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Protocolo de extracción de ADN paraAloe barbadensis Mill.

DNA extraction protocol for Aloe barbadensis Mill.A. Nava1, N. Albany2 y J. Vilchez3

1Departamento de Agronomía, 2Departamento de Química y 3Depar-tamento de Botánica. Facultad de Agronomía, Universidad del Zulia,AP 15205, Maracaibo, estado Zulia (4005ZU), República Bolivarianade Venezuela.

Resumen

El cultivo de Aloe barbadensis Mill. presenta múltiples aplicaciones en laindustria farmacéutica, cosmetológica y alimenticia. A pesar de su adaptabilidada zonas desérticas el incremento de la superficie sembrada en Venezuela se velimitado por las bajas tasas de propagación de hijuelos de forma convencional. Lapropagación masiva de plantas sanas de zábila se puede lograr a través de méto-dos de micropropagación, pero requiere de la verificación de la fidelidad genéticade las plantas, para lo cual es necesario contar con un método de extracción deADN que sea rápido, económico y que genere un ADN de alta calidad y cantidad.En tal sentido, se compararon tres protocolos de extracción de ADN (20% SDS,2% CTAB/3,5M NaCl y 2% CTAB/1,4M NaCl) en tejido foliar de vitroplantas ehijuelos de zábila. Basados en los análisis espectrofotométricos de pureza (1,45) eintegridad del ADN se seleccionó el protocolo de 2% CTAB/1,4M NaCl para eva-luar diferentes zonas del tejido foliar (apical, media y basal), además se realiza-ron modificaciones en los antioxidantes del tampón de extracción, el tiempo dehomogenización e incubación, y se eliminó el uso de acetato de sodio y se adicionóun tratamiento con ARNasa para la estandarización del método de extracción deADN de zábila. Las zonas media y basal del tejido foliar, así como las modificacio-nes realizadas al protocolo 2% CTAB/1,4M NaCl permitieron obtener un ADN dezábila con concentración (185,45 y 204,67 ng.μL-1) y calidad (1,89 y 1,93) adecua-da para los análisis moleculares.Palabras clave: Zábila, ácidos nucleicos, métodos de extracción.

Recibido el 5-3-2015 Aceptado el 1-06-2015Autor de correspondencia e-mail: nalbany@fa.luz.edu.ve

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Abstract

Aloe barbadensis Mill. is a crop with multiple applications in thepharmaceutical, cosmetic and food industry. Even though, Aloe has highadaptability to deserted areas, the increment of commercial sown surface of aloein Venezuela is limited due to the low propagation rates of offshoots by conventionalpropagation methods. Massive propagation of healthy plant could be achieved bymicropropagation techniques. However, the genetic stability of these plants mustbe verified, therefore a DNA extraction protocol is necessary, which be cheap,will consume less time and able to achieve high quality and quantity of DNA.Three DNA extraction protocols (20%SDS, 2%CTAB/3.5MNaCl and 2%CTAB/1.4MNaCl) on aloe foliar tissue of vitroplants and offshoots were compared. Basedon spectrophotometric analysis of the quality (1.45) and integrity (electrophoreticanalysis) of DNA, the extraction protocol 2%CTAB/1,4MNaCl was selected toevaluate different position of foliar tissue (apical, intermediate, base); in addition,several modification were carried out, antioxidants in the buffer extraction,incubation and homogenization time, and RNAase treatment, sodium acetatewas excluded for standardization of DNA extraction method for aloe. Theintermediate and base zone of foliar tissue as well as all modifications carried outto 2% CTAB/1.4M NaCl protocol allowed to obtain satisfactory quantity (185.45and 204.67 ng.μL-1) and quality (1.89 and 1.93) of DNA of aloe for molecularanalysis.Key words: Aloe, nucleic acid, extraction protocols.

Introducción

La especie Aloe barbadensisMill., ubicada en la familiaAsphodelaceae es muy utilizada en laindustria farmacéutica, de alimentosy cosmética por las propiedades bioló-gicas de la aloína y otros metabolitosprimarios y secundarios que se extraende esta especie (Campestrini et al.,2006; Araujo et al., 2002).

Los avances en el cultivo de teji-dos vegetales han generado en los últi-mos diez años varios métodos demicropropagación para zábila; alta-mente eficientes en cuanto a la canti-dad de plantas reproducidas y la cali-dad fitosanitaria (Matos, 2007; Albanyet al., 2006; Liao et al., 2004). Sinembargo, estas plantas deben ser eva-

Introduction

The species of Aloe barbadensisMill., belonging to the Asphodelaceaefamily is very used in thepharmaceutical, food and cosmeticsindustry by the biological properties ofthe aloin and other primary andsecondary metabolites that areextracted from this species(Campestrini et al., 2006; Araujo etal., 2002).

The advances in plant tissueculture have generated in the last tenyears several micropropagationmethods for aloe; highly efficientregarding the quantity of propagatedplants and the phytosanitary quality(Matos, 2007; Albany et al., 2006; Liaoet al., 2004). However, these plants

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luadas antes de ser establecidas comer-cialmente para reducir las posibilida-des de obtener variantes somaclonales(Samantaray y Maiti, 2008), para locual se usan marcadores morfológicoso moleculares (Sánchez y Jiménez,2009; Roca y Ramirez, 2000). Los pri-meros se basan en el estudio de cam-bios visibles en el fenotipo y requierende un registro cuidadoso de las carac-terísticas morfológicas de las plantashasta su madurez (Deore et al., 2014).Los segundos estan basados en el ADN,no son afectados por factores ambien-tales y generan resultados confiablesy reproducibles (Rathore et al., 2011);que además pueden ser empledos enla etapa de aclimatación de cultivo detejido.

El proceso de extracción de ADNimplica romper y digerir las paredescelulares para exponer los constituyen-tes celulares (Sánchez et al., 2012),seguido de la lisis celular para liberaral ADN del interior de la célula (Fal-cón y Valera, 2007). Para ello, se pro-cede a la destrucción de las estructu-ras formadas por lípidos y proteínasde la célula, permitiendo la liberacióndel ADN del núcleo celular; medianteuna solución tampón salina que suelecontener detergentes (Red Nacional deBiobancos, 2012), con adiciones de unamolécula quelante y el Tris-HCl paramantener el pH de la solución estable(Falcón y Valera, 2007); además deotras sustancias como antioxidantes (2mercaptoetanol, ácido ascórbico) yenzimas hidrolíticas (proteinasa K).

