ROMA, 21 -22 November, 2019

STANDARDIZZAZIONE P190CAMPUS LAL

1. Included Italian Centers:

1. CEINGE Biotecnologie Avanzate, UNIVERSITA’ di Napoli (Dott.ssa Barbara Izzo)

2. Laboratorio di Biologia Molecolare di Ematologia Careggi, Firenze (Dott.ssa Barbara Scappini)

3. Laboratorio Biologia Molecolare U.O.C. Ematologia Policlinico S. Maria alle Scotte, Siena(Dott.ssa Anna Sicuranza)

4. Fondazione Tettamanti c/o Centro Maria Letizia, Monza (Dott. Giovanni Cazzaniga)

5. Laboratorio di Diagnostica Molecolare Patologie Linfoidi, Roma (Dott.ssa Loredana Elia)

6. Istituto Seragnoli - laboratorio di biologia molecolare Ospedale Sant'Orsola-Malpighi, Bologna (Dott.ssa Carolina Terragna)

7. Laboratorio di Ricerca per le Scienze Ematologiche, Bari (Dott. Francesco Albano)

8. Laboratorio Clinica Ematologica, Udine (Dott.ssa Eleonora Toffoletti)

9. Laboratorio di Diagnostica Ematologicа, Bergamo (Dott.ssa Orietta Spinelli)

10. Ospedali Riuniti Villa Sofia Cervello, Palermo (Dott.sa Alessandra Santoro)

11. Laboratorio di Medicina Interna ad indirizzo Ematologico A.O.U. San Luigi Gonzaga, Orbassano (Dott.ssa Carmen Fava)

2. Objective of the study:

… to assess the functionality of this reference in order to:

- have a better internal control

- evaluation of a new kit and method

- comparison of the results obtained with kit vs. home made approach

- validation of advantages of droplet digital PCR (ddPCR) vs. real time PCR

- verification if the introduction of eventual conversion factor will minimize the variability in the low-level disease cases

3. Product description (LYOSET reference panel)

•HL60 cells

•TOM-1

Cells

Count

Cells

MixLyofilization

Mixture

dispensation

5 independent cell mixtures corresponding to predetermined ratio:•10%•1%•0.1%•0.01%•0.0032%Were prepared based on %BCR-ABL/ABL values (preliminary experiment on TOM1 expression).

•In addition, a suspension of pure HL60 as negative control was also processed

Lot Date

Pure HL60 P0418A 04/10/2018

0,0032% P0518J 22/05/2018

0,01% P0518AK 29/05/2018

0,1% P0618O 26/06/2018

1% P0618P 03/07/2018

10% P0718A 10/07/2018

•HL60 cells

•TOM-1

Cells

Count

Cells

MixLyofilization

Mixture

dispensation

Glass ampoules were filled with 1.5*10^6 cells (1 mL) for freeze-drying. The time interval

between cell harvesting and commencement of freeze –drying was less than 5 hours

Lot DateNumber of vials

Pure HL60 P0418A 10/4/2018 706

0.0032% P0518J 22/05/2018 758

0.01% P0518AK 29/05/2018 773

0.1% P0618O 26/06/2018 778

1% P0618P 03/07/2018 775

10% P0718A 10/07/2018 781

RNA Yield

•5 series extracted with Qiagen columns – independent extractions•6 series extracted with Trizol (or similar) – independent extractions•3 series extracted with Maxwell – independent extractions

Total RNA Yield (ng)

Average Dev STD Val Min Val Max CV%

Qiagen (n=30) 5858 1050 4512 8760 18%

Trizol (n=36) 4054 1810 1167 9080 45%

Maxwell (n=18) 5512 851 3483 6880 15%

Amplification Test – BCR-ABL/ABL RATIOB

CR

-AB

L/A

BL

Rati

o (

%)

BC

R-A

BL

/AB

L

Rati

o (

%)

BC

R-A

BL

/AB

L

Rati

o (

%)

BCR-ABL/ABL RATIO – Inter-Vial Varibility (CV%)

Panel Member

CV % BCR-ABL/ABL RATIO

WHO (210)

Qiagen Trizol Maxwell trizol

0.0032% 52% 75% 39%

0.01% 29% 52% 19% 53%

0.1% 20% 28% 17% 16%

1% 31% 14% 23% 17%

10% 25% 29% 13% 20%

Average 31% 40% 22% 26%

Average (0,01%-10%) 26% 31% 18% 26%

4. Working protocol for all included italian labs

For each of the 6 ampoules in the kit, extract RNA with the routine protocol that is used in your lab.

Establish the concentration, the purity ratios 260/280 and 260/230 and the total amount in micrograms for single tube of the extracted RNAs.

Each RNA must be reverse transcribed and amplified with routine protocol in two different days, at a distance of 7 days from each other.

Special notes:

Make sure to produce a sufficient volume of cDNA for: - one real-time run for BCR-ABL in triplicate and ABL in duplicate;- еxperiments in GUS, for those who can- еxperiments in digital PCR with the routine procedure, for those who can.

Risultati PreliminariCarmen Fava et al.

