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I
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR
ÁREA DE CONOCIMIENTO DE CIENCIAS DEL MAR
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA MARINA
TESIS DE LICENCIATURA
INTERACCIÓN MIXOTRÓFICA DE MICROALGAS MARINAS Y BACTERIAS
PROBIÓTICAS CON ENFOQUE A LA FORMACIÓN DE BIOFLOCS PARA
ACUICULTURA
QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TITULO DE
BIÓLOGO MARINO
PRESENTA
JESÚS ERNESTINA HERNÁNDEZ CASTRO
DIRECTOR
Dr. JUAN MANUEL PACHECO VEGA
LA PAZ, BAJA CALIFORNIA SUR, JUNIO DEL 2014.
II
III
RESUMEN
Los cultivos mixotróficos de ciertas microalgas-bacterias para la formación de
bioflocs se han incrementado, ya que producen compuestos que ayudan a prevenir el
desarrollo de Vibriosis y de otras bacterias patógenas en los sistemas de cultivo. En
este trabajo se evaluó la utilización de cultivos mixotróficos de diferentes especies de
microalgas: Grammatophora sp., Schizochytrium sp., Chaetoceros muelleri y una
cepa de bacterias acido lácticas (aislada de tracto digestivo de camarón) para la
formación de bioflocs. Para determinar el efecto de la interacción microalga-
probiótico en el crecimiento del cultivo, fueron sembradas las microalgas y probiótico
(20 mL 1x108 UFC/mL por garrafón) en garrafones con 17L, aireación constante, sin
control de temperatura y ciclo Día:Noche. Se determinaron las cinéticas de
crecimiento de las microalgas por ocho días y crecimiento poblacional del probiótico.
En esta etapa se obtuvo que los cultivos de Schizochytrium sp. + Probiótico,
presentaron el mejor crecimiento sin presentar crecimiento antagónico. En el caso de
cultivos con Grammatophora sp y Chaetoceros muelleri, se presentaron efectos
inhibitorios por parte de la microalga y la bacteria.
Para evaluar la formación de bioflocs mediante la utilización de Schizochytrium
sp., fueron mantenidos los cultivos bajo las condiciones de cultivo previamente
descritas. En ésta etapa se evaluaron los cultivos mediante la adición de una fuente
de carbono (melaza) a una concentración de 2 g/m3 de agua cada 4 días, se evaluó
el crecimiento de cultivos, la concentración de oxigeno disuelto, formación de bioflocs
volumen ocupado por biofloc en 200 mL de cultivo (V:V) y presencia de Vibrio spp.
En este trabajo se obtuvo que bajo estas condiciones, a partir del día cuatro de
cultivo se presentó la formación de biofloc, generándose la mayor cantidad en el
tratamiento a base de Schizochytrium sp. + Probiótico + melaza, con 1.25mL
bioflocs/200 mL cultivo. En el sistema se mantuvo niveles de oxígeno de 6.7-8.1
mg/L, presentó una densidad máxima de 1.2 x106 cel/mL de Schizochytrium sp., y
una variación de concentración del probiótico en función de la adición de melaza a
los cultivos. Al final del experimento se obtuvo un resultado negativo a presencia de
Vibrio spp.
IV
Con estos resultados se propone un sistema biofloc a base de Schizochytrium
sp. + Probiótico + Melaza, que puede ser evaluado para el cultivo de especies
marinas.
Palabras clave: Bioflocs, Vibriosis, mixotrófico, probiótico.
V
AGRADECIMIENTOS
Primeramente quiero agradecer a mi mamá Sandra Luz Hernández quien es la persona
más importante para mí que gracias a su trabajo, esfuerzo y sacrificio fue posible que yo
terminara mis estudios que siempre ha confiado en mí y me ha apoyado en los buenos y malos
momentos.
Al resto de Mi Familia mis hermanos, mis tíos (as), primos (as), mis abuelos, mi papá, mi
amiga Carmen (la hermana muy mayor que nunca tuve) quienes han sido una parte importante
siempre alentándome para cumplir el sueño de terminar mi carrera.
Al Dr. Marco Cadena Roa por haber sido el primero que confió en mí aceptándome en
su equipo de trabajo, por todo su apoyo, tiempo, consejos por todas las veces que me hizo reír
mis respetos y muchas gracias por todo.
Al Dr. Juan Manuel Pacheco mi director de tesis por siempre que necesite algo estuvo
disponible, que no dejo de alentarme para que continuara con esto, le agradezco por todo su
tiempo, su paciencia y enseñanza de verdad nunca terminare de agradecer todo lo que ha hecho
por mí.
A la Dra. Maurilia Rojas por permitirme trabajar en su laboratorio, por su apoyo,
opiniones y enseñanzas gracias por confiar en mí.
Al Dr. Carlos Rangel Davalos por su apoyo, consejos y por confiar en mí y en este
trabajo muchas gracias.
En el apoyo técnico quiero agradecer a Elizabeth Bravo por toda su ayuda, tiempo que
invirtió en mí, su compañía, enseñanzas y siempre que necesite algo ahí estuvo sin importar la
hora o el día muchas gracias por todo.
A Gaspar Pettit otra persona que me ayudo muchísimo en la parte de laboratorio
cuando no crecían mis bacterias o el medio de cultivo no quedaba bien, que sin importar que
fuera sábado o domingo el estaba ayudándome de verdad muchas gracias.
VI
A Clara Santos, Francisco y José Carlos por su ayuda, los raites a Pichi y por hacer más
agradables los ratos en el laboratorio con todas las historias de clarita muchas gracias por todo.
A todos mis maestros y compañeros de la carrera de Biología Marina. En especial a B.M.
Marco Medina, Dr. Jorge López Calderón, Dra. Liliana Hernández Olalde y M.C. Marcial
Villalejo (CICIMAR) que siempre nos han apoyado y aconsejado son unas excelentes personas y
muy humildes gracias por todas sus enseñanzas los aprecio mucho y nunca los voy a olvidar.
Y por último pero no menos importante a las FORAMEN MAGNUM (Iza, Mara,
Tania, Valeria y Zuri) las mejores amigas que pude encontrar, gracias por todos los buenos
momentos que pasamos junta, que hicieron agradables todas esas noches de desveladas (por
hacer tarea claro), con ustedes aprendí a vivir la vida, con su compañía estos cuatro años se
fueron como si nada, las quiero mucho nunca las voy a olvidar y saben que siempre pueden
contar conmigo.
VII
Contenido
1.-INTRODUCCIÓN 1
2.-JUSTIFICACIÓN 8
3.-ANTECEDENTES 8
4.-OBJETIVO GENERAL 10
5.-OBJETIVOS PARTICULARES 10
6.-HIPÓTESIS 10
7.-METODOLOGÍA 11
1.-Reactivación de cepa probiótica .................................................................... 11
2.-Cultivo de Microalgas ..................................................................................... 12
Etapa 1.-Selección de cepa microalga y de bacteria. ........................................ 14
1.1 Conteos Bacterianos .................................................................................... 14
Etapa 2.-Interacción Microalga-Bacteria ............................................................ 15
2.1.-Toma de muestras ...................................................................................... 17
Etapa 3.-Interacción de la microalga-probiótico más una fuente de carbono. .... 18
3.1.-Formación de Bioflocs................................................................................. 19
3.2.-Prueba de presencia de Vibrio .................................................................... 19
3.3.-Analisis estadísticos .................................................................................... 20
8.-RESULTADOS 21
Etapa 1-Selección de la cepa de microalga y de bacteria. ................................. 21
1.1.-Conteos Bacterianos ................................................................................... 25
Etapa 2.-Interacción en cultivos mixotróficos Microalga-Bacteria ...................... 27
2.1.-Cultivos mixotróficos Chaetoceros muelleri. + Lactobacillus plantarum ...... 27
2.2. Cultivo mixotrófico Grammatophora sp. + Lactobacillus plantarum............. 32
2.3.-Interacción mixotrófica Schizochytrium sp. + Lactobacillus plantarum........ 36
Etapa 3.-Interacción mixotrófica de la microalga-probiótico más una fuente de
carbono. ............................................................................................................. 41
3.1.-Formación de Bioflocs................................................................................. 47
VIII
9.-DISCUSIÓN 52
Etapa 1-Selección de cepa de la cepa de microalga y de bacteria. ................... 52
1.1.-Conteos Bacterianos ................................................................................... 53
Etapa 2.-Interacción en cultivos mixotróficos Microalga-Bacteria ...................... 53
Etapa 3.-Interacción mixotrófica de la microalga-probiótico más una fuente de
carbono. ............................................................................................................. 54
3.1.-Formación de Bioflocs................................................................................. 56
10.-CONCLUSIONES……………………………………………………………59
11.-RECOMENDACIONES……………………………………………………..59
12.-BIBLIOGRAFÍA 60
13.-ANEXOS67
Anexo 1 .............................................................................................................. 67
Anexo 2 .............................................................................................................. 68
Anexo 3 .............................................................................................................. 69
Anexo 4 .............................................................................................................. 70
1
INTRODUCCIÓN
La población mundial se encuentra en un crecimiento continuo y acelerado,
esto trae consigo problemas a la hora de satisfacer las necesidades de alimentación,
las cuales se tratan de solucionar con actividades agrícolas, ganaderas y pesqueras,
siendo esta última la actividad que ha presentado una disminución y deterioro en la
poblaciones de organismos marinos debido al manejo no sustentable de los recursos
(Luchini y Panné Huidobro, 2008).
