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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS

FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DOS AGENTES DA CRIPTOCOCOSE E PERFIL

DE SUSCEPTIBILIDADE ANTIFÚNGICA DE ISOLADOS CLINICOS OBTIDOS EM

UM CENTRO DE REFERÊNCIA NO AMAZONAS

DIEGO FERNANDO SILVA ROCHA

MANAUS

2017

i





Orientador: Prof. Dr. João Vicente Braga de Souza

Co-orientadora: Profᵃ Dra Luciana Trilles

MANAUS

2017

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas, em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas

ii

FICHA CATALOGRÁFICA

R672e Rocha, Diego Fernando Silva.

Epidemiologia molecular dos agentes da criptococose e perfil de

susceptibilidade antifúngica de isolados clínicos obtidos em um

centro de referência no Amazonas./Diego Fernando Silva Rocha. --

Manaus : Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de

Medicina Tropical, 2017.

xvi, 108f. : il.

Dissertação (Mestrado) apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas – UEA/FMT, 2017.

Orientador: Prof. Dr. João Vicente Braga de Souza

Co-orientadora: Profa. Dra. Luciana Trilles

1.Cryptococcus neoformans 2.Cryptococcus gattii 3.Epidemiologia molecular 4. Susceptilidade antifúngica. Título.

CDU: 614.4(811.3)

Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária Maria Eliana N Silva, lotada na Escola

Superior de Ciências da Saúde - UEA

iii

FOLHA DE JULGAMENTO





“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças

Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação

em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a

Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”.

Banca julgadora:

Presidente

Membro

Membro

iv

AGRADECIMENTOS

À Deus por sua infinita graça, bondade e misericórdia manifestadas pelo seu

amor que excede as barreiras da nossa capacidade compreensiva. Obrigado por ter

preparado o caminho, por ter cuidado de cada detalhe com tanta perfeição, pela vida,

força e saúde doados para que eu tivesse o privilégio de vivenciar momentos tão

maravilhosos e de ter conhecido pessoas que foram essenciais para que eu pudesse

hoje estar escrevendo essas palavras de gratidão na minha dissertação de mestrado.

Tudo é teu Senhor Deus!

À toda a minha família pelo amor demonstrado a cada dia e pela preocupação

constante com o meu bem-estar. Reconheço e serei eternamente grato pelo esforço

dos meus pais e avós em proporcionar um ambiente familiar saudável e favorável aos

estudos.

Ao Dr. João Vicente Braga de Souza, meu querido orientador e pai científico

que me acompanha desde o PIBIC e por quem tenho um profundo respeito e

admiração. Sou grato pela sua expressiva contribuição na minha formação acadêmica

e profissional, por cada palavra de incentivo, críticas, elogios e pelos desafios. Me

sinto abençoado em tê-lo como conselheiro, por saber que ele sempre enxerga e

acredita no melhor de cada um e principalmente pelo seu esforço contínuo em criar

uma relação de amizade com seus alunos e um ambiente de trabalho e estudo

harmônicos.

À minha co-orientadora Dra. Luciana Trilles por ter aceitado a parceria neste

projeto, pela ajuda com as reações de sequenciamento de DNA que foram essenciais

para a produção de resultados de qualidade e principalmente por ter me acolhido de

forma tão cordial e atenciosa na sua residência e no Laboratório de Micologia da

Fiocruz durante a minha estadia no Rio de Janeiro para que eu pudesse aprimorar o

meu conhecimento nas metodologias desenvolvidas durante esta pesquisa.

À Dra. Rossicléia Lins Monte, gerente do Laboratório de Bacteriologia da FMT-

HVD e demais funcionários pela parcela de contribuição na produção dos dados

utilizados nesta pesquisa, assim como pela oportunidade de estágio realizado durante

os anos de 2011 a 2013 ainda durante a minha graduação. Agradeço a Ana Carolina

pela indicação, a Luiza Mara e Andrea Espara pelos ensinamentos e pela amizade.

v

Esta experiência foi importante para o meu amadurecimento e decisiva nas minhas

escolhas profissionais.

À Dra. Kátia Santana Cruz, Dra. Carla Silvana Silva Santos, aos técnicos do

Laboratório de Micologia da FMT-HVD e em especial aos alunos Lizandra e João

Ricardo pelo acolhimento, atenção, ajuda no levantamento de dados e no

armazenamento das cepas fúngicas e principalmente pelo excelente serviço de

diagnóstico prestado aos pacientes que foram o alvo deste estudo. Sem a participação

de vocês essa pesquisa não teria sido realizada.

Aos amigos do Laboratório de Micologia do INPA pelos conhecimentos

transmitidos, pela companhia diária, por cada momento de descontração e pelo apoio

emocional e psicológico. Dedico meus agradecimentos em especial à Silviane

Pinheiro e à Lucyane Mendes pelo auxílio nos experimentos laboratoriais.

Aos colegas da turma de mestrado pela companhia e parceria nas atividades

realizadas para o cumprimento dos créditos, pelas sugestões durante os seminários

de avaliação dos projetos e pela riquíssima troca de conhecimentos e experiências

profissionais. E não poderia esquecer de agradecer pelo carinho das minhas amigas

Arlene Pinto e Regina Nelson que foram um presente de Deus.

Agradeço a FMT-HVD pelo incentivo a pesquisa, pela estrutura fornecida, aos

servidores e principalmente aos médicos que geraram dados clínicos de extrema

relevância. E também aos pacientes e familiares que concordaram em participar deste

estudo.

Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) por conceder as

condições e estrutura laboratorial para a realização dos experimentos e em especial

ao Dr. Maurício Ogusku, líder do nosso grupo de pesquisas pelo apoio com os

equipamentos laboratoriais.

À Universidade do Estado do Amazonas (UEA) e ao Programa de Pós-

Graduação em Medicina Tropical (PPGMT) pela oportunidade e pelos serviços

prestados sempre de forma organizada e buscando a excelência. E aos órgãos de

fomento: FAPEAM, SUFRAMA, CAPES e CNPq pelos incentivos essenciais a

manutenção do PPGMT e das atividades de pesquisas.

vi

DECLARAÇÃO DAS AGENCIAS FINANCIADORAS

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de pesquisa e pelos recursos destinados a treinamento por meio do projeto Pró-Amazônia (N. 047/2012).

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) pelo

financiamento desta pesquisa (Edital PPSUS 007/2009).

vii

RESUMO

A investigação da diversidade genética dos agentes da Criptococose contribui para

um melhor entendimento da epidemiologia molecular desta micose e dos mecanismos

evolutivos de seus patógenos. A utilização do MLST para esses fins tornou-se uma

tendência atual devido às vantagens discriminatórias e pela sua aplicabilidade

filogenética que permite a distinção entre genótipos pela identificação de alterações

nucleotídicas, favorecendo análises mais específicas da associação dos mesmos com

fatores clínicos e de virulência. Tal ferramenta tem sido pouco explorada em

investigações regionais que foram limitadas ao estudo de cepas de C. gattii e que

apontaram para a presença de genótipos emergentes no ambiente amazônico.

Objetivos: utilizar o MLST para determinar os subtipos (STs) de cepas clínicas,

principalmente os de C. neoformans, para definir se há diversidade e correlação com

aspectos clínicos, assim como situar os isolados regionais no contexto global.

Materiais e métodos: dados foram coletados com o objetivo de descrever o cenário

epidemiológico atual da doença e o perfil de susceptibilidade antifúngica dos isolados

também foi investigado como medida de vigilância. Um total de 38 isolados foram

reativados da coleção de fungos da FMT-HVD, sendo relativos a 30 pacientes

diagnosticados de Fevereiro de 2014 a Maio de 2016, cujos prontuários foram obtidos

pelo sistema de prontuário eletrônico desta fundação. Os genótipos foram definidos

inicialmente por PCR-RFLP do gene URA5 em seguida por MLST com ajuda de banco

de dados internacional. A relação entre os genótipos da população foi avaliada pelo

algoritmo goeBURST no software Phyloviz. A microdiluição em caldo RPMI foi

utilizada para determinar a CIM da Anfotericina B (ANF), Fluconazol (FLZ) e

Itraconazol (ITZ) conforme recomendações da CLSI. Resultados: foi observado que

os pacientes com HIV (n=26) foram acometidos exclusivamente por isolados VNI

(n=34), enquanto que o tipo VGII (n=4) foi identificado em pacientes sem HIV (n=4).

O ST93 foi identificado como o mais prevalente (n=33; 93%) dentre as cepas VNI e

este é um indício de que no Amazonas este tipo molecular apresenta baixa

variabilidade intragenotípica. Constatou-se que o ST93 é endêmico na nossa região

assim como na Ásia, África e sudeste do Brasil e que o mesmo apresenta uma estreita

semelhança genética com o ST32. Dentre as 4 cepas de C. gattii, três STs (ST5,

ST172 e o novo ST445) foram identificados, confirmando o potencial de diversificação

e variabilidade genética de isolados VGII. O ST445 distingue do ST128 em três lócus

(LAC1, PLB1, SOD1), sendo ambos de origem exclusivamente brasileira. Todas as

cepas foram sensíveis aos antifúngicos, apesar dos isolados de C. gattii terem

apresentado médias geométricas quatro vezes mais elevadas para os azólicos, sendo

duas cepas ST172 as que apresentaram a CIM mais elevada para o FLZ. Conclusão:

no Amazonas os pacientes com HIV são acometidos por cepas de C.neoformans VNI

que compõem um grupo geneticamente homogêneo, o que não se observa entre as

cepas de C. gattii. Esta estruturação genética identificada na nossa região dificulta o

estabelecimento de correlações entre os subtipos com fatores clínicos. A anfotericina

B e os azólicos continuam sendo alternativas viáveis para o tratamento.