Entre los detergentes más utili-zados en las soluciones de extracciónse encuentra el dodecilsulfato sódico,conocido como SDS (Sodium DodecylSulfate), con propiedades tensoactivas

should be evaluated before beingestablished commercially to reduce thechances of obtaining somaclonalvariants (Samantaray and Maiti,2008), for which morphological ormolecular markers are used (Sanchezand Jimenez, 2009; Roca and Ramirez,2000). The firsts are based on thestudy of visible changes in thephenotype and require a thorough re-cord of the morphologicalcharacteristics of the plants until theirripening (Deore et al., 2014). Theseconds are based on the DNA, are notaffected by environmental factors andgenerate reliable and reproducibleresults (Rathore et al., 2011); whichcan also be used in the acclimationstage of the tissue culture.

The process of DNA extractioninvolves breaking and digesting thecell walls to expose the cellularconstituents (Sánchez et al., 2012),followed by cell lysis to release the DNAinside the cell (Falcón and Valera,2007). For this, the structures formedby lipids and proteins of the cell aredestroyed, allowing the release of theDNA in the cell nucleus using abuffered salt solution that usuallycontains detergents (National Networkof biobanks, 2012), and adding achelating molecule and the Tris-HClto maintain stable the pH of thesolution (Falcón and Valera, 2007);besides other substances such asantioxidants (2 mercaptoethanol,ascorbic acid) and hydrolytic enzymes(proteinase K).

Among the most used detergentsin the extraction solutions are: sodiumdodecyl sulphate, known as SDS withactive anionic properties (Falcón andValera, 2007); the cetyl trimethyl

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aniónicas (Falcón y Valera, 2007); elbromuro de cetiltrimetilamonio (CetylTrimethyl Ammonium Bromide :CTAB) con propiedades tensoactivascatiónicas y el Tween (Castillo et al.,2004). La función de estos detergentesen el proceso de extracción de ADN esprincipalmente solubilizar los lípidos;de tal manera que captura los lípidosjunto con las proteínas de la membra-na celular y nuclear exponiendo elADN. Algunos de los detergentes em-pleados pueden coadyuvar en ladesnaturalización de las proteínas li-gadas al ADN (histonas) y/o proteasas(ADNasas) que se encuentran en lacélula (Red Nacional de Biobancos,2012).

Una vez que se precipitan lasproteínas, el ADN que permanece enla solución acuosa puede precipitarcuando se adiciona un alcohol y unasal en alta concentración (acetato desodio, cloruro de sodio, acetato deamonio o cloruro de litio) (Falcón yValera, 2007; Sambrook y Russell,2001); ya que los ácidos nucleicos enforma de sales, presentan bajasolubilidad en los alcoholes (AbuAlmakarem et al., 2012). Elisopropanol o el etanol actuan sobre losácidos nucleicos exponiendo las cargasnegativas de sus grupos fosfatos, loscuales se unen a las contracargas delNa+ reduciendo las fuerzas de repul-sión entre los polinucleotios, favore-ciendo la precipitación del ADN porcentrifugación (Sambrook y Russel,2001); siendo el isopropanol selectivopara la precipitación del ADN en pre-sencia de ARN (Velasco, 2005).

La concentración y la calidad delADN extraído puede cuantificarse uti-lizando electroforesis de muestras y

ammonium bromide: CTAB withcationic properties and the Tween (Cas-tillo et al., 2004). The function of thesedetergents in the process of DNAextraction is mainly to solubilize lipidsin such a way that these capture thelipids along with the proteins in thecell membrane, exposing the nuclearDNA. Some of the detergents employedcan assist in the denaturalization ofthe proteins bounded to the DNA(histones) and/or proteases (DNAases)that are found in the cell (NationalNetwork of Biobanks, 2012).

Once the proteins areprecipitated, the DNA that remains inthe aqueous solution can precipitatewhen alcohol and a salt are added inhigh concentrations (sodium acetate,sodium chloride, ammonium acetateor lithium chloride) (Falcón andValera, 2007) Sambrook and Russell,2001) since the nucleic acids as saltshave low solubility in alcohols (AbuAlmakarem et al., 2012). Theisopropanol or ethanol act on nucleicacids by exposing the negative chargesof the phosphate groups, which join tothe counter-charge of Na reducing therepulsion forces between thepolynucleotides, favoring theprecipitation the ADN bycentrifugation (Sambrook and Russel,2001); being the isopropanol selectivefor the DNA precipitation in thepresence of RNA (Velasco, 2005).

The concentration and quality ofthe extracted DNA can be quantifiedusing sample electrophoresis andknown concentration patterns of DNAor by using a spectrophotometer,which detects the radiation emitted bythe nitrogenous bases found in theDNA after being moved with a

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patrones de concentraciones conocidasde ADN o empleando unespectrofotómetro, el cual detecta laradiación emitida por las basesnitrogenadas presentes en el ADN lue-go de ser excitadas con una longitudde onda de 260 nm (Rocha, 2002). Larelación A260nm/A280nm ha sidoseñalanda por varios autores como in-dicativo de pureza del ADN,considerandose que un ADN es de bue-na calidad si esta en los siguientes ran-gos: entre 1,8 y 2 (San Juan et al., 2014;Cerda y Díaz, 2013; Sánchez et al.,2012; Sambrook y Russel, 2001), en-tre 1,7 y 2,0 (López et al., 2011), entre1,6 y 1,8 (Gryson, 2010) o entre 1,5 y2,0 (Castillo et al., 2004).

La mayoría de las extraccionesde ADN de plantas se han realizadopor medio de dos protocolos básicos quehan sido modificados según las propie-dades de los tejidos vegertales estudia-dos, uno propuesto por Dellaporta etal. (1983) y otro por Doyle y Doyle(1990), con compuestos que eliminansubsecuentemente proteínas,polisacáridos y polifenoles. En el pri-mero son utilizados reactivos como SDSen presencia de acetato de potasio parala precipitación simultanea deproteinas y polisacaridos, mientras queen el segundo se utiliza CTAB (Roma-no y Miranda, 1999).

