtodo recomendado de"e ser el ultrasnicaenzymolysis pretratado con independencia del tipo de ultrasonido parala concentracin 345) de ,G (H I v!' la concentracin de Alcalase/&&& J I $' el tiempo de ,& min' y la temperatura de & C >' lo 1ue dio unaalta concentracin de polipptido de /0,.&,:l$ I ml o /0,.0/&l$ramoIml para la sonda o la limpieza de ultrasonido "a8o.3.2.Efecto del tratamiento pre"io de ultrasonidos en la termodinmicaenzimlisisLos parmetros termodinmicosEla

' y

re#re

$yre%erandeterminado a partir de las pistas y intercepta trazando ln kfrenteMesa 1

Las constantes de velocidad de reaccin en tradicional' sonda y de limpieza "a8ode ultrasonidos pretrataron enzymolysis a diferentes temperaturas.

scri"eTemperatura (C >!k (1I min!k

do(, minuto!k

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u

(, minuto!Q

,(

l$ I mL!nzimlisis Tradicional/&&'&&:&'&&:&/F0.:00&&'&,F&'&,F&/F0.;,F&&'&/&'&/&/0./F&&'&0,&'&0,&/F.*F;Sonda ultrasnica enzimlisis pretratados/&&.&/F (,;;'*G!la&'&&:&'&,

/F*.,*;0&&.&/* (:/':G!&'&,F&'&,0/FF.&*F&

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&.&0/ (/'&G!&'&/&'&&*//.*/,&

&.&0; (,;',G!&'&0,&'&&/0,.&,:>u"as para limpieza enzimlisis pretratados/&&.&// (,FF'FG!&'&&:&'&,0/F:./0;0&&.&/; ('*G!&'&,F&'&,//F.&F&&.&0/ (/'&G!&'&/&'&&//./*&&&.&0 (,/':G!&'&0,&'&&F/0,.0/&laLos valores entre parntesis son las crecientes tasas de velocidad constante enenzimlisis pretratados ultrasonidos en comparacin con enzimlisis tradicionalreaccin.

9. Qu et al.; *ltrasonidos %onoc0emistry 2, (2,137 1:,

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rido formar molculas no de activacin en molculas de activacin'refle#a la rapidez de las reacciones 1u2micas' lo 1ue representa un ayunovelocidad de reaccin cuando es "a#a y una velocidad lenta cuando la alta [31].

Ella

los valores de la mayor2a de las reacciones var2an de F& B? I mol a F&& B? Imol. Si el valor es inferior a F& B? I mol' la reaccin se com9

plete muy rpidamente. >uanto menorEla

(%F& B? I mol! tanto de la tradicincional y enzimlisis pretratados ultrasnica implica"an 1ue menosse necesita ener$2a para la reaccin enzymolysis y una reaccin ms rpidatasa de entre el 345) y Alcalase. Adems' se o"serv1ueEla

valores de reaccin enzymolysis con la sonda y limpiezapretratamientos ultrasnicos "a8o in$ disminuyeron si$nificativamente en com9comparacin con la tradicional y las tasas decrecientes eran tanalto como ;';G y ;/'FG. ste resultado certificada ms le#os de lamecanismo 1ue el ultrasonido disminuy si$nificativamente la ener$2are1uiere "arrera para la reaccin enzymolysis. )or lo tanto' ultrasnicaenzimlisis pretratados corri ms rpidamente 1ue los clsicos'1ue era consistente con el fenmeno o"servado en elexperimentar. los

re$re#yrealores %1ue muestran una tendencia similarconla

' 6ueron' respectivamente' reducido en un *F',G y ;*'G' 0F'0G y0,'/G y ,'FG y ,'0G para la sonda y "a8o de limpieza ultra9

sonidos' 1ue tam"in se puede explicar con ms detalle 1ue la reaccinenzymolysisla catalizada por el pretratamiento ultrasnico puede ocurrir muy rpidamente.Jn informe similar @a mostrado 1ue los parmetros termodinmicos(E

la

'