Palavras-chave: Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, genótipos,

epidemiologia molecular, susceptibilidade antifúngica.

viii

ABSTRACT

The genetic diversity investigation of the cryptococcosis agents contributes to a better understanding of the molecular epidemiology of this mycosis and the evolutionary mechanisms of their pathogens. The use of MLST for these purposes has become a current trend due to the discriminatory advantages and its phylogenetic applicability that allows the distinction between genotypes by the identification of nucleotide alterations, favoring more specific analyzes of their association with clinical and virulence factors. This tool has been little explored in regional investigations that were limited to the study of C. gattii strains and that pointed to the presence of emergent genotypes in the Amazonian environment. Aims: use the MLST to determine the molecular subtypes (STs) of clinical strains, especially those of C. neoformans, to define if there is diversity and correlation with clinical aspects, as well as to situate the regional isolates in the global context. Materials and methods: data were collected with the aim of describing the current epidemiological scenario of the disease and the antifungal susceptibility profile of the isolates was also investigated as a surveillance measure. A total of 38 isolates were recovered from the FMT-HVD fungi collection, being related to 30 patients diagnosed from February 2014 to May 2016, whose records were obtained by the idoctor system of this foundation. Genotypes were initially defined by URA5-RFLP followed by MLST analyses in an international database. The relation between the genotypes of the population was evaluated by the algorithm goeBURST in Phyloviz software. The microdilution in RPMI broth was used to determine the MIC of ANF, FLZ and ITZ according to CLSI recommendations. Results: was observed that HIV patients (n = 26) were exclusively affected by VNI isolates (n= 34), whereas the VGII (n= 4) were identified only in non-HIV patients (n= 4). The ST93 was identified as the most prevalent (n= 33; 93%) among the VNI strains and this is an indication that in the Amazon this molecular type presents low intragenotypic variability. It was found that ST93 is endemic in our region as well as in Asia, Africa and Southeast Brazil and that it has a close genetic similarity with ST32. Among the four strains of C. gattii, three STs (ST5, ST172 and the new ST445) were identified, highlighting the potential for diversification and genetic variability of VGII isolates. The ST445 differs from ST128 in three loci (LAC1, PLB1, SOD1), both of exclusively brazilian origin. All strains were susceptible to the antifungals, although C. gattii isolates showed geometric means four times more higher for azoles and two strains ST172 showed the highest MIC for FLZ. Conclusion: in Amazonas state, patients with HIV are affected by strains of C.neoformans VNI that make up a genetically homogeneous group, which is not observed among strains of C. gattii. These genetic population structure identified in our region hamper the establishment of correlation between the subtypes with clinical factors. Amphotericin B and azoles remain as viable alternatives to treatment.

Key words: Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, genotypes, molecular

epidemiology, antifungal susceptibility.

ix

RESUMO LEIGO

A Criptococose é uma doença grave e causada por fungos adquiridos por inalação após o contato com fezes de aves acumuladas, principalmente de pombos e também madeira em decomposição. Esses fungos podem se disseminar pela corrente sanguínea e comprometer vários órgãos, sendo bastante comum a meningite. Os indivíduos com HIV/Aids são frequentemente acometidos e evoluem para o óbito em quase 50% dos casos, principalmente por ainda serem diagnosticados de forma tardia. Existem duas espécies que acometem o ser humano e atualmente há um interesse em conhecer os seus perfis genéticos (genótipos) e assim determinar a sua frequência, conhecer sua distribuição geográfica e avaliar se os mesmos estão associados a fatores como resistência aos antifúngicos, com a capacidade de causar infecções graves e até surtos. Nesta pesquisa foram obtidos isolados fúngicos de 30 pacientes da FMT-HVD, os genótipos foram identificados utilizando o método MLST que permite ter acesso direto a informação genética presente no DNA, facilitando a diferenciação de fungos aparentemente semelhantes e a comparação dos mesmos com outros fungos identificados em diferentes países através da internet. Informações clínicas e epidemiológicas foram investigadas com o objetivo de descrever a situação atual da doença no estado do Amazonas, de verificar se a doença ocorre de forma distinta entre pacientes com e sem HIV e também de buscar associações com os genótipos. Também foi avaliado se esses fungos poderiam responder adequadamente às drogas disponíveis para tratamento. Foi constatado que o Cryptococcus neoformans é a espécie que prevaleceu nos pacientes com Aids nos quais o genótipo ST93 foi o de maior importância. Este já foi identificado na região sudeste do Brasil e também em países da Ásia e África. Quatro casos desta doença ocorreram em indivíduos HIV negativos nos quais foram identificados três genótipos diferentes (ST5, ST172 e o novo ST445). Ao avaliar a capacidade de ação dos antifúngicos nenhum isolado resistente às drogas foi identificado.

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Características micro e macromorfológicas dos agentes causadores da

criptococose. ............................................................................................................... 5

Figura 2. Fluxograma das etapas e procedimentos realizados ................................ 20

Figura 3. Etapas para obtenção de DNA dos isolados clínicos ................................ 25

Figura 4. Procedimentos realizados para a determinação dos genótipos

principais.. ................................................................................................................. 26

Figura 5. Etapas pós PCR e purificação para definição do perfil alélico e ST de cada

isolado . .. ................................................................................................................... 31

Figura 6. Resultado do bioensaio de microdiluição em caldo RPMI.. ....................... 33

xi

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA

µg – Micrograma

µl – Microlitros

µm - Micrômetros

µM – Micromolar

⁰C – Graus Celsius

5-FC – 5-Fluorocitosina

AFLP – Amplified Fragment Lengh Polymorphism (Polimorfismo de comprimento de

fragmento amplificado)

AIDS - Acquired immunodeficiency syndrome (Síndrome da imunodeficiência

adquirida)

ANF – Anfotericina B

CAAE - Certificado de apresentação para apreciação ética

CAP10, CAP59 - Genes das proteínas associadas à cápsula de Cryptococcus spp.

CC – Clonal complex (complexo clonal)

CD4 – Cluster of differentiation 4

CEP – Comitê de ética em pesquisa com seres humanos

CGB – Canavanina-glicina-azul de bromotimol

CIM – Concentração inibitória mínima

CLSI – Clinical and Laboratory Standard Institute

CO2 – Dióxido de carbono

CRAG- Cryptococcal antigen (antígeno criptocócico)

ddNTP´s – Dideoxinucleotídeos trifosfatados

DMSO – Dimetil sufoxido

DNA – Ácido desoxirribonucleico

dNTPs – Deoxinucleotídeos trifosfatados

EDTA - Ethylenediamine tetraacetic acid (Ácido etilenodiamino tetra-acético)

EUA – Estados Unidos da América

Fiocruz – Fundação Oswaldo Cruz

FLZ – Fluconazol

xii

FMT-HVD – Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado

GPD1 – Gene da enzima Gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase

HCl – Ácido clorídrico

HhaI – Enzima de restrição obtida de Haemophilus haemolyticus

HIV – Human Immunodeficiency Virus (Vírus da Imunodeficiência Humana)

IGS1 – Intergenic spacer region 1

IL-10 – Interleucina 10

INI - Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas

INPA – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia

ISHAM – International Society of Human and Animal Mycology (Sociedade

Internacional de Micologia Médica e Veterinária)

ITR – Itraconazol

KCL – Cloreto de potássio

LAC1 – Gene da enzima Lacase

LCR- Líquido Cefalorraquidiano

M – Molar

MATa ou α – Mating Type (tipo sexuado) a ou alfa

MgCl2 – Cloreto de magnésio

min – Minuto

ml- Mililitros

MLST- Multi Locus Sequence Typing

mM – Milimolar

MP88 – Gene da Manoproteina

MPD1 – Gene da enzima Manitol-1-fosfato desidrogenase

MST – Minimum sppaning tree (árvore de extensão mínima)

NaCl – Cloreto de sódio

ng – nanograma

nm – Nanômetro

pb – pares de bases

PCR – Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)

pH – Potencial hidrogeniônico

xiii

PLB1 – Gene da enzima Fosfolipase B

RAPD- Random Amplified Polymorphic DNA (DNA polimórfico amplicado

randomicamente)

RFLP – Restriction Fragment Lengh Polymorphism (Polimorfismo de comprimento

de fragmento de restrição)

RNA – Ácido ribonucleico

rpm – Rotações por minuto

RPMI - Meios Roswell Park Memorial Institute

Sau96I – Enzima de restrição obtida de Staphylococcus aureus

SDS – Sodium dodecyl sulfate (Dodecil sulfato de sódio)

SLV – Single locus variant (variante em um único lócus)

SNC – Sistema Nervoso Central

SOD1CG – Gene da enzima Superóxido Dismutase de cobre e zinco de C. gattii

SOD1CN – Gene da enzima Superóxido Dismutase de cobre e zinco de C.

neoformans

ST – Sequence Typing

Taq – Thermus aquaticus

TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TEF1α – Translation elongation factor 1α (Fator de alongamento da traduação 1 alfa)

Th2 – T helper 2

TLV – Triple locus variant (variante em três lócus)

TOP1 – Gene da enzima Topoisomerase 1

Tris – 2-amino-2-hidroximetilpropano-1,3-diol

U – Unidade

UFC – Unidade formadora de colônia

URA5 – Gene da enzima Orotidina Monofosfato Pirofosforilase

URE1 – Gene da enzima Urease

V – Volt

var. – Variedade

VGI, VGII, VGIIa, VGIIb, VGIIc, VGIII, VGIV – Variedade gattii 1, 2, 2a, 2b, 2c, 3 e 4

VNB – Variedade neoformans de Botswana

xiv

VNI, VNII, VNIII, VNIV – Variedade neoformans 1, 2, 3 e 4

VNI/VGI e VGI/VNV – genótipos híbridos entre espécies

xv

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1

1.1 Criptococose – infecção e formas clínicas ............................................................ 1

1.2 Epidemiologia ........................................................................................................ 3

1.3 Agentes etiológicos – características gerais e fatores de virulência ...................... 3

1.4 Eco-epidemiologia das espécies patogênicas ....................................................... 6

1.5 Epidemiologia molecular ....................................................................................... 7

1.6 MLST como uma nova ferramenta de epidemiologia molecular .......................... 10

1.7 Genótipos e correlações clínicas ......................................................................... 16

2 OBJETIVOS ........................................................................................................ 19

2.1 Geral ................................................................................................................... 19

2.2 Específicos .......................................................................................................... 19

3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 20

3.1 Modelo de estudo ................................................................................................ 20

3.2 Universo de estudo ............................................................................................. 21

3.2.1 Locais de estudo ............................................................................................ 21

3.2.2 População analisada e período de estudo ...................................................... 21

3.2.2.1 Critérios de inclusão .................................................................................. 21

3.2.2.2 Critérios de exclusão ................................................................................. 22

3.3 Procedimentos .................................................................................................... 22

3.3.1 Obtenção dos isolados clínicos ...................................................................... 22

3.3.2 Coleta de dados clínicos, epidemiológicos e de diagnóstico .......................... 23

3.3.3 Caracterização molecular por MLST .............................................................. 24

3.3.3.1 Extração de DNA ........................................................................................... 24

3.3.3.2 Genotipagem inicial por PCR-RFLP do gene URA5 ..................................... 26

3.3.3.3 PCR para amplificação dos lócus do MLST .................................................. 27

3.3.3.4 Purificação dos produtos de PCR ................................................................. 27

3.3.3.5 Preparo e envio das amostras de DNA para sequenciamento ...................... 28

xvi

3.3.3.6 Reações de sequenciamento de DNA........................................................... 28

3.3.3.7 Determinação do perfil alélico e dos subtipos moleculares (sequence types -

STs) ........................................................................................................................... 29

3.3.4 Análise pelo algoritmo goeBURST ................................................................... 30

3.3.5 Avaliação da susceptibilidade antifúngica ........................................................ 30

3.3.6 Análise estatística ............................................................................................ 33

3.4 Aspectos éticos ................................................................................................... 34

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 35

4.1 Artigo ................................................................................................................... 36

5 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 69

6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 70

7 ANEXOS ................................................................................................................ 79

7.1 Anexo A – Primers dos sete lócus analisados pelo MLST e suas respectivas

temperaturas de amplificação ................................................................................... 79

7.2 Anexo B – Parecer do cep da FMT-HVD............................................................. 80

7.3 Anexo C – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) ....................... 81

7.4 Anexo D – Formulário aplicado para entrevista e coleta de dados clínico-

epidemiológicos e laboratoriais ................................................................................. 86

1

1 INTRODUÇÃO

1.1 Criptococose – infecção e formas clínicas

A Criptococose é classificada como uma micose sistêmica e de distribuição

cosmopolita. É adquirida por inalação de basidiósporos ou leveduras ressecadas em

suspensão no ar após a exposição contínua ou esporádica à excretas de aves

acumuladas e desidratadas assim como pela manipulação do solo ou madeira em

decomposição contaminados, dando início a infecção (1).

