pengantar bioteknologi-6 dna rekombinan.ppt

5/19/2018 Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt

1/35

Powerpoint Templates

Page 1

DNA REKOMBINANCloning Vectors
http://www.powerpointstyles.com/http://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_8/dna%20cloning%20-%20YouTube.flvhttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_8/dna%20cloning%20-%20YouTube.flvhttp://www.powerpointstyles.com/


2/35

Apakah teknologi DNA Rekombinan?

Pembentukan kombinasi materi

genetik yang baru dengan

penyisipan molekul DNA ke

dalam suatu vektor sehingga

terintegrasidan mengalami

perbanyakandi dalam selorganisme (sel inang).


3/35

Tahapa

nRekom

binanD

NA


4/35


Page 4

Tahapan DNA Rekombinan

1. Isolasi DNA

2. Pemotongan & penggabungan molekul DNA

3. Kloning DNAa. Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor

b. Vektor kloning

4. Transformasi5. Reisolasi molekul DNA rekombinan

6. Analisis DNA rekombinan
http://www.powerpointstyles.com/http://www.powerpointstyles.com/


5/35


Page 5

SUB-KLONING (Insersi gen pada vektor ):

teknik untuk memindahkan gen interes

dariparent vector ke destination vector

Enzim restriksi : memotong gen interes (insert) dariparental.

Insert dimurnikan dengan isolasi (metode :gel isolation)

Gen digandakan dengan PCR

Enzim Restriksi yang sama : untuk mendigesti gen tujuan

Penggunakan enzim yang sama agar complementarysticky

ends

phosphatase(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase; CIAP)

digunakan untuk mencegah ligasi sendiri

Vektor yang terdigesti diisolasi/dimurnikan

Vektor insert dan tujuan dicampurspecific temperature

(tergantung pada ukuran DNA yang diligasi

Vektor yang ada gen interes ditransformasikan ke sel inang

Ketika sel inang membelah maka vektor juga akan

digandankan

T

ahapan
http://www.powerpointstyles.com/http://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzymeshttp://en.wikipedia.org/wiki/Gel_isolationhttp://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_Chain_Reactionhttp://en.wiktionary.org/wiki/complementaryhttp://en.wikipedia.org/wiki/Sticky_endhttp://en.wikipedia.org/wiki/Sticky_endhttp://en.wikipedia.org/wiki/Phosphatasehttp://en.wikipedia.org/wiki/Alkaline_phosphatasehttp://www.powerpointstyles.com/http://en.wikipedia.org/wiki/Alkaline_phosphatasehttp://en.wikipedia.org/wiki/Phosphatasehttp://en.wikipedia.org/wiki/Sticky_endhttp://en.wikipedia.org/wiki/Sticky_endhttp://en.wiktionary.org/wiki/complementaryhttp://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_Chain_Reactionhttp://en.wikipedia.org/wiki/Gel_isolationhttp://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzymeshttp://www.powerpointstyles.com/


6/35

VEKTOR KLONING

Bagian DNA dimana

fragmen DNA asingdapat disisipkan

Digunakan untukmenggandakan molekulDNA


7/35

Powerpoint Templates Page 7

KARAKTERISTIK VEKTOR

1. Memiliki origin of repl ication sehinggaDNA dapat digandakan

dalam sel inang

2. Mudahdiisolasi dan tidak terdegradasi selama pemurnian

3. Memiliki beberapa unique restr iction sites untuk kloningfragmen DNA (multiple cloning site/MCS) sehingga vektor

hanya terpotong sekali untuk membukanya

4. Memiliki selectable markers untuk menentukan bahwa kloning

telah dipindahkan dalam sel dan untuk menduga bahwa DNAasing telah disisipkan kedalam vektor


8/35


VEKTOR KLONING

A. Vektor Bakteri

1. Plasmid

2. Bakteriofag

3. Kosmid

B. Vektor Organisme lain

1. Yeast Artificial Chromosomes (YACs)

2. Bacterial Artificial Chromosomes (BACs)

3. Plant Cloning Vectors4. Mammalian Cell Vectors


9/35


VEKTOR KLONING-PLASMID

Bagian EkstrakromosomDNA : tidak terlalu dibutuhkan bakteri

Memiliki beberapa fungsi : resisten antibiotik, menghasilkan pigmen,

degradasi komponen dan fiksasi dinitrogen

Dapat disisipi DNA sampai 10 kb

Memiliki high copy number atau low copy number

Contoh:pBR322 : plasmid pertama, memiliki ciri:

1. molekul kecil dan mudah diisolasi

2. Dapat disisipi DNA 5 -10 kb

3. Memiliki beberapa unique restriction sites

4. Memiliki gen yang mengkode resisten ampicillin (ampr) dan tetracycline (tetr)


10/35


Plasmid-Good Cloning Vectors

Ukuran kecil (mudah untuk manipulasi dan isolasi)

Sirkuler (lebih stabil)

Replikasi tidak bergantung sel inang Memiliki resistensi terhadap antibodi (deteksi

mudah)


11/35

PLASMID


12/35


13/35


Penyisisipan DNA asing pada Plasmid

Untuk membuka DNA digunakan enzim restriksi

Memotong DNA pada bagian spesifikrestriction site.

