percorso di battereologia
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Percorso didattico legato allo stage del progetto POR C5 realizzato dal Liceo Scientifico "de Giorgi" di Lecce e il Laboratorio Pignatelli.TRANSCRIPT
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Programma Operativo Regionale 2007IT051PO007 FSE Puglia
Percorso di batteriologia
IPPOCRATE 2012
Dirigente Scolastico: Prof.ssa Giovanna Caretto D.S.G.A.: Dott. Valterluigi Carluccio Coordinatore log.co e org.vo e Responsabile piattaforma Ansas - Resp. Pubblicità: Prof. Rollo Antonio Facilitatore: Prof. Enrico Peccarisi
Tutor scolastiche: Prof.ssa Maria Rosaria Arlotta Prof.ssa Alessandra Galizia Prof.ssa Luciana Tesorone Prof.ssa Patrizia Tommasi
Gruppo di lavoro:
Valentina Pesce Barbara Irno Consalvo Roberta Iovino Francesca Erroi Katia Monteduro
Percorso di Batteriologia
Tutor d’azienda: Dott.ssa Carla Colaci
MICROBIOLOGIA
Il batterio è un microrganismo unicellulare procariota.
La cellula procariotica si distingue da quella eucariotica per:
• Assenza di una membrana nucleare • Struttura priva di compartimenti • Presenza di un unico filamento di DNA
circolare
I batteri in base alla particolare struttura
della loro parete batterica si
suddividono in due gruppi:
• Gram + • Gram -
LA COLORAZIONE DI GRAM
La colorazione di Gram è un esame di laboratorio che perme6e la classificazione dei ba6eri in gram-‐posi:vi e gram-‐nega:vi (gram+ e gram-‐).
Fu messo a punto dal medico danese Hans Joachim Chris:an Gram (1884) e me6e
in evidenza alcune proprietà fondamentali della parete cellulare dei ba6eri.
Le fasi della colorazione sono le seguen::
1. Preparare un soKle striscio di materiale
2. Fissare il materiale sul vetrino passando 3-‐4 volte il vetrino sulla fiamma di un becco Bunsen
3. Ricoprire la superficie con il colorante cristalviole0o ( o viole6o di genziana) e lasciarlo agire per 1 minuto
4. Coprire il preparato con il Lugol (iodio in ioduro di potassio) e lasciare agire per 1 minuto. Successivamente risciacquare con acqua
5. Lavare la superficie con il decolorante a base alcolica
6. Lavare con acqua e ricoprire il vetrino con il colorante di contrasto fucsina ( o safranina) per 1 minuto, quindi risciacquare
7. Esaminare il preparato al microscopio con obieKvo 100x ad immersione
I GRAM + al microscopio appaiono colorati in BLU SCURO perché la parete essendo più spessa ha trattenuto il primo colorante
I GRAM – risultano invece colorati in ROSSO/ROSA in quanto la parete è più sottile
Un’indagine è clinicamente efficace se contribuisce a:
• Individuare o escludere una malattia • Aiutare il processo decisionale: valutazione sulla
possibilità di iniziare la terapia o sulla necessità di eseguire ulteriori indagini
• Determinare la sensibilità del microrganismo agli antibiotici
• Valutare la prognosi • Monitorare il decorso clinico
LE FASI DELL’ ITER DIAGNOSTICO FASE PRE-ANALITICA
• Richiesta • Accettazione del campione che consiste in tamponi del distretto interessato (faringeo, vaginale, uretrale, congiuntivale...) o feci, urine, cute, liquido seminale e sangue (nel caso di sospetta batteriemia)
• Associazione univoca tra il campione e il codice assegnatogli.
FASE ANALITICA Consiste nell’approccio diretto con il materiale. Il campione prelevato viene analizzato dapprima con un esame microscopico e poi attraverso una coltura.
L’esame microscopico può essere di due diversi tipi: • Esame microscopico a fresco che rivela la
mobilità e la morfologia del batterio. • Esame microscopico dopo colorazione
FASE ANALITICA
I microrganismi isolati in coltura, se ritenuti patogeni, devono essere identificati e sottoposti a saggio di sensibilità agli antibiotici.
L’identificazione biochimica è basata sullo studio delle attività metaboliche del microrganismo.
L’antibiogramma è un esame che permette di valutare se un batterio è sensibile o resistente ad un determinato antibiotico. Seguendo questo procedimento si può stabilire la terapia più adatta.
IDENTIFICAZIONE Il sistema di identificazione API è stato il sistema manuale utilizzato per lungo
tempo per la identificazione di batteri gram positivi, gram negativi fermentanti e non, lieviti.