A carga fúngica inalada, os fatores de virulência da cepa que podem ser

induzidos ainda no ambiente e principalmente a condição imunológica do hospedeiro

infectado irão determinar o curso da doença, que a princípio poderá ser combatida ou

se desenvolver de forma assintomática com a formação de granulomas no pulmão ou

em linfonodos. Mas em indivíduos com imunodepressão severa essa micose pode

ocorrer de forma aguda ou por reativação de focos latentes que tenham sido gerados

ainda na infância (2–4).

Dependendo da condição imunológica dos indivíduos acometidos esta micose

pode assumir dois perfis clínicos: a de doença oportunista que ocorre com maior

frequência em imunodeprimidos com HIV/Aids, nos quais pode haver

desenvolvimento de infecções generalizadas e prognóstico desfavorável e também o

perfil de doença primária por acometer indivíduos hígidos sem imunodepressão

aparente (5–7). No entanto, condições como cirrose descompensada, transplantes,

neoplasias, doenças auto-imunes e o uso de drogas imunossupressoras tem sido

descritos como potenciais fatores de risco e devem ser investigados em pacientes

considerados imunocompetentes (8).

As formas clínicas da criptococose são caracterizadas por quadros de

meningoencefalite estando ou não associada a lesões nodulares ou de aspecto

tumoral nos pulmões e com potencial de disseminação hematogênica e linfática para

pele e outros órgãos (9–11).

As apresentações pulmonares descritas em pacientes sintomáticos são: tosse

com ou sem expectoração, febre, suores noturnos, perda de peso e fraqueza, com

possível evolução para pneumonia e insuficiência respiratória. Exames de imagem

2

geralmente revelam lesões nodulares uni ou bilaterais de tamanhos variáveis que são

achados comuns, assim como infiltrado intersticial, derrame pleural e a presença de

massas fúngicas (criptococomas) que podem comprimir bronquíolos e vasos

sanguíneos (3,9).

Os agentes etiológicos Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii

apresentam neurotropismo pelo sistema nervoso central (SNC) e são capazes de

atravessar a barreira hematoencefálica para desenvolverem quadros agudos ou sub-

agudos de meningoencefalite, sendo esta forma clínica a mais importante devido a

ampla variedade e intensidade dos sintomas. Cefaléia, febre, vômitos, alterações no

nível de consciência são os sintomas iniciais mais observados. Alterações visuais

como amaurose e diplopia são indicativas de comprometimento de nervos cranianos

e os pacientes podem desenvolver complicações neurológicas no decorrer da doença,

como hidrocefalia que pode ser resultante do aumento da pressão intracraniana.

Exames de imagem podem revelar criptococomas únicos ou múltiplos no encéfalo

(5,12,13).

Condições como idade avançada, leucopenia, carga fúngica elevada no líquido

cefalorraquidiano (LCR), fungemia, hipertensão intracraniana e alterações no status

mental tem sido considerados como fatores de mau prognóstico para a ocorrência de

óbito em pacientes com neurocriptococose (5,14,15).

O comprometimento cutâneo pode ser observado em 10-15% dos casos e é

resultante da disseminação hematogênica. As manifestações cutâneas são de

aspecto polimórfico, sendo típica a presença de lesões papulares com centro

umbilicado (10).

As manifestações clínicas podem ser distintas dependendo da condição

imunológica dos doentes. Lesões pulmonares, massas fúngicas cerebrais e

pulmonares e o desenvolvimento de sequelas neurológicas são mais predominantes

nos imunocompetentes que também desenvolvem respostas inflamatórias mais

intensas e nos quais a sintomatologia costuma ser mais prolongada. Enquanto que

nos imunodeprimidos são observadas formas de comprometimento sistêmico como

fungemia, lesões secundárias para a pele, sendo que a meningoencefalite ocorre

comumente associada a elevada carga fúngica no líquor, que geralmente apresenta

pouca resposta inflamatória devido à imunidade deficiente (5,6,12).

3

1.2 Epidemiologia

Dados epidemiológicos descritos na literatura, apesar de estarem

desatualizados e mesmo não refletindo a real prevalência da criptococose em nível

global, estimam que em pacientes com HIV esta micose é responsável por uma média

de 1 milhão de casos de meningite que resultam em torno de 625.000 óbitos

anualmente. A maioria dos casos se concentram na África subsaariana onde a

mortalidade por meningite criptocócica é mais elevada do que por Tuberculose (16).

No Brasil foram relatados 3,583 óbitos por micoses sistêmicas em pacientes

com Aids no período de 1996 a 2006, dos quais 50,9 % foram ocasionados pela

criptococose. Esta micose também foi considerada como a principal causa de

internações dentre as micoses sistêmicas no nosso país durante os anos de 2000 a

2007 (17,18).

No Amazonas os casos de meningite criptocócica como infecção oportunista

em indivíduos com Aids tem sido diagnosticados desde 1986 conforme dados

epidemiológicos da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-

HVD). Em um período de 23 anos (1990-2012) a prevalência dessa infecção foi de

0,8% dentre as demais causas de meningite, com um aumento significativo de casos

no ano de 2008 (19). A criptococose também foi descrita como a sexta causa de óbito

em pacientes com Aids necropsiados na FMT-HVD no período de 1996 a 2003 (20).

1.3 Agentes etiológicos – características gerais e fatores de virulência

Quanto a sua classificação taxonômica atual, os agentes causadores da

criptococose são atribuídos ao filo Basidiomycota, classe dos Tremellomycetes,

ordem Tremellales, família Tremellaceae e ao gênero Cryptococcus do qual fazem

parte mais de 30 espécies, sendo C. neoformans e C. gattii os principais responsáveis

pelas manifestações clínicas desta micose. E em virtude da diversidade genética

demonstrada por métodos moleculares e filogenéticos, foi proposto atualmente a

utilização do termo “complexo de espécies” para ambos os agentes (21–23).

4

Em parasitismo, estes fungos são leveduriformes, podendo assumir formas

ovaladas ou globosas que variam entre 3-10 µm de diâmetro, são geralmente

haplóides, se reproduzem assexuadamente por brotamento único ou múltiplo, toleram

desde baixas temperaturas até 40 ⁰C e também apresentam características peculiares

que facilmente os diferenciam das demais leveduras de interesse médico (24–27).

Estes patógenos possuem no seu genoma uma região que confere a sua

identidade sexual (mating types), podendo ser do tipo MATα ou MATa. Em condições

ambientais hostis ou pela privação de nutrientes, pode ocorrer reprodução sexuada

pela fusão de células leveduriformes haplóides de tipos sexuados distintos ou

semelhantes assim como por duplicação cromossômica de uma única célula haplóide.

Ambos os eventos irão dar origem a uma forma filamentosa e sexuada, sendo então

denominados de Filobasidiella neoformans e F. bacillispora respectivamente (28–30).

Este mecanismo de reprodução é considerado como um fator de virulência,

pois favorece a captação de nutrientes, contribui para a produção de basidiosporos

que irão facilitar a sua dispersão no ambiente, mantendo a sua viabilidade. Existe a

possibilidade de ocorrer recombinações genéticas que podem gerar cepas híbridas,

com capacidade de adaptação a novos nichos (30–32).

Estas leveduras apresentam uma cápsula composta principalmente pelos

polissacarídeos glucuronoxilomanana e galactoxilomanana, seu diâmetro pode variar

de 5-30 µm, sendo esta estrutura responsável pela determinação dos cinco sorotipos

existentes: A, D e AD (C. neoformans) e B e C (C. gattii) (Quadro 1) (33). A cápsula

pode desenvolver uma ação imunomodulatória por induzir a produção de citocinas

como a IL-10 que desencadeiam respostas adaptativas do tipo Th2, consideradas

como não protetivas e que interferem no controle da infecção, principalmente no SNC

(34).

A cápsula pode ser observada em isolados ambientais, mas a sua síntese é

estimulada in vivo pelos componentes do soro e também em presença de CO2,

constituindo uma barreira física. Estes fungos podem se tornar células gigantes ao

produzirem a cápsula de forma exacerbada, tornando-se resistentes a fagocitose (35).

A capacidade de se proliferar e sobreviver no interior de macrófagos já foi

descrita e é considerada como um importante fator de virulência que pode contribuir

5

para a latência, disseminação sistêmica e recorrências, fazendo com que estas

células fagocíticas desenvolvam um papel antagônico na patogênese (36–38).

Também possuem a enzima lacase que catalisa a oxidação de compostos

difenólicos presentes em diferentes substratos como os nossos neurotransmissores

para produzirem o pigmento melanina que se polimeriza e se deposita em camadas

na sua parede celular, caracterizando-se como uma barreira que pode interferir na

ação de antifúngicos e na fagocitose ao proteger esses fungos contra o estresse

oxidativo gerado pelos macrófagos. A produção de melanina também pode ser

observada in vitro pela presença de colônias marrons em meios de cultura contendo

compostos difenólicos, sendo utilizados para diagnóstico diferencial já que essa

pigmentação não é observada em outras leveduras (25,39,40).

Figura 1. Características micro e macromorfológicas dos agentes causadores da criptococose. A)

Cápsula polissacarídica das leveduras de Cryptococcus spp. evidenciada pelo exame direto com tinta

nanquim (Fonte: acervo pessoal). B) Colônias marrons devido a produção de melanina por C.

neoformans em ágar níger (Fonte: acervo pessoal).

A enzima fosfolipase B contribui para a sua colonização no parênquima

pulmonar e também desenvolve um importante papel na patogênese da criptococose

ao favorecer a disseminação hematogênica e consequentemente o acesso destes

agentes aos microcapilares que revestem o encéfalo (41).

Tanto C. neoformans quanto o C. gattii utilizam esses fatores de virulência para

invadir o SNC, causando danos a barreira hematoencefálica, principalmente pela ação

6

de outras enzimas como proteases e a urease. É provável que estes fungos possam

realizar transmigração passiva pelo endotélio, podem forçar a sua passagem entre as

junções das células endoteliais (paracitose) ou penetrar no SNC internalizados em

macrófagos em um mecanismo denominado de “cavalo de tróia” (42–45).

1.4 Eco-epidemiologia das espécies patogênicas

Diferenças genéticas detectadas entre cepas do sorotipo A e D permitiram a

classificação desta espécie em duas variedades: C. neoformans variedade grubii e C.

neoformans var. neoformans respectivamente (33).

