Graduao em Biotecnologia Disciplina de ProtemicaCaroline Rizzi Doutoranda em Biotecnologia - UFPel

IntroduoDon't waste clean thinking on dirty enzymes!!!

Efraim Racker (1913-1991)

IntroduoDesta maneira, a enzima alvo pode finalmente ser estudada

Assegurar-se que a reao catalizada por um nico tipo de enzima!

Purificar uma enzima ao ponto que outras enzimas no so detectadas!!!!!

IntroduoNenhuma enzima purificada at a absoluta homogeneidade!!!

Atividade cataltica e resposta a inibidores e ativadores

Interaes com outros componentes celularesMecanismos de represso ou estmulo da sntese celular

Para que a enzima vai ser usada? Quantidade Atividade

Ensaio O ensaio pode ser realizado? Sensibilidade, acurcia, preciso Disponibilidade de substratos, custo

Aditivos ao tampo Ativadores, inibidores.... Conservadores da atividade

Ensaios enzimticosPadronizao de unidades:1. Quantidade de substrato consumido ou produto formado em mol; 2. Tempo da reao (minutos); 3. Quantidade de enzima (mg)

Atividade enzimtica mol/min Unidade 1 unidade: quantidade de enzima que catalisa a transformao de 1 unidade de massa de substrato ou formao de produto (geralmente mol) por minuto sobre as condies de pH e temperatura definidas.

Atividade especfica Unidades/mg

Ensaios enzimticosComponentes: Mix: Tampo para estabilizar o pH Substrato (s) Cofatores ou ativadoresTemperatura tima da enzima

Enzima ou extrato bruto (tratado) Reagente stop Espectrofotmetro

Ensaios enzimticosMetodologias

Substrato consumido

Produto formado

Variao de absoro de coenzimas

Ensaios enzimticosPonto Final

Metodologias

Cinticos Acoplados

Substrato consumido

Complementao gnica

Produto formado

Variao de absoro de coenzimas

Ensaios ponto final ou descontnuos

Reagente stopMix Enzima

Geralmente o produto corado e quantificado

Ensaios ponto finalAvaliao do consumo de substrato Teste da atividade da -amilase pancreticaIncubao da enzima com substrato (amido) e a diminuio da cor azul aps a adio de iodo comparada com o controle

Ensaios ponto finalAvaliao da formao do produto Teste da atividade da fosfatase alcalinaA FAL hidrolisa o substrato de timolftalena monofosfato liberando timolftalena cor azul.

timolftalena monofosfato

timolftalena

Fosfato inorgnico

pH alcalino=cor azul

Ensaios cinticos abs/tempo

Mix

Enzima

Ensaios cinticosAvaliao do consumo de substrato Teste da atividade da DAHP sintase

Fosfoenolpiruvato COOH

Eritrose 4-fosfato OH HH2O

O

COOH C

+P O C CH2

P

O C H2 OH O

_ O _ CH P 2HO

OH

DAHP SintaseEC 4.1.2.15OH 3-desoxi-D-arabino- heptulosonato 7-fosfato

Absortividade mxima a 232nm (=2,8 x 103 M -1 cm-1)

Ensaios cinticosAvaliao do consumo de substrato Teste da atividade da DAHP sintase

Consumo de PEP/s0,35 Absorbncia a 232 nm 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160

abs/60 s = 0,1 PEP232 nm =2,8 x 103 M -1 cm-1

Tempo em segundos

C PEP= 0,1/2,8 x 103 C PEP= 3,57 x 10-5 M = 35,7 M/min

Atividade enzimtica: 35,7 U

Ensaios cinticosAvaliao do produto formato Teste da atividade da PNPMetilguanosina Metilguanina

Formao de produto0,35 Absorbncia a 360 nm 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 50 100 Tempo em segundos 150 200

Ensaios cinticosEnsaio da variao da absorbncia da coenzima associada Ensaios utilizando a reao inversa Teste da atividade da chiquimato desidrogenase

NADPH 340nm=2,8 x 103 M -1 cm-1

Atividade enzimtica: aumento de NADPH Desidrogenao do chiquimato

Ensaios acopladosVerificao da formao do produto utilizando-o como substrato para outra reao enzimtica Atividade da EPSP sintase

Metilguanina

Aumento proporcional atividade enzimtica de EPSP

Complementao gnicaUso de mutantes para comprovar que a construo gnica capaz de reparar os mutantes Atividade da desidroquinato sintase

Hin dIII (4221)

oriC

ADAPTADOR

Kan(R)

Xho I (3408) Hin dIII (3262)

PKK223-3 + aroB 4416 bp

pUP410

Escherichia coli AB2847 mutanteOriM

aroB LeuD

RBS1KpnI (2431) Xho I (2016)

Ausncia de suplementos + complementao gnica

Presena de suplementos

De que maneira avaliar a atividade e cinticas enzimticas???

