INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN

PROGRAMA DE MAESTRÍA EN INMUNOLOGÍA

Fenotipo y respuesta al estímulo a través de TREM-1 de subpoblaciones de monocitos de sangre periférica de

donadores sanos y pacientes sépticos

T E S I S QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIAS EN INMUNOLOGÍA P R E S E N T A QC Jacqueline Liszeth Oliva Ramírez

DIRECTORES DE TESIS DR. FRANCISCO JAVIER SÁNCHEZ GARCÍA DRA. MARIA ISABEL WONG BAEZA

MÉXICO, D.F. 2010

A mis padres, mi hermano y, a todos

aquellos seres que quiero y ya no están; gracias por enseñarme que sólo hace

falta creer.

AGRADECIMIENTOS

Dr. Armando Isibasi. Por darme la oportunidad de trabajar a su cargo y por la confianza depositada en mí, con gran admiración y respeto, muchas gracias.

Dr. Constantino López. Por contagiarme de su gran entusiasmo, por ser firme y brindarme consejos para superarme académicamente.

Dr. Javier Sánchez. Por el apoyo incondicional y credibilidad a este proyecto, por ayudarme a fortalecerme académicamente; con suma admiración, muchas gracias.

Dra. Isabel Wong. Por darme la oportunidad de ser una de sus primeras alumnas con todo lo que ello implica, por apoyarme tanto académicamente como personalmente y enseñarme a ser una mejor estudiante.

Dra. Lourdes Arriaga. Porque con o sin impronta me ayudaste a crecer en todo sentido, por todo el apoyo incondicional, el justo consejo y preciso correctivo; gracias por ser un claro ejemplo del lugar a dónde quiero llegar, pero sobre todo por creer en mí.

Dr. Eduardo Ferat. Por ser un excelente asesor, gracias por su confianza, compañía y apoyo.

Dra. Iris Estrada y Dra. Martha Moreno. Por sus consejos y bien atinados comentarios en los momentos necesarios.

A mis compañeros de la UIMIq

Cristina y Christian. Por el ejemplo de cómo hacer las cosas, gracias por ser mis amigos y hacer más venideras las horas áridas. Los voy a extrañar.

Ismael, Javier, Marcela y Mireille. A mis hermanos de camada, gracias por todas las veces que me ayudaron, por escucharme y apoyarme siempre.

Eli Guido. Por ayudarme con todo este proyecto, ser crítico y objetivo siempre con todos sus comentarios y especialmente por toda esa energía que contagia.

A mis compañeros del laboratorio. Porque son un muy buen equipo de trabajo. Gracias.

A mis amigos

Gabriela. De no ser por tu entusiasmo no estaría aquí.

Adriana M. y Brenda. Por su apoyo incondicional, por escucharme siempre y a pesar de la distancia siempre estar ahí.

Julio, Fernando, Adriana G. y Evelyn. Por el gran impulso que brinda el contar con ustedes. Gracias por sus consejos, compañía y amistad.

César. Gracias por no dejarme desistir cuando quise hacerlo, por apoyarme a soportar el estar lejos de casa y creer en mí, pero sobre todo por ayudarme a crecer inmensamente en estos 2 años.

A mi familia

A papá. Por ser mi fortaleza en tiempos de flaqueza y brindarme siempre el soporte necesario para sobrellevar la distancia.

A mamá. Gracias por siempre apoyar mis decisiones y haberme enseñado lo necesario para saber llegar al final de todas las cosas.

A mi hermano. Por ser la persona que siempre ha iluminado mi camino, gracias por escucharme, comprenderme y apoyarme, siempre sigo adelante pensando en ti.

A mis tíos, Mirna, Alberto, Mari y César. Por acompañarme todo este tiempo, soportar mis humores y abrirme las puertas de su casa. Gracias por su apoyo.

El presente trabajo se realizó en la Unidad de investigación Médica en Inmunoquímica del Hospital de Especialidades “Dr. Bernardo Sepúlveda” del Centro Médico Nacional Siglo XXI del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) a cargo del Dr Armando Isibasi, y en el Laboratorio de Inmunorregulación de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección la Dra. Ma. Isabel Wong Baeza y el Dr Francisco Javier Sánchez García.

La sustentante becaria del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) con número de registro 216199.

ÍNDICE

INDICE DE TABLAS................................................................................................... I

INDICE DE FIGURAS............................................................................................... II

RESUMEN................................................................................................................. III

ABSTRACT................................................................................................................ IV

ABREVIATURAS ........................................................................................................V

INTRODUCCIÓN........................................................................................................ 1

Respuesta Inflamatoria ........................................................................................................ 1 Subpoblaciones de monocitos ...............................................................................................................7

JUSTIFICACIÓN..........................................................................................................9

OBJETIVO GENERAL .............................................................................................. 10

Objetivo particulares .......................................................................................................... 10

HIPOTESIS ................................................................................................................ 11

METODOLOGÍA ...................................................................................................... 12

Criterios de selección de los pacientes sépticos ................................................................ 12

Variables ............................................................................................................................. 12

Separación de células mononucleares de sangre periférica............................................... 13

Obtención de cultivos de monocitos ................................................................................. 13

Despegado de monocitos................................................................................................... 13

Procesamiento de muestras de sangre............................................................................... 14

Fenotipificación de células con anticuerpos monoclonales .............................................. 14

Estimulación de monocitos y movilización de calcio intracelular .................................... 15

Disociación de balsas lipídicas .......................................................................................... 15

Translocación de TREM-1 a balsas lipídicas .................................................................... 16

Determinación de IL-10 e IL-6 por ELISA ........................................................................ 16

Análisis estadístico ............................................................................................................. 17

RESULTADOS ........................................................................................................... 18

DISCUSIÓN ..............................................................................................................33

CONCLUSIONES ......................................................................................................39

PERSPECTIVAS .........................................................................................................40

REFERENCIAS .......................................................................................................... 41

ANEXO ......................................................................................................................46

I

Índice de Tablas

No. Tabla Pág

1. Criterios diagnósticos de SIRS 2

2. TLRs: Tipos celulares que los presentan y algunos de sus ligandos 4

3. Funciones de algunas citocinas que regulan la respuesta

inflamatoria 5

4. Tinción de las células para citometría de flujo 14

5. Datos clínicos de los pacientes sépticos 21

II

Índice de Figuras

Pág No. Fig.

1. Identificación de monocitos CD14+CD16low y CD14+CD16high 19

2. Identificación de monocitos CD14+GM1low y CD14+GM1high 20

3. Proporción de las subpoblaciones de monocitos en sangre periférica 22

4. Expresión relativa de TREM-1 en subpoblaciones de monocitos 23

5. Porcentaje de células que expresan HLA-DR en subpoblaciones de monocitos

24

6. Expresión relativa de GM1 en las subpoblaciones de monocitos 25

7. Concentraciones séricas de IL-6 e IL-10 26

8. Correlación entre TREM-1 y GM1 en cada subpoblación de monocitos 27

9. Disociación de balsas lipídicas en monocitos totales con metil-beta-

ciclodextrina (MbCD) 28

10. Translocación de TREM-1 a balsas lipídicas 29

11. Análisis de la colocalización de TREM-1 y GM1 30

12. Movilización del calcio intracelular en subpoblaciones de monocitos 32

III

RESUMEN

Los niveles de expresión de TREM-1 y el porcentaje de células que expresan HLA-DR en monocitos se han estudiado como posibles biomarcadores en los pacientes sépticos. Sin embargo, los monocitos (CD14+) constituyen una población muy heterogénea, y se pueden definir subpoblaciones con base en la expresión diferencial de CD16 y GM1. En este trabajo determinamos los niveles de expresión de TREM-1 y GM1 y el porcentaje de células que expresan HLA-DR en las subpoblaciones CD14+CD16low/CD14+CD16high, y los niveles de expresión de TREM-1 y el porcentaje de células que expresan HLA-DR en las subpoblaciones CD14+GM1low/CD14+GM1high en pacientes sépticos, y evaluamos su asociación con la sobrevivencia a esta patología. Como observamos una correlación entre los niveles de expresión de TREM-1 y GM1 (que se encuentra en las balsas lipídicas) en los monocitos de los pacientes sépticos, evaluamos si estas dos moléculas colocalizan en la superficie de los monocitos. Finalmente, evaluamos la movilización de calcio intracelular en respuesta a la estimulación con un anticuerpo anti-TREM-1 agonista y/o con LPS en las cuatro subpoblaciones.

Pacientes y métodos

Se tomaron muestras de sangre de 19 pacientes sépticos adultos; 9 de estos pacientes sobrevivieron y 10 fallecieron. La primera muestra se tomó en las primeras 24 h posteriores al diagnóstico, y la segunda y tercera muestras se tomaron 3 y 7 días después. También se analizaron muestras de 15 controles sanos. Se aislaron las células mononucleares de sangre periférica por centrifugación en gradiente de densidad y se tiñeron con anticuerpos anti-CD14, anti-CD16, anti-HLA-DR y anti-TREM-1, y con la subunidad B de la toxina del cólera (que se une a GM1), y se analizaron por citometría de flujo. La colocalización de TREM-1 y GM1 se evaluó por disociación de las balsas lipídicas con metal-beta-ciclodextrina y por microscopía confocal; y la movilización de calcio intracelular se evaluó por citometría de flujo.

Resultados

Los niveles de expresión de TREM-1 estaban significativamente aumentados en las subpoblaciones CD14+GM1high and CD14+CD16low de los pacientes sépticos, en comparación con los controles sanos; no hubo diferencias entre los pacientes sépticos sobrevivientes y nos no sobrevivientes. Se observó una correlación positive entre los niveles de expresión de TREM-1 y GM1 en los monocitos de los pacientes sépticos. Además, la expresión de GM1 es mayor en los pacientes sépticos sobrevivientes que en los no sobrevivientes. El porcentaje de células que expresan HLA-DR está disminuido en los pacientes sépticos, en comparación con los donadores sanos, pero esto solo es estadísticamente significativo entre los pacientes no sobrevivientes y los controles sanos en las subpoblaciones CD14+GM1high y CD14+GM1low. Se observó que TREM-1 colocaliza con GM1 cuando los monocitos se estimulan con LPS o con el anticuerpo anti-TREM-1 agonista y con LPS. No hubo diferencias en la movilización de calcio intracelular entre las subpoblaciones estudiadas.

Conclusiones

TREM-1 y GM1 se expresan diferencialmente en las subpoblaciones de monocitos de los pacientes sépticos, y una expresión elevada de GM1 correlaciona con la sobrevivencia de los pacientes. La disminución de GM1 podría reflejar una pérdida de balsas lipídicas y una baja capacidad para señalizar, lo que podría ayudar a explicar la parálisis inmune que frecuentemente se observa en estos pacientes.

