seminario 6 2006 – human mediator enhances basal transcription by facilitating recruitment of...
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Seminario 6
2006 – Human Mediator enhances basal transcription by facilitating recruitment of TFIIB
during PIC assembly
(Baek, Kang, Roeder)
Mediador mejora la transcripción basal por la facilitación del reclutamiento de TFIIB en el
ensamblaje del PIC
Transcripción
• ARN polimerasa II
• Factores de Transcripción Generales (GTFs): TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF y TFIIH
Necesarios y suficientes para transcripción basal de templados de DNA con TATA y para la formación del PIC
Ensamblaje del PIC
Estructura del complejo TBP-TATA
Modelo de Holoenzima Ensamble secuencial
Formación del PIC: Dos modelos
Mediador
Es un coregulador general de la transcripción
Compuesto por distintas subunidades y dominios
HEAD
MIDDLE
TAIL
CDK
Conservado en todos los eucariotas
Forma complejos con RNA pol II
Mediador• Aumenta nivel de transcripción basal (cooperatividad
con TFIID en ensamblaje y estabilización del PIC y en la reiniciación de transcripción en levaduras)
• Estimula actividad kinasa de TFIIH en el CTD de Pol II necesario para la transcripción basal y la formación del PIC dependiente de activador
Interacciones con la pol II y los GTFs facilitan la formación y función del PIC
Mediador interaccionando con la maquinaria basal de la transcripción
La cola de CTD no fosforilada está asociada al mediador y a componentes de la maquinaria de iniciación
La fosforilación parcial de la cola de CTD hace que tanto el mediador como los GTFs se separen
Mediador
• No esencial para transcripción basal in vitro con RNA pol II y GTFs purificados
• Necesario para transcripción basal en extractos nucleares y para transcripción activada
¿es coactivador, contrarresta la presencia de algún inhibidor o las condiciones in vivo son más restricivas?
•Compensa la presencia de GTFs en niveles limitantes, o de inhibidores
• Estudio de la interacción Med – TFIIB
Hipótesis: • Mediador recluta y estabiliza PIC• facilita fosforilación de CTD
Preguntas:
Paper
¿El ensamblaje del PIC en extractos nucleares es igual que con TFs purificados?
¿TFIIB tiene un efecto de reclutamiento similar al del Mediador?
Materiales
• Extracto nuclear HeLa inmunodepletado de GTFs y Mediador (tratamiento con anticuerpos, crosslinking, agregado de anti-anticuerpos y precipitación)
• GTFs y Mediador con tags de His o epítopes, expresados en bacterias y purificados
• Templados de ADN biotinilado con o sin TATA + bolitas de Streptavidina-Sefarosa
Materiales
• SDS PAGE de dos preparaciones de Mediador Purificado
FL
AG
-tags
epítop
es
Métodos
Templados inmovilizados
↓
Preincubación con extracto nuclear y GTFs
↓
LavadoIncubación con Mg2+, NTPs↓
Electroforesis Phosphorimager
↓nivel de transcripción
Western Blot (Immunoblot)↓
Unión de GTFs o Mediador
corte EcoRI
Resultados
• Templados + NE(IID/ Med) + TBP (TATA Binding Protein) + Med (variable)
UNIÓN TATA DEPENDIENTE
UNIÓN MED DEPENDIENTE
Unión no específica TFIIH y TFIIFMediador papel importante en
reclutamiento de, al menos, TFIIB TFIIE y Pol II
Resultados
Aumento >9x (TATA+ vs TATA-)
Aumento >5x (TATA+Med+ vs TATA+Med-)
=
Aumento 49x con TATA y Med
Correlación entre reclutamiento Med-dependiente de GTFs y Pol II y nivel de la transcripción basal
Resultados
• Comparación temporal (preincubación por tiempos variables, templado con TATA + NE(Med) + Med)
Nivel de transcripción a distintos tiempos Reclutamiento de Med y
GTFs a distintos tiempos
An
ticuerp
os
CORRELACIÓN TEMPORALEl reclutamiento del PIC depende de Mediador y determina el nivel basal de transcripción
Resultados
• Templados iG5HML con sitios para activador Gal4 + NE(Med) + Med + Gal4
Gal4 aumenta reclutamiento de Med y GTFs; si no hay Med, el reclutamiento de GTFs es mucho menor
Esto se correlaciona con los niveles de transcripciónEsto se correlaciona con los niveles de transcripción
Anticuerpos
Med parece ser esencial para el aumento de la transcripción en presencia de un activador (los niveles de reclutamiento no parecen diferir por Gal4)
Resultados
• Templados con TATA + NE(Med) + TFIIB en exceso
Un exceso de TFIIB (25x TFIIB endógeno) compensa la falta de Med con respecto a un extracto nuclear no depletado, en cuanto a niveles de transcripción basal
Un exceso de Med no compensa la falta de TFIIB
Control recíproco Control especificidad
Un exceso de TFIIF no compensa la
falta de Med
Med el aumento de transcripción se daría por aumento de reclutamiento
de TFIIB
Resultados
• Templados con TATA + NE(IIB) + TFIIB
La transcripción disminuye y sólo vuelve a niveles basales si se suplementa con TFIIB
purificado
¿Se debe a disminución del
reclutamiento del PIC cuando se elimina
TFIIB?