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re$

re#yre%7de Alcalase puede ser reducido por ultrasonidotratamiento y' en consecuencia lleva a un aumento en la enzimaactividad [10].La $ran disminucin en el parmetro termodinmicotros se pueden atri"uir a la rotura por ultrasonidos inducida deenlaces de @idr$eno' la interrupcin del nPcleo @idrof"ico interno' oxidacintiva modificacin de residuos de aminocidos' la iniciacin de cross9varilla#ecin' y la a$re$acin de prote2nas [10].Adems' se encontr1ue los descensos' tanto en elre

$yre%eran "eneficiosos para elre#descenso' mientras 1ue el cam"io en lare

$tuvo muc@a ms influenciaenre#de"ido a la mayor tasa decreciente de

re$dere%.n $e9ral' los resultados o"tenidos demostraron claramente 1ue por ultrasonidos

pretratamiento con independencia del tipo era "eneficioso para el enzi9molysisreaccinde345)

por1uedesus

"a#oener$2are1uisitos.4. Conclusiones

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Los resultados mostraron 1ue tanto la pre tradicional y ultrasnicatratado enzimlisis adaptarse "ien a una cintica de primer orden. Jltrasonidose8alsi$nificativamente promovido la velocidad de reaccin de 345) enzimlisis endiversas temperaturas especialmente a una temperatura "a#a' pero no se8al

efecto so"re la concentracin de si$9 polipptido final. >omparadocon enzymolysis tradicional' las constantes de velocidad de la sonda y

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9'9'&9*'9*'&9sesenta y cinco

nzimlisis TradicionalSonda ultrasnica enzimlisis pretratados>u"as para limpieza enzimlisis pretratadoslnk

(, I s!, I T \ ,&90(, I D!Fig.2. La relacin entreln ky ,;T en el tradicional' la sonda y el "a8o delimpiezaultrasonidos pretratado enzimlisis. Los coeficientes de re$resin de las curvasson&':' &':: y &':' respectivamente.0.&0.,0./0.00.F0.9,.&9,F.9,F.&9,0.9,0.&9,/.mzymolysis TradicionalSonda ultrasnica enzimlisis pretratados>u"as para limpieza enzimlisis pretratados

ln(k ;

A

! (, Is.

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D!, I T \ ,&90(, I D!Fig.3.La relacin entre ln (k ; A7y ,;T en el tradicional' sonda y limpieza

"a8o ultrasnico pretratado enzimlisis. Los coeficientes de re$resin de lascurvas son&':*' &':: y &':;' respectivamente.Tabla 2

)armetros termodinmicos en la tradicional' la sonda y el "a8o de limpiezaultrasnico enzymolysis pretratada.scri"emi

la(A,&0? I mol!3$ (&1,0? I mol!3 % (+I mol D!3 # (&1,0? I mol!nzimlisis Tradicional0F./;0,.;::7/&:.::;.0*:Sonda ultrasnica enzimlisis pretratados,&.*;/ (;';G!la./& (*F',G!

7/,.:,; (0F'0G!:'&** (,'FG!>u"as para limpieza enzimlisis pretratados,/.; (;/'FG!,&.0&: (;*'G!7/*.0 (0,'/G!:',;& (,'0G!

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laLos valores entre parntesis son las tasas decrecientes de parmetrostermodinmicos en enzimlisis pretratados ultrasonidos en comparacin conenzimlisis tradicional.

?

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345) concentracin en solucin de reaccin en un momento dado tmin (l$ramoIml!.