Hasilnya : satu set double-stranded DNA denganpotongan beruntai tunggal akhir

Ujung tersebut tidak hanya "sticky" tetapi memiliki ruangyang kemudian dapat diisi DNA asing.

DNA dari sumber luar diikat dengan fragmen DNA

Ligasemenyambung potongan molekul DNA


14/35


Kerugian menggunakan plasmid

Tidak dapat menerima fragmen DNA

ukuran besar, hanya 0- 10 kb

Metode standar transformasi tidakefisien


15/35

Menginfeksi bakteri, DNA direkayasa dalam vektor kloning

Membunuh bakteri melalui 2 jalur:

1. Litik

penting karena DNA phage rekombinan dapat dimasukkan

kedalam bakteri. Bakteri mati, membentuk area jernih

plaques berarti DNA rekombinan dapat di isolasi

2. Lisogenik:

Genom phage diintegrasikan kedalam DNA bakteri, bereplikasi

sama dengan genom sel bakteri

VEKTOR KLONING-BACTERIOPHAGE


16/35

BACTERIOPHAGE

Struktur: head, tail, tail fibres

Dapat disisipi DNA sepanjang >20 kb

Replacement VectorsVektor phage

yang memiliki segmen DNA non

esensial dapat dihilangkan untuk

digantikan DNA asing.

Insertion vector

memiliki salah saturestriction site untuk menyisipkan

DNA 5-10 kb.


17/35

BACTERIOPHAGE LAMBDA

Phage lambdaE. colisebagai

inang. Lambda viral genome: DNA

48,5 kb linier dengan 12 basa

ssDNA "sticky end" pada kedua

ujung; ujung tsb komplemen

sekuennya dan dapat dihibridkansatu sama lain (cos site: cohesive

ends).

Infection:lambda tail fibres

masuk ke reseptor permukaan sel,

ekor berkontraksi, DNAdimasukkan.

DNA sirkuler pada cossite, dan

mulai siklus hidupnya pada inang

E. coli.


18/35

Preparasi pustaka klon faga Skrining pustaka klon faga


19/35

Plasmid kecil yang mengandung satu atau dua lamda cos

site (cohesive termini) dari phage DNA, plasmid originof replication, dan gen untuk resisten antibiotik

Di bungkus dalam protein secara in vitro, tetapi plasmidbereplikasi seperti plasmid bukan DNA phage setelah

berada dalam bakteri Dapat membawa segmen DNA sebesar 35 45 kb.

VEKTOR KLONING-COSMID


20/35


21/35


22/35

untuk molekuler eukaryotic, mengandung:

1. Sentromer : kromosomditransfer ke sel anakan selama

pembelahan sel

2. Telomer : ujung kromosom yeast,

memastikan bahwa telah direplikasi

dan dilindungi dari degradasi

3. Autonomously replicating sequence (ARS),

mengandung sekuen DNA spesifik yang

membuat molekul bereplikasi

4. Gen yang mendukung pendeteksian fragmen

DNA insert.

bermanfaat untuk kloning fragmen DNA ukuran

besar , 200 - 1500 kb.

Dapat menggunakan sel inang bakteri dan yeast

VEKTOR KLONING-Yeast Artificial Chromosomes (YACs)


23/35

Yeast Artificial Chromosomes


24/35


Vektor sintetis yang digunakan untuk kloning kromosom

eukaryotik dengan ukuran fragmen sangat besar, 100 - 300 kb.

Digunakan untuk analisis sebagian besar genom kompleks,whole genes, dan peta konstruksi genom.

Menggunakan plasmid kecil (F (fertility) factor), bersamadengan cloning sites dan selectable markers.

F factor mengijinkan vektor menampung DNA, sampai dengan

25% dari ukuran kromosom bakteri

VEKTOR KLONING-Bacterial Artificial Chromosomes (BACs)

Bacterial Artificial Chromosomes (BACs) sebagai vektor kloning


25/35

Bacterial Artificial Chromosomes (BACs) sebagai vektor kloning


26/35


PACs - P1-berasal dari Artificial Chromosomes

E. colibacteriophage P1 = phage lambda, dapateksis dalamE. colipada tahap propagasi

Eksis dalam selE. colisebagai plasmid, TIDAKterintegrasi dalam kromosomE. coli

Kloning dan propagasi chimeric DNA sebagai

plasmid P1 dalam selE. coli

VEKTOR KLONING-PACs


27/35

Digunakan untuk tujuan : resistensi penyakit, hama dan

herbisida; meningkatkan kualitas tanaman dan hasil;meningkatkan kualitas nutrisi; dan meningkatkan masa

simpan pangan.

