Transformación Bacteriana

Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern

Alianza para el Aprendizaje de Ciencias y Matemáticas (AlACiMa)

Temas Cubiertos • Introducción

• Transformación de bacteria con el plásmido de pGLO• Inducción de la expresión de GFP con arabinosa y la subsecuente purificación de la proteína

pGLO™ & GFP

Dogma Central de la Biología Molecular

ADN ARN Proteína Característica

El ciclo celular

De ADN a proteína

Kit de Transformación de Bacteria con plásmido pGLO™

Procedimiento de Transformación

Day 1

Day 2

¿Qué es una Transformación? Alteracion de una Bacteria como resultado de la incorporación de ADN exógeno (que viene de afuera de la célula).

Frecuentemente, el ADN es circular yllamado plásmido.

GFP

-Lactamasa

Confiere Resistencia

al Antibiótico Ampicilina. plásmidos

bacteria

Métodos de Transformación

• Electroporación– Un choque eléctrico resulta en que

la célula sea permeable al plásmido ADN

• Cloruro de Calcio y Choque Térmico– Las células químicamente

competentes absorben el ADN después del choque térmico

¿Qué es un plásmido? Un pedazo circular de ADN de doble cadena, que se replica autónomamente.

Fue evolucionado originalmente enbacterias.

Puede expresar resistencia a un antibiótico o puede ser modificado paraexpresar una proteína de interés.

Plásmido pGLO

• Beta-Lactamasa Confiere resistencia al

antibiótico ampicilina.

• Proteína Verde Fluorescente (“Green Fluorescent Protein, GFP”)Aequorea victoria, gen de medusa

• araC: Regulador Regula la transcripción de GFP

Transformación con pGLO

Beta-Lactamasa(resistencia a ampicilina)

Plásmidos de pGLO

Cromosoma Bacteriano (ADN)

Pared celular

GFP

Bacteria

Proceso de Transformacion • Suspender las colonias en la Solución de

Transformación.

• Añadir el plásmido pGLO ADN.

• Incubar los tubos en hielo por 10 minutos.

• Choque térmico a 42°C por exactamente 50 segundos, y luego colocar en hielo por 2 minutos.

• Añadir el caldo nutriente LB e incubar a temperatura ambiente.

• Esparcir 100 L de la suspensión por la superficie de las placas de agar.

¿Que es el caldo nutriente de LB?

• Caldo Luria-Bertani (LB)

• Un medio que contiene los nutrientes para el crecimiento bacteriano y la expresión de los genes de interés.

– carbohidratos– aminoácidos– nucleótidos– sales– vitaminas

Importancia de cada paso de la transformación

1. La solución de transformación contiene CaCI2 .

La carga positiva del los iones de Ca2+ neutralizan la carga negativa de los fosfatos del ADN.

Ca++

OCH2

O

P OO

O Base

CH2

O

PO

O

O

Base

OH

Azúcar

Azúcar

OCa++

Importancia de cada paso de la transformación

2. Incubación en hielo -disminuye la fluidez de la membrana celular.

3. Choque térmico -incrementa la

permeabilidad de la membrana celular.

4. La recuperación con LB permite la expresión de la beta-lactamasa.

Beta-Lactamasa(resistencia a ampicilina)

Pared Celular

GFP

¿Qué observó en las placas de agar?

Crecimiento en área

completa.

Ningún Crecimiento de

Bacterias.

Crecimiento de colonias que no

brillan.

Crecimiento de colonias que sí

brillan.

De ADN a proteína

Relación de RNA con las cadenas del DNA

Unidad transcripcional

Regulación de Transcripción

•Operón de Arabinosa

•Plásmidos de pGLO

Regulación de la expresión del gen

araC

Operón GFPGen de GFP

Gen de GFP

Gen de GFPB A D

B A DaraC

ARN Polimerasa

Efector (Arabinosa)

B A D

Operón ara

araC

araCaraC

Efector (Arabinosa)

araC

ARN Polimerasa

araCaraC

¿Cómo podemos expresar genes eucariotas en células procariotas?

Preparación de cDNA