Control de la depleción sólo se eliminó TFIIB y muy pequeñas cantidades de Med u otros GTFs
Resultados
• Templados con TATA + NE(IIB) + TFIIB
Disminuye reclutamiento de Pol II y de TFIIE en ausencia de TFIIB
TFIIB no es requerido para el reclutamiento de Med, pero sí
de Pol II y TFIIE
Resultados
• Templados con TATA + NE(IIB) + TFIIB
El mismo fenómeno se aprecia a nivel transcripcional; aunque se haya reclutado Med, sin TFIIB hay muy poca transcripción porque no se
recluta eficientemente parte del PIC
Resultados
El nivel de transcripción se ve limitado por el tiempo de reclutamiento del Med cuando es agregado en la incubación
Resultados
• Templados con TATA + Med + TFIID/TBP
El reclutamiento de Med también depende de TFIID, pero no de TBP sola importancia de TAFs
Conclusiones
• Mediator aumenta la transcripción basal por reclutamiento de TFIIB, TFIIE y Pol II (como mínimo), como se infiere por la correlación temporal de transcripción Mediator-dependiente y reclutamiento Mediator-dependiente
• El reclutamiento de Mediator es un paso limitante en la formación del PIC y parece depender de la interacción con TFIID (habiendo ésta reconocido a la TATA previamente)
Conclusiones
• Mediator aumenta la síntesis indirectamente al reclutar a TFIIB, que a su vez recluta a Pol II.
• Es necesario para transcripción basal en extractos nucleares pero no con factores purificados; sin embargo aún no se encontraron cofactores negativos que pudieran explicarlo. Puede deberse a una limitación en los GTFs en los extractos naturales, lo cual concuerda con que TFIIB en exceso puede compensar su ausencia en cuanto a niveles de transcripción basal y reclutamiento de Pol II. También un exceso de TFIIH puede producir este efecto (Nair et al., 2005).
Conclusiones
• Este reclutamiento Med-independiente permite descartar el modelo de holoenzima en que Med cataliza la formación del complejo de Pol y los GTFs que deben unirse juntos a TFIID
• También implica que aunque los GTFs son irreemplazables por exceso de Mediator, éste podría compensar niveles limitantes de los mismos in vivo, actuando de forma cooperativa. En ausencia de Mediator se necesitaría un nivel muy alto de GTFs.
Conclusiones
• Mediator actúa además de forma directa estimulando la actividad kinasa de TFIIH para la fosforilación de CTD, lo que permite una transcripción eficiente por aumento del reclutamiento y estabilización de factores.
• La transcripción activada, tanto en extractos nucleares como con factores purificados, es siempre Med-dependiente.
Conclusiones
• Mediator formaría un complejo estable con TFIID, luego de lo cual se reclutaría el resto de los GTFs y la Pol II (no niega que se pudiesen unir en distinto orden, aunque de forma menos eficiente al desaparecer el efecto cooperativo) stepwise model
• Este hecho, sumado al factor correspondiente a la interacción entre Mediator y los GTFs, proveería instancias extra para el control de los niveles de transcripción plasticidad regulatoria
Críticas
• El experimento intenta acercarse a condiciones fisiológicas en cuanto al extracto utilizado; sin embargo el ADN no se encuentra cromatinizado, factor que tiene efectos sobre los niveles de transcripción in vivo.
• Concluyen que el reclutamiento de Mediator es el paso limitante, pero éste es dependiente de unión de TFIID la unión de TBP o TAFs podría ser el verdadero paso limitante
• No analiza función de Mediator en el PIC post-reclutamiento, que pueden haber afectado los niveles de transcripción observados