1. Como montar uma reao enzimtica???Que reagentes e aparelhos vamos usar? Verificar ensaios descritos na literatura; Tampo, substrato, cofatores... Preo, pureza, estabilidade; Enzima pura ou extrato bruto; Disponibilidade de filtros de espectrofotmetro; O espectrofotmetro controla a temperatura? A leitura cintica? A reao em atmosfera com presena ou ausncia de O2?

1. Como montar uma reao enzimtica???Como preparar estes reagentes? Solues estoques que sero diludas na concentrao final no momento da reao!!!! Dissoluo, conservao, utilizao, peso molecular, pKs, ...: Manuais qumicos Estabilidade dos reagentes durante a reao enzimtica.

1. Como montar uma reao enzimtica???Que parmetros devo considerar? Km das anlogas para determinar a concentrao de substrato; Velocidade da reao enzimtica (turnover); Quais so os cofatores? uma metaloenzima? O extrato bruto pode conter inibidores ou interferentes na reao? O que utilizar como controle negativo? A enzima multimrica? Faz parte de um complexo enzimtico?

2. A enzima tem atividade em estado estacionrio?Quais so as condies para o ensaio estacionrio?A enzima est na forma ES A velocidade inicial medida em estgio estacionrio O substrato est em excesso = concentrao constante Em relao [substrato], a [produto] formado desprezvel Todos as outras condies da reao permanecem constante durante a medio.

2. A enzima tem atividade em estado estacionrio?Sem atividade? Concentrao enzima Inibidores Desnaturao Condio da reao

Mix

Enzima

Excesso de Substrato

Com atividade? Aumento da concentrao enzimtica

2. A enzima tem atividade em estado estacionrio?A atividade corresponde atividade da enzima recombinante??? Comparar com um controle negativo!!!!

3. A velocidade inicial proporcional concentrao da enzima?

Atividade enzimtica linearmente dependente do volume de enzima adicionado reao. A velocidade proporcional concentrao enzimtica. Medida da real da velocidade inicial.

O que podemos determinar utilizando a reao em estado estacionrio?O efeito do pH, da temperatura e diferentes ativadores na velocidade inicial; Curva de diluio do substrato: Km, Vmx;

3. Parmetros em estado prestacionrioMetodologia tipo flow methods: Baseados em mistura rpida dos reagentes (milisegundos); Anlise de reaes enzimticas rpidas; Estudo de mecanismos catalticos enzimticos.

Tcnica stopped-flow : Mais apropriada para observao de reaes rpidas; A real velocidade inicial a [substratos] baixas j transcorreu em mix manual.

Reaes no estado prestacionrio: Ligao ao substrato, liberao de produtos, associao a cofatores, alteraes no pH e temperatura....

Estado pr estacionrio

http://bcs.whfreeman.com/stryer/pages/bcs- ain.asp?v=chapter&s=08000&n=00010&i=99010.01&o=|00040|00010|&ns=0

Tabela de Purificao de uma EnzimaProvar que voc est trabalhando com a enzima j que a sua atividade est aumentando em relao ao aumento do nvel de pureza

Componentes da tabela de purificao: Quantidade total de protena (mg) Atividade total (U) Atividade especfica (U/mg) Purification fold: aumento da atividade especfica Rendimento (%): recuperao da atividade em cada passo

Tabela de Purificao de uma Enzima

Quantificao protica /mL X Volume total da etapa

Atividade total Protena total

Atividade total de uma etapa Atividade total do 1 etapa

Atividade enzimtica da etapa (U/mL) X Volume total da etapa

Atividade especfica de uma etapa Atividade especfica do 1 estgio

Quais so os destinos da enzima pura?

Imobilizao Enzimtica

100.000 compostos/dia!!!!!!!

Quais so os destinos da enzima pura?

Cristalografia e predio de estruturas

Desenvolvimento de frmacos

OBRIGADA!!!