IV

ABSTRACT

The expression levels of Triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) and the percent of cells that express HLA-DR on monocytes have been studied as possible biomarkers in septic patients. However, monocytes (CD14+) are highly heterogeneous, and subpopulations can be defined by the differential expression levels of CD16 and GM1. So, in this study we determined the expression levels of TREM-1 and GM1 and the percent of cells that express HLA-DR on CD14+CD16low/CD14+CD16high monocytes, and the expression levels of TREM-1 and the percent of cells that express HLA-DR on CD14+GM1low/CD14+GM1high monocytes in septic patients, and evaluated their association with the outcome of the disease (survival/death). As we observed a correlation between the expression levels of TREM-1 and GM1 (which is present in lipid rafts) on monocytes in septic patients, we evaluated if these two molecules co-localize on the surface of monocytes. Finally, we evaluated intracellular calcium mobilization in response to TREM-1 ligation and/or LPS in the four subpopulations.

Patients and Methods

Blood samples were taken from 19 adult septic patients; 9 of these patients survived and 10 died. The first sample was taken within the first 24 h after diagnosis, and the second and third samples were taken 3 and 7 days later. Samples from 15 blood bank donors were also analyzed. Peripheral blood mononuclear cells were isolated by gradient centrifugation, stained with fluorochrome-labeled anti-CD14, anti-CD16, anti-HLA-DR, anti-TREM-1 and cholera toxin B-subunit (which binds GM1), and analyzed by flow cytometry. TREM-1 and GM1 co-localization was evaluated by lipid raft dissociation with metil-beta-cyclodextrin and confocal microscopy, and intracellular calcium mobilization was evaluated by flow cytometry.

Results

TREM-1 expression levels were increased on monocyte subpopulations in septic patients, compared to healthy donors. However, this increase was only statistically significant on the CD14+GM1high and CD14+CD16low subpopulations. No differences were found between survivors and non-survivors. A positive correlation between the expression levels of TREM-1 and GM1 on CD14+CD16low/CD14+CD16high was observed. GM1 expression on the CD14+CD16low subpopulation was higher in survivors than in non-survivors. HLA-DR is decreased on all monocyte subpopulations in septic patients, and this is more evident in non-survivors, compared to healthy donors, on the CD14+GM1high and CD14+GM1low subpopulations. We observed that TREM-1 co-localizes with GM1 when monocytes are stimulated with LPS or with anti-TREM-1 agonist and LPS. The intracellular calcium mobilization shows no differences between the subpopulations.

Conclusions

TREM-1 and GM1 are differentially expressed on monocyte subpopulations in septic patients, and a high GM1 expression correlates with survival in septic patients. Decreased GM1 expression on non-survivors could reflect a loss of lipid rafts and poor cell signaling, which could help to explain the immune paralysis that is often reported in these patients.

V

ABREVIATURAS AP-1 Activating protein 1 CARS Compensatory anti-inflammatory response syndrome CTB Cholera toxin β subunit DAMP Damage-associated molecular patterns DAP 12 DNAX activating protein of 12 kDa ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay GM1 Gangliosid Membrane 1 GM-CSF Granulocyte/macrophage-colony stimulating factor HLA-DR Human leukocyte antigen DR HMGB1 High mobility group box 1 IL Interleukine IFN Interferon LPS Lipopolysaccharide MAPK Mitogen-associated protein kinases MCP Macrophage chemoattractant protein MIF Macrophage inhibitor factor MyD88 Myeloid differentiation associated protein of 88 kDa NF-κB Nuclear factor κB PAMP Pathogen-associated molecular patterns PRR Pattern-recognizing receptors SIRS Systemic inflammatory response syndrome TGF Transforming growth factor TIR Toll/IL-1 receptor TIRAP TIR associated protein TLR Toll-like receptor TNF Tumor necrosis factor TREM-1 Triggering receptor expressed on myeloid cells 1 TRAM Trif-associated adaptor molecule TRIF TIR-domain-containing inducing interferon protein

INTRODUCCIÓN

Respuesta inflamatoria

La inflamación es el proceso de reclutamiento y activación de las células del sistema inmune innato

en respuesta a una infección, traumatismo o lesión (Serhan, et al., 2007). El curso normal de una

respuesta inflamatoria lleva a la eliminación del agente causal, a la reparación del daño tisular y,

finalmente, a la eliminación de las células involucradas en dicha respuesta por macrófagos. La

inflamación empieza con el reclutamiento de células inflamatorias, inicialmente neutrófilos, al sitio de

la lesión a través de mediadores inflamatorios como citocinas, quimiocinas, moléculas de adhesión y

eicosanoides (prostaglandinas); una vez que los neutrófilos eliminan al microorganismo o contienen

el daño tisular, nuevos mediadores lipídicos como lipoxinas, resolvinas y protectinas promueven la

resolución de la inflamación e inducen apoptosis en estas células (Medzhitov, 2007). Los cuerpos

apoptóticos son eliminados por macrófagos provenientes de monocitos circulantes o por macrófagos

residentes de tejidos periféricos, que producen citocinas anti-inflamatorias como la IL-10 y el TGF-β

(Gilroy, et al., 2004; Mitchell, et al., 2002; Serhan, Savill, 2005). La respuesta anti-inflamatoria permite

recuperar la homeostasis, mediante la liberación de citocinas como IL-10, TGF-β entre otras; la

respuesta inflamatoria se caracteriza por activación del endotelio, vasodilatación, aumento en la

permeabilidad, infiltración celular y en ocasiones activación de la cascada de coagulación (Esmon, et

al., 1999). Sin embargo, en ocasiones la respuesta inflamatoria se vuelve sistémica, y los efectos de las

citocinas proinflamatorias como TNF-α, IL-1β, IL-6, HMGB1 (del inglés, High mobility group box1

protein) y factor inhibidor de migración de macrófagos (MIF) se observan en órganos lejanos al sitio

de la lesión inicial (Cavaillon, Annane, 2006; Gilroy, et al., 2004). Al conjunto de manifestaciones

clínicas de este estado se le conoce como síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) y se

caracteriza por la presencia de al menos dos de los siguientes criterios: fiebre o hipotermia,

taquicardia, taquipnea y leucocitosis o leucopenia (Levy, et al., 2003) Tabla 1. Cuando el SIRS se

presenta como consecuencia de un proceso infeccioso, se le llama sepsis.

1

Tabla 1. Criterios diagnósticos de SIRS. (Levy et al. 2003)

Variables generales

Fiebre (>38.3ºC) Hipotermia (<36ºC) Frecuencia cardiaca >90 latidos/min Frecuencia respiratoria >20/min Alteraciones neurológicas Edema significativo Glucosa plasmática >120 mg/dl en ausencia de diabetes

Variables inflamatorias

Leucocitosis (Cuenta de leucocitos >12,000/mm3) Leucopenia (Cuenta de leucocitos <4000/mm3) Cuenta de leucocitos normal con >10% de formas inmaduras Proteína C reactiva en plasma >2 desviaciones estándar sobre el valor normal Procalcitonina en plasma >2 desviaciones estándar sobre el valor normal

Variables hemodinámicas Hipotensión arterial Saturación de oxígeno en sangre venosa mixta >70% Índice cardiaco >3.5 l/min/m2

Variables asociadas a disfunción orgánica

Hipoxemia arterial Oliguria <0.5 ml/kg/h durante al menos 2h) Creatinina sérica >0.5 mg/dl Anormalidades en la coagulación (Tiempo de tromboplastina parcial activada >60 s) Íleo (Ausencia de sonidos intestinales) Bilirrubina total en plasma >4 mg/dl Trombocitopenia (<100,000/mm3)

Variables asociadas a perfusión tisular

Lactato sérico >1 mmol/l Retardo en el rellenado capilar

Si durante la sepsis se presenta falla orgánica, se conoce como sepsis grave, y cuando hay hipotensión

arterial sostenida y refractaria a tratamiento médico se le conoce como choque séptico (Brunn, Platt,

2006; Levy et al. 2003; Riedemann, et al., 2003; Vincent, Abraham, 2006). Se ha propuesto la

existencia del síndrome de respuesta anti-inflamatoria compensatoria (CARS) (Adib-Conquy,

Cavaillon, 2009), que se caracteriza por el incremento en la concentración sérica de IL-10 y por la

disminución en la expresión de moléculas de clase II del complejo principal de histocompatibilidad

(HLA-DR) en monocitos, lo que sitúa al paciente en un estado de “parálisis inmune” que en

2

pacientes no infectados aumenta la susceptibilidad a la infección y en pacientes sépticos a la

sobreinfección (Rittirsch, et al., 2008).

En los casos de infecciones, para que la inflamación se genere se requiere del reconocimiento de

componentes de la bacteria que reciben el nombre de PAMPs (Patrones Moleculares Asociados a

Patógenos), o componentes liberados durante el daño tisular secundario al proceso infeccioso como

algunos elementos de la matriz extracelular y/o HMGB1, que reciben el nombre de DAMPs

(Patrones Moleculares Asociados a Daño) por receptores de reconocimiento de patrón (PRRs) (por

ejemplo los Receptores tipo Toll, TLRs) que activan la transcripción de genes de la respuesta

inmune innata (Vincent, Abraham2006; Bianchi, 2007).

Los PAMPs son conservados entre microorganismos de una misma clase y participan en su

fisiología. Su origen puede ser de componentes de la pared celular, como lipopolisacárido (LPS),

péptidoglicana, ácido lipoteicoico y algunas lipoproteínas (Medzhitov2007). Los PRRs están ubicados

en diferentes compartimentos del organismo, en fluidos corporales, membranas celulares y

citoplasma; y cumplen diversas funciones como opsonización, activación del complemento y

transporte de PAMPs a otros PRRs. Una familia de PRRs que está actualmente bien caracterizada es

la de los TLRs, hasta el momento se conocen 11 y son glicoproteínas de membrana con un dominio

extracelular (Lee, Kim, 2007). Al activarse entre otras acciones, inducen la respuesta inflamatoria

mediante la producción de citocinas; pueden reconocer patrones específicos (PAMPs) de una amplia

gama de microorganismos como bacterias, hongos, virus y parásitos (Akira, Takeda, 2004). En la

tabla 2 se muestran los diferentes TLRs con el tipo celular que los presenta y algunos de sus ligandos

(Lee, Kim2007; Gowda, 2007; Coban, et al., 2005; Maldonado-Bernal, et al., 2005).

3

Tabla 2. TLRs: Tipos celulares que los presentan y algunos de sus ligandos. (Lee, Kim, 2007; Gowda, 2007; Coban et al. 2005; Maldonado-Bernal et al. 2005).

TLR Ligandos Tipos celulares

TLR1 Triacil lipopéptidos Macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, mastocitos

TLR2

Ácido lipoteicoico de bacterias Gram positivas, zimosán y lipopéptidos, GPI de parásitos.

Macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, mastocitos

TLR3 RNA viral de doble cadena y poli I:C

Macrófagos, células dendríticas, células epiteliales

TLR4 LPS, LPPG de Entamoeba histolytica

Macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, mastocitos, eosinófilos

TLR5

Flagelina

Monocitos, células dendríticas

TLR6

Diacil lipopéptidos

Monocitos, mastocitos, células dendríticas, neutrofilos

TLR7

RNA viral de cadena simple

Monocitos, mastocitos, células dendríticas, eosinófilos

TLR8 Resiquimod Monocitos, mastocitos, células dendríticas, neutrofilos

TLR9 CpG DNA bacteriano y viral, Hemozoina de Plasmodium

Células dendríticas plasmacitoides, células NK, eosinófilos, neutrofilos

TLR10 - Células dendríticas plasmacitoides, linfocitos B

TLR11

Profilina

Macrófagos, células epiteliales

Los TLRs, al reconocer sus ligandos, inician una cascada de señalización intracelular a través de

moléculas adaptadoras de dominio TIR, como MyD88, TIRAP, TRIF y TRAM; esta señalización

activa a los factores nucleares NF-κB y AP-1 produciendo mediadores inflamatorios. El

reconocimiento de LPS a través de TLR4 es crítico para la defensa del organismo contra bacterias

Gram negativas; su señalizaciones es MyD88 y TRIF dependiente induce la expresión de IL-6, IL-12,

4

TNF-α e IFN tipo 1 (Lee, Kim2007). Las citocinas son de naturaleza proteica y regulan la respuesta

inmune, así como también la respuesta inflamatoria. En la Tabla 2 se enlistan algunas de las

funciones principales de las citocinas que se mencionan.

Tabla 3. Funciones de algunas citocinas que regulan la respuesta inflamatoria. (Medzhitov, Janeway, Jr., 1997; Medzhitov, 2001)

Citocina Función

TNF-α Activa y estimula el reclutamiento de neutrófilos y monocitos a sitios de infección para erradicar patógenos.

IL-1 Produce fiebre, aumenta la adhesividad del endotelio y de los neutrófilos.

IL-6 Estimula la producción de neutrófilos de médula ósea y linfocitos B, y de las proteínas de fase aguda en el hígado.

IL-8 Es una quimiocina que ayuda en el reclutamiento de neutrófilos.

IL-10 Inhibe la activación de macrófagos y mantiene la homeostasis, es anti-inflamatoria.

TGF-β Inhibe la proliferación y activación de linfocitos, es anti-inflamatoria.

En la regulación de la respuesta inflamatoria participan, además de citocinas y quimiocinas, una gran

cantidad de moléculas, que incluyen prostaglandinas y leucotrienos, hormonas como

glucocorticoides, neuropéptidos, proteínas del complemento y de la cascada de la coagulación.

También participan receptores solubles y de membrana celular como TREM-1 (del inglés Triggering

Receptor Expressed on Myeloid Cells-1)(Cohen, 2002) que se encuentra en forma soluble o en membrana

celular en células mieloides; en estudios in vivo se ha demostrado que amplifica la respuesta

inflamatoria (Colonna, Facchetti, 2003; Colonna, 2003). Esta molécula es una glicoproteína que

consiste de un dominio extracelular de la familia de las inmunoglobulinas, una región

transmembranal con un residuo de lisina y una pequeña cola citoplasmática. Su ligando es

desconocido hasta el momento, pero a través de estudios con anticuerpos agonistas, se sabe que su

activación involucra la asociación de una molécula adaptadora conocida como DAP12, para activar la

transducción de señales que llevan a la amplificación de la respuesta inflamatoria. DAP12 se expresa

en monocitos, macrófagos, células NK, granulocitos, células dendríticas y mastocitos. TREM-1, en

5

cambio, sólo se expresa en neutrófilos, monocitos y macrófagos que infiltran tejidos dañados por

bacterias, y se cree que su expresión podría estar controlada por TLRs a través de NF-κB, ya que se

ha visto que cuando se activa TREM-1 en presencia de ligandos de TLR2 o TLR4 con LPS y

lipopéptido, hay incremento en la producción de citocinas proinflamatorias como TNF-α, IL-1β y

GM-CSF (Bleharski, et al., 2003). Esto se apoya con estudios de silenciamiento de TREM-1 en

macrófagos, en los que disminuye la expresión de CD14, MyD88, IL-10, IL-1β, MCP-1 e IκBα

(Ornatowska, et al., 2007). De esta manera, se sugiere que TREM-1 sinergiza con los TLR para

aumentar la transcripción de citocinas, a través de las MAPK (del inglés, Mitogen-activated protein

kinases) y de la movilización de calcio intracelular (Bouchon, et al., 2001; Klesney-Tait, et al., 2006;

Lanier, Bakker, 2000; Tomasello, Vivier, 2005).

Hay reportes que demuestran que la presencia de bacterias extracelulares incrementa la expresión de

TREM-1; y estudios in vitro e in vivo en los que se observa que el LPS incrementa su expresión

(Bouchon et al. 2001; Ornatowska et al. 2007; Bouchon, et al., 2000). El LPS puede, a través de PGE2,

regular la expresión de TREM-1 en monocitos de sangre periférica e incrementar la producción de

citocinas proinflamatorias; sin embargo se han realizado ensayos en los que se ve diferencialmente

con microarreglos que la activación indirecta de TREM-1 con LPS y la activación directa con

agonista de TREM-1 producen citocinas por diferentes vías y activan diferentes genes que pueden

ser antagónicos, por lo que se propone que TREM-1 se expresa como respuesta a una activación

alternativa de monocitos y que dicha expresión varía durante la maduración de los monocitos

(Gingras, et al., 2002; Ornatowska et al. 2007; Murakami, et al., 2007).

Existe la forma soluble de TREM-1 que se encuentra incrementada en sangre periférica durante los

procesos infecciosos, por lo que se propuso como biomarcador de infección para diferenciar a los

pacientes potadores de sepsis de aquellos que presentan SIRS de etiología no infecciosa (Gibot, et al.,

2004a; Gibot, et al., 2005; Vincent, Abraham, 2006). Sin embargo, ensayos posteriores demuestran

que TREM-1 está asociado tanto con procesos inflamatorios infecciosos como no infecciosos

(Gonzalez-Roldan, et al., 2005; Wong-Baeza, et al., 2006). Experimentos en ratones con choque

séptico han demostrado hasta el momento que el bloqueo de TREM-1 con RNA de interferencia,

disminuye las concentraciones de IL-1β y TNF-α en suero, corroborando su implicación en

procesos infecciosos e inflamatorios (Ornatowska, et al., 2007).

6

Subpoblaciones de monocitos

Los monocitos humanos de sangre periférica provienen de precursores de médula ósea y se pueden

dividir en dos subpoblaciones principales con base en la expresión de CD14 y CD16: los monocitos

CD14highCD16low o clásicos y los monocitos CD14lowCD16high o no clásicos. La maduración de

macrófagos muestra un incremento en la expresión de CD16 y una menor expresión de CD14, lo

que sugiere que los monocitos CD14lowCD16high constituyen una subpoblación más diferenciada. Los

monocitos CD14lowCD16high constituyen un 10% del total de monocitos, pero su número se

incrementa notablemente en presencia de inflamación, local o sistémica, por lo que se les ha llamado

“proinflamatorios”, ya que tienen una mayor capacidad para producir TNF-α con una baja

producción de IL-10. Otra característica de estas células es que expresan gran cantidad de moléculas

HLA-DR y de óxido nítrico sintasa, disminución de la capacidad fagocítica y baja producción de

peróxido de hidrógeno y de citocinas como IL-1β, IL-6 e IL-23 (Mosser, Edwards, 2008; Passlick, et

al., 1989; Ziegler-Heitbrock, et al., 1992; Ziegler-Heitbrock, 2007).

Recientemente se reportaron otras dos subpoblaciones de monocitos, con base en el nivel de

expresión del gangliósido GM1, un marcador de balsas lipídicas. Las balsas lipídicas son pequeños

dominios de la membrana celular (10-200nm), heterogéneos, altamente dinámicos, compuestos

principalmente por colesterol y esfingolípidos; en ocasiones estos pequeños dominios se unen y

forman largas balsas en la membrana que actúan como plataformas de señalización (Pike, 2006). Las

balsas lipídicas unen los eventos en el exterior de la célula con la señalización interna lo que se asocia

con mayor activación celular, y se sabe que también participan en la internalización de patógenos.

Para identificar al GM1, se utiliza la subunidad β de la toxina del cólera (CTB), que se une

específicamente a este gangliósido. La mayor parte de los monocitos de sangre periférica expresan

bajos niveles de GM1 en su superficie, y un porcentaje bajo de los monocitos expresan altos niveles

de dicho gangliósido. El porcentaje de GM1 aumenta durante la diferenciación in vitro de monocitos

a macrófagos (Chinnapen, et al., 2007; Moreno-Altamirano, et al., 2007; Munro, 2003). Este

gangliósido puede ser empleado como marcador de balsas lipídicas, y recientemente se ha reportado

que moléculas como TLR4 y CD14 se reclutan a estas balsas lipídicas para una señalización más

eficiente, una vez que han reconocido su ligando (Triantafilou, et al., 2002; Triantafilou, et al., 2004).

Durante esta fase las balsas lipídicas se vuelven más largas y estables, uniéndose incluso al

7

citoesqueleto; este fenómeno se conoce como coalescencia (Henderson, et al., 2004). Existe una

relación entre las balsas lipídicas y la señalización a través de TREM-1. En un estudio reciente se

demuestra que en neutrófilos activados con LPS a través de TLR4 o con el agonista de TREM-1,

este receptor se recluta hacia estas balsas lipídicas para señalizar; sin embargo, no hay aun evidencia

de que este fenómeno ocurra en monocitos y macrófagos (Fortin, et al., 2007).

8

JUSTIFICACIÓN

La inflamación es un proceso que está regulado por varios mediadores que provienen de diversas

poblaciones celulares. En el caso del SIRS y en la sepsis, se ha estudiado el comportamiento de

distintas moléculas en suero para tratar de asociarlas con el pronóstico de la evolución de los

pacientes; entre éstas se encuentran algunas citocinas como IL-6 y la forma soluble de TREM-1

(Arkader, et al., 2006; Gibot, et al., 2004b; Gibot et al. 2004a). También se han estudiado los niveles de

expresión de TREM-1 en monocitos y los porcentajes de monocitos que expresan HLA-DR, y se

observó que un incremento en los niveles de TREM-1, asociado con una disminución en el

porcentaje de células que expresan HLA-DR, correlaciona con un pronóstico desfavorable en los

pacientes sépticos (Gonzalez-Roldan, et al., 2005; Wong-Baeza et al. 2006).