A pesar de esto, dicha actividad es capaz de sostenerse con ayuda de la
acuicultura, tal como lo menciona el estudio de “El estado de la Pesca y Acuicultura
Mundial 2012” publicado por la FAO (Organización de las Naciones Unidas para la
Agricultura y la Alimentación), donde se afirma que la producción pesquera que toma
en cuenta la producción por acuicultura ha aumentado un 3.2% entre 1961 y 2009,
producción que ha superado el crecimiento poblacional promedio que presentó este
periodo (Navarrete Pérez, 2012).
El crecimiento de la acuicultura representa hoy en día casi el 50% de los
productos pesqueros mundiales destinados a la alimentación (FAO, 2006-2013).
Hablando a nivel nacional según la FAO, 2013 la acuicultura representa para
México una alternativa real para solucionar muchos de los problemas de
alimentación, contribuyendo a la seguridad alimentaria, generación de divisas y
creando fuentes permanentes de empleo, lo cual favorece al desarrollo regional.
En este país la actividad acuícola tiene muchas ventajas debido a la
diversidad en las condiciones climáticas, la geografía y el extenso mar territorial de
este país, lo cual genera ambientes dulceacuícolas, salobres y marinos con un gran
potencial para el cultivo de peces, moluscos y crustáceos, pero el aprovechamiento
de esto dependerá de la aplicación de nuevas tecnologías eficientes y de procesos
de innovación y modernización (Campos Norzagaray et al., 2012).
Datos de la Carta Nacional Acuícola 2012, indican que se cultivan 61
especies, de estas 40 son nativas y 21 son exóticas, en el año 2011 el Anuario
2
Estadístico de Acuicultura y Pesca registró que los organismos más cultivados son
crustáceos, peces y molusco siendo el camarón el primer lugar (43%) con las
especies Litopenaeus vannamei y Litopenaeus stylirostris, en segundo lugar se
encuentra la tilapia (27%) Oreochromis niloticus, Oreochromis mossambicus,
Oreochromis hornorum y Oreochromis aureus y por último el ostión (16%)
representado por las especies Crassostrea virginica, Crassostrea gigas y
Crassostrea corteziensi.
Estas especies son destinadas al consumo humano consideradas como un
alimento saludable, fácil de digerir, que pueden ayudar a combatir la obesidad (por el
tipo de grasas que contienen) y proporcionan vitaminas y minerales esenciales (Vela
Vallejo y González Posada, 2007).
Pero para que la acuicultura pueda cumplir con la meta de satisfacer las
necesidades de alimentación en la población, es necesario que exista el
abastecimiento adecuado de juveniles (semilla) para engorda, el cual es uno de los
principales problemas que enfrenta la acuicultura para mantener un crecimiento
adecuado que garantice una continua producción, ya que se observa frecuentemente
que los alimentos utilizados no contienen los nutrientes para su crecimiento optimo
principalmente en sus primeras etapas de vida, donde se presenta la mayor
mortalidad (Castro Barrera et al., 2003: Voltolina et al., 2000).
Por lo anterior es necesario conocer la biología de las especies y un punto
importante son los aspectos sobre la alimentación y nutrición lo cual ayudara a tener
una producción de mejor calidad, hoy en día se puede encontrar en el mercado gran
variedad de alimentos balanceados, pero la mayoría presentan deficiencias en la
estabilidad del agua, flotabilidad y sabor, otra posible opción es la utilización de
organismos vivos (Castro Barrera et al., 2003).
El microalimento vivo se encuentra constituido por microalgas y algunas
especies de zooplancton (rotíferos, copépodos y Artemia) (Voltolina et al., 2000).
Estudios realizados en los últimos años han demostrado los beneficios de la
utilización de microalgas para diversos fines por ejemplo; la salud humana,
3
purificación de aguas residuales, prevención de contaminación acuática, industria
farmacéutica, producción de pigmentos, antibióticos y acuicultura, se han registrado
493 especies utilizadas para estos fines Las microalgas son microorganismos
unicelulares que obtienen su energía principalmente por medio de la fotosíntesis son
capaces de biosintetizar ácidos grasos poliinsaturados y son portadoras de
pigmentos antioxidantes (Medina Jasso et al., 2012).
El valor nutrimental de las microalgas, está relacionado con el grado de
digestibilidad y la composición o contenido de enzimas del organismo que está
consumiendo la microalga (Brown, 2002).
En la acuicultura se han destinado diferentes especies de microalgas para ser
utilizadas como alimento vivo de las cuales varía su valor nutricional debido a sus
características fisiológicas (Pratoomyot et al., 2005).
Los géneros más utilizados en acuicultura son Arthrospira, Isochrysis,
Tetraselmis, Chlorella, Dunaliella, Schizochytrium, Ulkenia, Phaedactylum,
Rhodomonas, Chaetoceros, Thalassiossira, Pavlona, Navicula, Amphora,
Crypthecodinium, Nannochloropsis (Shields y Lupatsch, 2012).
De los diferentes géneros mencionados, las especies pertenecientes al género
Chaetoceros son las más utilizadas para alimentación en acuicultura, esta es una
diatomea planctónica de forma rectangular, unicelular de color café, posee cuatro
setas en cada uno de sus extremos, con un tamaño aproximado de 4 a 9 µm, esta
diatomea pertenece a la clase Bacillariophyceaes y se caracteriza por tener un alto
contenido de ácidos grasos poliinsaturados (AGPIs), su tipo de nutrición es autótrofa,
fotosintetizadores de color dorado oliváceo color proporcionado por pigmentos como
la clorofila C1 y C2 así como carotenos, además suelen contener alto contenido de
lípidos que sirven de reserva energética y contribuyen a su flotabilidad.
Dominio: Eucariontes
Reino: Chromalveolata
Filo: Heterokontophyta
4
Clase: Bacillariophyceae
Orden: Centrales
Suborden: Biddulphiineae
Familia: Chaetocerotaceae
Género: Chaetoceros
Especie: Chaetoceros muelleri
Otra diatomea utilizada es el género Grammatophora la cual es una diatomea
bentónica unicelular color café y forma rectangular que presenta un tamaño que va
de 28 a 36 µm:
Dominio: Eucariontes
Reino: Chromalveolata
Filo: Heterokontophyta
Clase Bacillariophyceae
Orden Striatellales
Familia Striatellaceae
Género Grammatophora
Schizochytrium es otro de los microorganismo que ha tomado gran
importancia a nivel industrial para ser usado como suplemento alimenticio ya que
puede llegar a presentar hasta un 37% de Ácido docohexaenoico (DHA, C22:6), y un
16% Ácido eicosapentanoico (EPA, C20:5), los cuales son AGPIs de cadena larga de
la serie ω3, estos han sido objeto de estudios debido a los efectos benéficos
observados en el tratamiento contra la arterioesclerosis, cáncer y artritis reumatoide
(Hakim, 2012)
5
Schizochytrium es un microorganismo esférico unicelular con red
ectoplasmica, puede presentarse en diversos estadios como zoospora biflgeladas,
aplanospora y células ameboides con un tamaño que va de 10-20 µm, además la
célula madura puede dividirse por fisión binaria o formar diadas, tétradas y clusters.
Cada célula de Schizochytrium puede desarrollar dentro de ella un esporangio que
produce varias zoosporas (Hakim, 2012, Kamlangdee y Fan, 2003).
Pertenece al grupo de los traustoquitridios que son microorganismos del
ambiente marino, clasificados antiguamente dentro de los hongos por su naturaleza
heterotrófica, pero con la utilización de técnicas de biología molecular se demostró
que son organismos relacionados con las algas heterokontas (Quilodrán, 2010).
Dominio: Eucariontes
Reino: Chromista
Filo: Heterokonta
Clase: Thraustochytridae
Orden: Thraustochytriales
Familia: Thraustochytriaceae
Género: Schizochytrium
Especie: Schizochytrium sp. (Source: Leipe et al., 1994)
Una buena opción para los cultivo de microalgas es la utilización de
microalgas autóctonas ya que se trata de organismos bien adaptados a las
condiciones locales, capaces de producir compuestos de interés biotecnológico con
una elevada tasa de crecimiento (Hoys, 2012).
A demás de la utilización de las microalgas en los sistemas de cultivo también
es común la utilización de aditivos complementarios para mantener a los organismos
saludables y favorecer su crecimiento, entre uno de los principales aditivos utilizados
se encuentran los antibióticos los cuales sirven para el control y tratamiento de
6
infecciones bacterianas pero el abuso de estos puede causar la resistencia
bacteriana, o pueden eliminar la flora microbiana normal del tracto digestivo (Sugita
et al., 1991).
Un método alternativo al uso de antibióticos son los microorganismos
probióticos con los cuales es posible generar un equilibrio entre las bacterias
“benéficas” y “nocivas” dentro del intestino de los organismos esto por medio de la
manipulación del ecosistema intestinal influyendo positivamente en procesos como la
digestión, inmunidad y resistencia a enfermedades (Monroy Dosta et al., 2012).
Entre los probióticos más utilizados están las bacterias lácticas, bifidobacterias
y levaduras. El grupo de las bacterias ácido lácticas se forma por: Aerococcus,
Alloicoccus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus,
Tetragenococcus, Vagococcusy Weissella (Apun, Molina, 2007).
Existen algunos ejemplos del uso exitoso de probióticos comerciales en
acuicultura como el Bacillus toyoi las cuales son esporas que mejoran la tasa de
supervivencia en la anguila japonesa y el jurel, el uso de bacterias ácido lácticas
ayudo en la producción de rotíferos y tasa de crecimiento de larvas de lenguado
(Gatesoupe, 2000).
En la naturaleza existe una interacción importante entre bacteria-microalga
donde las bacterias reciclan la materia orgánica y absorben nutrientes del medio.