Dados obtidos de estudos epidemiológicos e moleculares mostram que C.

neoformans é o principal agente oportunista que acomete imunodeprimidos, sendo

mais prevalente nos infectados pelo HIV. Esta espécie apresenta uma distribuição

mundial, mas predomina em pacientes da África e Ásia respectivamente, onde a

maioria dos casos é atribuída a C. neoformans var. grubii (6,16,46).

Esta espécie, assim como C. gattii são agentes saprófitas que participam da

biodegradação dos substratos orgânicos presentes em ocos e troncos de árvores,

onde podem estabelecer colonização, transformando esses microambientes em

fontes de infecção (47).

Apesar da sua relação com a madeira em decomposição, estudos de

investigação ambiental indicam que C. neoformans é melhor adaptado ao organismo

das aves, que mesmo tendo a temperatura corporal elevada podem ser colonizadas

sem desenvolver infecção, sendo então consideradas como reservatórios e podem

eliminar esses fungos pelas fezes (27). Em grandes metrópoles este agente tem sido

isolado com frequência a partir das excretas de pombos (Columba livia) e do solo

contaminado com esses substratos. No entanto as excretas secas e acumuladas de

passeriformes criados em cativeiro intradomiciliar também podem ser importantes

fontes de infecção (48–50).

O C. gattii pode acometer tanto a indivíduos imunodeprimidos quanto

imunocompetentes, nos quais é mais prevalente, sendo capaz de desenvolver

quadros graves (3,13,46). Os casos de criptococose por C. gattii são descritos em

7

todo mundo, porém em menor prevalência do que por C. neoformans e se concentram

em países como os Estados Unidos, Canadá, Austrália e também no Brasil, onde é

considerado endêmico nas regiões norte e nordeste e associado a elevadas taxas de

morbi-mortalidade em indivíduos hígidos, principalmente em crianças (51–55).

Quanto a sua presença no ambiente, C. gattii pode ser obtido quase que

exclusivamente de material vegetal em decomposição, pois não consegue

desenvolver seu ciclo sexuado em excretas de aves, dificultando seu isolamento a

partir desses substratos (56). O mesmo tem sido identificado em ocos e troncos de

árvores na área urbana de grandes cidades, assim como em amostras obtidas de

florestas nativas (57–60). No Amazonas o seu isolamento foi descrito a partir de poeira

domiciliar em casas de madeira no município de Santa Isabel do Rio Negro e em

Iranduba, assim como de material vegetal obtido do oco de árvores na área urbana

de Manaus e da água do Rio Negro coletada na orla da cidade (59–62).

Anteriormente considerado raro e restrito a regiões de clima tropical e

subtropical, C. gattii expandiu a sua distribuição geográfica e desde 1999 tem

emergido como um importante patógeno responsável por surtos de criptococose em

indivíduos hígidos e animais que foram relatados em Vancouver no Canadá e em

cidades do Noroeste Pacífico dos EUA, demonstrando uma mudança nas

características eco-epidemiológicas deste agente patogênico (63–65).

Um grande esforço tem sido aplicado na investigação dos fatores

determinantes desse surto e pesquisas tem demonstrando que esses agentes podem

ter sido gerados por eventos de recombinação produzida por reprodução sexuada

entre cepas do mesmo mating type, permitindo a sua adaptação e disseminação em

um novo nicho (31). Ferramentas moleculares aliadas a ensaios de virulência in vitro

e in vivo revelaram que as cepas relacionadas ao surtos apresentavam novos

genótipos, sendo alguns hipervirulentos (64). Genótipos semelhantes já foram

identificados no Brasil, inclusive na região Amazônica como demonstrado por análises

filogenéticas que sugerem que estes agentes tenham se originado na América do sul

e atualmente estejam se disseminando pelo mundo (61,66).

1.5 Epidemiologia molecular

8

Os surtos na América do Norte que tem ocorrido em indivíduos hígidos

ocasionados por cepas de virulência acentuada com potencial de disseminação

ambiental eminente e as elevadas taxas de morbi-mortalidade em imunodeprimidos,

são questões de atual emergência e que tem despertado o interesse da comunidade

cientifica em investigar primeiramente a variabilidade genética desses micro-

organismos e a sua distribuição mundial (16,63).

Ferramentas de caracterização molecular foram utilizados nos últimos anos

com o propósito de investigar a diversidade genética das espécies patogênicas de

Cryptococcus e resultados concordantes foram obtidos com a PCR-RFLP do gene

orotidina monofosfato pirofosforilase (URA5), com a técnica de polimorfismo de

comprimento de fragmento amplificado (AFLP) e também com a PCR Fingerprinting,

que realiza a amplificação de regiões no DNA presentes entre sequências curtas de

nucleotídeos (mini ou microssatélites) que se repetem de forma aleatória no genoma

(67,68).

Foram identificados oito genótipos principais, sendo quatro para cada espécie:

VNI e VNII correspondem a C. neoformans var. grubii (sorotipo A), VNIII (sorotipo

híbrido AD) e VNIV de C. neoformans var. neoformans (sorotipo D). Isolados de C.

gattii podem apresentar os genótipos VGI, VGII, VGIII e VGIV, não havendo

correlação com os sorotipos B e C (Quadro 1). A distinção entre estes genótipos se

dá pela visualização em eletroforese de bandas de DNA com tamanhos variados,

resultantes de diferenças nucleotídicas que alteram o sítio de anelamento do primer

ou de enzimas de restrição dependo do método utilizado e assim gerando

polimorfismos (67,68).

No primeiro estudo de caracterização molecular com isolados de C.

neoformans foram obtidas cepas de diferentes países, incluindo o Brasil. Foi

padronizado um protocolo de PCR Fingerprinting e de RAPD para serem utilizadas

como ferramentas de investigação epidemiológica global e também descreveram pela

primeira vez a distribuição dos genótipos de C. neoformans no mundo, sendo VNI o

mais prevalente em todos os países e cepas do tipo VNII, VNIII e VNIV foram

detectadas em menor frequência respectivamente. Nessa ocasião foram identificados

no Brasil apenas os genótipos VNI e VNII (67).

9

Um segundo estudo multicêntrico analisou 340 isolados, sendo 271 de C.

neoformans e 69 de C. gattii obtidos de países latino americanos e da Espanha que

foram caracterizados por PCR Fingerprinting e PCR-RFLP do gene URA5. Foram

obtidos resultados semelhantes ao do estudo anterior, sendo VNI o genótipo mais

comum e caracterizado como o responsável pela maioria das infecções no mundo,

principalmente em indivíduos com HIV. Pela primeira vez foi descrita a distribuição

dos genótipos de C. gattii, sendo VGII o mais frequente dentre os demais genótipos

dessa espécie e o mesmo foi associado aos casos de criptococose em

imunocompetentes, sendo também identificado no Brasil (68).

A PCR Fingerprinting e AFLP foram utilizadas para investigar as causas do

surto de criptococose por C. gattii em Vancouver (Columbia Britânica, Canadá) e

identificaram em isolados clínicos e ambientais os dois novos subtipos VGIIa e VGIIb

como os responsáveis por esse evento. Ambos apresentaram uma única banda de

DNA de diferença e a princípio foi sugerido que este polimorfismo pode ter sido gerado

por processos de microevolução ou recombinação em cepas do tipo VGII (63).

Além de C. neoformans do sorotipo AD (VNIII), novos híbridos entre espécies

foram descobertos com a aplicação do AFLP. Isolados com sorotipo BD (VGI/VNIV)

foram obtidos de pacientes na Holanda e um isolado do sorotipo AB (VNI/VGI) em um

paciente canadense com histórico de viagem para o México que evoluiu para óbito

mesmo em tratamento antifúngico. Isolados híbridos são diplóides e podem

apresentar maior expressão gênica e a possibilidade de desenvolverem novas

funções (69,70).

Trilles et al. (2008)54 por meio de um estudo multicêntrico, analisaram a

distribuição dos genótipos em cada uma das regiões brasileiras e a correlação dos

mesmos com as características epidemiológicas. A PCR Fingerprinting, AFLP e PCR-

RFLP do gene URA5 foram aplicadas na tipagem de 443 isolados, sendo 320 de C.

neoformans e 123 de C. gattii. Todos os principais genótipos foram identificados com

a exceção de VGIV, em imunocomprometidos o genótipo VNI foi mais prevalente,

assim como VGII em imunocompetentes, sendo este o genótipo responsável pela

endemia de criptococose nas regiões norte e nordeste do Brasil. Este foi primeiro o

trabalho a relatar a presença dos genótipos VNI e VGII no Amazonas.

10

Na Oceania predominam isolados com o genótipo VGI, VNI e VGII

respectivamente. Na Ásia foram descritos com maior frequência isolados do tipo VNI

e poucos VGI, enquanto que na África VNI, VNB e VNII são predominantes, sendo

extremamente raros os genótipos de C. gattii. Os tipos VNIII e VNIV se concentram

em países da Europa e os genótipos de C. gattii como VGII são mais típicos no

continente americano, principalmente no Brasil. Os subtipos VGIIa e VGIIb são

abundantes no Canadá e responsáveis pela epidemia que se inicou em 1999 (71).

No Amazonas apenas dois estudos investigaram os genótipos de cepas

clínicas regionais. No primeiro trabalho foram analisados 40 isolados clínicos por

PCR-RFLP do gene URA5, sendo descrito que 75,5% dos isolados eram do tipo VNI

e 22,5% de VGII (72). No segundo estudo foram utilizadas a PCR Fingerprinting e

PCR-RFLP na tipagem de 57 isolados clínicos e os autores obtiveram resultados

semelhantes ao do estudo anterior, confirmando a predominância dos tipos

moleculares VNI e VGII na nossa região e corroborando com os achados mundiais,

no entanto foi descrita pela primeira vez a presença de uma cepa VNII (73).

Com o panorama de distribuição mundial de genótipos proporcionado por esses

estudos moleculares, tornou-se evidente a existência de diferenças na diversidade

genotípica entre os continentes. As condições climáticas e ambientais peculiares de

diferentes regiões podem exercer uma influência na biologia, evolução e nos

mecanismos de dispersão destes fungos, favorecendo a seleção e o estabelecimento

de cepas com genótipos específicos e melhores adaptadas (63,67).

1.6 MLST como uma nova ferramenta de epidemiologia molecular

Atualmente o Multi Locus Sequence Typing (MLST) tem sido o método mais

aplicado para genotipagem de Cryptococcus e pode ser utilizado como ferramenta de

epidemiologia molecular. Apresenta maior acurácia na determinação dos genótipos

do que as técnicas anteriores baseadas apenas em PCR, já que realiza o

sequenciamento e identificação de polimorfismos presentes em sequências de

múltiplos genes conservados, utilizando recursos de bioinformática. Além de

apresentar uma maior capacidade de discriminação entre cepas de um mesmo

genótipo, a grande vantagem do MLST está na sua reprodutibilidade e por gerar dados

11

de alta qualidade que podem ser compartilhados pela internet e aplicados em análises

filogenéticas, evitando a troca de cultivos entre laboratórios e consequentemente

agilizando a realização de estudos moleculares e no aumento do conhecimento

microbiológico e genético de patógenos de importância para a saúde pública (74).