No se conoce, sin embargo, cómo se comportan las distintas subpoblaciones de monocitos en

cuanto a expresión de TREM-1 y el porcentaje de células que expresan HLA-DR, y tampoco se sabe

si dichas subpoblaciones responden de manera distinta a la estimulación a través de TREM-1. El

estudio de estos aspectos en las subpoblaciones de monocitos, tanto en el curso de la enfermedad

como en controles sanos, permitirá comprender mejor su posible participación durante la sepsis, y

también permitirá evaluar la utilidad de estas moléculas como biomarcadores para determinar en

forma temprana el pronóstico de pacientes sépticos.

9

OBJETIVO GENERAL

Comparar los niveles de expresión de TREM-1 y GM1 y los porcentajes de células que expresan

HLA-DR en las subpoblaciones de monocitos de controles sanos y de pacientes sépticos, y analizar

la respuesta de dichas subpoblaciones a la estimulación a través de TREM-1.

OBJETIVOS PARTICULARES

• Fenotipificar las subpoblaciones de monocitos CD14+CD16low/CD14+CD16high y

CD14+GM1high/CD14+GM1low en pacientes sépticos y controles sanos.

• Evaluar los niveles de expresión de TREM-1 y GM1 y los porcentajes de células que

expresan HLA-DR en las subpoblaciones CD14+CD16low y CD14+CD16high de monocitos.

• Evaluar los niveles de expresión de TREM-1 y los porcentajes de células que expresan HLA-

DR en las subpoblaciones CD14+GM1high/CD14+GM1low de monocitos.

• Comparar los niveles de expresión de HLA-DR, TREM-1 y GM1 entre las subpoblaciones

de monocitos de los pacientes sépticos y de los controles sanos.

• Evaluar la respuesta de las cuatro subpoblaciones de monocitos a la estimulación a través de

TREM-1 (con un anticuerpo monoclonal agonista), en cuanto a movilización del calcio

intracelular.

• Evaluar si TREM-1 colocaliza con GM1 en monocitos.

10

HIPÓTESIS

• Los niveles de expresión TREM-1 y los porcentajes de células que expresan HLA-DR en las

subpoblaciones CD14+CD16high y CD14+GM1high son mayores en pacientes sépticos que en

controles sanos, por lo tanto hay mayor movilización del calcio intracelular en estas dos

subpoblaciones.

• TREM-1 colocaliza con GM1 en monocitos.

11

METODOLOGÍA

Criterios de selección de los pacientes sépticos

Criterios de inclusión

1. Pacientes de cualquier sexo con diagnóstico de sepsis con menos de 24 h de evolución.

2. Pacientes que aceptaron participar en el estudio y firmaron la carta de consentimiento

informado (Anexo 1).

3. Pacientes entre 18 y 90 años de edad.

Criterios de no inclusión

1. Pacientes post-operados en los últimos 3 meses.

2. Pacientes que rehusaron participar en el estudio.

3. Pacientes en tratamiento con inmunosupresores; pacientes portadores del virus de

inmunodeficiencia humana; pacientes con hepatitis viral crónica secundaria a infección por

virus de la hepatitis B o de la hepatitis C; pacientes embarazadas.

Criterios de exclusión

1. Pacientes que decidieron retirarse del estudio.

2. Pacientes cuyas muestras sanguíneas no fueron factibles de procesar por situaciones

inherentes a la toma y/o procesamiento de la misma.

3. Pacientes cuyas historias clínicas no están completas.

Variables

Variables independientes

• Sepsis

• Estímulo a través de TREM-1

Variables dependientes

• Expresión de TREM-1 (intensidad media de fluorescencia, IMF)

• Porcentaje de células que expresan HLA-DR

• Movilización del calcio intracelular

12

Separación de células mononucleares por centrifugación en gradiente de densidad

Se trabajó el concentrado leucocitario inmediatamente después de obtenerlo del banco de sangre, en

campana de flujo laminar. En un frasco despirogenizado se realizó una dilución 1:2 con solución

salina amortiguada con fosfatos (PBS). Se prepararon 4 gradientes en tubos Falcon (BD Biosciences,

NJ, USA) de 50 ml con 15 ml de Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo, Noruega), posteriormente se

centrifugaron a 2500 rpm durante 30 min a temperatura ambiente. Se transfirieron las células

mononucleares a un tubo Falcon de 50 ml para realizar lavados con PBS a 1500, 1000 y 900 rpm

durante 10 min, hasta que el sobrenadante dejó de estar turbio. Las células se resuspendieron en 10

ml de RPMI (GIBCO BRL, NY, USA) suplementado para contar en cámara de Neubauer con azul

tripano, haciendo una dilución 1:100.

Obtención de cultivos de monocitos

Se colocaron en cajas para cultivo celular 15 ml de RPMI y se añadieron 40x105 células

mononucleares a cada caja; se incubaron durante 2 h en la incubadora a 37°C con 5% de CO2.

Después de 2 h se realizó un lavado con PBS, y se colocaron nuevamente 15 ml de RPMI. Las

células se incubaron en las condiciones indicadas durante 1, 3 y 7 días.

Cosecha de monocitos

Se realizaron 2 lavados con PBS y se adicionaron 5 ml más para proceder a despegar las células

mediante raspado ligero sobre la superficie de la caja con una espátula estéril. Las células se

colectaron y se centrifugaron en un tubo Falcon de 15 ml, a 1500 rpm durante 10 min y 4°C. Las

células se resuspendieron en un volumen conocido con PBS-albúmina y se contaron en cámara de

Neubauer con azul tripano, haciendo una dilución 1:100.

13

Procesamiento de muestras de sangre de pacientes sépticos y controles sanos para

citometría de flujo

Se obtuvieron 5 ml de sangre periférica y se realizó la separación de mononucleares por

centrifugación en gradiente de densidad, con la misma metodología arriba mencionada. A los

controles sanos se les tomó una sola muestra, y a los pacientes sépticos se les tomó una muestra en

las primeras 24 h posteriores al diagnóstico y 3 y 7 días después.

Fenotipificación de células con anticuerpos monoclonales

Para fenotipificar las células obtenidas como se describe en los párrafos anteriores, se emplearon

anticuerpos monoclonales anti-CD14/FITC (BD Pharmingen, NJ, USA), anti-CD16/APC

(Invitrogen, CA, USA), anti-HLA-DR/PE (BD Pharmingen) y anti-TREM-1/PE (R&D, MN, USA);

también se utilizó CTB/biotina seguida de estreptavidina/PerCP. En 7 tubos para citometría (tabla

4) se colocaron 2 μl de uno de estos reactivos, a excepción de la estreptavidina PerCP; a cada tubo se

le agregaron 1x106 células, se agitó suavemente y se dejó a 4ºC durante 20 min.

Tabla 4. Tinción de las células para citometría de flujo.

CD14/FITC CD16/APC TREM/PE HLA-DR/PE CTB/biotinaTubo 1 - - - - - Tubo 2 2 μl/1x106 - - - - Tubo 3 - 2 μl/1x106 - - - Tubo 4 - - - 2 μl/1x106 - Tubo 5 - - - - 2 μl/1x106 Tubo 6* - - - - 2 μl/1x106 Tubo 7* 2 μl/1x106 2 μl/1x106 2 μl/1x106 - 2 μl/1x106 Tubo 8* 2 μl/1x106 2 μl/1x106 - 2 μl/1x106 2 μl/1x106

Transcurrido el tiempo de incubación, a los tubos marcados con (*) se les adicionaron 2 μl de

estreptavidina/PerCP y se dejaron nuevamente a 4ºC durante 20 min. Posteriormente se agregaron

250 μl de solución de lisis (BD, CA, USA) a cada tubo y se dejaron durante 15 min a temperatura

14

ambiente. Se adicionaron 1000 μl de PBS y se centrifugó a temperatura ambiente durante 5 min a

2500 rpm, al término de lo cual se decantó y resuspendió en 100 μl de PBS. Las muestras así

procesadas se analizaron en el citómetro de flujo (DAKO, USA). Los resultados se analizaron con el

programa SUMMIT (DAKO).

Estimulación de cultivos de monocitos con el anticuerpo anti-TREM-1 agonista y

movilización del calcio intracelular

Se separaron células mononucleares por la metodología antes descrita y se sembraron en placas de

baja adherencia, se lavaron con solución de Krebs y se despegaron con gendarme, después de lo cual

se transfirieron y se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 min en un tubo Falcon de 50 ml.

Posteriormente se realizó una tinción para CD14, CD16 y GM1 como se indicó anteriormente, y se

añadió Fluo-4 AM (50 μg, Invitrogen, OR, USA), un compuesto que fluoresce en presencia de

calcio. Después de 30 min a temperatura ambiente, se realizaron lavados con solución de Krebs, se

centrifugó a 1500 rpm durante 5 min y se llevó al citómetro de flujo. Para adquirir los datos en el

citómetro, se prepararon los tubos al momento, colocando 1x106 células a una dilución de 1:10 con

solución de Krebs y agregando 10 μl de CaCl2 0.2 M; se adquirieron células durante 30 s para medir

su estado basal y después de este tiempo se añadió un anticuerpo anti-TREM-1(R&D systems, MN,

USA). Se determinó la cantidad de calcio intracelular 4 minutos posterior al estímulo y finalmente se

agregó ionomicina (Sigma-Aldrich, MO, USA) para comprobar la funcionalidad del sistema.

Disociación de las balsas lipídicas

Para esta metodología se requirieron nuevamente de células mononucleares de sangre periférica,

obtenidas por el método ya descrito. Se colocaron 10x106 células en diferentes concentraciones de

metil-beta-ciclodextrina (5, 10 y 20 mM), se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente, se

tiñeron para TREM-1, CD14, CD16 y GM1 y se analizaron por citometría de flujo.

15

Translocación de TREM-1 a balsas lipídicas

Se realizó la separación de células mononucleares de sangre periférica y la separación de células

adherentes por el método arriba mencionado. En cámaras para microscopía confocal con 8 pozos

(Lab-Tek Chamber Slide, Nunc, NY, USA) se colocaron, en 3 pozos, 10 μg de anticuerpo anti-

TREM-1 agonista en 50 μl de PBS y en los pozos restantes, 50 μl de PBS. La cámara se dejó durante

12 h a 4°C, tras lo cual se retiró el PBS y se adicionaron 5x105 células por pozo, se centrifugó a 1200

rpm durante 30 s y se incubó durante 30 min a 37ºC. Se añadieron 10 μg/ml de LPS en los pozos

correspondientes durante 1 h, se realizaron 2 lavados con PBS y, para proceder con la tinción, se

bloqueó con 0.01% de albúmina sérica bovina en PBS durante 30 min a 37 °C. Se agregaron 2 μl de

anti-TREM-1/PE (R&D systems, MN, USA) y de CTB/FITC (Sigma-Aldrich, MO, USA), se lavó

con PBS y se montó con Vectashield, mounting medium (Vector Labs, USA) para leer en el

microscopio confocal (LSM Carl, Zeiss Jena, Alemania). Las imágenes se analizaron con el programa

LSM Image Browser (Carl Zeiss).