Attualmente l’introduzione di terreni cromogeni, come il CPS, sono di grande aiuto per una identificazione presuntiva di molti microrganismi, per cui l’esecuzione sulla colonia batterica di pochi test biochimici è sufficiente per definire la specie batterica.
SISTEMA AUTOMATICO Il VITEK 2 è uno strumento di microbiologia che garantisce sicurezza e rapidità dei risultati dei test di identificazione dei microrganismi e dei saggi di sensibilità agli antibiotici ; è in grado di saggiare 32 antibiotici per i cocchi Gram + e 46 antibiotici per i bacilli Gram-.
Le card VITEK per l’identificazione e l’antibiogramma presentano 64 pozzetti contenenti reagenti biochimici o antibiotici. Nella card è preinserito il tubicino di trasferimento della sospensione del microrganismo e un’etichetta con codice a barre che permette il collegamento tra card e numero di riferimento del paziente.
Produzione di un referto FASE POST-ANALITICA
I terreni di coltura • Il terreno di coltura è il mezzo NEL quale o SUL quale può avvenire lo
sviluppo e la crescita in vitro di un microrganismo. Le sue caratteristiche principali sono :
- Concentrazione adatta di sostanze nutritive per la crescita batterica. - Adeguato grado di umidità. - Reazione (pH) adatta. - Sterilità e protezione da qualsiasi inquinamento.
In base allo STATO FISICO si distinguono:
- Terreni LIQUIDI in cui i componenti sono sciolti in acqua e sterilizzati.
- Terreni SOLIDI i quali possono essere naturalmente tali o vengono solidificanti per aggiunta di un agente gelificante (agar, gelatina..)
In base alla FUNZIONE si distinguono: - Terreni di ARRICHIMENTO (o elettivi) : la specie microbica di interesse vi cresce in un tempo assai più breve rispetto ad altre specie microbiche. Possibili arricchimenti sono sangue lisato, emoglobina ecc necessari per la crescita di batteri “esigenti” dal punto di vista nutrizionale. - Terreni SELETTIVI: A concentrazione nota che inibiscono o ralletano lo sviluppo di molte specie microbiche, ma non di altre. Sono utilizzati in casi di campioni particolarmente contaminati. - Terreni DIFFERENZIALI: Contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel terreno stesso.
Hektoen Enteric Agar: a destra nel terreno selettivo si ha la crescita della Klebsiella (lac più), a sinistra Salmonella (lac meno).
Fattori influenzanti la crescita:
Con il termine crescita si indica generalmente l’acquisizione di biomassa per la divisione cellulare (o riproduzione). A seconda dei fattori della crescita dei batteri essi si definiscono OBBLIGATI se una condizione è necessaria per la crescita batterica e FACOLTATIVI se il microrganismo può crescere in quella condizione sebbene non necessaria (ad esempio un termofilo facoltativo può crescere ad alte temperature ma anche a temperature più basse). Fattori influenzanti sono la TEMPERATURA, pH e OSSIGENO. Nel primo caso la maggior parte dei batteri cresce in un intervallo termico di circa 20°C, poi si suddividono in:
Psicrofili 0-20 °C Mesofili 10-50°C Termofili 40-75°C Ipertermofili 70-110 °C
In base al pH: Acidofili : crescono al di sotto di pH 6 come funghi e lieviti Neutrofili crescono in un intervallo di pH tra 6-8 come nel caso della maggior parte dei batteri Alcalofili crescono a pH >8
In base all’ossigeno : Batteri AEROBI OBBLIGATI Vivono solo in presenza di O2 Batteri AEROBI-ANAEROBI FACOLTATIVI Vivono in presenza/assenza di O2 Batteri ANAEROBI OBBLIGATI Vivono in assenza di O2 Batteri MICROAEROFILI Vivono in presenza di (O2 5%, CO2 10%, N2 85%)
1: I batteri aerobi obbligati si sviluppano in suferficie, in modo da assorbire la maggior quantità possibile di ossigeno. 2: I batteri anaerobi obbligati si raccolgono sul fondo, per evitare l'ossigeno. 3: I batteri aerobi-anaerobi facoltativi possono crescere sia in presenza che in assenza di ossigeno,per cui si distribuiscono nel terreno di coltura,concentrandosi in maggiore quantità in prossimità della superficie (aerobi facolt.) o sul fondo (anerobi facolt.) . 4: I microaerofili si raccolgono nella parte superiore della provetta, ma non in testa; essi richiedono infatti ossigeno a bassa concentrazione. 5: Il metabolismo dei batteri aerotolleranti non è influenzato dalla presenza di ossigeno
Terreni di coltura e tecniche di semina.. L’allestimento delle colture microbiche comporta il trasferimento dei microorganismi in esame negli opportuni mezzi di crescita. La scelta della tecnica di semina è determinata dalle condizioni in cui si presenta il campione e dallo scopo per cui vengono predisposte. Le più comuni tecniche di semina sono:
- Semina per striscio.