Los métodos de extracción deADN buscan rápidez, simplicidad, efi-ciencia y economía; además, de obte-ner un producto aislado que sea de ca-lidad y con altos rendimientos para serutilizado en diferentes objetivos (Deoreet al., 2014, Castillo et al., 2004). Sinembargo, la extracción del ADN nosiempre es simple y los protocolos pu-blicados no son necesariamente repro-

wavelength of 260 nm (Rocha, 2002).The A260nm/A280nm relationship hasbeen mentioned by different authorsas an indication of the DNA purity,considering that a DNA with goodquality is the one that merges in theranges: from 1.8 and 2 (San Juan etal., 2014; Cerda and Diaz, 2013;Sánchez et al., 2012; Sambrook andRussell, 2001), from 1.7 to 2.0 (Lópezet al., 2011), from 1.6 to 1.8 (Gryson,2010) or from 1.5 to 2.0 (Castillo et al.,2004).

Most of the DNA extractions ofplants have been carried out by meansof two basic protocols that have beenmodified according to the properties ofthe vegetable tissued studied, oneproposed by Dellaporta et al. (1983) andother by Doyle and Doyle (1990), withcompounds that subsequentlyeliminate proteins, polysaccharidesand polyphenols. In the first, agentssuch as SDS are used along topotassium acetate for thesimultaneous precipitation of proteinsand polysaccharides, while in thesecond CTAB is used (Romano andMiranda, 1999).

The DNA extraction methodslook for speed, simplicity, efficiency andeconomy, also to obtain a high qualityisolated product with high yields to beused in different objectives (Deore etal., 2014, Castillo et al., 2004).However, the DNA extraction is notalways simple and the publishedprotocols are not necessarily reprodu-cible for any species, due to the factthat a large number of plants producesecondary metabolites (Castillo et al.,2004) that interfere and hinders theremoval process; thus, eachresearcher describes a different

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ducibles para cualquier especie, debi-do a que un gran número de plantasproducen metabolitos secundarios(Castillo et al., 2004); que interfiereny dificultan el proceso de extracción,por lo que cada investigador describeun método diferente (López et al.,2011) estandarizado a sus propias con-diciones; especialmente cuando los te-jidos de la planta dificultan el procesode extracción como las células delparénquima que forman el gel de lazábila. Por tanto se plantea como obje-tivo de esta invetigación obtener unprotocolo de extracción de ADN paraA. barbadensis que proporcione la con-centración y calidad necesaria para eldesarrollo de estudios moleculares.

Materiales y métodos

Material vegetalDe una planta de zábila (A.

barbadensis) crecida en condiciones decampo en el Centro Socialista de In-vestigación y Desarrollo Fruticola yApicola de CORPOZULIA, ubicado enel Municipio Mara, estado Zulia, Ve-nezuela (latitud Norte 10°49'40" y lon-gitud Oeste 79°46'31"), se selecciona-ron brotes para generar: vitroplantas(Albany et al., 2006) e hijuelos por pro-pagación convencional.

Comparacición de tres pro-tocolos de extracción de ADN parazábila

La extracción de ADN se llevó acabo a través de tres protocolos, unobasado en el uso de dodecilsulfatosódico (SDS); y dos basados en el usode bromuro de cetiltrimetilamonio(CTAB). Los tres protocolos fueronadaptados a las condiciones de sumi-nistros, equipos e instalaciones del la-

method (Lopez et al., 2011)standardized to their own conditions;especially when the plant tissuehinders the removal process such asthe parenchyma cells that form thealoe gel. Therefore, the aim of thisresearch is to obtain an extractionprotocol of DNA for A. barbadensis thatwould provide the necessaryconcentration and quality for thedevelopment of molecular studies.

Materials and methods

Vegetal materialSprouts were selected to generate

vitroplants (Albany et al., 2006) andtillers by conventional propagation froman aloe plant (A. barbadensis) grownunder field conditions in the SocialistCenter of Fruit and Beekeeping Researchand Development of CORPOZULIA,located in Mara county, Zulia state, Ve-nezuela (North latitude 10º49'40" andWest longitude 79º46'31").

Comparison of three DNAextracting protocols for aloe

DNA extraction was carried outthrough three protocols, one based onthe use of sodium dodecyl sulphate(SDS); and two based on the use of cetyltrimethyl ammonium bromide(CTAB). The three protocols wereadapted to the conditions of supplies,equipment and facilities of theBiotechnology laboratory “ProfessorSilvia León de Sierralta” of theAgronomy Faculty of Universidad delZulia.

Selection and processing ofthe foliar tissue for the DNAextraction

Young leaves of equal appearancein terms of length and thickness of

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boratorio de Biotecnología “ProfesoraSilvia León de Sierralta” de la Facul-tad de Agronomía de la Universidaddel Zulia.

Selección y procesamientodel tejido foliar para la extracciónde ADN

Hojas jóvenes de igual aparien-cia en cuanto a longitud y grosor devitroplantas e hijuelos de edad, altura(~ 15 cm) y número de hojas simila-res se cortaron en condiciones de asep-sia, utilizando guantes de latex e ins-trumentos esterilizados (capsulas depetri, pinzas y bisturí). Sólo las hojasprovenientes de hijuelos se desinfecta-ron con una solución de NaClO al 3%v/v durante 3 min; luego se enjuaga-ron con suficiente agua destilada esté-ril y se colocaron sobre la capsula depetri con una pinza. Para obtener unalámina delgada constituida por la cu-tícula, la epidermis y las celulasparenquimatosas (tejido foliar) se uti-lizó un bisturí y un Flosbrush® (man-go de auto dispensación de hilo dental)con un alambre fino y estéril (figura1a, 1b, 1c y 1d). Para eliminar la ma-yor cantidad posible de gel se realizóun barrido con la hoja de un bisturí enforma de bisel sobre el tejido foliar.

Un círculo de 0,5 cm de diáme-tro de la zona media-basal del tejidofoliar con un peso comprendido entre50 y 55 mg se colocó en un tubo nuevoy estéril de microcentrífuga de 1,5 mLde capacidad, previamente identifica-do según la procedencia del tejido foliary el protocolo de extracción a evaluar,todos los protocolos se hicieron por tri-plicado.