Diversas investigaciones en laboratorio han demostrado que se puede dar el
fenómeno de inhibición de crecimiento en microalgas y/o bacterias, o estas pueden
incrementar el crecimiento microalgal por medio de la producción de alguna vitamina
(Riquelme y Avendaño Herrera, 2003).
Por ende, esta interacción es de gran importancia para la acuicultura ya que
se ha demostrado que en condiciones de laboratorio en la utilización de microalgas
como método de alimentación es casi imposible trabajar con cultivos totalmente
axénicos, debido a que estas secretan sustancias que pueden llegar a estimular el
crecimiento bacteriano, de tal forma que los cultivos pueden componerse por una o
varias bacterias asociadas, dependiendo de la especie de microalga. Estos cultivos
7
“mixtos” (microalga-bacteria) le dan beneficios a los organismos que los consumen
ya que son fáciles de digerir y favorecen al crecimiento y sobrevivencia, donde las
bacterias juegan un papel importante en los procesos de digestión de las microalgas
por medio de la producción de enzimas extracelulares (Curbelo et al., 2004: Leal et
al., 2010: Riquelme y Avendaño Herrera, 2003).
Todas estas investigaciones has surgido con el fin de mejorar los sistemas de
producción acuícola que presentan limitaciones como la cantidad de agua que se
requiere, los espacios donde serán desarrollados los cultivos y los volúmenes de
producción por área, pero recientemente se han incorporado los sistemas intensivos
en acuicultura los cuales aumentan la densidad de los organismos del cultivo,
disminuyen la utilización de agua y reducen el espacio, pero el alto número de
organismos genera en el sistema una rápida acumulación de materia orgánica de los
desechos del alimento y algunos compuestos inorgánicos tóxicos esto lleva a un
deterioro de la calidad del agua y poco aprovechamiento del alimento, para resolver
estos problemas de la calidad del agua se desarrolló la técnica de cultivo de Biofloc
(BFT) el cual se basa en el desarrollo y control de bacterias heterotróficas en los
sistemas de cultivo que forman un macroagregado que puede contener bacterias,
protozoos, zooplancton y otros microorganismos; este sistema ayuda en la remoción
de nutrientes produciendo biomasa microbiana la cual puede servir como alimento
reduciendo costos (Emerenciano, 2013).
8
2.-JUSTIFICACIÓN
Teniendo todo lo anterior como antecedente, el presente trabajo tiene como
finalidad evaluar la relación entre algunas de las microalgas autóctonas más
utilizadas en acuicultura con bacterias probióticas aisladas del tracto digestivo de
camarón, y determinar con ello la mejor forma de suministrarse y ser utilizados como
alimento para larvas de camarón. Una forma común y actualmente llevada a cabo es
la utilización de microalgas y probióticos en cultivos pero aplicados de forma
individual y directamente al agua de los cultivos. Este procedimiento aunque ha
mostrado su funcionalidad, podría mejorarse. Por lo que en éste trabajo se pretende
hacer una evaluación conjunta de los efectos de la interacción de microalgas y
bacterias probióticas orientadas a la formación de flóculos para mantener constante
la calidad del agua en cultivos de camarón y adicionalmente puedan llegar al tracto
digestivo del organismo y lleve a cabo funciones probióticas y proporcione una fuente
de nutrientes al llegar el flóculo (microalgas + bacterias) a su tracto digestivo.
3.-ANTECEDENTES
En la última década ha aumentado el interés en cultivos mixotróficos,
generándose importantes conocimientos al respecto. Curbelo et al, en 2006
realizaron el estudio titulado “Alimentación de las primeras postlarvas de camarón
Litopenaeus schmitto con una especie de diatomea bentónica”, con el cual se
demostró que la mayor supervivencia (68%) y el mayor incremento en peso se
lograba cuando se sustituía totalmente el alimento artificial con la diatomea Navicula
sp., el incremento en talla no fue significativo, pero si se observó una mejor calidad
de las postlarvas de camarón.
Otro experimento es el realizado por Naranjo et al., 1999 donde se evaluó el
efecto de diferentes microalgas en el desarrollo de larvas de camarón café esto bajo
condiciones controladas de temperatura y salinidad, Chaetoceros gracilis produjo la
mayor sobrevivencia (55%), seguida por la combinación de C. gracilis con Dunaliella
sp. (48%) y por último el tratamiento con más baja sobrevivencia fue donde se utilizó
de forma independiente a Dunaliella sp.
9
Otra alternativa para mejorar los cultivos como ya se mencionó son los
probióticos y esto se comprueba con la investigación realizada por Martínez Díaz y
Quiroz Guzmán en 2012, donde se desarrolló una tecnología usando
microorganismos probióticos la cual es capaz de producir millones de larvas de
camarón libres de patógenos y eliminación de la necesidad de los recambios de agua
durante el cultivo.
Jin ju y Kuan Fu en 2009, probaron el efecto probiótico de Bacillus fusiformis
en larvas de camarón blanco encontrando que dicha bacteria tiene la habilidad de
exclusión por competencia contra patógenos, mejora la sobrevivencia y acelera la
metamorfosis de las larvas y se determinó que el método óptimo de aplicación es de
105 UFC por mL-1 diariamente.
Schveitzer et al., en 2013, evaluaron el efecto de 3 diferentes niveles de
bioflocs (200 mg/L, 400-600 mg/L, y 800-1000 mg/L) en estanques de camarón
blanco en base a la concentración de sólidos suspendidos y se llegó a la conclusión
de que nivel intermedio 400-600 mg/L era el mejor ya que dio la mayor tasa de
sobrevivencia.
10
4.-OBJETIVO GENERAL
Evaluar la interacción mixotrófica entre microalgas marinas autóctonas y
bacterias probióticas en el proceso de formación de bioflocs específicos para uso en
acuicultura.
5.-OBJETIVOS PARTICULARES
Evaluar el crecimiento cuantificado de microalgas marinas interactuando con
una bacteria probiótica.
Evaluar el crecimiento poblacional de una bacteria probiótica mantenida en un
sistema de cultivo de microalgas.
Evaluar la eficiencia de la formación de flóculos generados mediante la
utilización de microalgas autóctonas y bacterias probióticas.
6.-HIPÓTESIS
Las bacterias ácido lácticas probióticas provenientes del tracto digestivo de
camarón blanco (Litopeneaus vannamei) tendrán una interacción mixotrófica positiva
con las microalgas marinas Grammatophora sp., Schizochytrium sp., y Chaetoceros
muelleri en ausencia y presencia de melaza.
11
7.-METODOLOGÍA
Reactivación de cepa probiótica
La obtención de la cepa probiótica se realizó en el Laboratorio de Ciencia y
Tecnología de Alimentos del Área de Conocimientos de Ciencias Agropecuarias
(AICA en la Universidad Autónoma de Baja California Sur (UABCS)) de la Colección
de BAL (Bacterias Ácido Lácticas) mantenidas a -85°C, de aquí se tomó uno de los
respaldos de la cepa probiótica (TD19 Lactobacillus plantarum y TD23 Lactobacillus
plantarum) aislada del tracto digestivo del camarón blanco (L. vannamei) para ser
reactivada. Para esto se obtuvo un respaldo del ultracongelador (a -85°C) y se
resembraron 100µl en placas de MRS (Anexo 1) usando la técnica de extensión en
superficie con varilla de vidrio. Posteriormente, se mantuvieron en incubación a 30°C
en jarras de anaerobiosis por un periodo de 24 a 48 horas (o más si es necesario).
Una vez que presentaron crecimiento las colonias, fue seleccionada la más aislada y
se resembro en placas de MRS usando la técnica de estría cruzada, y se dejó
incubar por 24 hrs bajo las mismas condiciones.
De las colonias recién formadas en las placas de MRS se tomó una colonia y
se inoculó en tubos de ensaye con 3ml de caldo MRS (Anexo 2) y se puso a encubar
en las condiciones ya mencionadas para las placas.
De la cepa recién activada en los tubos de ensaye se colocó una muestra de
10µl con una micropipeta en un porta objetos, se cubrió con un cubreobjetos y se
observó al microscopio de contraste de fases para determinar la morfología de las
células, y ser comparada con la morfología que se tiene en el registro inicial de
respaldo y comprobar que la nueva cepa corresponde a la misma y se encuentre
libre de contaminación biológica.
Y por último de los tubos con MRS se inoculó al 1% (30µl) en otros tubos con
caldo (en cada uno de los pasos donde se manipule la cepa se observara al
microscopio para asegurarse de que se conservaron los cultivos monoespecificos de
la bacteria probiótica).
12
Ya que se obtuvieron las cepas puras reactivadas y con las mismas
morfologías de los registros iníciales se preparó un nuevo stock de cepas, con los
cultivos de los tubos de ensaye, para esto se tomó 520μl de cada una de las cepas y
se colocó en microtubos de la marca eppendorf con 50% de glicerol al 80%, cada
una de las cepas se respaldó por triplicado, estos se homogenizaron, rotularon,
sellaron y guardaron en ceparios para posteriormente conservarse en el
ultracongelador a -85°C.