. 3espus de inte$rar la ecuacin (1),modelo cintico se expres comoQn t

V 7 ktY n &W/Xdonde>&es la concentracin inicial en 345) solucin de reaccin (l

$ramoIml!.>omo es dif2cil para medir la disminucin de 345)' la reaccinla tasa puede ser determinado por el aumento de la cantidad de polipptidosmarea pu"licado por 345). l modelo cintico de primer orden en el marco delcondiciones de reaccin t >&9,' t

Z Q,7 QtE ,

Z Q,fue escritocomoQ

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LN3 Q,7 Qt

X V 7 ktY ln Q

,W0Xdonde Q,es la concentracin de polipptido Pltimo en la reaccin desolucin (l$ I ml!' y Qt

es la concentracin del polipptido en elsolucin de reaccin en un momento dado tmin (l$ I ml!.l? y Q,Los valores pueden determinarse experimentalmente a partir dela pendiente y la interseccin trazando ln (Q,7 Qt

! n contra de t.n comparacin con enzymolysis tradicional' el pre ultrasnicaenzymolysis reaccin tratada puede ser influenciada por el ultrasonidoefectuar adems del efecto trmico. )or lo tanto' la ken ultra9sonic enzymolysis pretratada se expres comoQkV kdo

Y ku

WFXdondeBdo

es la constante de velocidad de reaccin inducida por efecto trmico enenzymolysis tradicional' y ku

se induce la constante de velocidad de reaccin

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por efecto del ultrasonido en enzymolysis pretratado [email protected] enzimlisiscuacin de Arr@enius se aplic en la descripcin de la relacinentre kconstante de velocidad de reaccin y la temperatura A1ue eraescrita como [18]:kV&e7Ea

A

WXdondeA es el factor pre9exponencial o de colisin (, I min7la

es elener$2a de activacin (? I mol7+ es la constante universal de los $ases ('0,F ? Imol D!'yT es la temperatura a"soluta (D!.La trama de ln kfrente a ,;T se utiliz para el clculo deEla

.yrin$ teor2a del estado de transicin (TST! se utiliz para entender laefecto de la temperatura so"re enzymolysis y tam"in el macroscpicacam"ios o"servados en este estudio [10].La ecuacin TST fue escritocomoQkVk

seundo

Amarido

exp 7re#&8B

AVk

seundo

A

maridoexp 7re

8&'4B

AYre
https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6https://translate.googleusercontent.com/translate_f#6

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%

W;XdondeB

seundo

es la constante de

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re$yre%.

2.2.C.4eterminacin de la concentracin de polipptido

La concentracin de polipptido'l$ I ml' se determin utilizando uninformaron 6olin9fenol mtodo colorimtrico [19].=nicialmente' un volumenF ml de reactivo de 6olin9fenol A se mezcl con &' ml de muestra en unatu"o de vidrio. La solucin se incu" durante ,& min a tempe9 @a"itacinratura' despus de lo cual &' ml de reactivo de 6olin9fenol < se a8adi a cadatu"o de vidrio' y la a"sor"ancia se ley a && nm en un espectrofotmetrofotmetro (Jnic */&&' Jnocal >orporation' S@an$@ai' >@ina! despus0& min de incu"acin. Jn espacio en "lanco se prepar usando a$ua 3= enlu$ar de la muestra. Normas de &9&l$ I ml de

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doF&odo&

odoln (9ermont!(a! el tiempo enzimlisis (min!&,/0F;*:,&,,.&.,./.0.F./&odo0&odo

F&odo&odoln

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(9ermont!("! el tiempo enzimlisis (min!&,

/0F;*:,&,,.&.,./.0.F./&odo0&odoF&odo&odoln (

9ermont!(c! enzymolysis tiempo (min!Fig.1.Los ln (Q,7 Qt! 6rente a veces en valores tradicionales (a!' la sonda ("! y limpieza

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"a8o (c! enzymolysis pretratado ultrasnica a diferentes temperaturas. Lare$resincoeficientes de las curvas o"tenidas a los /&' 0&' F& y & C > son &':;' &':' &':y&': en (a!' &.:;' &.:;' &.:; y &.:: en ("!' y &':;' &':;' &':; y &':: en (c!

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