O MLST tem sido aplicado para a vigilância epidemiológica da criptococose em

nível mundial, principalmente na investigação de surtos. Também tem permitido a

identificação de novos genótipos (Quadro 1) e a realização de estudos sobre a

estrutura populacional microbiana dessas leveduras. A utilização das informações

geradas pelo MLST em análises filogenéticas podem ajudar a estimar a origem

evolutiva desses patógenos, na avaliação de relações de parentesco genético entre

isolados obtidos de diferentes regiões, auxiliando na triagem da sua disseminação

global, na detecção de recombinações que podem ser refletidas em mudanças

fenotípicas e de patogênese (31,65,66,75,76).

12

Quadro 1. Genótipos e sub-genótipos dos agentes da criptococose.

Espécies Sorotipos Genótipos

(PCR) Exemplos de sub-genótipos (STs)

Definidos por MLST

Total de STs depositados no banco de dados

Ref

C. neoformans

Sorotipo A (C. var. grubii)

VNI

ST1, ST2, ST3, ST4, ST5, ST6, ST15, ST23, ST31, ST32, ST39, ST58, ST63, ST67, ST69, ST71, ST77, ST93, ST185, ST199, ST200, ST202, ST212, ST218, ST234, ST235, ST236, ST237, ST238, ST239, ST240, ST241, ST246, ST247,

ST540

173 (76–82)

VNII ST40, ST41, ST42, ST43, ST48, ST60, ST97, ST100, ST107, ST172, ST173, ST207, ST208, ST209, ST220, ST221, ST222, ST242, ST244, ST243, ST262

26 (76–80)

VNB ST8, ST9, ST10, ST11, ST14, ST16, ST17, ST18, ST19, ST20, ST27, ST29,

ST33, ST35, ST210, ST245, ST249, ST261, ST263, ST295, 102 (75–78)

Sorotipo D (C. var.

neoformans) VNIV

ST108, ST112, ST114, ST117, ST119, ST120, ST121, ST122, ST126, ST129, ST131, ST132, ST134, ST135, ST160, ST251, ST252, ST294,

79 (79–81,83)

Sorotipo AD (Híbrido - diplóide)

VNIII MLST não é realizado

MLST não é realizado

C. gattii Sorotipos B

e C

VGI ST4, ST51, ST58, ST159, ST332 88 (80,84–86)

VGII

ST3, ST5, ST8, ST12, ST18, ST21, ST25, ST29, ST31, ST33, ST35, ST37, ST44, ST45, ST46, ST48, ST50, ST182, ST283, ST321, ST322, ST323, ST324, ST168,

ST169, ST170, ST250, ST251 Brasil

ST1, ST4, ST9, ST10, ST11, ST13, ST14, ST15, ST16, ST17, ST19, ST22, ST23, ST24, ST26, ST27, ST28, ST34, ST39, ST40, ST41, ST120, ST122, ST124,

ST128, ST134, ST277, ST311, ST316. Identificados no Amazonas

ST5, ST46, ST264, ST265, ST266, ST267, ST268, ST172, ST288

167

(61,62,66,84,85,87)

VGIIa ST20 (53,61,88)

VGIIb ST7 (53,61,79,88)

VGIIc ST6 (65,88)

VGIII ST60, ST62, ST68, ST72, ST74, ST75, ST143, ST145 68 (79,80,84,86)

VGIV ST1, ST2, ST70 21 (79,84,86)

13

Na primeira investigação com o MLST foram analisados 102 isolados de C.

neoformans var. grubii obtidos de diferentes países, incluindo Botswana na África e

para caracterização foram empregados 12 loci: CAP10, CAP59, GPD1, LAC1, MPD1,

MP88, SOD1, TEF1α, TOP1, URE1 e a região IGS1 do DNA ribossomal, presentes

em diferentes cromossomos. O MLST identificou três grupos geneticamente distintos,

sendo VNI, VNII e um novo genótipo denominado de VNB e de sorotipo A (Variedade

neoformans de Botswana), encontrado exclusivamente em isolados desta região (75).

Um segundo estudo usou inicialmente nove loci, sendo dois responsáveis pelos

tipos sexuados para caracterizar 202 isolados clínicos e ambientais de C. gattii com o

objetivo de investigar as causas do surto em Vancouver. O MLST confirmou a

existência dos dois novos sub-genótipos VGIIa e VGIIb identificados previamente por

RAPD, sendo estes geneticamente semelhantes entre si e extremamente divergentes

dos demais tipos moleculares de C. gattii (31).

Pela análise dos lócus dos mating types foi demonstrado que os tipos VGIIa e

VGIIb foram gerados por recombinação induzida por reprodução sexuada entre duas

cepas ancestrais VGII com o mesmo tipo sexuado α. Para comparar estes isolados

com cepas obtidas de outras regiões foram analisados 22 loci adicionais que

revelaram semelhanças genéticas com um isolado da Austrália e do Brasil, sugerindo

que a cepa recombinante ancestral tenha se originado nessas regiões (31).

Baseado nos resultados obtidos com os dois estudos anteriores, um grupo de

pesquisadores em criptococose definiram por consenso durante um evento em 2007

que para uma caracterização concreta era necessário a análise em conjunto de no

mínimo sete loci polimórficos e capazes de gerarem distinção entre isolados

relacionados. Foram definidos para caracterização pelo MLST a amplificação e

sequenciamento dos lócus: CAP59 (responsável pela cápsula polissacarídica), LAC1

(lacase), PLB1 (fosfolipase), SOD1 (superóxido dismutase), sendo estes genes

relacionados a expressão de fatores de virulência, assim como os lócus URA5, GPD1

(gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase) e a região IGS1(espaço intergênico) (74).

Uma parte do procedimento de genotipagem é realizada no Banco de dados

Fungal MLST Database coordenado pela Sociedade Internacional de Micologia

Médica e Veterinária (ISHAM). As sequencias de interesse são comparadas por

alinhamento com outras sequencias de referência, permitindo a detecção de

14

alterações nucleotídicas que passam a ser consideradas como novos alelos e aos

mesmos é atribuído um número. A combinação desses códigos geram um perfil alélico

e consequentemente o genótipo denominado de sequence type (ST) (74).

A partir de 2006 começaram a surgir casos novos de criptococose por C. gattii

em Washington e Oregon no noroeste pacífico dos EUA e o MLST foi utilizado na

caracterização dos isolados (N=22), sendo identificadas cepas do tipo VGIIa, VGIIb,

o que indicou uma possível disseminação dos isolados de Vancouver para esta região.

(65).

Um total de 178 isolados de C. gattii VGII obtidos de diferentes países, incluindo

amostras relacionadas aos microsurtos na América do Norte e também isolados

ambientais do Brasil foram analisados por MLST e análise filogenética de

ancestralidade (66). Isolados da América do Sul apresentaram os maiores índices de

recombinações genéticas no seu histórico evolutivo e deram origem as cepas

circulantes atualmente, inclusive as presentes em Vancouver e nos EUA que se

disseminaram por meios ainda não esclarecidos e que provavelmente as alterações

ecológicas e mudanças climáticas tenham contribuído nesse processo e para o atual

surgimento e emergência desses micro-organismos em novos nichos, representando

um agravo para a saúde da população mundial, já que podem acometer indivíduos

saudáveis (66).

A cepa considerada mais ancestral (ST26) foi isolada em 2001 em uma árvore

na Floresta da Ilha de Maracá em Roraima, demonstrando que a região Amazônica é

uma fonte em potencial de micro-organismos patogênicos, cuja diversidade ainda é

desconhecida (66,89).

Um estudo comparou 183 isolados clínicos e ambientais de C. neoformans var.

grubii da Tailândia com outros 77 isolados da mesma espécie obtidos em outros

países. Foram identificados 10 STs (ST43 a ST53), sendo todos correspondentes a

VNI, os STs 44, 45 e 46 foram mais prevalentes respectivamente e quando

comparados aos isolados globais, principalmente da África foi observada uma baixa

diversidade. E pela análise filogenética foi sugerida uma origem Africana para os

isolados de C. neoformans circulantes nesse país (90).

Foi observada uma associação de STs com a condição imunológica de

indivíduos com criptococose na Ásia. Em pacientes HIV positivos foram identificados

15

14 tipos de STs de C. neoformans var. grubii, sendo os STs 4, ST6, ST93 e ST5 mais

prevalentes consecutivamente. Em HIV negativos o ST5 também foi o mais frequente

dentre 20 STs identificados (76).

No estudo pioneiro de genotipagem com MLST no Amazonas foram analisadas

45 cepas ambientais de C. gattii VGII obtidas de três amostras de poeira domiciliar em

casas de madeira no munícipio de Santa Isabel do Rio Negro. Foram identificados oito

STs, sendo o ST20 de VGIIa (n=11) e ST7 de VGIIb (n=22), os mesmos

caracterizados em Vancouver e nos EUA. Isolados do tipo VGII (n=12) apresentaram

os ST5 (n=2), ST264 (n=6), sendo este único do Brasil e os ST265, ST266, ST267,

ST268 (n=1 de cada) descritos como novos genótipos (61). Os resultados deste

estudo também demonstraram que isolados com diferentes genótipos podem coabitar

o mesmo habitat já que mais de 3 tipos de STs foram identificados em isolados de

duas amostras de poeira, sugerindo que indivíduos expostos a tais fontes podem vir

a desenvolver infecções mistas.

Investigação semelhante ao estudo anterior foi realizada por Alves (2016) (62)

que isolou C. neoformans (VNI) e C. gattii (VGII) a partir da poeira domiciliar de

residências em uma comunidade rural do município de Iranduba, na região

metropolitana de Manaus e por MLST foram identificados pela primeira vez o ST46

de C. gattii e o ST93 de C. neoformans na nossa região. Tais pesquisas regionais

evidenciaram o risco de infecção intradomiciliar pelos agentes da criptococose que

pode se estender a todos os membros de um grupo familiar, principalmente para os

que apresentam deficiências imunológicas. E especificamente na região amazônica

onde são típicas as moradias de madeira e as próprias condições ambientais podem

possibilitar o desenvolvimento de Cryptococcus. O risco de infecção da população

ribeirinha, das periferias e principalmente do ambiente rural necessita ser avaliado já

que estão em área endêmica.

No Brasil, as pesquisas sobre a epidemiologia molecular da criptococose tem

propósitos biológicos, visando investigar a diversidade genética e de situar os isolados

obtidos em diferentes regiões do país em um contexto global com o intuito de triar as

suas origens evolutivas e de avaliar os mecanismos que contribuíram para o

surgimento de cepas com novos genótipos e mais virulentas atualmente, no entanto

estudos de genotipagem por MLST ainda são escassos no Brasil (82,87).