- Tecnica per infissione.
- Tecnica becco di clarino.
SEMINA PER STRISCIO
Si utilizzano piastre contenenti terreno già solidificato. Il prelievo dell’inoculo viene effettuato con un’ansa. Prima di effettuare il prelievo l’ansa va sterilizzata alla fiamma di un bunsen e fatta raffreddare per non rischiare di uccidere i microrganismi dell’inoculo. La semina viene eseguita strisciando delicatamente con movimenti a zig-zag l’ansa sul terreno della piastra.
SEMIN
A PER STR
ISCIO
TECNICA PER INFISSIONE Avviene mediante un ago ed è utilizzata per inoculare nei terreni
già solidificati in provetta. L’ago consente di inserire le cellule batteriche lungo una linea verticale, in profondità e quindi permette lo sviluppo dei batteri anaerobi e favorisce l’osservazione delle forme mobili che manifestano una crescita diffusa a partire dalla linea dell’inoculo.
TECNICA A BECCO DI CLARINO Si lascia la provetta contenente il terreno in
posizione orizzontale e si fa raffreddare. Si semina il campione per striscio con un' ansa sulla superficie del terreno nella provetta.
COPROLOGIA
La coprologia è un se6ore della microbiologia che si occupa dell’esame delle feci. Una delle metodologie più comunemente u:lizzate è l’esame chimico-‐fisico che in una prima fase consiste nello studio di:
Consistenza (poltacea, formata e liquida) Colore (nocciola, marrone, verdastro ed ocraceo) Odore (fermentazione, putrefazione) Presenza di muco Analisi del pH In una seconda fase si procede alla ricerca del sangue occulto e all’esame parassitologico.
Consiste nella ricerca di tracce di sangue umano nelle feci: rappresenta uno dei marker più significa:vi per le patologie infiammatorie e neoplas:che dell’intes:no. L’esame è effe6uato tramite un test rapido immunocromatografico che si basa sull’interazione tra an:corpi monoclonali ed emoglobina umana (per escludere la presenza di sangue proveniente da carne animale ingerita).
È finalizzato alla ricerca di parassi: a6raverso l’osservazione microscopica “a fresco” di un campione di feci che inizialmente viene filtrato e mescolato con della fisiologica e successivamente viene centrifugato. Al microscopio è possibile osservare diversi parassi: come la giardia, le amebe, la tenia, le uova di ossiuri.
Malaria Un caso di malaria è:
Importato se l’infezione è stata contra6a al di fuori della zona in cui viene diagnos:cato;
Autoctono se l’infezione è stata contra6a localmente
Gli agen: eziologici della malaria sono protozoi appartenen: al genere Plasmodium. Se ne conoscono più di cento specie di cui qua6ro interessano l’uomo:
• Plasmodium falciparum
• Plasmodium vivax
• Plasmodium ovale • Plasmodium malariae
I plasmodi si mol8plicano per schizogonia nelle cellule del parenchima epa8co (ciclo pre–eritrocitario) e poi nei globuli rossi (ciclo eritrocitario); qui si formano anche i gametoci8 che vengono ingeri8 dall’inseJo veJore. Nello stomaco della zanzara i gametoci8 maturano a game8 e si accoppiano a dare uno zigote mobile (oocinete). Segue la formazione di una oocis8 con numerosi sporozoi8 (ciclo sporogonico) che raggiungono le ghiandole salivari e da qui vengono inieJa8 all’uomo.
Plasmodium falciparum È la specie più comune nelle zone tropicali e subtropicali, occasionalmente zone temperate. Questo :po di plasmodium è l’agente eziologico della terzana maligna, cosidde6a perché può essere letale. Il ciclo schizogonico ema:co si completa in 48 ore e gli accessi febbrili si ripetono ogni terzo giorno.
Ha la stessa distribuzione di P. falciparum ma è molto meno frequente; è responsabile, infaO, di circa il 5% dei casi di malaria nel mondo. Esso è l’agente eziologico della malaria cosiddeJa “quartana”, perché durante gli aJacchi l’accesso febbrile si verifica ogni 72 ore.