Determinación de IL-6 e IL-10 por ELISA

Se utilizaron los sistemas de BD Pharmingen (BD Pharmingen, NJ, USA) para lo cual se emplearon

placas de 96 pozos y se cubrieron con 100μL de anticuerpo de captura diluido en solución

reguladora correspondiente para cada citocina; y se dejó toda la noche a 4ºC. Se realizaron 3 lavados

con solución reguladora de lavado (PBS con 0.05% de Tween-20). Los pozos se cubrieron con 200

μL de solución reguladora de bloqueo (PBS con 10% de suero fetal bovino, pH 7.0), dejándose

durante 1 h a temperatura ambiente y después se lavaron 3 veces con solución reguladora de lavado.

Posteriormente se colocaron 100 μl de cada muestra (suero de pacientes o de controles sanos) y cada

dilución del estándar correspondiente, por duplicado; las placas permanecieron durante 2 h a

temperatura ambiente y se lavaron cinco veces con solución reguladora de lavado. Se añadieron 100

μL de solución de detección (anticuerpo de detección biotinilado y estreptavidina-peroxidasa) a cada

pozo y se dejó durante 1 h a temperatura ambiente. Se procedió a lavar siete veces con solución

reguladora de lavado; se colocaron 100 μL de solución sustrato (tetrametilbenzidina con peróxido de

hidrógeno) a cada pozo y se dejó durante 30 min a temperatura ambiente. Se añadieron 50 μL de

solución de paro (ácido sulfúrico 2 N) y 30 min después se determinó la absorbencia de cada pozo a

16

450 nm en el lector de placas de ELISA (Dynex MRX, VA, USA). La concentración de la citocina en

las muestras se obtuvo por interpolación de la lectura en la curva tipo.

Análisis estadístico

Se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis con post-prueba de Dunn para los datos no paramétricos. Para

los resultados de ELISA se utilizó la prueba de ANOVA unifactorial con post-prueba de Tukey. Se

consideraron valores significativos con una P <0.05. Para los análisis de correlaciones se utilizó la

prueba de Pearson; se consideró una correlación significativa con una P <0.05 y una r >0.5.

17

RESULTADOS

Las células mononucleares de sangre periférica de los controles sanos y los pacientes sépticos se

analizaron por citometría de flujo, para delimitar las regiones de las subpoblaciones de monocitos

CD14+CD16low y CD14+CD16high (figura 1). Se seleccionó la región de monocitos por su tamaño y

granularidad (R43), y de aquí se seleccionaron aquellos que expresan CD14. De esta nueva región

positiva para CD14 (R38), se analizó la expresión de CD16, lo cual define dos subpoblaciones:

CD14highCD16low (R39) y CD14lowCD16high (R40). A cada subpoblación se le analizó el nivel de

expresión de TREM-1 y GM1 y el porcentaje de células que expresan HLA-DR. Es importante

mencionar que se toman todas las células CD14 positivas, incluyendo High y low debido a que las

CD14low presentan mayor expresión de CD16, de lo contrario podríamos perder eventos positivos

para este último marcador.

Para el análisis de las otras subpoblaciones de monocitos (CD14+GM1low y CD14+GM1high) se parte

nuevamente de la selección de monocitos por tamaño y granularidad, se toma luego aquellos que son

CD14 positivos (R37) y luego se busca en estos la expresión de GM1, encontrando las 2

subpoblaciones (R39 y R40); a cada una de ellas se analiza el nivel de expresión de TREM-1 y el

porcentaje de células que expresan HLA-DR (figura 2). Se tomaron las células CD14 francamente

positivas para este análisis.

18

a

b

CD14 FITC CD16 APC

Control de isotipo

FITC APC

a

b

CD14 FITC CD16 APC

Control de isotipo

FITC APC

Figura 1. Identificación de monocitos CD14+CD16low y CD14+CD16high. Se realizó el

análisis por citometría de flujo de mononucleares de sangre periférica separados por centrifugación en gradiente de densidad, para fenotipificar las células CD14+CD16low y CD14+CD16high. a. R43 corresponde a la zona presuntiva de monocitos por tamaño y granularidad; b. controles de isotipo para cada marcador. c. R38, células positivas para CD14; R39 y R40, a las poblaciones CD16low y CD16high, respectivamente.

19

a

FITC PerCP b

Figura 2. Identificación de monocitos CD14+GM1low y CD14+GM1high. Se realizó el análisis de citometría de flujo de mononucleares de sangre periférica separados por centrifugación en gradiente de densidad, para fenotipificar las poblaciones CD14+GM1low y CD14+GM1high. Se partió de un gráfico de tamaño contra granularidad dónde se selecciona la población presuntiva de monocitos; R37 corresponde a células CD14 positivas; R39 y R40, a las poblaciones GM1low y GM1high, respectivamente. a corresponde a controles de isotipo y b a las células positivas a los marcadores

Se analizaron muestras de 15 controles sanos con una edad promedio de 51 años. Durante el periodo

de enero de 2008 a noviembre de 2009 se ingresaron 26 pacientes sépticos a este estudio. De estos,

cinco se excluyeron porque la muestra de sangre no fue suficiente para separar las células

mononucleares; uno se excluyó porque no se obtuvo la historia clínica completa y otro porque no se

confirmó la presencia de infección. Se tienen entonces 19 pacientes, de los cuales 9 fallecieron y 10

20

sobrevivieron; el promedio de edad de los pacientes es de 56 años. Los datos clínicos de los pacientes

se muestran en la tabla 5.

Tabla 5. Datos asociados de los pacientes sépticos

Sujeto  Sexo  Edad  Diagnóstico Definitivo 

1  F  36  Sepsis abdominal 2  M  65  Sepsis abdominal 3  F  66  Ulcera péptica perforada 4  M  33  Pancreatitis Aguda 5  M  61  Neuroinfección 6  M  63  Neuroinfección 7  M  60  Choque séptico 8  M  72  Neumonía 9  M  74  Pielonefritis enfisematosa 10  M  54  Mediastinitis 11  M  61  Colangitis 12  F  60  Choque séptico 13  M  62  Síndrome de Fournier 14  M  34  Sepsis abdominal 15  M  16  Sepsis abdominal 16  M  44  Sepsis abdominal 17  F  88  Sepsis abdominal 18  M  72  Sepsis abdominal 

19  M  55  Absceso pancreático 

En concordancia con lo que se reporta en la literatura, se observó que en los controles sanos las

poblaciones menos abundantes en circulación son CD14+CD16high y CD14+GM1high (figura 3). En los

pacientes sépticos, ambas subpoblaciones se ven ligeramente aumentadas, sin que la diferencia sea

estadísticamente significativa. No se observan diferencias entre los pacientes sobrevivientes y los no

sobrevivientes. La subpoblación CD14+GM1low presenta una disminución con valores significativos

respecto a los sanos y la subpoblación CD14+GM1high presenta un aumento con valores significativos

respecto a los sanos, ambos en la primera toma de muestra con una P<0.05 (figura 3).

21

CD14+CD16low

0

25

50

75

100

sanos1 3 7 1 3 7 sobrevivientes no sobrevivientes

n=15 n=9 n=10

A

Prop

orci

ón c

elul

ar (%

)

CD14+CD16high

0

25

50

75

100

sanos1 3 7 1 3 7 sobrevivientes no sobrevivientes

B

Prop

orci

ón c

elul

ar (%

)CD14+GM1low

0

25

50

75

100

sanos1 3 7 1 3 7 sobrevivientes no sobrevivientes

C

*

Prop

orci

ón c

elul

ar (%

)

CD14+GM1high

0

25

50

75

100

sanos1 3 7 1 3 7 sobrevivientes no sobrevivientes

D

*

Prop

orci

ón c

elul

ar (%

)

Figura 3. Proporción de las subpoblaciones de monocitos en sangre periférica. (A)

Subpoblación CD14+CD16low; (B) CD14+CD16high; (C) CD14+GM1low; y (D) CD14+GM1high. Alos pacientes sépticos se les tomó una muestra el día del diagnóstico (1), tres días después (3) y siete días después (7). Se incluyeron valores de 15 controles sanos, 9 sépticos sobrevivientes (en la última barra n=8) y 10 sépticos no sobrevivientes (barra 1, n=10, barra 2, n=9 y barra 3, n=3). * corresponde a P <0.05.

Se determinó el nivel de expresión de TREM-1 en cada subpoblación de monocitos (figura 4). Se

puede observar que en los sanos las células CD14+CD16high tiene una mayor expresión relativa de

TREM-1, en comparación con las células CD14+CD16low. En los sépticos, se incrementa la expresión

relativa de TREM-1 en ambas subpoblaciones, y esto es más evidente en las células CD14+CD16low

22

(** P<0.01, * P<0.05). En los pacientes sépticos no sobrevivientes se ve una clara tendencia a

disminuir la expresión de TREM-1 y no así en los sépticos sobrevivientes, en los que se mantiene alta

la expresión del receptor, tanto en la subpoblación CD4+CD16low como en la CD14+CD16high (figura

4). La subpoblación CD14+GM1low tiene un valor basal alto de expresión relativa de TREM-1 en los

controles sanos, en comparación con la subpoblación CD14+GM1high. En esta última subpoblación,

la expresión de TREM-1 aumenta en los pacientes sépticos y se mantiene aumentada en los pacientes

que sobreviven. En los monocitos CD14+GM1low, la expresión de TREM-1 disminuye en la segunda

muestra de los pacientes que no sobreviven (figura 4).