Cultivo de Microalgas
Las microalgas se obtuvieron de la Colección de Cepas del Laboratorio
experimental de Acuacultura en la Unidad Pichilingue de la UABCS. Estas cepas se
encuentran en el cuarto de cultivos en medio F/2 (Guillard, 1975) (Anexo 3) en tubos
de ensaye con 10ml del medio a una temperatura de 19°C y una iluminación
constante con lámparas incandescentes de luz de día. Adicionalmente, se
conservaron los respaldos de cepas en medio sólido conteniendo el medio de Agar
marino (Anexo 4). Para la recuperación de las cepas se partió del medio sólido,
utilizando la técnica de resiembra por estría simple con asa metálica, las cajas se
sellaron con parafilm, y se encubaron en el cuarto de cultivo a 22°C e iluminación
continua por un periodo de 6 días. Las microalgas utilizadas fueron Chaetoceros
muelleri (control) y las microalgas autóctonas: Grammatophora sp. Y Schizochytrium
sp., estas últimas cepas han sido aisladas de las costas de la Bahía de La Paz y han
presentado una buena composición bioquímica y aplicaciones como alimento vivo en
acuicultura en trabajos previos.
Una vez obtenido el crecimiento en las placas, estas se sometieron al proceso
de escalamiento el cual consiste en transferir una colonia a medio líquido y una vez
que alcance la densidad celular deseada (˃ 1000 000 cel mL-1) se continuo su
escalamiento a volúmenes progresivamente mayores cajas Petri-Tubo de ensaye-
Matraz Erlenmeyer de 150 ml-Matraz Erlenmeyer de 250 ml-Matraz Erlenmeyer de
500 ml-Garrafones de 19 L (Figura 1) para esto se utilizó agua de mar filtrada,
irradiada con luz ultravioleta y esterilizada en el autoclave a 121°C por 20 minutos a
una presión de 1.02 kg/cm-2.
13
Figura 1.- Proceso de escalamiento de microalgas.
14
Para evaluar la interacción el experimento se dividió en tres etapas, las
cuales se realizaron bajo condiciones naturales: con un fotoperiodo 12:12,
temperatura ambiente y aireación constante.
Etapa 1.-Selección de cepa microalga y de bacteria.
Para ver el efecto de las bacterias sobre las microalgas se seleccionaron
las cepas TD19 y TD23 (de acuerdo a información obtenida en una investigación
anterior) y se llevó a cabo un primer ensayo en dos matraces de 120ml en cada
uno de estos se colocó 100ml de agua de mar estéril y se les adiciono el medio
F/2, a uno de los matraces se le colocó 15ml del cultivo de la microalga
Grammatophora sp., y al otro 15ml de la microalga Schizochytrium sp., y para
ambos casos se les colocó 3ml de la cepa bacteriana TD23 centrifugada a una
concentración de 1x109 UFC/ml, para esto se tomaron 3ml de los tubos con caldo
MRS con la cepa reactivada como se mencionó en: 1.-Reactivación de cepa
probiótica y se colocaron en microtubos, se metieron a la centrifuga refrigerada a
25°C, 5,000 rpm por un periodo de 5min, se retiró el sobrenadante y se
resuspendió el pellet en 1ml de una solución buffer de fosfatos PBS para limpiar el
inóculo esto se realizó 2 veces, en el último lavado la cepa resuspendida en 3ml
de PBS y se añadió a los matraces con las microalgas.
En el segundo ensayo solo se intercambió la cepa bacteriana por la TD19
(en esta primera etapa no se utilizara la microalga C. muelleri ya que solo se
utilizara como control para la Etapa 2).
Estos cultivos se revisaron al microscopio y fueron registradas las uniones
microalga-probiótico mediante fotografías tomadas mediante el uso de un
microscopio OLYMPUS CX31 con el objetivo de 20X + 2.0.
Conteos Bacterianos
Posteriormente a esto, se realizó el recuento de Unidades Formadoras de
Colonia (UFC) en superficie y con ello comprobar que la cepa puede crecer en la
condiciones del cultivo de microalga, para esto se colocaron dos matraces ya con
el cultivo de Grammatophora sp., y Schizochytrium sp., y se les adicionó la cepa
15
que mejores resultados dio en la Etapa #1, en este caso se adicionaron 3ml de la
cepa centrifugada (sometiéndose al mismo proceso de lavado y resuspención ya
mencionado).
En cuanto se mezclaron las bacterias y microalgas los matraces se
homogenizaron y se tomaron 100µl que se colocaron en un microtubo con una
solución de 900µl de PBS para llevar a cabo diluciones seriadas desde 10-1 hasta
10-3 estas diluciones se sembraron en placas de MRS por extensión en superficie
al T0 con una cantidad de 100µl, estos cultivos se dejaran por un periodo de 24hrs
y se volvieron a realizar diluciones desde 10-1 hasta 10-5 sembrándose en placas
las ultimas 3 diluciones.
Etapa 2.-Interacción Microalga-Bacteria
Se llevaron a cabo tres tratamientos para evaluar el efecto que tienen las
bacterias probióticas en 3 especies de microalgas; Grammatophora sp.,
Schizochytrium sp., y C. muelleri (cultivo control) (Figura 3). Los cultivos de
microalgas se realizaron en el laboratorio BR2 (Bio Reactor 2) en la Unidad
Pichilingue de la UABCS.
El periodo de cultivo experimental de la primera etapa fue de ocho días, del
19 al 27 de Febrero de 2014, los tratamientos se mantuvieron a una temperatura
de 23.9°C con fotoperiodo 12:12.
16
La evaluación se realizó en garrafones de 19 l de capacidad (distribuidos al
azar), utilizando agua de mar filtrada hasta 1µm, pasada por luz ultravioleta y
clorada con hipoclorito de sodio a una relación de un mililitro de solución de cloro
comercial por litro de agua de mar, esto por 24 h. Para neutralizar el hipoclorito de
sodio, se utilizó tiosulfato de sodio a una relación de 0.05 gr por un mililitro de
cloro comercial utilizado. Para mantener en suspensión los cultivos, se utilizó
aireación constante, pasado por filtros de una micra y luz ultravioleta. Fueron
evaluados los ocho tratamientos que se muestra en la Figura 2. Cada tratamiento
presento tres repeticiones.
Figura 2.- Sistema de cultivo inicial. Primera etapa.
17
Para la siembra de estos a los garrafones se les bajo el nivel de agua a
17L, se enriquecieron con el medio F/2 el cual consistió en 17 ml de silicatos,
micronutrientes, macronutrientes y 8.5ml de vitaminas, además se les añadió un
inóculo de 350ml de un cultivo de microalga.
En cuanto al probiótico utilizado en esta etapa, se preparó un matraz de
300ml con caldo MRS y se inoculó al 1% con la cepa TD19 recién reactivada en
un cultivo en tubo de ensaye por toda la noche con un número inicial de células de
1x109 UFC/ml. Este cultivo del matraz se centrifugo por 30min a 2000 rpm en
frascos de 600 ml y se re suspendió en 300ml de agua de mar estéril, a cada uno
de los tratamientos con probiótico se les adicionó 20ml de la cepa.
Toma de muestras
El primer día de cultivo (Día 0) se tomaron muestras de todos los
tratamiento y sus réplicas en microtubos. Con estas muestras se realizaron
siembras en placas de MRS para los conteos de bacterias con un inóculo de 100µl
estos conteos se realizaron al inicio y final del experimento.
Figura 3.- Esquema de los tratamientos utilizados con las tres especies de microalga y la cepa bacteriana probiótica.
18
Una vez terminadas las siembras las muestras se fijaron con lugol para su
posterior registro fotográfico, adicionalmente se realizaron conteos de microalgas
por triplicado de cada una de las muestras usando la cámara de Neubauer
0.100mm Deep. De aquí se obtuvo el número de células por día con la siguiente
fórmula:
𝑥
8∗ 10000 = 𝑐𝑒𝑙/𝑚𝑙
X= Número de células totales en la cuadricula.
8= Número de cuadrantes de la cámara.
10,000= Diezmilésima parte de la muestra.
Estos datos se tomaron diariamente por ocho días y se graficaron
(tiempo/densidad) usando el programa Excel.
Etapa 3.-Interacción de la microalga-probiótico más una fuente de
carbono.
En esta parte del experimento se seleccionó como la mejor cepa de
microalga a Schizochytrium sp., y en este caso se le añadió a los tratamientos
melaza como fuente de carbono agregándola a los cultivos a una concentración de
2 g/m3 de agua (Figura 4), y con ello determinar si la melaza favorece al
crecimiento de las microalgas y las bacterias. El tratamiento de agua de mar
utilizada y el aire será llevado de la misma forma que la Etapa #2. En ésta etapa
se consideraron cinco tratamientos, que se muestran en la Figura 3. Cada
tratamiento presentó tres repeticiones.
19
Figura 4.-Esquema de los tratamientos utilizando una especie de microalga
con la misma bacteria probiótica y la melaza.
De cada uno de los tratamientos se realizó la 2.1.-Toma de muestras. Y se
registraron los parámetros de temperatura y oxígeno disuelto.
Formación de Bioflocs.
La medición del volumen del biofloc se realizó en tubos falcón de 15ml,
tomando una muestra de cada uno de los garrafones agitando bien antes de la
toma estos de dejaron sedimentar por 20 min y se midió el volumen final de los
flóculos a demás se realizó el registro fotográfico.
Prueba de presencia de Vibrio
Para verificar si los cultivos estaban libres de bacterias patógenas del
género Vibrio se realizó una pequeña prueba realizando resiembras en placas de
TCBS medio de cultivo selectivo para éstas bacterias, para esto se tomó una
muestra de cada uno de los cultivos y se resembraron 100µl en la placas usando
la técnica de extensión en superficie con varilla de vidrio.
Y una vez que se obtuvo el crecimiento se comparó con la literatura y se
determinó que posible grupo bacteriano se encontraba presente en los cultivos.
20
Análisis estadísticos
Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías en la etapa 3:
formación de los flóculos para la comparación entre los tratamientos y a través del
tiempo, utilizando el programa SigmaStat para Windows versión 3.5
21
8.-RESULTADOS
Etapa 1-Selección de la cepa de microalga y de bacteria.