16

Destaca-se a investigação multicêntrica realizada por Souto et al. (2016) (87)

que caracterizaram os STs de 145 isolados VGII de origem clínica e ambiental obtidas

em 8 estados, incluindo o Amazonas. Um alto índice de diversidade genética foi

observado, já que foram caracterizados 81 STs para o genótipo VGII, sendo os

isolados da região nordeste os que apresentaram o maior índice de diversidade (total

de 31 STs). Em nível nacional os STs 40, ST20 e ST5 foram os mais prevalentes

respectivamente. Este estudo também foi o primeiro a realizar a sub-tipagem de

isolados clínicos VGII do Amazonas, sendo identificados os STs 5, ST20 (VGIIa), ST7

(VGIIb), ST288 e ST274 em um total de 10 cepas analisadas.

Em relação a genotipagem e filogenia de cepas de C. neoformans VNI,

Ferreira-Paim et al. (2017) (82) observaram uma condição contrária ao analisarem 143

isolados clínicos e ambientais obtidos em Uberaba, Minas Gerais. Apenas 13 STs

foram identificados, sendo o ST93 (encontrado previamente no Amazonas) e ST77 os

mais prevalentes respectivamente e, o ST540 foi definido como um novo genótipo.

Concluiu-se que as cepas VNI apresentaram pouca variabilidade genética e

características de expansão clonal. Por métodos filogenéticos foi observada uma

relação ancestral com isolados do genótipo VNB de origem africana.

1.7 Genótipos e correlações clínicas

Os agentes da criptococose apresentam distintas características eco-

epidemiológias, moleculares e clínicas e resultados obtidos com os estudos de

epidemiologia molecular tem contribuído para um melhor esclarecimento dessas

diferenças, revelando altos graus de variabilidade genética entre isolados. Alguns

trabalhos investigaram a relação de genótipos com parâmetros clínicos, produção de

fatores de virulência e susceptibilidade antifúngica (Quadro 2) e demonstraram que os

genótipos podem estar associados ao desenvolvimento de manifestações clínicas

específicas e também podem ser um fator determinante no prognóstico e desfecho

clínico dos pacientes (52,64,78,91,92).

17

Quadro 2. Associações clínicas dos principais genótipos dos agentes da criptococose

Espécies

Genótipos / STs (Região ou País de

origem) Correlação Ref

C.

neo

form

ans

VNB: ST9, ST210, ST245, ST249, ST261, ST263

(África)

Clínica: Alterações no status mental e altas taxas de mortalidade.

(78)

VNII: ST40 (África)

Virulência: maior viabilidade fora do organismo humano e maior produção de lacase do que isolados com genótipo VNI e VNB.

VNI: ST5 (Ásia)

Predominante em pacientes HIV negativos. (76)

VNI: ST 4 e ST6 (Ásia)

Mais frequentes em pacientes HIV positivos.

VNI: ST5, ST6, ST77 (Ásia)

Resistência in vitro ao Fluconazol (FLZ).

VNI: ST93 (Ásia)

Resistência in vitro a 5-Fluocitosina (5-FC) e ao Fluconazol simultaneamente.

VNI: ST1, ST36, ST37, ST74 VNII: ST107 VNIV: ST122

(Uganda-África)

Altas taxas de mortalidade por apresentarem maior capacidade de produzir cápsula e consequentemente de estimular o perfil de resposta imune do tipo Th2, considerada menos protetiva.

(92)

VNI (Brasil)

Isolados deste genótipo obtidos de pacientes com HIV foram menos susceptíveis ao FLZ do que os obtidos de pacientes hígidos.

(91)

VNIII (França)

Esterilização mais rápida do LCR e melhor prognóstico dos pacientes.

(83)

C.

gattii

VGII (Diversos países,

maioria da Austrália e Canadá)

Menos sensível a 5-FC e aos azólicos; principalmente ao FLZ quando comparado com os demais genótipos de C. gattii;

Observado que cepas com este mesmo genótipo obtidas de diferentes regiões, apresentavam diferenças de susceptibilidade antifúngica ao FLU.

(93,94)

VGII (Brasil)

Menos sensível aos azólicos e a 5-FC do que isolados VGI e VNI respectivamente.

(91)

VGIIa (ST20) e VGIIc (ST6)

(EUA e Canadá)

São os sub-genótipos mais virulentos relacionados ao surto no EUA e Canadá,

Apresentam altos de níveis de proliferação intracelular em macrófagos

VGIIa é capaz de produzir mais melanina

(64)

18

Frente ao exposto, o presente estudo teve como justificativa para a sua

realização a falta de dados mais atualizados e concretos sobre os aspectos

epidemiológicos da criptococose no Amazonas. Os únicos dados disponíveis não

descrevem as taxas de mortalidade, a frequência da infecção em indivíduos

imunodeprimidos e imunocompetentes, assim como a proporção de casos nos quais

ocorre desenvolvimento de sequelas. Até o momento nenhum estudo investigou de

forma mais minuciosa os parâmetros clínicos, laboratoriais e o desfecho dos pacientes

como tem sido realizado em trabalhos de âmbito nacional e mundial.

A criptococose é uma doença negligenciada pelos órgãos de saúde pública e

por isso os casos ainda não são notificados, tornando difícil avaliar a real dimensão

da frequência da doença e de seus efeitos. Estudos epidemiológicos regionais podem

ser úteis ao fornecer dados que respondam a esses questionamentos e que poderão

servir futuramente como subsídio para o desenvolvimento de medidas de prevenção

de agravos como a realização de diagnóstico precoce (triagem para detecção de

antígeno capsular criptocócico), beneficiando os pacientes por antecipar o tratamento

e na redução das taxas de morbi-mortalidade e de gastos com internação.

Estudos de genotipagem com os agentes da criptococose no Amazonas ainda

são escassos e os subtipos moleculares de isolados clínicos também não foram

investigados de uma forma mais abrangente, principalmente os de C. neoformans que

é a espécie mais frequente em indivíduos com Aids. Em virtude das suas inúmeras

vantagens como método de investigação em epidemiologia molecular, o MLST foi

aplicado com o intuito de caracterizar detalhadamente as cepas que acometem os

pacientes na nossa região, de avaliar o grau de associação genética dos STs regionais

com os de outras localidades, permitindo também verificar se os mesmos

compartilham características clínicas e fenotípicas de importância médica, sendo

estas informações importantes para entender o papel dos genótipos na infecção.

19

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Realizar a caracterização clínico-epidemiológica e molecular por MLST dos

casos de Criptococose em pacientes com e sem HIV no Amazonas e investigar o perfil

de susceptibilidade antifúngica dos isolados clínicos.

2.2 Específicos

Descrever as características clínico-epidemiológicas e laboratoriais dos casos

de Criptococose em pacientes com e sem HIV e compará-las para identificar

diferenças significativas no fenótipo da doença;

Utilizar o Multi Locus Sequence Typing (MLST) para definir os sequence types

(STs) dos isolados clínicos;

Descrever a correlação entre os subtipos moleculares (STs) dos isolados

regionais com outros geneticamente relacionados por comparação do perfil

alélico de STs já descritos na literatura;

Determinar a concentração inibitória mínima (CIM) dos antifúngicos

Anfotericina B, Fluconazol e Itraconazol frente aos distintos genótipos;

20

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Modelo de estudo

Trata-se de um estudo de corte transversal que foi realizado com uma

população de pacientes diagnosticados com criptococose na Fundação de Medicina

Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) no período de Janeiro de 2014 a Maio

de 2016. A figura em seguida descreve os procedimentos que foram realizados de

acordo com os objetivos do presente estudo.

Figura 2. Fluxograma das etapas e procedimentos realizados.

21

3.2 Universo de estudo

3.2.1 Locais de estudo

Este estudo foi desenvolvido no Laboratório de Micologia da FMT-HVD, onde

os pacientes com criptococose foram diagnosticados e onde também foi realizado o

isolamento por cultivo das respectivas cepas fúngicas. Parte deste estudo também foi

realizado na Unidade de internação hospitalar Prof. Nelson Antunes, onde os

pacientes foram entrevistados.

Os procedimentos de extração de DNA, reação em cadeia da polimerase (PCR)

e a purificação dos produtos de PCR foram executados no Laboratório de Micologia

do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) e o preparo das amostras de

DNA para a reação de sequenciamento foi conduzida no Laboratório de Micologia do

Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas (INI), na Fiocruz do Rio de Janeiro.

3.2.2 População analisada e período de estudo

No período de Janeiro de 2014 a Maio de 2016 este estudo avaliou 30 pacientes

oriundos da rotina de atendimento da FMT-HVD e que apresentaram diagnóstico

micológico de Neurocriptococose ou fungemia causadas pelas leveduras

Cryptococcus neoformans ou Cryptococcus gattii. Foram incluídos os pacientes que

atenderam aos critérios descritos abaixo.

3.2.2.1 Critérios de inclusão

Foram incluídos os pacientes que:

a) Foram atendidos e diagnosticados na FMT-HVD;

b) De todas as faixas etárias portadores ou não do vírus HIV;

22

c) Dos quais foi possível obter cepas de C. neoformans ou C. gattii a partir do

cultivo primário ou de culturas armazenadas na coleção de fungos do

Laboratório de Micologia da FMT-HVD representativas do período de estudo;

d) Com dados clínico-epidemiológicos e laboratoriais disponíveis para acesso

pelo sistema Idoctor da FMT-HVD ou por meio de entrevista.

3.2.2.2 Critérios de exclusão

Foram excluídos os pacientes que:

a) Cujos isolados fúngicos apresentaram inviabilidade de crescimento após

tentativas de reativação por repiques sucessivos em meios de cultura

específicos. E também por comprometimento da cultura por contaminação;

b) Foram transferidos para outros hospitais;

c) Dos quais não foi possível obter as informações clínico-epidemiológicas e

laboratorias adequada.

3.3 Procedimentos

3.3.1 Obtenção dos isolados clínicos

Foram obtidos um total de 38 isolados clínicos recuperados a partir de amostras

de LCR (n=30) e sangue (n=8) de 30 pacientes, destes 34 foram caracterizados por

ágar CGB como C. neoformans e 4 como C. gattii conforme registrado pelo laboratório

de Micologia da FMT-HVD. Dos 38 isolados, 26 foram recuperados de culturas em

tubos de ágar Sabouraud já armazenadas em geladeira a 8 ⁰C na coleção de fungos

da FMT-HVD e os 12 isolados restantes foram obtidos de pacientes diagnosticados

23

em 2016, permitindo o acesso ao cultivo primário em ágar níger onde as amostras

biológicas foram inoculadas.

Alguns isolados (n=8) foram obtidos de amostras seriadas de LCR coletadas

de dois pacientes durante o controle de tratamento e 4 isolados foram obtidos de

amostras de LCR e sangue coletadas simultaneamente em dois casos ainda durante

o diagnóstico, permitindo avaliar a possibilidade de detecção de genótipos distintos.