El protocolo 20% SDS: fue rea-lizado siguiendo los procedimientos deGilbertson et al. (1991) con modifica-

vitroplants and tillers with similar age,height (~ 15 cm) and number of simi-lar leaves were cut on asepsisconditions, using latex gloves andsterilized instruments (petri plates,tweezers and scalpel). Only the leavesfrom shoots were disinfected with aNaClO 3% v/v solution for 3 min; thenflushed with enough sterile distilledwater and placed on a petri plate witha clamp. A scalpel and a Flosbrush®

(self dispensing flossing) with a thinand sterile wire (figure 1a, 1b, 1c and1d) were used to obtain a thin sheetformed by the cuticle, the epidermisand the parenchymal cells (leaf tissue).To eliminate the greatest amount ofgel, a sweep on the foliar tissue wasdone using a scalpel.

A 0.5 cm diameter circle in themedia-basal area of the foliar tissueweighing between 50 and 55 mg wasplaced in a new and sterile micro-centrifuge tube for 1.5 mL capacity,previously identified according to theorigin of the foliar tissue and theextraction protocol to be evaluated; allthe protocols were made by triplicate.

The 20% SDS protocol: wascarried out following the Gilbertson etal. (1991) procedures with modificationin the times of centrifugation(increased from 10 to 15 min) and theethanol percentage (increased from 70to 100%).

The 2% CTAB/3.5 M NaClprotocol: was used following theprocedure described by Rathore et al.(2011), whose modifications consistedof the exclusion of the nitrogen inliquid and the ARNase.

The 2% CTAB/1.4 M NaClprotocol: employed the methodologyof Doyle and Doyle (1990) with some

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Figura 1. Proceso de extracción del tejido foliar de zábila(Aloe barbadensis Mill.): (a) Corte del margen dentado yespinoso de la hoja con bisturí. (b) Incisión transversaldebajo de la epidermis de la cara adaxial de la hoja.(c) Inserción con alambre fino y estéril usando unFlosbrush®®®®®. (d) Obtención del tejido foliar para extracciónde ADN haciendo un recorrido del alambre a lo largo de lahoja. (e) Círculos de tejido foliar de zábila deaproximadamente 0,5 cm de diámetro de las zonas basal,media y apical utilizados para la estandarización delprotocolo 2% CTAB/1,4 M NaCl de extracción de ADN.

Figure 1. Extraction process of the leaf tissue of Aloe (Aloe barbadensisMill.): (a) toothed and thorny cut of the sheet with a scalpel.(b) Transverse incision below the epidermis of the adaxialface of the leaf (c) insertion with fine and sterile wire usinga Flosbrush®®®®®. (d) Obtaining of the foliar tissue for the DNAextraction doing a tour of the wire throughout the leaf. (e)Circles of foliar tissue of Aloe of approximately 0.5 cm ofdiameter of the basal, middle and apical areas used for thestandardization of the protocol 2% CTAB/1.4 M NaCl of theDNA extraction.

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ción en los tiempos de centrifugación(incrementado de 10 a 15 min) y elporcentaje del etanol (incrementado de70 a 100%).

El protocolo 2% CTAB/3,5 MNaCl: se utilizó siguiendo el procedi-miento descrito por Rathore et al.(2011), cuya modificación consistió enla exclusión del nitrógeno líquido y laARNasa.

El protocolo 2% CTAB/1,4 MNaCl: empleó la metodología de Doyle yDoyle (1990) con algunas adaptacionesrealizadas por Pardo et al. (2008), queincluyen el uso de centrifugación en frío.

Evaluación de diferentes zo-nas del tejido foliar de zábila enla estandarización del protocolode extracción de ADN.

Se evaluó la zona apical, media ybasal del tejido foliar de zábila (figura 1e)en la estandarización del protocolo selec-cionado de la comparación en el primerensayo, realizando algunos cambios comola eliminación de raspado del gel en elprocesamiento del tejido para evitar pro-cesos de oxidación del tejido y degrada-ción del ADN, la solución tampón de ex-tracción estuvo constituida por 2% CTAB;100 mM Tris HCl (pH 8); 20 mM EDTA;1,4 M NaCl; 1% PVP 40000 y 2mercaptoetanol (0,2%) al momento de suuso, la homogeneización fue más rápidaaproximadamente 5 seg, el tiempo deincubación se redujó a 30 min, se exclu-yó el uso del acetato de sodio y finalmen-te se adicicionó tratamiento con ARNasasegún lo descrito por Romano y Miranda(1999).

Evaluación de la concentra-ción, pureza, rendimiento e inte-gridad del ADN

Una vez resuspendidos los preci-pitados de ADN en 40 mL de solución

adjustments made by Pardo et al.(2008), who include the use ofcentrifugation in cold.

Evaluation of different leaftissue areas of aloe in thestandardization of the DNAextraction protocol.

The apical, middle and basalareas of the aloe leaf tissue wereevaluated (figure 1e) in thestandardization of the selected protocolof the comparison in the first essay,making some changes such as thescraping elimination of the gel in thetissue processing to prevent oxidationprocesses of the tissue and degradationof DNA, the solution extraction bufferwas composed of 2% CTAB; 100 mmTris HCl (pH 8); 20 mm EDTA, 1.4 MNaCl, 1% PVP 40000 and 2mercaptoethanol (0.2%) at the time ofits use, the homogenization was fast,approximately 5 sec, the incubationtime reduced to 30 min, the use ofsodium acetate was excluded andfinally the treatment with ARNasewas added as described by Romano andMiranda (1999).

Evaluation of the DNAconcentration, purity, perfor-mance and integrity

Once suspended the DNAprecipitates in 40 mL of buffer sterilesolution of TE-8 (10 mM Tris HCl and1 mm EDTA, adjusted to pH 8), it wasproceeded to measure theconcentration and purity (A260nm/A280nm) of the DNA in an UV visiblespectrophotometer (Bioware DNA,WPA, Cambridge, UK). Threereadings of the same sample were doneto verify the performance of theequipment. The DNA yield (ng.mg-1)was calculated taking the DNA

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tampón esterilizada de TE 8(10 mM Tris HCl y 1 mM EDTA, ajus-tada a pH 8), se procedió a medir laconcentración y la pureza (A260nm/A280nm) del ADN en unespectrofotómetro UV visible (BiowareDNA, WPA, Cambridge, RU). Se rea-lizaron tres lecturas de la mismamuestra para verificar la operatividaddel equipo. El rendimiento del ADN(ng.mg-1) se calculó tomando el valorde la concentración de ADN (ng.μL-1)obtenida en el espectófotometro, mul-tiplicado por el volumen total deresuspensión (40 mL) y dividido entreel peso (mg) del tejido foliar seccionadode cada muestra.