Estos primeros cultivos de Microalgas-Bacterias se revisaron por una
semana y de ellos se obtuvo lo siguiente:
Grammatophora sp.-TD23 (L. plantarum): En este cultivo se observó como
la mayoría de las células se encontraban degradadas con daños físicos en la
frústula, sin una forma definida y también fue posible identificar células que
presentaban separación de la frústula como se observa en la Figura 5, donde la
epiteca e hipoteca de las células se encuentran separadas, a demás la célula
presento una pérdida de la pigmentación, mientras que el número de bacterias
seguía siendo alto observándose principalmente adheridas a los pequeños
fragmentos de las células rotas adicionalmente, se observa la perdida de
pigmentos en las células de Grammatophora sp.
Figura 5.-Células de la diatomea Grammatophora sp., mezcladas con las
bacterias de la cepa TD23 (bacilos) señaladas con la flecha negra. Aumento 20x + 2.0.
22
Schizochytrium sp.-TD23 (L. plantarum): Las células de esta microalgas se
observaron con una ligera pérdida de pigmentación, gran tamaño, formando
agregados y las bacterias estuvieron unidas a algunas células Figura 6. Este
cultivo se observó que la presencia de las bacterias fue en aumento.
Figura 6.- Células de Schizochytrium sp., con algunas de las bacterias de la cepa TD23 adheridas a las células. Aumento 60x + 0.8, las bacterias se encuentran señaladas con la flecha negra.
23
Grammatophora sp.-TD19 (L. plantarum): se presentó muy poco
crecimiento de la microalga, las células presentaron poca pigmentación y grandes
colonias bacterianas desplazando en proporción a la microalga (Figura 7).
Figura 7.- Se observa un par de células Grammatophora sp., con poca pigmentación y diversas bacterias de la cepa TD19 dispersas en la muestra. Aumento 20x + 2.0.
24
Schizochytrium sp.-TD19 (L. plantarum): En este caso se encontraron
colonias de microalga grandes, células con buena pigmentación y gran tamaño,
también fue posible identificar dos diferentes estadios de crecimiento uno en fase
móvil llamado zoospora y otro en el que se ve un pequeño agregado de células
llamado esporangio, el cual consiste en una célula madura en proceso de división
Figura 8.
En este primer ensayo Schizochytrium sp., fue la cepa de microalga más
resistente ante el contacto con ambas cepas de bacterias probióticas. Sin
embargo, con la cepa probiótica TD23 se observó una pequeña pérdida en su
pigmentación por lo cual se selecciona a la cepa TD19 L. plantarum para un
cultivo mixotrófico, ya que al estar en el cultivo de Schizochytrium sp., se observó
la aparición de nuevos estadios de crecimiento, signo evidente de que no
Figura 8.- Se muestran dos esporangio (flecha negra) y dos zoosporas (flecha roja) de Schizochytrium sp., además de las bacterias de la cepa TD19. Aumento 60x +
0.8.
25
presentaron inhibición de crecimiento poblacional, de acuerdo a la biología de éste
género.
Conteos Bacterianos
El número de las células bacterianas de la cepa TD19 que se adicionó a los
cultivos de microalga al inicio del experimento, y al realizar recuentos en placas al
inicio, presentaron las concentraciones que se muestra en la Tabla 1. Las placas
del cultivo inicial se muestran en la Figura 9 y las placas del cultivo a las 24 hrs en
la Figura 10.
Tabla 1.-Crecimiento del Probiótico en el cultivo de microalgas expresado en UFC/ml.
Tratamiento Tiempo 0 24 hrs
Grammatophora sp. incontables 0
Schizochytrium sp. 1.6x107 5.3x106
Figura 9.-Placas de MRS con las UFC de la cepa TD19 al Tiempo 0 (T0) de Schizochytrium sp.
26
Figura 10.-Placas de MRS con las UFC de la cepa TD19 a las 24 hrs de Schizochytrium sp.
Respecto al crecimiento del probiótico se observó que disminuyó la
concentración del probiótico de 107 a 106 UFC/ml en un tiempo de 24 hrs. Con
estos resultados se muestra que las bacterias pueden crecer con un buen número
de células en el sistema de cultivo de microalgas.
27
Etapa 2.-Interacción en cultivos mixotróficos Microalga-Bacteria
Considerando los resultados obtenidos en los análisis previos, fue
programada y obtenidos los resultados de ésta segunda etapa. Entre los aspectos
sobresalientes considerados, es el crecimiento favorable de la microalga
Schizochytrium sp., con la cepa probiótica identificada con la clave TD19.
Cultivos mixotróficos Chaetoceros muelleri. + Lactobacillus plantarum
El número inicial de células en el cultivo control de C. muelleri fue de
6,458.33 cel/ml y para el último día de cultivo (día 8) del experimento, el número
total de células fue de 1,577,083.33 cel/ml. en cuanto al cultivo experimental de C.
muelleri + TD19 el número de células inicial de 6,944.44 cel/ml y para el día 8 la
densidad celular total fue de 2,139,027.77 cel/ml.
En la Figura 11 se muestra el crecimiento de los dos cultivos de C. muelleri
con la línea de color gris oscuro se representa el cultivo control y la línea gris claro
el cultivo experimental, en la Figura 12 se observa la diferencia entre ambos
cultivos. De acuerdo a los datos registrados en ambos cultivo, los cultivos se
encontraban en la fase exponencial, sin presentarse la fase estacionaria en éste
tiempo.
28
Figura 11.- Crecimiento de Chaetoceros muelleri en el cultivo control (gris oscuro) y cultivo experimental (gris claro), mantenido en garrafones por 8 días. C.m (C. muelleri) y C.m +P (C. muelleri+ Probiótico).
0
500
1000
1500
2000
2500
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
De
nsi
dad
ce
lula
r (
#ce
l x 1
03/m
l)
Tiempo (Dias)
Chaetoceros muelleri
C.m C.m+P
29
Figura 12.- Cultivo de C. muelleri en forma individual y en combinación con
bacterias probióticas. Cultivo control (Ch) y experimental (Ch+P).
En la Figura 13, se presentan las imágenes de las células del cultivo control
de C. muelleri a lo largo de los días de cultivo. En ella se observa el buen estado
fisiológico, presentando su forma rectangular definida, color café y sus 4 setas
largas y completas, en la Figura 14 se observan las células del cultivo mixotrófico
de C. muelleri + Probiótico en esta caso algunas de las células tenían las setas
cortas y también se pueden ver las bacterias adheridas a la pared celular.
.
30
Figura 13.- Secuencia de imágenes del cultivo monoespecífico de C. muelleri.
31
Figura 14.- Secuencia de imágenes de cultivos mixotróficos con C. muelleri + L plantarum.
32
Cultivo mixotrófico Grammatophora sp. + Lactobacillus plantarum
El número inicial de células al día 0 en el cultivo control de Grammatophora
sp., fue de 3,958.33 cel/ml y para el día 8, final del experimento el número total fue
de 662,708.33 cel/ml. En cuanto al cultivo experimental de Grammatophora +
TD19 el número de células inicial de 2 902.77 cel/ml y para el día 8 final del
experimento el número total fue de 137,972.22 cel/ml, presentando una mayor
densidad celular, los cultivos sin bacterias probióticas.
El crecimiento de ambos tratamiento se encuentra representado en la
Figura 15 con la línea de color gris oscuro se representa el cultivo control y la línea
gris claro el cultivo experimental, de C. muelleri y probiótico. Este cultivo al igual
que el de C. muelleri se encontró en la fase exponencial de crecimiento, en la
Figura 16 se muestran los cultivos en garrafón de los dos tratamientos.
Figura 15.- Crecimiento de Grammatophora sp., en el cultivo control (gris oscuro) y cultivo experimental (gris claro), mantenido en garrafones por 8 días. Gr (Grammatophora sp) y Gr+P (Grammatophora sp +Probiótico)
.
0
100
200
300
400
500
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9De
nsi
da
d c
elu
lar
(#
cel x
103 /
ml)
Tiempo (Días)
Grammatophora sp.
Gr Gr+P
33
En la Figura 17 se muestra la secuencia de imágenes para el tratamiento de
Grammatophora sp., se puede observar que las células se encontraron formando
colonias grandes de color café en cuanto al cultivo mixotrófico de Grammatophora
sp., se observó que las bacterias probióticas se adherían a las células sanas y
posteriormente causan daño o ejercen un daño celular como se observa en la
Figura 18, el día 5.
Figura 16 Cultivo de Grammatophora sp., en forma individual y en combinación con
bacterias probióticas, cultivo control (Gr) y experimental (Gr+P).
34
Figura 17.- Secuencia de imágenes en cultivos monoespecíficos de Grammatophora sp.
35
Figura 18.- Secuencia de imágenes de cultivos mixotróficos de Grammatophora sp. + L plantarum.
36
Interacción mixotrófica Schizochytrium sp. + Lactobacillus plantarum
El número inicial de células al día 0 en el cultivo monoespecifico de
Schizochytrium sp., fue de 7,708.33 cel/ml y al final del experimento (día 8) la
densidad celular fue de 964,375 cel/ml. En cuanto al cultivo mixotrófico de
Schizochytrium sp. + TD19, la densidad celular inicial de las microalgas fue de
4,305.55 cel/ml y para el día 8 final del experimento el número total fue de 605,000
cel/ml. A partir del día 8 de cultivo, se observa una disminución de la
concentración celular en ambos cultivos (Figura 19), en donde se muestra con la
línea de color gris oscuro la cinética de crecimiento en el cultivo control y la línea
gris claro el cultivo experimental integrado por Schizochytrium sp., con probiótico
Los cultivos en garrafón se muestran en la Figura 20.