CD14+CD16low

0

50

100

150

200

sanos1 3 7 1 3 7 sobrevivientes no sobrevivientes

A

****

***

IMF

TREM

1

CD14+CD16high

0

50

100

150

200

sanos1 3 7 1 3 7 sobrevivientes no sobrevivientes

B

IMF

TREM

1

CD14+GM1low

0

50

100

150

200

sanos1 3 7 1 3 7 sobrevivientes no sobrevivientes

C

*

IMF

TREM

1

CD14+GM1high

0

50

100

150

200

sanos1 3 7 1 3 7 sobrevivientes no sobrevivientes

D

***

******

***

IMF

TREM

1

Figura 4. Expresión relativa de TREM-1 en subpoblaciones de monocitos. (A)Subpoblación CD14+CD16low; (B) CD14+CD16high; (C) CD14+GM1low; y (D) CD14+GM1high. A los pacientes sépticos se les tomó una muestra el día del diagnóstico (1), tres días después (3) y siete días después (7). Se incluyeron valores de 15 controles sanos, 9 sépticos sobrevivientes (en la última barra n=8) y 10 sépticos no sobrevivientes (barra 1, n=10, barra 2, n=9 y barra 3, n=3). * corresponde a P <0.05, ** P <0.01 y *** P <0.001

23

Al analizar el porcentaje de células que expresan HLA-DR en las subpoblaciones de monocitos

(figura 5), se observa que en los pacientes sépticos no sobrevivientes, dicho porcentaje tiene una

tendencia a disminuir respecto al tiempo de evolución en las subpoblaciones CD4+CD16low y

CD14+CD16high. En los pacientes sépticos sobrevivientes no hay cambios en los porcentajes de

células que expresan HLA-DR. En las subpoblaciones CD14+GM1low y CD14+GM1low también se

observa una tendencia a la disminución en los porcentajes de células que expresan HLA-DR; sin

embargo, sólo hay valores significativos en la segunda muestra en ambas subpoblaciones, respecto a

los controles sanos (figura 5, *** P< 0.001)

CD14+CD16low

0

50

100

150

200

sanos1 3 7 1 3 7 sobrevivientes no sobrevivientes

A

% H

LA-D

R

CD14+CD16high

0

50

100

150

200

sanos1 3 7 1 3 7 sobrevivientes no sobrevivientes

B

% H

LA-D

R

CD14+GM1low

0

50

100

150

200

sanos1 3 7 1 3 7 sobrevivientes no sobrevivientes

C

***

% H

LA-D

R

CD14+GM1high

0

50

100

150

200

sanos1 3 7 1 3 7 sobrevivientes no sobrevivientes

D

***

% H

LA-D

R

Figura 5. Porcentaje de células que expresan HLA-DR en subpoblaciones de monocitos. (A) Subpoblación CD14+CD16low; (B) CD14+CD16high; (C) CD14+GM1low; y (D) CD14+GM1high. A los pacientes sépticos se les tomó una muestra el día del diagnóstico (1), tres días después (3) y siete días después (7). Se incluyeron valores de 15 controles sanos, 9 sépticos sobrevivientes (en la última barra n=8) y 10 sépticos no sobrevivientes(barra 1, n=10, barra 2, n=9 y barra 3, n=3). * corresponde a P <0.05, ** P <0.01 y *** P <0.001.

24

Se analizó el nivel de expresión de GM1 en las subpoblaciones CD14+CD16low y CD14+CD16high. En

los pacientes sépticos no sobrevivientes, la expresión de GM1 es inversamente proporcional al

tiempo de evolución de los pacientes, disminuyendo en ambas subpoblaciones incluso por debajo del

nivel de expresión de los sanos. En los pacientes sépticos sobrevivientes se muestra un patrón

diferente, pues la tendencia es a incrementar la expresión de GM1 a niveles más altos que en los

controles sanos, y a mantenerse elevada durante el tiempo de evolución, con valores estadísticamente

significativos para la subpoblación CD14+CD16high en la primera toma de muestra de los pacientes

sépticos sobrevivientes, respecto a los controles sanos (* P<0.05) (figura 6).

CD14+CD16low

0

300

600

900

sanos1 3 7 1 3 7 sobrevivientes no sobrevivientes

***

n=15 n=9 n=10

IMF

GM

1

CD14+CD16high

0

300

600

900

sanos1 3 7 1 3 7 sobrevivientes no sobrevivientes

*IM

F G

M1

Figura 6. Expresión relativa de GM1 en las subpoblaciones de monocitos. (A) Subpoblación CD14+CD16low; (B) CD14+CD16high. A los pacientes sépticos se les tomó una muestra el día del diagnóstico (1), tres días después (3) y siete días después (7). Se incluyeron valores de 15 controles sanos, 9 sépticos sobrevivientes (en la última barra n=8) y 10 sépticos no sobrevivientes (barra 1, n=10, barra 2, n=9 y barra 3, n=3). * corresponde a P <0.05, ** P <0.01 y *** P <0.001.

25

También se analizaron las citocinas IL-6 e IL-10 en el suero de los pacientes, y se observó que los

pacientes sépticos no sobrevivientes presentan un incremento significativo en la concentración sérica

de IL-6, respecto a los controles sanos y a los pacientes sépticos sobrevivientes (*** P< 0.001, *

P<0.05) (figura 7). Los valores de la curva para IL-6 fueron de R=0.999 y para IL-10 R=0.977.

0

200

400

600

800

sanos1 3 7 1 3 7

sobrevivientes no sobrevivientes

ND

****

****

IL- 6

pg/

ml

0

20

40

60

80

100

120

1 3 7 1 3 7 sanos sobrevivientes no sobrevivientes

NDIL

-10

pg/m

l

Figura 7. Concentraciones séricas de IL-6 e IL-10. Se obtuvo suero de controles sanos y de

pacientes sépticos y se determinó por ELISA las concentraciones de IL-6 e IL-10. (A)Concentración de IL-6 en pg/ml; (B) concentración de IL-10 en pg/ml. Se incluyeron valores de 15 controles sanos, 9 sépticos (en la última barra n=8) y 10 sépticos no sobrevivientes (barra 1, n=10, barra 2, n=9 y barra 3, n=3). * corresponde a P <0.05, ** P <0.01 y *** P <0.001

26

Los niveles de expresión de GM1 y TREM-1 presentan una correlación positiva en las

subpoblaciones CD14+CD16low (en todos los pacientes sépticos) y CD14+CD16high (en los pacientes

sépticos no sobrevivientes), como se muestra en la figura 8.

CD14+CD16low sobrevivientes

0 50 100 150 200 2500

500

1000

1500

2000

2500

GM1

TREM

1

CD14+CD16low no sobrevivientes

0 100 200 300 4000

500

1000

1500

GM1

TREM

1

CD14+CD16high sobrevivientes

0 100 200 3000

1000

2000

3000

GM1

TREM

1

CD14+CD16high no sobrevivientes

0 200 400 6000

500

1000

1500

2000

GM1

TREM

1

r = 0.6827r = 0.6612

r = 0.2786r = 0.5505

a b

c d

Figura 8. Correlación entre TREM-1 y GM1 en cada subpoblación de monocitos. (A)

Subpoblación CD14+CD16low; (B) CD14+CD16high. A los pacientes sépticos se les tomó una muestra el día del diagnóstico (1), tres días después (3) y siete días después (7). Se incluyeron 9 sépticos sobrevivientes (en la última barra n=8) y 10 sépticos no sobrevivientes (barra 1, n=10, barra 2, n=9 y barra 3, n=3). Los valores son significativos para A, B y D.

Debido a esta correlación, procedimos a realizar un ensayo de disociación de balsas lipídicas con

metil-beta-ciclodextrina. Gombos y colaboradores en el 2004 (Gombos, et al., 2004) demuestran que

la metil-beta-ciclodextrina es un detergente que desestabiliza las balsas lipídicas, ya que remueve entre

el 40 y el 50% del colesterol de la membrana celular, lo que no ocurre con otros detergentes como el

tritón. Además, demuestran que este tratamiento disminuye significativamente la expresión de

moléculas que se reclutan a las balsas lipídicas, impidiendo también la formación de clusters de

receptores. Trantafilou y colaboradores (Triantafilou et al. 2004) en el mismo año demuestran que

hay moléculas como CD14, TLR2 y TLR4 que se reclutan las balsas lipídicas una vez activadas las

células, de tal manera que en el ensayo realizado en el presentes trabajo se quiere demostrar que

27

disminuye la expresión de TREM-1 en presencia de metil-beta-ciclodextrina, con lo que se

evidenciaría una posible movilización de este receptor a balsas lipídicas. Se realizaron 5 ensayos, y se

encontró que los niveles de expresión de CD14 y de TREM-1 en monocitos CD14+ presentan una

tendencia a disminuir conforme aumenta la concentración de metil-beta-ciclodextrina, pero los

valores no son estadísticamente significativos (figura 9). Los valores están normalizados con respecto

al control con PBS.

PBS 5 Mm 10 Mm 20 Mm0.0

0.5

1.0

Expr

esió

n re

spec

to P

BS

PBS 5 Mm 10 Mm 20 Mm0.0

0.5

1.0

Expr

esió

n re

spec

to P

BS

Concentración de MbCD Concentración de MbCD

A B

Figura 9. Disociación de balsas lipídicas en monocitos totales con metil-beta-ciclodextrina (MβCD). Se obtuvieron monocitos por adherencia y se incubaron a temperatura ambiente con las concentraciones indicadas del detergente; se realizó tinción de superficie con anticuerpos monoclonales anti-TREM-1/PE y anti-CD14/FITC y se analizó por citometría de flujo. Se realizaron 5 repeticiones de este experimento. Los valores de intensidad media de fluorescencia se normalizaron respecto al control con PBS.

Para verificar si TREM-1 se recluta a balsas lipídicas una vez activadas las células, se separaron célula

mononucleares de sangre periférica y colocaron por 24 h en microplacas de cultivo, se estimularon

con LPS, anti-TREM-1agonista y simultáneo; se empleó el método de microscopía confocal y se

observó que hay una mayor colocalización de TREM-1 y GM1 cuando se estimula con LPS o

cuando se estimula simultáneamente con LPS y con anticuerpo anti-TREM-1 agonista (figura 10). Se

realizaron 6 repeticiones del experimento y se analizaron 10 campos diferentes para cada pozo; cada

campo contenía alrededor de 8 células; se muestran resultados representativos para cada condición.

28

Figura 10. Traslocación de TREM-1 a balsas lipídicas. Se estimularon las células con el anticuerpo anti-TREM-1 agonista y/o con LPS durante 60 min, se realizó la tinción para TREM-1 con PE y para balsas lipídicas con CTB con FITC, y se analizó por microscopía confocal. Las imágenes se obtuvieron en un microscopio confocal Zeiss, y se analizaron con el programa LSM Image Browser. En la primera columna se muestra la tinción para GM1 con CTB/FITC, en la segunda columna se muestra la tinción para TREM-1 y en la tercera columna se encuentra el traslape de los 2 canales, con la colocalización en amarillo.

29

Se realizó un análisis de las imágenes obtenidas por microscopía confocal para comprobar la

colocalización de TREM-1 y GM1 (figura 11), y dicho análisis corrobora que hay una mayor

colocalización de estas moléculas cuando las células se estimulan con LPS o LPS y anticuerpo anti-

TREM-1 agonista.

Figura 11. Análisis de la colocalización de TREM-1 y GM1. En la primera columna se

encuentra un gráfico de puntos que muestra la fluorescencia de la muestra para 2 canales y, por lo tanto, para ambos colores; se toma como valor de corte de 100 unidades de intensidad para cada canal (Ch1 y Ch2). Una línea diagonal desde el origen indicaría una colocalización completa, así es que entre mayor inclinación hacia la derecha presente la gráfica de puntos, hay mayor colocalización de las moléculas de interés. En la segunda columna se muestran en color blanco las zonas que corresponden a una colocalización.