La integridad del ADN se verificóvisualmente a través de la intensidad ydefinición de la banda, así como el barri-do o arrastre de la misma en geles deagarosa (0,8%) mediante electroforesishorizontal, tinción con 0,0015 μg.mL -1

de bromuro de etidio (Méndez et al., 2010)y posterior visualización en untransiluminador de luz UV (UV/WhiteLigth transmilluminator, UVP,Cambridge, RU).

Se realizó un análisis de varianzapara evaluar la concentración, purezay rendimiento del ADN extraído porlos tres protocolos de extracción estu-diados, así como para la evaluación delas diferentes zonas de tejido foliar dezábila para la estandarización de laextracción de ADN. Se utilizó un dise-ño completamente aleatorizado con tresrepeticiones (muestras). La prueba demínima diferencia significativa deTukey se utilizó para comparar lasvariables concentración de ADN, pu-reza y rendimiento de cada método es-tudiado, las variables mencionadasfueron transformadas con √x+0,5.

concentration value (ng.μL-1) obtainedin the spectrophotometer, multipliedby the total volume of resuspension (40mL) and divided by the weight (mg) ofthe sectioned leaf tissue of each sample.

The DNA integrity was verifiedvisually through the intensity anddefinition of the band, as well as thesweep or drag of the same in agarosegels (0.8%) by using horizontalelectrophoresis, staining with 0.0015μg.mL 1 of ethidium bromide (Mendezet al., 2010) and subsequentvisualization in a light box of UV light(UV/White Ligth transmilluminator,UVP, Cambridge, UK).

A variance analysis was done toevaluate the concentration, purity andyield of the DNA extracted by threestudied extracting protocols, as well asfor the evaluation of different areas ofleaf tissue of aloe for thestandardization of the DNA extraction.A completely randomized design withthree replications (samples) was used.Tukey test was performed to comparethe variables: DNA concentration,purity and yield of each studiedmethod, the mentioned variables weretransformed with√x+0.5.

Results and discussion

Comparison of the DNAextracting protocols

The three protocols for the DNAextraction in aloe were statisticallydifferent (P≤0.01) for the concentrationand performance variables of theextracted DNA, while the purity showedno statistical differences among thethree protocols. The concentration andthe DNA yield obtained with theprotocol 2% CTAB/3.5 M NaCl were

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Resultados y discusión

Comparación de los protoco-los de extracción de ADN

Los tres protocolos de extracciónde ADN evaluados en zábila resulta-ron diferentes estadísticamente(P≤0,01) para las variables concentra-ción y rendimiento del ADN extraído;mientras que la pureza no mostró di-ferencias estadísticas entre los tres pro-tocolos. La concentración y el rendi-miento de ADN obtenidos con el proto-colo 2% CTAB/3,5 M NaCl fueron no-tablemente superiores en comparacióncon los valores obtenidos con los proto-colos SDS y 2% CTAB/1,4 M NaCl;donde se observaron valoresestadísticamente similares; según laprueba de mínima diferencia signifi-cativa de Tukey (cuadro 1).

Sin embargo, la alta concentra-ción de ADN y por ende el rendimien-to obtenido con el protocolo 2% CTAB/3,5 M NaCl pudiera estarsobreestimado por el efecto dehipercromicidad del ADN desnatura-lizado o degradado, a consecuencia deuna mayor exposición de la muestraen el baño de María (90 min) en com-paración con el protocolo SDS (10 min)y el protocolo 2% CTAB/1,4 M NaCl (20min). Una muestra de ADN de doblecadena al ser desnaturalizada o degra-dada incrementa notablemente su ca-pacidad de absorber luz UV a 260nm(San Juan et al., 2014). Así también,residuos de CTAB en las muestras,especialmente en medios hipersalinos(Castillo et al., 2004), aumentan erró-neamente el valor de la concentracióndel ADN. Contrariamente, otros inves-tigadores utilizan 4% CTAB y5 M NaCl y obtienen valores de

significantly higher in comparison withthe values obtained with the protocolsand SDS and 2% CTAB/1.4 M NaCl;where values were statistically similar;according to the evidence of leastsignificant difference of Tukey (table 1).

However, the high DNAconcentration and therefore, the per-formance obtained with the protocol2% CTAB/3.5 M NaCl might beoverestimated by the hyperchromicityeffect of the denatured or degradedDNA as a result of a greater exposureof the sample in a water bath (90 min)in comparison with the SDS protocol(10 min) and the protocol 2% CTAB/1.4 M NaCl (20 min). A sample ofdouble-stranded DNA when denatureor degraded, significantly increasesthe ability to absorb UV light at 260nm(San Juan et al., 2014). Also, waste ofCTAB in the samples, especially inhypersaline mediums (Castillo et al.,2004), erroneously increase the valueof the DNA concentration. Conversely,other researchers used 4% CTAB and5 M NaCl and obtain values ofA260nm/280nm from 1.6 to 1.7 andnote that the DNA extracted from aloepresented high purity and good quality(Deore et al., 2014).

Among other componentsassociated with the DNA extractionthat are capable of absorbingwavelengths of 260 nm, EDTA andphenol are emphasized, which meanthat their waste in the removal of theDNA can increase the concentrationvalue of nucleic acids, when themeasurement in thespectrophotometer is done (Sambrookand Russell, 2001). This might explainthe high values obtained with the SDSprotocol with respect to those obtained

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A260nm/280nm entre 1,6 y 1,7 y se-ñalan que el ADN extraído de zábilapresentó alta pureza y buena calidad(Deore et al., 2014).

Entre otros componentes asocia-dos con las extracciones de ADN queson capaces de absorber longitudes de260 nm se destaca el EDTA y el fenol,por lo que sus residuos en la extrac-ción del ADN pueden incrementar elvalor de la concentración de los ácidosnucleicos, cuando se hace la mediciónen el espectrofotómetro (Sambrook yRussell, 2001). Esto pudiera explicarlos altos valores obtenidos con el pro-tocolo SDS con respecto a los obteni-dos con el protocolo 2% CTAB/1,4 M NaCl, dado que en el primero laconcentración de EDTA en el buffer deextracción fue un 40% más que en elúltimo.