Figura 19.- Crecimiento de Schizochytrium sp., en garrafones por 8 días. Sc (Schizochytrium sp) (gris oscuro) y Sc+P (Schizochytrium sp +Probiótico) (gris claro).
0200400600800
1000120014001600
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Den
sid
ad c
elu
lar
(#c
el x
10
3 /m
l)
Tiempo (Días)
Schizochytrium sp.
Sc Sc+P
37
Figura 20.-Cultivo de Schizochytrium sp., en forma individual y en combinación con bacterias probióticas. Cultivo Schizochytrium sp., (Sc sp) y en combinación (Sc
sp+P).
Los cultivo de Schizochytrium sp., mostraron un desarrollo de acuerdo al
ciclo de vida que se reporta para éste género Figura 21, observándose un
incremento en el número de células que integran las colonias, en la Figura 22 se
encuentra la secuencia de imágenes del cultivo mixotrófico en el cual se puede
observar claramente la presencia de las bacterias probióticas alrededor de la
células de Schizochytrium sp.
38
Figura 21.- Secuencia de imágenes en cultivos monoespecíficos de Schizochytrium sp.
39
Figura 22.- Secuencia de imágenes en cultivos mixotróficos de Schizochytrium sp. + L plantarum.
40
El número de bacterias probióticas de los tres tratamientos experimentales
se encuentra registrado en la Tabla 2 se realizó un conteo inicial y uno final, y lo
que se presento es que las células disminuyeron para el final del experimento en
todos los tratamiento pero fue en los cultivos C. muelleri y Grammatophora sp.,
donde disminuyeron más.
Tabla 2.- Número inicial y final de células bacterianas probióticas.
Especie de microalga Día 0 UFC/ml Día 8 UFC/ml
Chaetoceros muelleri 947 23
Grammatophora sp. 947 15
Schizochytrium sp. 947 65
41
Etapa 3.-Interacción mixotrófica de la microalga-probiótico más una
fuente de carbono.
La microalga Schizochytrium sp., fue selecciona para probar su crecimiento
con la melaza como fuente de carbono, en el tratamiento de Schizochytrium sp.,
se registró un número inicial de células de 2, 500 cel/ml y al final la densidad
celular fue de 961,875 cel/ml, al comparar estos valores con los del tratamiento de
Schizochytrium sp+ Melaza el cual tuvo número inicial de 5,417cel/ml y final de
926,250 cel/ml, en esta comparación se encontró que a pesar de que el número
inicial del tratamiento de Schizochytrium sp., fue menor este al final del
experimento fue mayor que el tratamiento de Schizochytrium sp + Melaza, por su
parte el tratamiento de Schizochytrium sp + Probiótico+ Melaza tuvo un número
inicial de células de 2,917 cel/ml y al final la densidad celular fue de 1,391,250
cel/ml siendo este el tratamiento con mayor densidad celular y el tratamiento en el
que se dio la mejor formación de los bioflocs (Figura 24).
Figura 23.-Crecimiento Schizochytrium sp., sometido a tres diferentes condiciones experimentales. Sc (Schizochytrium sp), Sc +M (Schizochytrium sp+ Melaza) y Sc+ M+ P (Schizochytrium sp+ Melaza+ Probiótico).
0200400600800
1000120014001600
0 2 4 6 8 10
Den
sid
ad c
elu
lar
(#c
el x
10
3 /m
l)
Tiempo (Días)
Schizochytrium sp
Sc Sc+ M Sc+ M+ P
42
Figura 24.-Comparación de los cultivo de Sc sp. (Schizochytrium sp), Sc sp. +M (Schizochytrium sp+ Melaza), Sc sp.+ M+ P (Schizochytrium sp+ Melaza+ Probiótico) y P+M (Probiótico +Melaza).
43
Figura 25.- Secuencia de imágenes en cultivos monoespecíficos de Schizochytrium sp.
44
Figura 26.- Secuencia de imágenes en cultivos monoespecíficos de Schizochytrium sp. + Melaza.
45
Figura 27.- Secuencia de imágenes en cultivos mixotróficos de Schizochytrium sp + L plantarum + Melaza.
46
En la parte 2 del experimento se registró el número inicial de las bacterias
probióticas y el contenido de bacterias en el día 4 de cultivo (Tabla 3) ya que no se
presentó crecimiento en los días posteriores a este.
Tabla 3.-Número inicial y al día 4 de las células bacterianas probióticas.
Tratamiento Día 0 UFC/ml Día 4 UFC/ml
Schizochytrium sp+ Probiótico + Melaza 947 10
Probiótico + Melaza 1847 30
47
Formación de Bioflocs.
Los resultados obtenidos en la formación de bioflocs, muestran que a partir
del día 4 de cultivo se presenta la formación de los mismos. La medición del
volumen de los flóculos se realizó el día 4 del experimento y en la Figura 28 se
muestra como se realizó la medición de los flóculos, los datos obtenidos se
muestran en la Tabla 4, en esta parte se observó que el tratamiento formado por
Probiótico + Melaza tuvo un volumen final de 0.2 ml siendo este el menor volumen
de bioflocs registrado, mientras que el mayor volumen se encontró en el
tratamiento formado por Schizochytrium sp + Melaza+ Probiótico con un volumen
final de 2.5 ml. En la Figura 31 se muestra la comparación de los flóculos de los
cuatro tratamientos en la primera imagen se encuentra el tratamiento de
Schizochytrium sp., con un flóculo pequeño, seguido de este se encuentra el
tratamiento de Schizochytrium sp + Melaza donde el flóculo es más grande pero
poco compacto, en la tercer imagen esta Schizochytrium sp + Melaza+ Probiótico
en este tratamiento el flóculo es de gran tamaño y compacto y por último el flóculo
del tratamiento de Probiótico + Melaza el cual es de buen tamaño pero poco
compacto Al realizar el ANDEVA de dos vías (alfa de 0.05) para determinar las
diferencias en el volumen de los flóculos formados se obtuvo que entre (Factor 1)
tratamientos no existió diferencia estadísticamente significativa con una P= 0.938,
pero al comparar los datos en el tiempo (Factor 2) si existió un diferencia
estadísticamente significativa con una P=< 0.001.
48
Tabla 4.-Volumen Inicial y Final de los cuatro tratamientos.
Tratamientos Volumen Inicial (ml) Volumen Final (ml)
Schizochytrium sp 0 0.8
Schizochytrium sp + Melaza 0 0.8
Schizochytrium sp + Melaza+ Probiótico 0.7 2.5
Probiótico + Melaza 0.3 0.2
Figura 28.-Medición del volumen de Bioflocs en los diferentes tratamientos, AM (Agua de Mar), P+M (Probiótico+ Melaza), Sc (Schizochytrium sp), Sc+M (Schizochytrium sp+ Melaza) y Sc+ M+ P (Schizochytrium sp+ Melaza+ Probiótico).
En esta etapa se evaluó la variación del oxígeno disuelto y la temperatura
en el periodo experimental, en cuanto al oxígeno disuelto se encontró que la
menor concentración de éste, se obtuvo en el tratamiento experimental de
Schizochytrium sp. + Probiótico + Melaza con un valor de 6.37 ml/l el día 4 del
experimento. Mientras que la mayor concentración se encontró en el tratamiento
Schizochytrium sp. + Melaza con un valor de 8.19 ml/l el día 8, en todos los
tratamientos se encontró una variación en los niveles de oxígeno disuelto pero el
que se mantuvo más estable fue tratamiento control de Agua de mar Figura 29
49
En el caso de la temperatura el menor valor que se registro fue de 24.3 °C
en el tratamiento de Schizochytrium sp. +Melaza el día 2, y el mayor de 26.6 °C en
el tratamiento control de Agua de Mar y en el de Probiótico+ Melaza los días 3 y 4
respectivamente Figura 30.
50
24
24.5
25
25.5
26
26.5
27
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tem
pe
ratu
ra (°
C)
Tiempo (Días)
Temperatura
AM Sc P+M Sc+P+M Sc+M
6
6.5
7
7.5
8
8.5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Oxí
gen
o D
isu
elt
o (
mg/
l)
Tiempo (Días)
Oxígeno
AM Sc P+M Sc+P+M Sc+M
Figura 30.- Variación de la Temperatura en los diferentes tratamientos en un periodo de 8 días. AM (Agua de Mar), Sc (Schizochytrium sp.), P+M (Probiótico + Melaza), Sc+P+M (Schizochytrium sp+ Probiótico+ Melaza) y Sc+M (Schizochytrium sp+ Melaza).
Figura 29.- Variación del oxígeno disuelto en los diferentes tratamientos en un periodo de 8 días. AM (Agua de Mar), Sc (Schizochytrium sp.), P+M (Probiótico+Melaza), Sc+P+M (Schizochytrium sp+ Probiótico+ Melaza) y Sc+M (Schizochytrium sp+ Melaza).
51
Figura 31.-Comparación del tamaño de los bioflocs en los diferentes tratamientos. Sc sp. (Schizochytrium sp.), Sc sp. +M (Schizochytrium sp+ Melaza Sc sp +P + M (Schizochytrium sp+ Probiótico+ Melaza) y P+M (Probiótico + Melaza).
52
9.-DISCUSIÓN
Etapa 1-Selección de cepa de la cepa de microalga y de bacteria.