30

Finalmente, se evaluó si las subpoblaciones de monocitos responden de manera diferencial a la

estimulación con el anticuerpo anti-TREM-1 agonista, en cuanto a movilización del calcio

intracelular. Se encontró que no hay diferencias significativas entre las respuestas de las

subpoblaciones a los estímulos probados. Sin embargo, lo interesante es que las cinéticas de las

respuestas a los estímulos son diferentes: al adicionar primero el anticuerpo anti-TREM-1 agonista, la

señal del calcio muestra una cinética ascendente, que continúa al adicionar el LPS y luego disminuye

hasta por debajo de los valores basales. Cuando el estímulo inicial es LPS y posteriormente se

adiciona el anticuerpo anti-TREM-1 agonista, lo que se observa es que después del segundo estímulo

no hay una disminución sino una permanencia de la señal del calcio. Ahora bien, cuando el estímulo

es simultáneo se observa una curva, donde la señal del calcio desciende gradualmente (figura 12).

31

Figura 12. Movilización del calcio intracelular en subpoblaciones de monocitos. Se realizaron 4 ensayos en los que se midió la movilización de calcio intracelular en respuesta al estímulo con el anticuerpo anti-TREM-1 agonista y/o con LPS; simultáneamente se realizó la fenotipificación con anticuerpos monoclonales para identificar las cuatro subpoblaciones de monocitos (CD14+CD16high, azul: CD14+CD16low, rojo; CD14+GM1high, verde; CD14+GM1low, morado). Se grafica la intensidad media de fluorescencia de la señal del calcio (Fluo-4 AM)contra el tiempo en segundos. (A) Primero se adicionó el anticuerpo anti-TREM-1 agonista, posteriormente elLPS y finalmente la ionomicina, como control positivo. (B) Primero se adicionó el LPS y posteriormente el anticuerpo anti-TREM-1 agonista. (C) Se adicionaron simultáneamente los dos estímulos.

32

DISCUSIÓN

La sepsis es un estado multifactorial en el que se ven afectados diversos sistemas del organismo, y

está acompañado por una desregulación tanto de mediadores solubles como de moléculas en la

membrana celular. Algunos mediadores solubles aumentan sus concentraciones en la circulación

sanguínea; dentro de este grupo se encuentran las citocinas, que ejercen sus efectos a nivel sistémico

y entre otras cosas incrementan la permeabilidad vascular, lo que puede ocasionar problemas de

coagulación y en algunos casos falla orgánica múltiple. Por otro lado, las células de la respuesta

inmune innata también sufren cambios en su capacidad de respuesta a PAMPs.

Los pacientes sépticos cursan con niveles séricos elevados de citocinas proinflamatorias y anti-

inflamatorias, entre éstas se han descrito concentraciones altas de IL-10 e IL-6 (alrededor de 70

pg/ml y arriba de 1,000 pg/ml respectivamente) (van der, et al., 1997; Spittler, et al., 2000). Es

importante mencionar que el aumento en la concentración sérica de IL-10 se ha asociado con una

mayor susceptibilidad a infecciones por bacterias tales como Streptococcus pneumoniae, Klebsiella

pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa; (Mege, et al., 2006) esto también se ha asociado con un incremento

en la susceptibilidad a infecciones secundarias (Lyons, et al., 1997). La IL-10 inhibe las funciones

efectoras de los leucocitos, como neutrófilos, linfocitos y monocitos (Cavaillon, 2002), ocasionando

un estado de anergia. En el presente trabajo encontramos que las concentraciones de ambas citocinas

aumentan notablemente en los pacientes sépticos que no sobreviven, mientras que los pacientes

sépticos sobrevivientes hay sólo un ligero incremento que, con el tiempo de evolución de los

pacientes sépticos, muestra una tendencia a disminuir, lo que posiblemente se asocia con su mejoría

clínica.

Las células de la respuesta inmune innata tienen un papel crucial en la respuesta que lleva a la

resolución de la inflamación; dentro de estas células se encuentran los monocitos. Durante la

inflamación, los monocitos migran de la sangre periférica al sitio de la lesión y fagocitan a los

neutrófilos que han sufrido apoptosis; algunos de estos monocitos tienen propiedades anti-

inflamatorias, dependiendo de las citocinas que producen, por lo que podemos decir que los

monocitos no son una población homogénea de células con características similares sino que, por el

contrario, son una mezcla de subpoblaciones de células que difieren en su estado de madurez y en su

activación inicial. Los monocitos pueden expresar diferencialmente diversas moléculas de superficie,

33

tal es el caso de CD16; y además, cuando los monocitos se diferencian a macrófagos, expresan otros

conjuntos de marcadores en su superficie (Mosser, Edwards, 2008). Es entonces necesario identificar

a las subpoblaciones de monocitos en procesos que involucren una respuesta inflamatoria, ya que no

se sabe si las proporciones y/o las moléculas que se expresan diferencialmente en las subpoblaciones

correlacionan con la gravedad o con el pronóstico en estas patologías. En este trabajo, encontramos

que los porcentajes de las subpoblaciones de monocitos en controles sanos muestran, de acuerdo

con lo ya reportado por Passlick y colaboradores (Passlick et al. 1989), que la subpoblación

CD14+CD16low es la más abundante en sangre periférica (cerca de un 90%) y que, a pesar de que la

subpoblación CD14+CD16high tiende a aumentar en los pacientes sépticos, la relación de estas

subpoblaciones en sangre periférica en general se mantiene. Se observa un fenómeno similar con las

subpoblaciones CD14+GM1low y CD14+GM1high; la primera es la más abundante, tal como lo

reportan Moreno-Altamirano y colaboradores (Moreno-Altamirano et al. 2007). En los pacientes

sépticos sobrevivientes, se observa una disminución en el porcentaje de células CD14+GM1low y un

aumento en el de células CD14+GM1high, lo que sugiere que aumentan las células con un fenotipo

más activado (Moreno-Altamirano et al. 2007), lo cual podría relacionarse con la mejoría de los

pacientes.

Previamente se había reportado que el aumento en el nivel de expresión de TREM-1 en los

monocitos totales se asocia con procesos inflamatorios con o sin infección (Gonzalez-Roldan et al.

2005; Wong-Baeza et al. 2006). Sin embargo, una de las preguntas obligadas es saber cuál de las

subpoblaciones de monocitos es la que tiene una mayor implicación en dicho fenómeno. En este

trabajo se encontró que la expresión relativa de TREM-1 es diferencial entre las subpoblaciones de

monocitos en los controles sanos; las subpoblaciones CD14+CD16high y CD14+GM1low son las que

más expresan este receptor, lo que sugiere que podrían tener, en condiciones normales, una alta

capacidad inflamatoria (la molécula CD16, que es el receptor FcRγ, se incrementa cuando la célula

tiene un fenotipo más maduro y activado (Ziegler-Heitbrock et al. 1992; Ziegler-Heitbrock2007).

En los pacientes sépticos, se observa un incremento en el nivel de expresión de TREM-1 en las

subpoblaciones CD14+CD16low, CD14+CD16high y CD14+GM1high, tanto en sobrevivientes como en

no sobrevivientes, y esto más evidente en las células CD14+CD16low y CD14+GM1high, mostrando

valores significativos en las 3 tomas de muestra en los sobrevivientes y la primera toma de los no

sobrevivientes; esto hace pensar que estas subpoblaciones podrían tener una mayor participación en

34

el proceso inflamatorio que se presenta durante la sepsis. Un estudio apoya la propuesta de que los

monocitos pueden expresar TREM-1 diferencialmente, dependiendo de su estado de madurez y del

estímulo inicial (Gingras et al. 2002); con base en esta propuesta se puede explicar que las células

GM1high aumenten su expresión relativa de TREM-1, pues están funcionalmente más activadas ya

que tienen mayor capacidad endocítica, son más susceptibles a infecciones por micobacteria y cerca

del 90% de estas células expresan CD16 (Moreno-Altamirano et al. 2007). Es posible que este

aumento no sea tan evidente en las células CD16high, que de acuerdo a la literatura también deberían

presentar el fenotipo de TREM-1 elevado, porque la expresión basal de TREM-1 en estas células ya

se encuentra elevada. Una limitante del presente estudio es que, por el modo en que se realizó el

análisis, no sabemos cuántas ni cuáles células son GM1highCD16high. Con base en nuestros resultados,

se puede sugerir que la subpoblación CD14+GM1high aumenta en porcentaje en los pacientes sépticos

sobrevivientes, y también en su expresión relativa de TREM-1, y que esto puede estar relacionado

con un pronóstico favorable.

En varios estudios previos con pacientes sépticos (Ditschkowski, et al., 1999; Docke, et al., 2005;

Monneret, et al., 2004; Wong-Baeza et al. 2006) se ha propuesto a HLA-DR como un posible

marcador pronóstico, pues se ha encontrado de manera consistente una disminución en el porcentaje

de monocitos que expresan este receptor en pacientes sépticos, en especial en los pacientes sépticos

que fallecen. Estos reportes son en monocitos totales de sangre periférica, de modo que la pregunta

es, una vez más, cuál es la subpoblación responsable de dicha disminución. Lo que encontramos en

el presente trabajo, al igual que con TREM-1, es que en los controles sanos el porcentaje de células

que expresan HLA-DR es diferencial entre las subpoblaciones, lo que concuerda con lo ya reportado

por el grupo de Ziegler y colaboradores (Ziegler-Heitbrock, 2007) al caracterizar por primera vez

estas subpoblaciones de monocitos: en la subpoblación CD14+CD16high hay un mayor porcentaje de

células que expresan HLA-DR. Además, en los pacientes sépticos no sobrevivientes hay una

tendencia a la disminución del porcentaje de células que expresan HLA-DR, y esto ocurre de manera

más evidente en la subpoblaciones CD14+CD16low y CD14+GM1low. Resulta interesante que en la

segunda muestra de los pacientes sépticos no sobrevivientes hay una disminución significativa en el

porcentaje de células que expresan HLA-DR en las subpoblaciones CD14+GM1low y CD14+GM1high.

Estos resultados concuerdan con los reportes previos, respecto a que una disminución en el

porcentaje de monocitos que expresan HLA-DR se asocia con un mal pronóstico para los pacientes.

Sin embargo, no todas las subpoblaciones de monocitos contribuyen en igual medida al fenómeno

35

que se observa cuando se analizan los monocitos totales, y se puede sugerir, con base en este estudio,

que las células CD14+CD16high son las que menos contribuyen al fenómeno mencionado.

En cuanto a la expresión relativa de GM1, que identifica a las balsas lipídicas, no se observaron

diferencias entre las subpoblaciones CD14+CD16low y CD14+CD16high en controles sanos.