Para a realização dos experimentos, todos os isolados foram repicados duas vezes

em placas contendo ágar níger (contendo 20% de glicose e 10% de peptona) para

purificação e obtenção de colônias isoladas. Apenas 1 UFC de cada cepa foi

selecionada e em seguida repicada em triplicata em tubos contendo ágar Sabouraud

e estes foram mantidos em conservação a 8 ⁰C em geladeria para garantir possíveis

análises complementares.

3.3.2 Coleta de dados clínicos, epidemiológicos e de diagnóstico

Após a aprovação pelo CEP da FMT-HVD (Anexo B), foi realizada a busca dos

isolados no laboratório de Micologia da FMT-HVD, de acordo com o período

estipulado pelo estudo e em seguida foi realizado o levantamento dos dados clínico-

epidemiológicos e dados de exames laboratoriais. Em relação aos pacientes

diagnosticados em 2016, estas informações foram obtidas após os pacientes terem

sido esclarecidos sobre o estudo e aprovado a sua participação e a utilização das

cepas após a assinatura do TCLE (Anexo C). Em seguida foi realizada uma entrevista,

sendo aplicado um formulário próprio de investigação clínica, epidemiológica e

laboratorial dos casos de criptococose (Anexo D).

Os pacientes foram questionados sobre informações sociodemográficas (nome

da mãe, idade, naturalidade, endereço e profissão), assim como sobre as condições

de moradia, história de vida, relações de trabalho ou atividades de risco que poderiam

ter favorecido o desenvolvimento da criptococose e assim tentar avaliar a extensão

das possíveis áreas de transmissão, como o próprio ambiente domiciliar ou áreas de

lazer e trabalho.

24

Foram investigados os fatores de risco que possam ter contribuído para a

vulnerabilidade imunológica aos agentes da criptococose, principalmente a infecção

pelo HIV, outros fatores ou comorbidades como: alcoolismo, tabagismo, uso de drogas

ilícitas, uso prolongado de corticoesteróides devido a doenças auto-imunes ou

transplante, câncer, doenças crônicas cardiovasculares, renais ou hepáticas assim

como diabetes e tuberculose (TB).

Também foram questionados sobre os sintomas iniciais que o conduziram ao

diagnóstico. A ficha médica e o histórico dos pacientes disponível no sistema Idoctor

foi monitorada com frequência para avaliar a evolução do paciente, o desenvolvimento

de sequelas neurológicas decorrentes do quadro de meningoencefalite e também para

verificar a ocorrência de óbito. Foram analisados os resultados de exame direto e

cultivo de todas as amostras biológicas, principalmente de LCR enviadas para o

laboratório de micologia e bacteriologia. Resultados da contagem de linfócitos T CD4+

de pacientes com HIV foram obtidos diretamente no sistema idoctor.

Quanto aos pacientes diagnosticados entre 2014-2015 aos quais não tivemos

a oportunidade de entrevista-los, a mesma ficha de investigação clínico-

epidemiológica e laboratorial foi utilizada para preenchimento das informações obtidas

dos prontuários e histórico dos pacientes disponível no sistema iDoctor.

3.3.3 Caracterização molecular por MLST

3.3.3.1 Extração de DNA

A extração de DNA foi baseada no protocolo de Ferrer et al. (2001) (95).

Inicialmente os isolados foram cultivados por 48 horas em ágar Sabouraud, em

seguida foram transferidos com ajuda de alça bacteriológica para microtubos de 2,0

ml para serem incubadas a -20 ºC por 30 minutos ou overnight (Figura 3).

Posteriormente foram adicionados aos microtubos 500 µl de tampão de lise (contendo

SDS a 0,5%, NaCl a 1,4%, EDTA a 0,73% e 20 ml de Tris-HCl para 100 ml de água

destilada) e 5 µL de β-mercaptoetanol, sendo então incubados à 65 ºC por 1 hora.

Foram adicionados 500 µL de Fenol: clorofórmio: álcool-isoamílico (25:24:1), sendo

25

posteriormente realizada a agitação no vórtex para obtenção de uma suspensão

homogênea e em seguida a centrifugação a 14000 rpm por 15 min.

O sobrenadante obtido foi transferido para um novo microtubo de 1,5 ml e em

seguida foram adicionados 500 µl de isopropanol para precipitação do DNA,

homogeneizando levemente as amostras que foram novamente incubadas à -20 ºC

por 30 minutos ou overnight. Em seguida, foi realizada a centrifugação a 14000 rpm

por 15 min para sedimentar o DNA e retirar toda a fase líquida. Após esta etapa, o

precipitado foi lavado com 500 µl de etanol 70% e novamente realizada a

centrifugação a 14000 rpm por 15 min para retirar toda a fase líquida. Após a secagem

do precipitado, este foi ressuspendido em 100 µl de água ultrapura MilliQ®.

E a concentração de DNA Genômico foi verificada por leitura em

espectrofotômetro (GeneQuant-pro RNA/DNA Calculator, GE Healthcare) no

comprimento de onda de 260 nm (unidade de absorbância de 50 μg/ml) e a razão de

pureza determinada pela razão entre as absorbâncias a 260 e 280 nm.

Figura 3. Etapas para obtenção de DNA dos isolados clínicos (Fonte: acervo pessoal).

26

3.3.3.2 Genotipagem inicial por PCR-RFLP do gene URA5

A reação de amplificação foi realizada em um volume final de 40 µl contendo

50 ng de DNA molde, solução tampão 10X (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM), 1,5

mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 0,4 µM de cada primer (senso: 5'

ATGTCCTCCCAAGCCCTCGAC-3' / anti-senso: 5´-

TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC-3´) e 1,5 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen).

A PCR consistiu em 5 minutos de desnaturação à 94 ⁰C; 40 ciclos de 45 segundos à

94 ⁰C, 1 min à 63 ⁰C, 2 min à 72 ⁰C e uma extensão final de 10 min à 72 ⁰C. Os

produtos da amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5%,

por 50 minutos a 100 V (Figura 4). Posteriormente 8 µl dos amplicons foram

misturados a 1 µl de tampão da enzima Hha I e digeridos duplamente com 0,5 µl da

enzima Sau96I (10 U/µl) e 0,5 µl de Hha I (20 U/µl), sendo em seguida incubados por

3 horas a 37 °C. (68).

Os genótipos foram definidos por eletroforese em gel de agarose a 3% por 2

horas a 100V por comparação das bandas de DNA com a das seguintes cepas de

referência: WM 148 (sorotipo A, VNI), WM 626 (sorotipo A, VNII), WM 628 (sorotipo

AD, VNIII), WM 629 (sorotipo D, VNIV), WM 179 (sorotipo B, VGI), WM 178 (sorotipo

B, VGII), WM 161 (sorotipo B, VGIII) e WM 779 (sorotipo C, VGIV).

Figura 4. Procedimentos realizados para a determinação dos genótipos principais (Fonte:acervo

pessoal).

27

3.3.3.3 PCR para amplificação dos lócus do MLST

Para a caracterização genotípica de cada isolado pelo MLST foi realizada

inicialmente a amplificação individual dos genes conservados: CAP59, LAC1, GPD1,

SOD1, PLB1, URA5 e da região IGS1 padronizados pela ISHAM para C. neoformans

e C. gattii. As concentrações dos reagentes utilizados na PCR foram determinados

após modificações no protocolo proposto por Litvintseva et al. (2006) (Tabela 1) (75).

As temperaturas de amplificação da PCR seguiram a padronização da ISHAM (Anexo

A). E os produtos de PCR foram visualizados por eletroforese em gel de agarose a

1,5 % por 40 min a 100 V.

Tabela 1. Concentração e volume dos componentes da PCR para amplificação dos

lócus do MLST.

3.3.3.4 Purificação dos produtos de PCR

Para a precipitação e remoção de primers e nucleotídeos não incorporados na

reação de PCR, os amplicons foram purificados conforme protocolo descrito por Dunn

& Blattner (1987) com modificações (96). Em microtubos de 1,5 ml foram adicionados

32 µl do produto de PCR e igual volume de Polietilenoglicol (20%, 2.5M de NaCl). As

amostras foram homogeneizadas em vórtex e incubadas a 37 ⁰C por 15 minutos com

Componentes do MIX de PCR (Concentração de estoque)

Concentração para PCR

Volume para 1 reação

Água ultrapura - 21,1 µl

Tampão (10X) 1X 4,0 µl

MgCl2 (50 mM) 2 mM 1,6 µl

dNTP´s (2 mM) 0,2 mM 4,0 µl

Primer senso (10 µM) 0,5 µM 2,0 µl

Primer antissenso (10 µM) 0,5 µM 2,0 µl

Taq DNA Polimerase (5 U/µl) 1,5 U/ µl 0,3 µl

DNA molde 10 ng 5,0 µl

Volume final: 40,0 µl

28

posterior centrifugação a 6000 rpm por 15 minutos para realizar a separação dos

componentes precipitados do DNA.

O sobrenadante foi descartado e em seguida foram adicionados 125 µl de

etanol 80% gelado, sendo então centrifugado a 4500 rpm por 2 minutos para remoção

de oligos e nucleotídeos residuais. O sobrenadante foi descartado e os microtubos

foram incubados com as tampas semi-abertas por 5 minutos a 60 ⁰C em termobloco

(IT-2002, Bioplus) para remoção de resíduos de etanol. Para eluição do DNA foram

adicionados 20 µl de água ultrapura MilliQ® e posteriormente as amostras foram

submetidas a eletroforese em gel de agarose a 1,5% por 40 minutos a 100 V para

avaliar a qualidade da purificação.

3.3.3.5 Preparo e envio das amostras de DNA para sequenciamento

O preparo das reações de sequenciamento de DNA foi realizado no Laboratório

de Micologia do Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas (INI), na Fiocruz

do Rio de Janeiro. Para o envio dessas amostras, os produtos de PCR foram

desidratados por secagem a 60 ⁰C em termobloco (IT-2002, Bioplus) e juntamente

com os primers senso e antisenso (3,2 picomol) utilizados na PCR, foram enviados

por Sedex em caixas de isopor em temperatura ambiente.

3.3.3.6 Reações de sequenciamento de DNA

Na reação de sequenciamento foi utilizado o Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle

Sequencing (Applied Biosystems). O DNA foi adicionado na microplaca de 96 poços

(Applied Biosystems) com o primer e água MilliQ®, totalizando um volume de 7,5 µl.

O volume final de 10 µl da reação de sequenciamento para cada poço foi completado

com a adição de 1 µl de BigDye® e 1,5 µl de tampão 5X. As microplacas foram

colocadas em termociclador e as temperaturas de amplificação programadas

conforme instruções do fabricante (97).

29

Após a amplificação e incorporação dos dideoxinucleotídeos (ddNTP´s) aos

fragmentos de DNA, esses produtos da reação de sequenciamento foram submetidos

a precipitação com isopropanol 75% e álcool 75% para remoção de ddNTP´s livres,

seguindo as instruções descritas no Procedimento operacional padrão (POP)

disponível online no site da Rede de Plataformas Tecnológicas da Fiocruz (PDTIS)

(http://plataformas.fiocruz.br/subunidade/exibe_sub/1).