Las cepas bacterianas seleccionadas para este trabajo fueron identificada
en una investigación anterior de tesis en publicación por Cota Sánchez como
(TD23) Lactobacillus plantarum y (TD19) Lactobacillus plantarum esta es una
bacteria ácido láctica (BAL) anaeróbica facultativa que pueden crecer tanto en
presencia y ausencia de oxígeno. Sin embargo, en el trabajo mencionado se
utilizaron como una evaluación probiótica a diferencia del trabajo aquí realizado,
en donde además de buscó la capacidad de formación de bioflocs.
Al inicio de éste trabajo fue necesario determinar el efecto del cultivo
mixotrófico Bacteria probiótica-microalga, con el fin de realizar una selección de la
cepa de bacteria. Al someter al cultivo de la diatomea Grammatophora sp., a las
bacterias probióticas TD23 y TD19, se observó que la diatomea presento daños
físicos en la frústula, perdida de pigmentación y encontrándose la mayoría de las
bacterias en los pequeños fragmentos de las células rotas, Riquelme et al. (1987)
sugiere que este aumento bacteriano se produce por la utilización del fitoplancton
muerto y detritus, tal efecto ha sido posible observarlo en anteriores
investigaciones y es conocido como “Antagonismo Bacteriano”, en donde algunas
bacterias tienen la capacidad de provocar la inhibición y lisis de células algales
debido a la secreción de productos extracelulares, tal efecto pudo presentarse de
igual manera en el cultivo de Schizochytrium sp., en combinación con la cepa
TD23, ya que también fue posible observar gran cantidad de bacterias en el medio
y pocas células de la microalga (Riquelme y Avendaño herrera, 2003).
Adicionalmente, los diferentes compuestos celulares pueden ser utilizados por las
bacterias.
Por otro lado al someter al cultivo de Schizochytrium sp., a la cepa TD19 el
cultivo no presento ningún daño por el contrario se observaron células grandes,
con buena pigmentación y formando grandes colonias a pesar de estar rodeadas
de las bacterias probióticas, además se logró identificar dos diferentes estadios de
crecimiento el cual fue considerado como signo evidente de que no se presentó
53
inhibición de crecimiento poblacional, esta interacción positiva entre los
organismos ha sido identificada como “mutualismo”, Riquelme y Avendaño-
Herrera, 2003 sugieren que es debido a los productos extracelulares del
fitoplancton que puede estimular la proliferación de algunas bacterias, estudios
recientes han demostrado que tal interacción positiva se rompe cuando existen
condiciones limitantes de nutrientes (Aota & Nakajima 2001).
Conteos Bacterianos
Para realizar el recuento en placas de MRS se realizaron unos nuevos
cultivos de 100 ml de microalgas y a los 3 días de edad se realizó la mezcla con
las bacterias, lapso en el cual la mayoría de los nutrientes fueron consumidos por
las microalgas, este factor pudo influir en la ausencia total de las bacterias en el
cultivo de Grammatophora sp., a las 24hr pero esto no afectó al de Schizochytrium
sp., ya que a las 24 hr de cultivo se contabilizaron un total de 5.3x106 UFC/ml,
corroborando así la presencia de las bacterias probióticas cepa TD19 en el
tratamiento. Ambos efectos son sugeridos por los estudios de Riquelme y
Avendaño-Herrera, 2003 y Aota y Nakajima 2001.
Etapa 2.-Interacción en cultivos mixotróficos Microalga-Bacteria
En cuanto al crecimiento de C. muelleri el tratamiento experimental de C.
muelleri + TD19 presentó una mayor densidad celular en comparación con el
tratamiento control el número de células finales fue de 2,139,027.77 cel/ml, pero
este aumento solo se presentó en la microalga ya que se vio reducido el
crecimiento de la bacteria cepa TD19 de 947 a 23 UFC/ml, tal inhibición del
crecimiento bacteriano se pudo dar por el efecto de “Antagonismo microalgal” muy
frecuente en el género Chaetoceros, en este caso la microalga es capaz de
producir sustancias antibacteriana y se ha determinado que estas sustancias se
producen por la combinación de algunos ácidos grasos (Naviner et al. 1999),
Kellam et al. (1988) señalan que ácidos grasos con más de 10 átomos de carbono
en su estructura inducen a la lisis del protoplasto bacteriano.
54
A pesar de que el tratamiento control tuvo menor número de células en el
cultivo estas presentaron un mejor estado fisiológico en comparación con el
tratamiento de C. muelleri + Probiótico Figura 13 y Figura 14.
En los cultivos de Schizochytrium sp., fue común encontrar diferentes
estadios de crecimiento (zoosporas y esporangios) según la literatura para orden
Traustochytriales estos es posible observarlos cuando se encuentran en un ciclo
asexual la célula joven aumenta su tamaño y dentro de ella experimenta divisiones
nucleares. El protoplasto se cliva progresivamente la pared celular empieza a
deshacerse, liberando las células móviles llamadas zoosporas, las cuales buscan
un sustrato donde fijarse, y crecen para formar una nueva célula vegetativa joven
(Darley et al 1973).
Con estas características encontradas en el cultivo de la microalga fue
posible determinar que este se encontraba en buenas condiciones, además solo
en este cultivo las bacterias probióticas permanecieron por más tiempo en el
medio de cultivo a comparación con el de las diatomeas Grammatophora sp., y C.
muelleri., este efecto puede deberse a lo mencionado por Darley et al. 1973
quienes al realizar un estudio de la composición de la pared celular encontraron
que su composición química es inusual pero se ha encontrado a L-galactosa como
el carbohidrato mayoritario en dos especies Schizochytrium aggregatum y
Thraustochytrium motivum, este compuesto pudo ser favorable para las bacterias
ya que la galactosas en un azúcar simple al igual que la glucosa y esta última es el
principal componente que se utiliza para elaborar el medio de cultivo MRS que es
para bacterias ácido lácticas.
Etapa 3.-Interacción mixotrófica de la microalga-probiótico más una
fuente de carbono.
En esta parte del experimento también se observó un decremento en el
número de UFC de la cepa TD19 en el medio de cultivo para el tratamiento
Schizochytrium sp+ Probiótico + Melaza al día 0 se contabilizaron 947 UFC/ml y al
día 4 solamente 10 UFC/ml, en el tratamiento Probiótico + Melaza al día 0 1847
UFC/ml y al día 4, 30 UFC/ml, estos resultados no fueron lo esperado ya que se
55
sabe que esta bacteria es capaz de utilizar la fuente de carbono para un buen
crecimiento y convertir los azúcares en ácido láctico o alcohol (heterofermentativo)
como lo menciona Ossa et al 2010 quien evaluó las condiciones óptimas de
crecimiento para L. plantarum utilizando la melaza sus resultados indicaron que el
tratamiento permitió el máximo crecimiento de este microorganismo. La afición de
la fuente de melaza fue sugerida por (Lara Anguiano, 2011)
Además de esto otro factor que pudo influir en esta etapa donde se utilizo
solo a la microalga Schizochytrium sp., es que ésta tienen la capacidad de
cambiar su metabolismo de autótrofo a heterótrofo (mixotrófica) puede tomar la
energía de sustancias orgánicas simples sin requerir de la luz para su crecimiento
en este caso la melaza le sirvió de fuente de energía y pudo provocar una
competencia por el sustrato entre la microalga y la bacteria (Hakim, 2012). Esos
resultados indican que la adición de las bacterias probióticas a un sistema de
cultivo algal, puede tener diferentes resultados en la cinética de crecimiento de las
microalgas. La utilización de Grammatophora sp., bajo la condición mixotrófica con
las bacterias probióticas aquí evaluadas (TD19) presenta un crecimiento
antagónico, a diferencia de la utilización de Schizochytrium sp., en donde se vio
favorecido el crecimiento en presencia de melaza, y adicionalmente favorecido al
ser mantenido en presencia del probiótico mencionado. Aunque en éste trabajo no
se determinó la generación de vitaminas, glucoproteínas y otros compuestos
activos, se tiene reportada la generación de diversos compuestos promotores de
la relación simbiótica entre bacterias y ciertas microalgas (Maruyama et al., 1989;
Suminto y Hirayama, 1997). Las microalgas excretan algunas fuentes de carbón
(material orgánico extracelular derivado de la fotosíntesis) u otros productos que
estimulan la síntesis de DNA en bacterias (Natrah et al., 2013). Por otro lado,
estas mismas bacterias pueden inhibir o dañar algún tipo de microalgas como se
observo en este trabajo, por lo que para poder llegar a comprender éste tipo de
interacción microalga-bacterias y sus efectos fisiológicos, son necesarios trabajos
adicionales.
56
Formación de Bioflocs.
La tecnología biofloc en sistemas de cultivo es de reciente interés en
camaronicultura y para el cultivo de otras especies. La duración del tiempo de
maduración o formación del biofloc puede variar en función de diversos factores:
temperatura del sistema, oxígeno, relación de C:N, carga bacterianas y
microalgas. En éste trabajo y bajo las condiciones aquí descritas, se observó que
a partir del día 4 de cultivo presentó un grado de madurez (formación de
bioflóculos). De las diferentes condiciones experimentales para la formación de
bioflocs, el tratamiento formado por Schizochytrium sp + Melaza+ Probiótico fue el
que presentó el mayor volumen de flóculos al final del experimento. Al realizar los
conteos de las bacterias probióticas se encontró que en los tres tratamientos el
número de células por militros disminuyo con respecto al número inicial del inóculo
pero estos números no concuerdan con lo observado al microscopio ya que al
tomar las fotografías era posible observar las bacterias adheridas a las células de
la microalga lo que ocurrió en esta parte es que al tomar las muestras solo se
tomaba de la columna de agua para hacer las siembras en el medio MRS y no de
las muestras de los flóculos. Con esto además se comprobó que la bacteria es
capaz de permanecer adherida a la microalga (flóculo) lo cual se espera de
mejores resultados al ser ingeridas por los organismos. Este tipo de asociación
microalga-bacteria ha sido aprovechada para la floculación y cosecha de
microalgas (Lee et al., 2013).