Interesantemente, en los pacientes sépticos no sobrevivientes la expresión de GM1 en estas dos

subpoblaciones disminuye casi a la mitad en el séptimo día de evolución, lo que sugiere una menor

capacidad de estas células a ser activadas a través de receptores que requieren de las balsas lipídicas

para señalizar. Entonces, las balsas lipídicas podrían desempeñar un papel importante durante la

sepsis, que ayudaría a la sobrevivencia de los pacientes.

Se ha reportado que, durante la sepsis, hay un estado de hiporrespuesta de los monocitos al estímulo

con PAMPs y, en general, hay un estado de parálisis inmunológica, y no se tiene una clara explicación

del proceso por medio del cual las células dejan de responder; este efecto se observa también en

ensayos de tolerancia a la endotoxina in vitro (Bouchon, et al., 2001). Nuestros resultados sugieren

que la disminución de GM1, que refleja una disminución de las regiones de la membrana que son

necesarias para la transducción de señales y, por tanto, para la activación celular, podría ayudar a

explicar esta disminución en la capacidad de respuesta de los monocitos durante la sepsis.

Hasta la fecha no hay reportes donde se asocie una disminución de las balsas lipídicas con alguna

patología. Las zonas de balsas lipídicas pueden formar “clusters” o agrupaciones cuando las células se

activan, de tal forma que se forma una plataforma para que muchos receptores entren a ellas y

puedan transducir señales eficientemente. Por ejemplo, CX3CR1 está normalmente en zona de balsas

lipídicas y en los pacientes sépticos, en especial en los no sobrevivientes, se ha descrito que esta

molécula se encuentra disminuida en la superficie de los monocitos circulantes y aumentada en la

circulación (Green, et al., 2006); esto podría correlacionar con nuestra observación de que GM1

disminuye en los pacientes sépticos no sobrevivientes. En estos pacientes, la falta de estas

plataformas de señalización podría afectar con la señalización de receptores como CX3CR1 o

TREM-1.

Los marcadores celulares que se incluyeron en este estudio muestran entonces que la subpoblación

de monocitos que posee mayor expresión basal de TREM-1 son las células CD14+CD16high, que sería

36

la subpoblación con mayor madurez según lo reportado en la literatura; sin embargo, esta

subpoblación prácticamente no tiene cambios en la expresión de este receptor durante la sepsis. En

cambio, parece ser que los monocitos con un papel más activo en esta patología son los

CD14+CD16low, pues en estas células se observan los cambios más marcados en la expresión de

TREM-1 y en el porcentaje de células que expresan HLA-DR.

Dado que observamos un comportamiento similar entre los niveles de expresión de TREM-1 y GM1

en los monocitos de los pacientes sépticos, decidimos determinar si estas dos moléculas colocalizan

en la membrana celular de los monocitos. Los resultados obtenidos por microscopía muestran que

TREM-1 se encuentra en las balsas lipídicas (marcadas con GM1) de los monocitos, tanto de manera

basal como en respuesta a estímulos, como el anticuerpo anti-TREM-1 agonista y el LPS; en este

último caso se incrementa la colocalización, lo que indica que TREM-1 se mueve a esta zona de

balsas lipídicas cuando la célula se activa y podría así tener su efecto amplificador de la inflamación.

Estos resultados refuerzan la propuesta de que la disminución de GM1 en los monocitos de los

pacientes sépticos que no sobreviven podría estar relacionada con la falta de respuesta, la tolerancia o

la parálisis inmune que presentan las células de estos pacientes.

Finalmente, realizamos ensayos funcionales in vitro para determinar si hay una activación diferencial

de estas cuatro subpoblaciones, en cuanto a movilización de calcio intracelular, en respuesta a

estímulos con el anticuerpo anti-TREM-1 agonista y con el LPS. Dentro de la señalización de

TREM-1, cuando éste reconoce a su ligando se incrementan los niveles intracelulares de calcio y esto

promueve la translocación de factores nucleares como NFAT o NF-kB (Colonna, Facchetti, 2003;

Colonna, 2003; Green et al. 2006). Se encontró que no hay diferencias en cuanto a la movilización de

calcio intracelular entre las cuatro subpoblaciones, pero las cinéticas de activación en respuesta los

estímulos probados son diferentes. Cuando se adiciona en primer lugar el anticuerpo anti-TREM-1

agonista, hay una activación gradual que se asemeja a una curva, y cuando se adiciona el LPS se

observa un pico ascendente que cae rápidamente. Esto no ocurre cuando primero se adiciona LPS y

después se agrega anticuerpo anti-TREM-1 agonista, pues en este caso la señal del calcio se mantiene.

La adición simultánea de los dos estímulos da lugar a una cinética de activación gradual, ya que el

aumento y el descenso de la señal del calcio son paulatinos y más prolongados. Estos resultados

reflejan la interacción que puede ocurrir entre las vías de señalización que se activan en respuesta a

37

dos estímulos distintos (uno exógeno, el LPS, y uno posiblemente endógeno, el ligando de TREM-1);

dicha interacción modifica entonces el tipo y la duración de la respuesta inflamatoria.

38

CONCLUSIONES

• Las subpoblaciones de monocitos CD14+CD16high y CD14+GM1low tienen mayor expresión

relativa de TREM-1 en controles sanos, en comparación con las subpoblaciones

CD14+CD16low y CD14+GM1high, respectivamente.

• La expresión relativa de TREM-1 en pacientes sépticos es mayor en las subpoblaciones

CD14+CD16low y CD14+GM1high, respecto a controles sanos.

• Las subpoblaciones de monocitos CD14+GM1low y CD14+GM1high presentan menor

porcentaje de HLA-DR en pacientes sépticos no sobrevivientes respecto a controles sanos.

• El nivel de expresión de GM1 en pacientes sépticos sobrevivientes es mayor en las

subpoblaciones CD14+CD16low y CD14+CD16high en comparación con los controles sanos.

GM1 en estas mismas subpoblaciones muestra una tendencia marcada a disminuir en

pacientes sépticos no sobrevivientes.

• No hay diferencias en cuanto a la movilización del calcio intracelular en ninguna de las

subpoblaciones.

• TREM-1 colocaliza con GM1 en monocitos cuando son estimulados por LPS o

simultáneamente con anticuerpo anti-TREM-1 agonista y LPS.

39

PERSPECTIVAS

La perspectiva a largo plazo de esta línea de investigación es la creación de un panel de

biomarcadores que ayude al pronóstico de la evolución de los pacientes con sepsis. Con los

resultados de este trabajo, se propone que la medición de TREM-1 y HLA-DR en subpoblaciones de

monocitos es útil, pues los fenómenos que se habían observado en monocitos totales no se deben a

todas las subpoblaciones. Por lo tanto, convendría medir el nivel de expresión de TREM-1 en la

subpoblaciones CD16low y GM1high, y el porcentaje de células que expresan HLA-DR en la

subpoblación CD16low, porque es probable que así se obtengan correlaciones más claras con la

evolución de los pacientes (en comparación con las mediciones de estas moléculas en monocitos

totales). Es necesario probar esta propuesta en un estudio prospectivo con mayor número de

pacientes.

Otra propuesta derivada de este trabajo es la inclusión de GM1 en el panel de biomarcadores para

sepsis. Resulta interesante que la expresión de esta molécula disminuye en los pacientes sépticos que

no sobreviven, pues esto podría ayudar a explicar por qué las células de estos pacientes presentan una

menor capacidad de respuesta a PAMPs. Sin embargo, quedan diversas preguntas respecto a este

fenómeno, ya que no se sabe qué determina la disponibilidad de los niveles de balsas lipídicas en las

células, y tal vez se podría, en un futuro, modular la cantidad de balsas lipídicas para favorecer la

reactivación adecuada de las células de estos pacientes. También podría evaluarse la cantidad de

balsas lipídicas en otras patologías que involucren procesos inflamatorios sistémicos, todo esto

orientado a la búsqueda de la mejoría clínica de los pacientes.

Para redondear el presente trabajo, se podría buscar en los pacientes sépticos la colocalización de

TREM-1 a balsas lipídicas, y también se podrían realizar los ensayos de movilización de calcio para

entonces evaluar directamente la funcionalidad de las células en estos pacientes, lo que ayudaría a

explicar la parálisis inmune.

40

REFERENCIAS

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ANEXO 1. CARTA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO México, D. F., a de de 200 .

Unidad de Investigación Médica en Inmunoquímica Hospital de Especialidades CMN SXXI

Carta de consentimiento informado de la persona legalmente responsable.

Por medio de la presente acepto que participe_________________________________ _____________________________________, cuyo parentesco conmigo es ______________________________, en el proyecto de investigación titulado:

“Análisis del comportamiento y nivel de asociación de HMGB1 y Hsp70, en pacientes con padecimientos asociados con procesos inflamatorios y sépticos, en búsqueda de una señal temprana

para el desarrollo de sepsis.”

El objetivo del estudio es comprender mejor la respuesta inflamatoria en pacientes con sepsis.

Esto se logrará mediante la determinación de moléculas en suero (HMGB1 y Hsp70) y otras moléculas en la superficie de las células sanguíneas (TREM-1, HLA-DR). Se me ha explicado que la participación consistirá en la donación de 30 mL de sangre venosa, distribuidas en 3 tomas de 10 mL cada una, a los días 1, 3 y 7. La sangre se obtendrá mediante a través de catéter central o punción en vena periférica.

Declaro que se me ha informado ampliamente sobre los posibles riesgos, inconvenientes, y molestias; que se reducen a la incomodidad derivada de la punción en venas periféricas, pero sin que esto pueda poner en riesgo la vida. Se podrán hacer tomas del catéter intravenoso que fue instalado para el manejo rutinario de la enfermedad. No se obtendrá beneficio económico al participar en este protocolo, en cambio, el conocimiento generado a través del presente estudio, podrá retribuir en mejorar algunos aspectos terapéuticos de la enfermedad que, finalmente, podrán ser beneficiosos para los pacientes.

El investigador principal se ha comprometido a responder cualquier pregunta y aclarar cualquier duda que le plantee acerca de los procedimientos que se llevarán a cabo, los riesgos, beneficios o cualquier otro asunto relacionado con la investigación o con el tratamiento.

Entiendo que conservo el derecho de retirar del estudio a mi paciente, en cualquier momento en que lo considere conveniente, sin que ello afecte la atención médica que recibo de la Institución. Así mismo, mi paciente podrá ser retirado del estudio en caso de que cumpla con alguno de los criterios de exclusión. El investigador principal me ha dado seguridades de que no se identificará a mi paciente en las presentaciones o publicaciones que deriven de este estudio, y de que los datos relacionados con su privacidad serán manejados en forma confidencial. También se ha comprometido a proporcionarme la información actualizada que se obtenga durante el estudio aunque esta pudiera hacerme cambiar de parecer respecto a su permanencia en el mismo.

Podré contactar al investigador responsable en el teléfono 56-27-69-15 del Dr. Armando Isibasi.

Nombre y firma del paciente Dr. Armando Isibasi Araujo Testigo Testigo