Centro Estrazione Amplificazione ABL Copy

Numbers

(Mean)

Roma Maxwell Home made 629563

Monza Maxwell Home made 286583

Bologna Maxwell Home made 161571

Palermo Qiagen Home made 146813

Bari Qiagen Kit Two-steps 102338

Orbass Maxwell Kit One-step 88511

Napoli Trizol Home made 63255

Udine Qiagen Kit Two-steps 60489

Bergamo Maxwell Home made 52810

Siena Trizol Kit Two-steps 11839

Firenze Trizol Kit Two-steps 11735

Average ABL copies by laboratory

1 (N=19) 2 (N=19) 3 (N=19) 4 (N=19) 5 (N=18)

BCR-ABL/ABL%

Mean (SD) 19.156

(13.245)

2.182 (2.338) 0.388 (0.340) 0.029 (0.018) 0.008 (0.007)

Median (Q1, Q3) 15.267 (8.520,

29.327)

1.129 (0.851,

2.603)

0.334 (0.212,

0.409)

0.028 (0.018,

0.032)

0.005 (0.004,

0.009)

Min - Max 4.256 - 47.054 0.218 - 7.812 0.063 - 1.552 0.006 - 0.084 0.002 - 0.027

CoeffVariation 0.691 1.07 0.875 0.622 0.905

GUSB copies by laboratory

Bozza R.I.L.Barbara Izzo, Nicoletta Coccaro, Enrico Gottardi

Indice RIL Campus ALL 1. Background

2. Struttura del network

a. Laboratori di riferimento e organigramma

b. Tempistiche di refertazione suggerite

3. Metodologie approvate

a. Isolamento cellule nucleate

1) Volume e tipologia del campione (sangue midollare)

2) Procedura con Ficoll

b. Estrazione RNA

1) Purificazione mediante Trizol Reagent

2) Purificazione mediante RNeasy Mini KIT (Qiagen)

3) Purificazione mediante Qiacube Instrument (Qiagen)/Qiasimphony

4) Purificazione mediante Maxwell16 Promega

c. Quantizzazione dell’acido nucleico RNA estratto e verifica della sua integrità

1) Procedura per quantizzazione spettrofotometrica

2) Procedura per quantizzazione con fluorimetro

3) Quantizzazione e verifica dell’integrità dell’RNA mediante analisi al Nanodrop

d. Procedure di retrotrascrizione e di amplificazione

1) Retrotrascrizione (Protocollo BIOMED1) (descrizione e protocollo operativo)

2) Retrotrascrizione conVILO ss Script IV

2) PCR qualitativa (Protocollo BIOMED1) (descrizione e protocollo operativo)

3) Q-LAMP PCR (descrizione e protocollo operativo)

e. Monitoraggio della malattia minima residua (MMR)

1) Metodiche home made di analisi quantitativa (RQ-PCR) (Protocollo EAC)

2) metodiche RQ-PCR con kit commerciali:

- TWO STEP (Ipsogen, ELITech)

- ONE STEP (Bioclarma, AB Analitica, ELITechGroup)

f. Definizioni e criteri interpretativi per la validazione della malattia minima residua

Criteri di valutazione in riferimento ai parametri dell’analisi

Curva di riferimento (curva standard)

Intervallo di quantificazione (QR)

Sensibilità del saggio

Positività MRD

Quantificazione MRD

4. Controlli di qualità

1) Scopo

2) Obiettivi

3) Descrizione attività

4)Controlli di qualità interni

5) Procedure generali

6)Materiali e apparecchiature necessarie

5 Bibliografia

Criteri per l’interpretazione dei risultati e RefertoLoredana Elia, Carolina Terragna, Eleonora Toffoletti, Alessandra Santoro, Orietta Spinelli, Gianni Cazzaniga

Curva di riferimento o curva

standard

• ≥ 3 diluizioni note per ABL1/GUS, almeno in duplicato

• ≥ 5 diluizioni note per BCR-ABL1, almeno in duplicato

• Intervallo di diluizioni tra 10 – 105 copie per BCR-ABL1

• pendenza della curva (slope): compresa tra -3.2 e -3.7

• coefficiente di correlazione > 0.98

Intervallo di quantificazione (QR) Definito dalla più bassa diluizione della curva di riferimento con le seguenti caratteristiche:

• un Delta-CT riproducibile di tutti i replicati ≤ 1,5 CT

• un’ amplificazione specifica (determinata dall’analisi del grafico multicomponente e dalla forma

delle curve di amplificazione)

• un valore medio di delta-CT compreso tra 2.6 – 4.0 CT per differenze di diluizione di 1 log e tra

0.5 – 1.5 CT per differenze di diluizione di 0.5 log

Sensibilità del saggio (SR) E’ la più bassa diluizione della curva di riferimento positiva con:

• una curva di amplificazione specifica

• almeno un replicato positivo (CT ≤ al valore dell’intercetta +1) indipendentemente dalla

riproducibilità e dalla differenza Delta-CT

Positività MRD • una curva di amplificazione specifica

• almeno un replicato positivo con un valore di CT ≤ al valore dell’intercetta +1

• qualsiasi amplificazione oltre questo valore: indeterminato, non chiaramente negativo, dubbio

positivo.

Quantificazione MRD Il livello di MRD di un campione è quantificabile se:

• il Delta-CT dei replicati è ≤ 1.5

• il valore medio dei CT è ≤ al più alto valore di CT dell’intervallo di quantificazione (QR)

• un campione MRD-positivo (vedi sopra) ma inferiore all’intervallo di quantificazione è definito

come ‘positivo, inferiore al valore minimo di quantificazione’ (POS<QR)

Qualità ottimale del campione • ≥10.000 copie di ABL1

• Il valore minimo di copie di ABL1 necessario per il calcolo dell rapporto BCR-ABL/ABL1 è 1000

copie, ma sarà ulteriormente verificato su dati sperimentali.

Linee-guida per l’identificazione del trascritto p190BCR-ABL1: requisiti sperimentali e definizioni (PfeiferH, et al. Leukemia 2019)

Parametro Criteri

Esempio di risposta LAL-Ph+