Contoh vektor tanamantobacco mosaic virus dan Ti

plasmid dari bakteri tanahAgrobacterium tumefaciens.

VEKTOR KLONING-TANAMAN

tobacco mosaic virus


28/35


Agrobacterium tumefaciens menyebabkan

penyakit empedu mahkota (pembentukan tumor)

pada tanaman, disebabkan oleh T-DNA (DNAtransfer), terletak di Ti plasmid, dan berisi delapan

gen yang diintegrasikan ke dalam genom tanaman

Ti plasmid kekurangan gen penyebab tumor, tetapi

memiliki gen yang diperlukan untukmengintegrasikan DNA bunga ke dalam genom

tanaman.

Plasmid disisipkan kedalam embryo tanaman

melalui perendaman benih dengan rekombinan

bakteriA. tumefaciens , atau dengan memasukkan

plasmid Ti ke dalam sel, yang akan menumbuhkan

tanaman

Gen marker akan memilih hanya sel tanaman

dengan DNA plasmid.

VEKTOR KLONING-TANAMAN


29/35

VEKTOR KLONING SEL MAMMALIA


30/35

Ada beberapa vektor sel mamalia:

1. Simian virus 40 (SV40)sirkuler, ds-DNA, tumor, hanya bisa diinsert

sepotong kecil DNA dan menyebabkan ekspresi sementara (temporer)

dari DNA yang disisipkan. Memiliki inang terbatas dan membutuhkan

faga untuk pengepakan2. Retrovirusss-RNA yang mengandung gen enzim reverse transcriptase

untuk membentuk DNA beruntai ganda dari template RNA, sehingga

DNA dapat diintegrasikan dalam genom sel inang.

3. Adenovirusds-DNA yang dapat menginfeksi banyak jenis sel inang

dengan efisiensi yang tinggi, sedikit resiko menyebabkan penyakit. Tidakharus menginfeksi secara aktif selama pembelahan sel

Sel Mammalia digunakan karena bakteri tidak mampu memproduksi protein

eukaryot kompleksyang dimodifikasi oleh proses seperti glycosylation, atau

jika mRNA memerlukan proses setelah transkripsi.

VEKTOR KLONING-SEL MAMMALIA

Ad i


31/35

Adenovirus


32/35


Konfirmasi Keberadaan Insert

Untuk memastikan pertumbuhan bakteri hanya bakteri

transforman (pembawa plasmid diinginkan)Gen penanda digunakan dalam vektor untuk seleksi. Gen

penanda khas resistensi antibiotik atau biosintesis nutrisi.

Contoh, "penanda gen" bisa resistensi terhadap antibiotik

:ampicillin.

Jika bakteri mengandung plasmid dengan gen interest maka

mereka juga akan berisi "gen penanda".

Bakteri yang mengandung plasmid diinginkan akan dapat

tumbuh pada ampisilin sedangkan bakteri yang tidak

mengandung plasmid diinginkan akan rentan terhadap

kerusakan ampisilin.



33/35



34/35

Jawablah beberapa pertanyaan berikut ini!

1. Apakah teknologi DNA rekombinan?

2. Bagaimana tahapan sub-kloning?

3. Apa yang dimaksud dengan vektor kloning?

4. Apa saja karakteristik vektor?

5. Sebutkan macam vektor kloning!

6. Vektor kloning apa yang dapat digunakan untuk sel eukaryotik

7. Apa keuntungan dan kerugian menggunakan plasmid sebagai vektor?8. Apa fungsiselectable marker,unique restr iction sites,dan origin of

replication?

9. Dalam menginfeksi sel bakteri, bakteriofag memiliki 2 jalur, sebutkan,

jelaskan dan gambarkan secara skematis!

10. Dalam medium yang ditambah antibiotik, sel bakteri yang tidakmengandung DNA rekombinan akan mati, mengapa demikian?

11. Sebutkan 2 vektor kloning tanaman!

12. Mengapa vektor sel mamalia digunakan dalam proses kloning? Sebutkan

3 contoh vektor sel mamalia!
http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/http://desktopwallpaper-s.com/23-Windows-7/-/Apple_windows_7_desktop_backgrounds/


35/35

pengantar bioteknologi-6 dna rekombinan.ppt

Documents

gen interes ditransformasikan

selorganisme sel inang

kloning insersi gen

digandakandalam sel