transformación bacteriana original de essy levy, m.s. y julie mathern alianza para el aprendizaje...
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Transformación BacterianaOriginal de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern
Alianza para el Aprendizaje de Ciencias y Matemáticas (AlACiMa)
Temas Cubiertos • Introducción
• Transformación de bacteria con el plásmido de pGLO
• Inducción de la expresión de GFP con arabinosa y la subsecuente purificación de la proteína
pGLO™ & GFP
Dogma Central de la Biología Molecular
ADN ARN Proteína Característica
El ciclo celular
De ADN a proteína
Kit de Transformación de Bacteria con plásmido pGLO™
Procedimiento de Transformación
Day 1
Day 2
¿Qué es una Transformación?
Alteracion de una Bacteria como resultado de la incorporación de ADN exógeno (que viene de afuera de la célula).
Frecuentemente, el ADN es circular yllamado plásmido.
GFP
-Lactamasa
Confiere Resistencia
al Antibiótico Ampicilina. plásmidos
bacteria
Métodos de Transformación
• Electroporación– Un choque eléctrico resulta en que
la célula sea permeable al plásmido ADN
• Cloruro de Calcio y Choque Térmico– Las células químicamente
competentes absorben el ADN después del choque térmico
¿Qué es un plásmido?
Un pedazo circular de ADN de doble cadena, que se replica autónomamente.
Fue evolucionado originalmente enbacterias.
Puede expresar resistencia a un antibiótico o puede ser modificado paraexpresar una proteína de interés.
Plásmido pGLO
• Beta-Lactamasa Confiere resistencia al
antibiótico ampicilina.
• Proteína Verde Fluorescente (“Green Fluorescent Protein, GFP”)Aequorea victoria, gen de medusa
• araC: Regulador Regula la transcripción de GFP
Transformación con pGLO
Beta-Lactamasa(resistencia a ampicilina)
Plásmidos de pGLO
Cromosoma Bacteriano (ADN)
Pared celular
GFP
Bacteria
Proceso de Transformacion • Suspender las colonias en la Solución de
Transformación.
• Añadir el plásmido pGLO ADN.
• Incubar los tubos en hielo por 10 minutos.
• Choque térmico a 42°C por exactamente 50 segundos, y luego colocar en hielo por 2 minutos.
• Añadir el caldo nutriente LB e incubar a temperatura ambiente.
• Esparcir 100 L de la suspensión por la superficie de las placas de agar.
¿Que es el caldo nutriente de LB?
• Caldo Luria-Bertani (LB)
• Un medio que contiene los nutrientes para el crecimiento bacteriano y la expresión de los genes de interés.
– carbohidratos– aminoácidos– nucleótidos– sales– vitaminas
Importancia de cada paso de la transformación
1. La solución de transformación contiene CaCI2 .
La carga positiva del los iones de Ca2+ neutralizan la carga negativa de los fosfatos del ADN.
Ca++
OCH2
O
P O
O
OBase
CH2
O
P
O
O
O
Base
OH
Azúcar
Azúcar
OCa++
Importancia de cada paso de la transformación
2. Incubación en hielo -disminuye la fluidez de la membrana celular.
3. Choque térmico -incrementa la
permeabilidad de la membrana celular.
4. La recuperación con LB permite la expresión de la beta-lactamasa.
Beta-Lactamasa(resistencia a ampicilina)
Pared Celular
GFP
¿Qué observó en las placas de agar?
Crecimiento en área
completa.
Ningún Crecimiento de
Bacterias.
Crecimiento de colonias que no
brillan.
Crecimiento de colonias que sí
brillan.
De ADN a proteína
Relación de RNA con las cadenas del DNA
Unidad transcripcional
Regulación de Transcripción
•Operón de Arabinosa
•Plásmidos de pGLO
Regulación de la expresión del gen
araC
Operón GFP
Gen de GFP
Gen de GFP
Gen de GFPB A D
B A DaraC
ARN Polimerasa
Efector (Arabinosa)
B A D
Operón ara
araC
araCaraC
Efector (Arabinosa)
araC
ARN Polimerasa
araCaraC
¿Cómo podemos expresar genes eucariotas en células procariotas?
Preparación de cDNA