En la prueba de integridad delADN para los tres protocolos de extrac-

Cuadro 1. Concentración, pureza (A260nm/A280nm) y rendimiento deADN de zábila (Aloe barbadensis Mill.) obtenidos con losprotocolos de extracción SDS, 2% CTAB/3,5 M NaCl y2% CTAB/1,4 M NaCl.

Table 1. Concentration, pureness (A260nm/A280nm) and DNA yield ofAloe (Aloe barbadensis Mill.) obtained with the extractionprotocols SDS, 2% CTAB/3.5 M NaCl and 2% CTAB/1.4 M NaCl.

Variables

Protocolo Concentración A260nm/A280nm Rendimientode ADN (ng.mL-1) (ng.mg-1)

SDS 406,40b 1,23a 309,64b

2% CTAB/3,5 M NaCl 1697,30a 1,06a 1293,20a

2% CTAB/1,4 M NaCl 257,56b 1,45a 196,23b

Valores seguidos de letras distintas en la misma columna, difieren estadísticamente (P≤0,05)para la prueba de mínima diferencia significativa de Tukey.

with the 2% protocol CTAB/1.4 MNaCl, given that in the first EDTAconcentration in the extraction bufferwas a 40% more than in the past.

In the DNA integrity test for thethree extraction protocols evaluated,diffuse DNA bands were observed,scarcely defined with a broad sweepalong the gel, which shows a highdegradation of the DNA. Romano andMiranda (1999) mention that when aDNA is not clearly visualized in thegel; it is possible that the sample iscontaminated with RNA and theARNases are recommended to be usedin the extraction protocols to decreasethe pollution of the DNA extracted withRNA.

Although the variance analysisshowed no significant differencesamong the DNA extracting protocolsfor purity; the mean values wereconsidered (table 1) as quality

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ción evaluados, se observaron bandasde ADN muy difusas, escasamentedefinidas con un amplio barrido a lolargo del gel, lo que evidencia una altadegradación del ADN. Romano y Mi-randa (1999) señalan que cuando unADN no es visualizado de forma níti-da en el gel; es posible que la muestraeste contaminada con ARN y recomien-dan incorporar en los protocolos de ex-tracción el uso de ARNasas para dis-minuir la contaminación del ADN ex-traído con ARN.

Aunque el análisis de la varianzano mostró diferencias significativasentre los protocolos de extracción deADN evaluados para la pureza; se con-sideraron los valores promedios (cua-dro 1) como indicadores de calidad delADN para cada protocolo de extracciónestudiado. Entre los valores promediosde la pureza; se destaca el protocolo2% CTAB/1,4 M NaCl con el valor(1,45) más cercano al señalado porGryson (2010); aunque San Juan et al.(2014) afirman que para calificar unADN de óptima calidad el rango de larelación A260nm/A280nm debe estarentre 1,8 y 2.

Además de los resultados obteni-dos, fue necesario considerar algunasventajas y diferencias entre los tresprotocolos de extracción evaluados, encuanto a la practicidad del proceso,tiempo de ejecución y uso de algunoscompuestos o sustancias que mostra-ron inconvenientes durante el procesode extracción. Esta comparación per-mitió descartar el protocolo 2% CTAB/3,5 M NaCl; ya que los valores de esti-mación de pureza resultaron ser losmás bajos (1,06); con una dudosacuantificación de ADN y barrido en laprueba de electroforesis; siendo el pro-

indicators of DNA for each extractingprotocol studied. Among the averagevalues of purity, the protocol 2% CTAB/1.4 M NaCl stands out with the value(1.45 ) closest to the one outlined byGryson (2010); although San Juan etal. (2014) claim that in order to qualifya DNA with optimum quality therange of the relationship A260nm/A280nm should be between 1.8 and 2.

In addition to the resultsobtained, it was necessary to considersome of the advantages and differencesbetween the three extraction protocolsevaluated in terms of the practicalityof the process, runtime and use of somecompounds or substances that showeddisadvantages during the extractionprocess. This comparison allowed todismiss the protocol 2% CTAB/3.5 MNaCl; since the estimate values ofpurity proved to be the lowest (1.06 ),with a questionable DNAquantification and sweep in theelectrophoresis test; being the morelaborious protocol among theevaluated, with the highestconcentration of salts in the buffersolution (3.5 M NaCl), longerincubation time in water bath (90 min)and where some whitish precipitatesof DNA were observed as possiblepresence of unsettled salts by thecentrifugation in the presence ofsodium acetate.

This protocol, 2% CTAB/3.5 MNaCl, was selected in the consultedliterature (Rathore et al., 2011) byreferring to the DNA extraction fromaloe. However, in the execution of thisresearch liquid nitrogen, phenol, andARNase were not used; thus thechanges done to the original protocoldescribed by Rathore et al. (2011)

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tocolo más laborioso entre los evalua-dos, con la más alta concentración desales en la solución tampón(3,5 M NaCl), mayor tiempo deincubación en baño de María (90 min)y en el que se observaron algunos pre-cipitados de ADN blanquecinos; comoprobable presencia de sales decantadaspor la centrifugación ante la presen-cia del acetato de sodio.

Este protocolo, 2% CTAB/3,5 MNaCl, fue seleccionado de la literaturaconsultada (Rathore et al., 2011) porestar referido a la extracción de ADNde zábila. No obstante, en la ejecucióndel mismo en esta investigación no seutilizaron nitrogeno líquido, fenol, niARNasa; por lo que los cambios reali-zados al protocolo original descrito porRathore et al. (2011) probablementemarcaron las diferencias en los resul-tados obtenidos en esta investigación.

Entre los protocolos SDS y2% CTAB/1,4 M NaCl no se observa-ron diferencias estadísticas para laconcentración y rendimiento de ADN;y en ambos casos se visualizó un am-plio barrido en el gel de agarosa. Sinembargo, al comparar los valores pro-medio de la relación de A260nm/A280nm (cuadro 1) se procedió a des-cartar el protocolo SDS por obtener elvalor mas distante de los referidos porGryson (2010), quien estimó elparámetro de pureza del ADN entre1,5 y 2,0 de A260nm/A280nm.