È la specie più diffusa nelle zone temperate ed è l’agente eziologico della “terzana benigna”, responsabile di circa il 40% dei casi di malaria nel mondo. È praticamente assente in Africa occidentale, le sue infezioni sono caratterizzate da frequenti ricadute; la malattia è raramente letale.
È presente in Africa tropicale e occasionalmente nell’Oceano Indiano e nel Pacifico occidentale (Papua e Nuova Guinea). La malattia che provoca è simile a quella da P. vivax , ma più benigna. È responsabile di una bassa percentuale di casi di malaria nel mondo
La diagnosi clinica della malaria deve essere seguita dalla conferma diagnos:ca con test di laboratorio. Le tecniche diagnos:che per la malaria possono essere riunite in:
metodi dire8 diagnosi microscopica di prepara: ema:ci colora: con Giemsa o con fluorocromi
test immunocromatografici test molecolari
metodi indire8 test immunologici Il prelievo deve essere fa6o prima che il paziente inizi la terapia e tenendo presente che i parassi: sono più numerosi nel sangue qualche ora dopo l’inizio dell’accesso febbrile. Per ogni individuo si deve alles:re almeno una goccia spessa per la ricerca del parassita e uno striscio soKle per l’iden:ficazione della specie.
L’inizio dell’era degli antibiotici.
La storia degli antibiotici comincia nel 1929 quando Fleming, studiando varianti dello stafilococco, osservò che una muffa che contaminava una delle sue colture aveva inibito intorno a sé la crescita del batterio. Inoltre, Fleming poté osservare che il brodo di coltura in cui erano cresciuti i funghi possedeva un potente effetto inibitorio nei confronti di molti altri microrganismi. Poiché la muffa apparteneva al genere Penicillum, Fleming chiamò questa sostanza antibatterica penicillina. Iniziava così l’era degli antibiotici il cui significato è letteralmente «contro la vita». Il termine nell'uso comune attuale indica un farmaco, di origine naturale (antibiotico in senso stretto) o di sintesi (chemioterapico),in grado di rallentare o fermare la proliferazione dei batteri. La loro caratteristica principale è la tossicità selettiva che gli permette di non agire sulle cellule eucariotiche (a differenza dei disinfettanti.)
L'antibiogramma (spesso indicato come ABG) è un esame in vitro che permette di valutare se un batterio è sensibile ad un determinato antibiotico.
• inibizione della sintesi della parete cellulare (penicilline e cefalosporine)
• alterazione delle membrane cellulari (polimixine)
• inibizione della sintesi proteica (cloramfenicolo, eritromicina e tetracicline)
• inibizione della sintesi degli acidi nucleici (actinomicina, mitomicine e acido nalidixico)
• attività anti-metabolica o antagonismo competitivo (sulfamidici)
Resistenza antibiotica Acquisita: Si tratta di una
variazione informazionale e può essere cromosomica o endogena (quando il DNA batterico va incontro a mutazione) o extra-cromosomica (quando c’è trasferimento di materiale genetico da un microrganismo all’altro).
Naturale: si tratta di una resistenza naturale all’azione antibiotica, immutabile nel tempo, geneticamente determinata: es. resistenza di Klebsiella sp. ad ampicillina
Saggio di sensibilità agli antibiotici. Si possono utilizzare diverse tecniche di saggio di sensibilità agli antibiotici: - Antibiogramma secondo Kirby-Bauer - Antibiogramma con il metodo delle diluizioni per la valutazione delle MIC (sistema automatico, E test)
MIC e MBC Il metodo più corretto per determinare l’efficacia di
un antibiotico nei confronti di un microrganismo consiste nello stabilire, per ogni farmaco antibatterico, la concentrazione minima inibente (MIC) e la concentrazione minima battericida (MBC).
- MIC (Minimal Inhibitory Concentration ): la concentrazione minima di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica.
- MBC (Minimal Bactericidal Concentration): la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di distruggere i batteri.
Subito dopo l’inoculo si depongono sulla superficie della piastra una serie di dischetti di carta assorbente sterili imbevuti di adatte concentrazioni degli antibiotici che si desidera testare.
• Si pongono le piastre in incubatore a 37°C per 18-24 ore.
• Si misura il diametro degli aloni di inibizione per ogni antibiotico.
Interpretazione dei risultati.
L’interpretazione del saggio di sensibilità agli antibiotici permette di classificare il microrganismo come: - "sensibile" (l'antibiotico risulta efficace ai dosaggi comunemente raccomandati). - "intermedio“ (la crescita batterica è inibita solo al dosaggio massimo raccomandato). - "resistente" (l'antibiotico non ha effetto nei confronti del microrganismo).