Los 3 tratamientos experimentales (Schizochytrium sp + Melaza,
Schizochytrium sp + Probiótico+ Melaza y Probiótico + Melaza) mostraron una
disminución muy marcada en los niveles de oxígeno disuelto en los dos días
posteriores al que se le agrego la segunda dosis de melaza a los cultivos (día 4)
alcanzando valores mínimos de 6.39 mg/L. Estos cambios se pueden atribuir al
incremento en el consumo de alimento por las microalgas (Schizochytrium sp.,
heterotrófica) que se encontraban en su fase exponencial de crecimiento ya que
en esos días se registró el mayor número de células de microalga en los conteos y
un aumento en la concentración bacterias en el sistema 30 UFC en el tratamiento
melaza + probiótico y 10 UFC/ml en el tratamiento de Schizochytrium+ Probiótico +
57
Melaza, estos valores se vieron reducidos a cero en los conteos posteriores a
estos (Poleo et al. 2011). Además de lo anterior, la disminución de la
concentración de oxígeno disuelto se asoció a el incremento de concentración de
bacterias después de la adición de ración de melaza, estos resultados nos hace
predecir lo que mencionan otros autores (Natrah et al. 2013; Hargreaves, 2013).
En éste trabajo se presentaron concentraciones de oxigeno superiores 6 mg/L,
que son los recomendados para los sistemas de biofloc que permitan problemas
de hipoxia a causa de la disminución de oxígeno a causa de la concentración de
bacterias probióticas y microalgas (Hargreaves, 2013).
El género Lactobacillus tiene acción inhibidora, ya sea por la competencia
para la producción de hidrógeno o la producción de peróxido de hidrógeno de los
ácidos orgánicos, tales como el ácido láctico o el ácido acético que inhiben el
crecimiento de muchas bacterias Gram-negativas patógenas (Gatesoupe, 2008).
El trabajo previo realizado por Vieira et al. (2007) mostraron que L. plantarum tiene
capacidad inhibidora in vitro e in vivo contra Vibrio spp. Tal efecto fue posible
observarlo en el presente estudio ya que al realizar una evaluación de presencia
de Vibrio en placas con medio TCBS a medio experimento, esta dio positivo a
Vibrio. Esta evaluación fue realizada después de un evento inusual de incremento
de viento al exterior del laboratorio, presentándose ingreso de diferentes partículas
a través de la toma de aire del sistema de aireación (Blower). Considerando lo
anterior, en los resultados obtenidos en el tratamiento experimental de
Schizochytrium sp. + Probiótico + Melaza se encontró una menor carga
bacteriana, y al final del experimento la prueba dio negativo para la presencia de
Vibrio. Con estos resultados se comprueba la inhibición de bacterias del genero
Vibrio con el sistema biofloc aquí presentado. Estos resultados son comprables a
los obtenidos por otros autores (Crab et al 2010; Natrah et al., 2013) quienes
encontraron que los biflocs pueden presentar actividad de biocontrol contra
infecciones bacteriana, tanto algunas bacterias como ciertas microalgas, pueden
presentar actividad antimicrobial mediante la generación de diferentes
compuestos. Entre los resultados relevantes, se puede mencionar que los
58
sistemas bioflocs pueden controlar las infecciones de Vibrio harveyi sin la
necesidad de secretar sustancias inhibitorias de crecimiento.
El oxígeno disuelto (OD) mostró cambios durante el transcurso del
experimento registrándose inicialmente valores de 6.77 a 7.19 mg/L, el monitoreo
de este parámetro es importante en la formación de los flóculos ya que es esencial
para la actividad metabólica de las células, asimismo se cree que existe una
tendencia hacia flóculos más grandes y compactos en concentraciones altas de
oxígeno como lo mencionan Wilen y Balmer, 1999., este comportamiento no se
presentó en este caso ya que el tratamiento de Schizochytrium sp + Melaza+
Probiótico fue el que presentó los flóculos más grandes y compactos pero también
se registró que éste tuvo la menor concentración de oxígeno (6.37 mg/l ) durante
el periodo de experimentación. Esta discrepancia es atribuida a la demanda de
oxigeno por la alta concentración de bacterias, y que es requerido para las
actividades metabólicas en bacterias (Vinatea et al., 2009) y en este caso la carga
de microalgas.
El otro parámetro monitoreado fue la temperatura el cual se ha demostrado
tiene influencia en la formación de los flóculos afectando su morfología y
resistencia. Wilen el at (2000) encontraron que la desfloculación ocurre a
temperaturas bajas de 4°C, lo cual se puede deber a que existe una disminución
de la actividad microbiana del biofloc, pero las temperatura muy alta de 30-35°C
tampoco son recomendables ya que el floculo pierde estabilidad por la excesiva
producción de polisacáridos extracelulares por lo cual lo recomendable es una
temperatura intermedia de 20-25°C ya que es posible obtener flóculos estables, en
este trabajo los cultivos se encontraron a una temperatura de 24-26°C intervalo
que se encuentra muy cercano al recomendado anteriormente por Schryver, et al
(2008).
59
10.-CONCLUSIONES
La asociación de Schizochytrium sp. + Probiótico (Lactobacillus) en
el cultivo mixto presentó una interacción positiva viéndose favorecido
el crecimiento de la microalga.
Se observó la adhesión celular de la bacteria (Lactobacillus) en la
microalga Schizochytrium sp.
Se propone el cultivo mixotrófico de Schizochytrium sp. + Probiótico
+ Melaza, para la formación de bioflocs específicos.
11.-RECOMENDACIONES
Determinar la ración adecuada de melaza en el sistema de cultivo.
Determinar un mejor método para el conteo de bacterias adheridas a
las células de Schizochytrium sp.
Determinar la composición bioquímica del Biofloc específico
generado.
Escalar el sistema mixotrófico con camarón integrado u otras
especies.
60
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67
13.-ANEXOS
Anexo 1
Medio de cultivo MRS
Nombrado así por las iníciales de Man, Rogosa y Sharpe quienes fueron los
que desarrollaron el medio, el cual sirve para el aislamiento, cultivo y enumeración
de Lactobacilos y bacterias ácido lácticas (BAL).
Contenido:
Composición Concentración del medio
Mezcla de peptona 18.0 g/litro
Extracto de levadura 4.0 g/litro
Glucosa 20.0 g/litro
Tween 80 1.0 g/litro
Fosfato dipotasio de hidrógeno 2.0 g/litro
Citrato triamonio 2.0 g/litro
Acetato de sodio anhídro 3.0 g/litro
Sulfato de magnesio 7H2O 0.2 g/litro
Sulfato de magnesio anhídro 0.034 g/litro
Agar 12.0 g/litro
pHfinal: 6.2±0.2
68
Anexo 2
Medio de cultivo Caldo MRS.
Contenido:
Composición Concentración del medio
Proteosa peptona 10.0 g/litro
Extracto de carne 8.0 g/litro
Extracto de levadura 4.0 g/litro
Glucosa 20.0 g/litro
Monoleato de sorbitán 1 ml
Fosfato dipotásico 2.0 g/litro
Acetato de sodio 5.0 g/litro
Citrato de amonio 2.0 g/litro
Sulfato de magnesio 0.2 g/litro
Sulfato de maganeso 0.05 g/litro
pH final: 6.4±0.2
69
Anexo 3
Composición del Medio de cultivo F/2
Medio de cultivo F/2 de Guillard (1975) utilizado para el cultivo de
microalgas.
Contenido:
Composición Concentración del medio
Nitrato 75.0 g/litro
Fosfato 5.0 g/litro
Silicato 30.0 g/litro
FeCl3.6H2O 3.5 g/litro
Na2EDTA 4.36
Disuelta en 900 ml de agua destilada.
Añadir 1 ml de cada una de las siguientes soluciones de metales traza
Composición Concentración del medio
CuSO4.5H2O 0.98 g por 100 ml
ZnSO4.7H2O 2.20 g por 100 ml
CoCl2.6H2O 1.00 g por 100 m
MnCl2.4H2O 18.00 g por 100 ml
Na2MoO4.2H2O 0.63 g por 100 ml
Añadir 1 ml por litro de las soluciones anteriores
Composición Concentración del medio
Vitaminas
Biotina 1.0 mg/litro
B12 1.0 mg/litro
Tiamina HCL 20.0 mg/litro
Disolver todas las concentraciones en 1 L de agua destilada y posteriormente
congelar, por cada litro de agua de mar añada ½ litro de solución de vitaminas.
70
Anexo 4
Medio de cultivo Agar Marino
Medio de cultivo usado para cultivar bacterias marinas heterotróficas
Contenido:
Composición Concentración del medio
Peptona 5.0 g/litro
Extracto de levadura 1.0 g/litro
Citrato férrico 0.1 g/litro
Cloruro de sodio 19.45 g/litro
Cloruro de magnesio 8.8 g/litro
Sulfato de sodio 3.24 g/litro
Cloruro de calcio 1.8 g/litro
Cloruro potasio 0.55 g/litro
Bicarbonato de sodio 0.16 g/litro
Bromuro de potasio 0.08 g/litro
Cloruro de estroncio 34. 0 g/litro
Ácido bórico 22.0 g/litro
Silicato de sodio 4.0 g/litro
Floruro de sodio 2.4 g/litro
Nitrato de amonio 1.6 g/litro
Fosfato disodico 8.0 g/litro
Agar 15.0 g/litro
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