Considerando que en la mayoríade las referencias consultadas sobre losprotocolos de extracción específicos parael género Aloe, se destacan aquellosbasados en el uso de CTAB/NaCl (Deoreet al., 2014; Rathore et al., 2011;Toothman, 1999); y tomando en cuen-ta los resultados obtenidos en la com-

probably marked the differences in theresults obtained in this research.

Among the protocols SDS and 2%CTAB/1.4 M NaCl none statisticallysignificant differences were observedfor the concentration and performan-ce of DNA, and in both cases a widesweep in the agarose gel was observed.However, when comparing the meanvalues of the relationship of A260nm/A280nm (table 1) it was proceeded todismiss the SDS protocol to obtain themost distant value from those referredby Gryson (2010), who considered thepurity parameter of the DNA from 1.5and 2.0 to A260nm/A280nm.

Considering that in most of theliterature consulted on the extractionprotocols specific for Aloe, highlightedthose based on the use of CTAB/NaCl(Deore et al., 2014; Rathore et al.,2011; Toothman, 1999); and takinginto account the results obtained in thecomparison of the three DNAextracting methods from this study,the protocol 2% CTAB/NaCl 1.4 wasselected to determine the leaf tissuearea of aloe for its standardization.

Evaluation of different leaftissue areas of aloe in thestandardization of the DNAextracting protocol

The evaluation of the leaf tissueareas of aloe showed no statisticaldifferences for the variables:concentration, purity and performanceof the extracted DNA. However, from apractical point of view it is simpler touse the middle and basal areas by thewidth of sheet lamina that allowsremoving the leaf tissue in a singlesurface (Figure 1e), facilitating thehomogenization process and avoiding theDNA degradation. Both areas showed

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paración de los tres métodos de extrac-ción de ADN de este estudio se seleccio-nó el protocolo 2% CTAB/1,4 NaCl paradeterminar la zona del tejido foliar dezábila para la estandarización.

Evaluación de diferentes zo-nas del tejido foliar de zábila enla estandarización del protocolode extracción de ADN

La evaluación de la zonas del te-jido foliar de zábila no mostraron dife-rencias estadísticas para las variablesconcentración, pureza y rendimientodel ADN extraído. Sin embargo, desdeel punto de vista práctico es mas sen-cillo emplear las zonas media y basalpor el ancho de la lámina de la hojaque permite extraer el tejido foliar enuna sola superficie (figura 1e), facili-tando el proceso de homogeneización yevitando la degradación de ADN. Am-bas zonas mostraron valores de pure-za altos (1,93 y 1,89) (cuadro 2) cerca-nos a los señalados por varios autorespara calificar el ADN de óptima cali-dad (San Juan et al., 2014; Cerda yDíaz, 2013; Sánchez et al., 2012). Losvalores de concentración y rendimien-to de ADN resultaron más altos (cua-dro 2) que los obtenidos con el protoco-lo 2% CTAB/1,4% NaCl del primerensayo de comparación de tres proto-colos (cuadro 1).

Con los resultados obtenidos, esindudable que las modificaciones rea-lizadas al protocolo seleccionado (2%CTAB/1,4% NaCl) para disminuir ladegradación del ADN fueron acertadas,evidenciándose un incremento en losvalores de todas las variables estudia-das independientemente de las zonasdel tejido foliar evaluadas.

Entre las modificaciones realiza-das en el proceso de extracción de ADN

high purity values (1.93 and 1.89) (table2) close to those reported by severalauthors to qualify the DNA of optimalquality (San Juan et al., 2014; Cerdaand Diaz, 2013; Sanchez et al., 2012).The concentration values and perfor-mance of DNA were higher (table 2) thanthose obtained with the protocol 2%CTAB/1.4% NaCl of the first comparisontest of three protocols (table 1).

With the results obtained, thereis no doubt that the modificationsmade to the selected protocol (2%CTAB/1.4% NaCl) to reduce thedegradation of the DNA were right,this shows an increment in the valuesof all the studied variablesindependently of the leaf tissue areasevaluated.

Among the changes in the DNAextracting process of aloe, highlightsthe reduction in the homogenizationtime of the sample to a few seconds(approx. 5 Sec), which possibly allowedminimizing the factors which lead tothe degradation of DNA. AbuAlmakarem et al. (2012) mention thatthe nucleic acids generally begin todegrade shortly after the tissue lysisby the release of nucleases, proteasesand other degrade molecules; therefore,to minimize the risk factors for theDNA degradation guarantees thequality of the DNA obtained.

Likewise, the replacement of theantioxidants NaSO3 and PEG by theuse of 2-mercaptoethanol and polyvinylpyrrolidone (PVP 40000) in theextraction buffer solution may haveinfluenced in the control of substancesor oxidative molecules that affect theintegrity of the DNA. The 2mercaptoethanol is widely used in theDNA extraction processes as an

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para zábila, se destaca la disminucióndel tiempo de homogeneización de lamuestra a unos pocos segundos (aprox.5 seg), que posiblemente permitieronminimizar los factores que inducen ala degradación del ADN. AbuAlmakarem et al. (2012) señalan quelos ácidos nucleicos por lo general co-mienzan a degradarse poco después dela lisis del tejido, por la liberación denucleasas, proteasas y otras molécu-las degradativas; por lo tanto, reduciral mínimo los factores de riesgo parala degradación del ADN, garantizan lacalidad del ADN obtenido.

Igualmente la sustitución de losantioxidantes NaSO3 y PEG por el usode 2 mercaptoetanol y polivinilpirrolidona (PVP 40000) en la solucióntampón de extracción, puede haberinfluenciado en el control de las sus-tancias o moléculas oxidativas que afec-tan la integridad del ADN. El 2

Cuadro 2. Concentración, pureza (A260nm/A280nm) y rendimiento deADN de zábila (Aloe barbadensis Mill.) de la zona apical,media y basal del tejido foliar utilizando el protocolo deextracción de ADN 2% CTAB/1,4 M NaCl.

Table 2. Concentration, pureness (A260nm/A280nm) and DNA yield ofaloe (Aloe barbadensis Mill.) of the apical, medium and basalarea of the foliar tissue using the DNA extraction protocol 2%CTAB/1.4 M NaCl.

Variables

Zona Concentración de ADN A260nm/A280nm Rendimiento (ng.mg-1)(ng.mL-1)

Apical 198,89a 1,62a 151,94a

Media 185,45a 1,89a 141,29a

Basal 204,67a 1,93a 155,94a

Valores seguidos de letras iguales en la misma columna, no difieren estadísticamente (P≤0,05)para la prueba de mínima diferencia significativa de Tukey.

efficient antioxidant that inactivatesproteins by reducing the disulfides(Velasco, 2005); while the PVP is adetergent that reduces the phenoliccompounds (Rocha, 2002). Thesecompounds according to Deore et al.(2014) are vacuoles releases during thehomogenization process of the sample,and react quickly with cytoplasmicenzymes; therefore, the addition of PVPin the presence of the CTAB can helpto eliminate the presence of phenoliccompounds by their union throughhydrogen links forming a complex; andto some extent these can helpeliminate other impurities (Velasco,2005).

The reduction of the incubationtemperature from 74 to 65minimizes the fragmentation anddenaturalization of the DNA;avoiding a hyperchromic effect fornot overestimating the reading of

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mercaptoetanol es ampliamente utili-zado en los procesos de extracción deADN como un antioxidante eficiente;que inactiva proteínas por reducción delos puentes disulfuros (Velasco, 2005);mientras que el PVP es un detergenteque reduce los compuestos fenólicos (Ro-cha, 2002). Estos compuestos segúnDeore et al. (2014) son liberados devacuolas durante el proceso dehomogeneización de la muestra, y re-accionan rápidamente con enzimascitoplasmáticas; por lo que la adiciónde PVP en presencia del CTAB puedencontribuir a eliminar la presencia delos compuestos fenólicos por unión aéstos a través de enlaces de los hidróge-no formando un complejo; y hasta cier-to punto pueden ayudar a eliminar otrasimpurezas (Velasco, 2005).

La disminución de la temperatu-ra de incubación de 74ºC a 65ºC, mini-miza la fragmentación ydesnaturalización del ADN; evitandoun efecto hipercrómico, para no sobre-estimar la lectura de absorbancia a260 nm que se traduce en lecturaserroneas de concentración del ADNextraído (San Juan et al., 2014).

La adición de ARNasa en el pro-tocolo de extracción 2% CTAB/1,4% NaCl para las tres zonas del teji-do foliar de zábila evaluado fue apro-piado; observándose una banda deADN de alto peso molecluar, nítida ydefinida en el gel de agarosa; especial-mente cuando se utilizó tejido foliar dezábila de las zonas media y basal (fi-gura 2). Igualmente otros autores(Deore et al., 2014; Nayanakantha etal ., 2010; Singh et al., 2010;Toothman, 1999) han incluido ARNasaen sus protocolos de extracción de ADNespecíficos para Aloe con resultados

absorbance at 260 nm resulting inerroneous readings of DNA extractedconcentration (San Juan et al . ,2014).

The addition of ARNase in theextraction protocol 2% CTAB/1.4%NaCl to the three leaf tissue areasevaluated of aloe was appropriate,observing a DNA band with highmolecular weight, clear and defined inthe agarose gel; especially when usingleaf tissue of aloe of the middle andbasal areas (figure 2). Likewise, otherauthors (Deore et al., 2014;Nayanakantha et al., 2010; Singh etal., 2010; Toothman, 1999) haveincluded ARNase on their DNAextraction protocols specific for Aloewith similar results in terms ofincrease in concentration, purity andintegrity of the extracted DNA.

Conclusions

The protocol 2% CTAB/1.4%NaCl of DNA extraction standardizedfor aloe markedly improved the DNAintegrity displayed in the agarose gels,the concentration values and the DNAperformance, as well as the purity ofthe DNA by placing the values inoptimal ranges; especially for themiddle and basal areas of the leaftissue of aloe.

The reduction in thehomogenization time of the samplesapproximately at 5 sec, the use ofantioxidants 2 mercaptoethanol andpolyvinyl pyrrolidone 40000 in theextraction buffer solution, thereduction of the time and incubationtemperature at 30 min and 65ºC,respectively, as well as the use ofARNase allowed the standardization of

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Figura 2. Electroforesis de ADN genómico de las zonas apical, media ybasal del tejido foliar de vitroplantas de zábila(Aloe barbadensis Mill.) extraído por el protocolo 2% CTAB/1,4 mM NaCl estandarizado. Carril 1: zona apical, carril 2:zona media y carril 3: zona basal. El carril 4 contiene elmarcador de peso molecular de 1 kb de ADN (Promega). Losvalores de concentración y pureza de ADN fueron calculadosen base al promedio de 3 muestras.

Figure 2. Electrophoresis of genomic DNA from apical, middle and basalareas of the leaf tissue in vitroplants of aloe (Aloebarbadensis Mill.) extracted by the protocol 2% CTAB/1.4mM NaCl standardized. Lane 1: apical area, lane 2: Middleand lane 3: basal area. Track 4 contains the molecular weightmarker of 1 kb of DNA (Promega). The concentration andpurity of DNA values were calculated based on the averageof 3 samples.

similares en cuanto a incremento deconcentración, pureza e integridad delADN extraído.

Conclusiones

El protocolo 2% CTAB/1,4% NaClde extracción de ADN estandarizado para

the protocol 2% CTAB/1.4% NaCl tothe DNA extraction of aloe.

Acknowledgment

The authors thank the Scientific,Humanistic and Technological Boardof Universidad del Zuloia (CONDES-

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zábila; mejoró notablemente la integri-dad del ADN visualizado en los geles deagarosa, los valores de concentración yrendimiento de ADN, así como la purezadel ADN ubicando los valores en rangosóptimos; especialmente para las zonasmedia y basal del tejido foliar de zábila.

La disminución del tiempo dehomogeneización de las muestrasaproximadamente a 5 seg, el uso delos antioxidantes 2 mercaptoetanol ypolivinil pirrolidona 40000 en la solu-ción tampon de extracción, la dismi-nución del tiempo y la temperatura deincubación a 30 min y 65ºC, respecti-vamente, asi como el uso de ARNasapermitieron la estandarización del pro-tocolo 2% CTAB/1,4% NaCl para laextacción de ADN de zábila.

Agradecimiento

Los autores desean expresar suagradecimiento al Consejo de Desarro-llo Científico, Humanístico y Tecnoló-gico de la Universidad del Zulia (CON-DES-LUZ) por el financiamiento otor-gado a esta investigacion a través delProyecto VAC-CONDES-0439-14.

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