Logo após a esta etapa de purificação, foi adicionada Formamida Hi-di nos

poços para desnaturação do DNA. No Laboratório de Genômica Funcional e

Bioinformática foi realizada a eletroforese capilar no aparelho ABI 3730xl DNA

Analyser (Applied Biosystems) (Figura 5).

3.3.3.7 Determinação do perfil alélico e dos subtipos moleculares (sequences types

-STs)

As sequências nucleotídicas foram recebidas por e-mail (em formato abi.) e

pelo software Sequencher 5.3 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI, USA) foram

analisadas e corrigidas para remoção/substituição de gaps ou de bases nitrogenadas

incorretas, sendo então gerada uma sequência consenso (contig) (Figuar 5).

O algoritmo Muscle presente no software MEGA v6.0.6 foi utilizado para o

alinhamento dos contigs com sequencias já conhecidas (alelos) oriundas do banco de

dados Fungal MLST Database, permitindo então realizar uma segunda revisão das

sequencias nucleotídicas por comparação visual com os alelos já caracterizados

(Figura 5). Utilizando o recurso de alinhamento “Single Locus ID” no site do banco de

dados (http://mlst.mycologylab.org/), as sequencias foram analisadas para

identificação do seu número alélico, sendo considerado como aceitável o índice de

100% de similaridade com alelos já conhecidos e depositados. As sequencias com

alelos novos não apresentaram este valor e por isso foram enviadas para o curador

da Fungal MLST Database para determinar um novo número alélico correspondente

as suas alterações nucleotídicas e depositar a mesma no banco de dados.

Todas os contigs e seus respectivos números alélicos identificados foram

armazenados em uma planilha Excel. E para determinar o número do ST as

30

sequencias dos sete lócus foram copiadas e submetidas ao algoritmo de identificação

polifásica “Multi Loci ID” online da Fungal MLST Database, sendo aceito como

resultado o valor de 100% de similaridade (Figuar 5). O isolado cujas sequencias

apresentaram novos alelos também recebeu um novo número de ST corresponde a

sua ordem de identificação em relação aos já conhecidos.

3.3.4 Análise pelo algoritmo goeBURST

O algoritmo goeBURST disponível pelo software online PHYLOVIZ

(http://www.phyloviz.net/) foi utilizado com o intuito de avaliar as semelhanças

genéticas e relações dos STs presentes no Amazonas com os de cepas oriundas de

outras regiões e países. Inicialmente foi realizado um levantamento de todos os STs

de C. neoformans VNI e C. gattii VGII depositados no banco de dados Fungal MLST

Database (http://mlst.mycologylab.org/) e em seguida o download dos seus perfis

alélicos em arquivos distintos (planilhas no Excel). Artigos científicos foram

consultados para investigar a ocorrência geográfica dos STs, sendo mantidos na

análise somente os STs com origem geográfica conhecida (82,87). O algoritmo

interligou os STs conforme as semelhanças no perfil alélico e os resultados foram

apresentados sob a forma de um diagrama radial. Sequence types que apresentaram

no mínimo seis lócus semelhantes (dentre os sete analisados) foram agrupados,

formando um complexo clonal no qual o genótipo fundador foi centralizado (98).

3.3.5 Avaliação da susceptibilidade antifúngica

Os procedimentos foram realizados de acordo com o protocolo M27-A3

recomendado pela Clinical and Laboratory Standards Institute (99). As soluções

estoque de antifúngicos Anfotericina B (ANF) e Itraconazol (ITZ) foram preparadas

previamente em dimetil sufoxido (DMSO) e a de Fluconazol (FLZ) diretamente em

meio RPMI 1640. Em seguida as soluções foram diluídas em meio RPMI 1640 líquido

(pH= 7,0) e tamponado com ácido morfolino propanossulfônico (MOPS). Todas as

soluções foram armazenadas a uma temperatura de -20 ºC até o momento do uso.

31

Figura 5. Etapas pós-PCR e purificação para definição do perfil alélico e ST de cada isolado. A)

Aparelho (ABI 3730xl DNA Analyser) utilizado para as reações de sequenciamento senso e anti-senso

dos seis lócus e da região IGS1. B) Layout da página de edição das sequências nucleotídicas no

software Sequencher (pontos escuros indicavam os trechos das sequências que necessitavam de

revisão e correção). C) Alinhamento dos contigs no software MEGA. D) Resultados (perfil alélico e ST)

32

apresentados pelo banco de dados Fungal MLST Database após o preenchimento do campo de busca

“Multi Loci ID” com as sete sequências consenso (Fonte: acervo pessoal).

Para a preparação do inóculo fúngico, as cepas foram previamente reativadas

e cultivadas em ágar Saboraud dextrose por 48 horas. Em seguida foi feita a

suspensão de células em 5 ml de solução salina estéril (0,85%) e a quantificação das

mesmas em câmara de Neubauer. De acordo com a quantidade de células presentes

na solução foi calculada uma concentração final de 2x103 células/ml e posteriormente

o volume correspondente do inóculo inicial foi transferido para um novo tubo contendo

10 ml de meio RPMI 1640.

Para a microdiluição em caldo, 100 µl de meio RPMI 1640 e 100 µl da solução

da droga foram transferidos em duplicata para a microplaca de 96 poços com o auxílio

da pipeta multicanal, realizando a diluição seriada da droga do segundo até o

penúltimo poço. E por fim, foram adicionados 100 µl do inóculo fúngico, delimitando a

1ᵃ e a 12ᵃ coluna de poços da placa para o controle positivo (RPMI + Inóculo) e

controle negativo (apenas meio RPMI), respectivamente. A faixa de concentração

testada para o FLZ foi de 0,125 µg/ml a 64 µg/ml e a da ANF e ITZ de 0,062 µg/ml a

16 µg/ml.

As microplacas foram incubadas a 35 ºC por 72 horas, após este tempo foi

realizada a leitura visual da concentração inibitória mínima (CIM), tendo como

comparação o crescimento nos poços do controle positivo (Figura 6). A CIM da ANF

foi determinada como a menor concentração capaz de inibir completamente (100%) o

crescimento fúngico e para os azólicos a que gerou uma redução parcial (50%)

quando comparado ao crescimento nos poços do controle positivo. Para interpretação

dos resultados foram considerados os valores de corte epidemiológicos (VCE)

genótipo-específicos propostos atualmente e que categorizam os isolados como tipos

selvagem “wild-type” (sensíveis) ou não selvagem “non wild-type” (com

susceptibilidade reduzida ou resistente devido a mutações) (100,101).

33

Figura 6. Resultado do bioensaio de microdiluição em caldo RPMI. As faixas de concentração

destacadas em vermelho indicam a CIM dos antifúngicos determinadas por comparação visual do

crescimento fúngico nos poços teste com o dos poços controle.

3.3.6 Análise estatística

Foi criado um banco de dados com as informações clínico-epidemiológicas e

laboratoriais no software Excel. O software R version 3.3.1 (https://www.r-project.org)

foi utilizado para calcular as medidas de estatística descritiva (média, desvio-padrão

e frequência relativa), as variáveis categóricas foram analisadas pelo teste exato de

Fisher e variáveis continuas pelo Teste t de Student e pelo Teste não paramétrico de

Mann-Whitney. O intervalo de confiança aplicado foi de 95% e valor de p (< 0.05)

considerado como nível de significância estatística.

34

3.4 Aspectos éticos

Este projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP)

da FMT-HVD, sendo obtido o CAAE de n⁰ 53952416.1.0000.0005 (Anexo B).

35

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados e discussão foram inseridos em formato de artigo científico em

inglês que será submetido para publicação no Periódico Plos One (instruções para

formatação disponíveis no link: http://journals.plos.org/plosone/s/submission-

guidelines).

36

4.1 Artigo

MLST reveals a clonal population structure for Cryptococcus neoformans

isolates and a new sequence type of Cryptococcus gattii obtained from

clinical sources in Amazonas, Northern-Brazil.

Diego Fernando Silva Rocha1,2, Lucyane Mendes Silva2, Silviane Bezerra Pinheiro2,

Lizandra Stephanny Fernandes Menescal3,4, João Ricardo da Silva Neto4, Katia

Santana Cruz4, Carla Silvana Silva Santos4, Luciana Trilles5, João Vicente Braga de

Souza1,2*.

1 Postgraduate Program in Tropical Medicine, University of State of Amazonas/Tropical Medicine Foundation Dr. Heitor Vieira Dourado, Manaus, Amazonas, Brazil.

2 Mycology Laboratory, Coordination of Society, Environment and Health, National Institute of Amazonian Research, Manaus, Amazonas, Brazil

3 Faculty of Pharmaceutical Sciences, Federal University of Amazonas, Manaus, Amazonas, Brazil. 4 Medical Mycology Laboratory, Tropical Medicine Foundation Dr. Heitor Vieira Dourado, Manaus, Amazonas, Brazil.

5 Evandro Chagas National Institute of Infectious Diseases, Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, Brazil

*Corresponding author:

[email protected] (JVBS)

37

Abstract

Cryptococcosis is considered endemic in the Amazonas state, occurring more

frequently in individuals with Aids that are predominantly affected by C. neoformans

VNI. Infections by C. gattii VGII are more rare but present similar severity and emergent

genotypes (VGIIa and VGIIb) associated with outbreaks in North America have been

reported in the Amazonian environment. Despite this development, several aspects of

the molecular epidemiology of this disease in Amazonas remain unclear, including the

limited use of multilocus sequence typing (MLST) to evaluate the genetic population

structure of clinical isolates (mainly C. neoformans). Therefore, we used MLST to

identify the sequence types of 38 isolates of C. neoformans and C. gattii, and the

goeBURST algorithm was used to evaluate their genetic relationship with global

isolates. Records of 30 patients were analyzed to describe the current scenario of

cryptococcosis in the region, and associations with genotypes were sought afterwards.

Broth microdilution was also performed to determine the susceptibility profile to

antifungals amphotericin B (AMB), fluconazole (FLZ) and itraconazole (ITZ). MLST

identified that patients with HIV (n=26) were exclusively affected by a genetically

homogeneous group of VNI strains (n=33) with the same ST (ST93), and among the

VGII strains (n=4) three STs (ST5, ST172 and the new ST445) were identified. We

also observed for the first time an in-hospital mortality of 54% in the HIV group and

demonstrated that there were no significant differences in the clinical aspects of the

disease among HIV and non-HIV patients, with the exception of visual deficit (p =

0.012) at the baseline. In addition, all isolates were susceptible to the antifungals

tested. Therefore, in Amazonas, VNI isolates show low intragenotypic variability and

have a clonal population structure, with ST93 being of great importance in HIV

individuals and C. gattii being highly diversified.

38

Introduction

Cryptococcosis is a systemic, cosmopolitan and predominantly opportunistic

mycosis whose incidence and mortality have been accentuated by the Aids epidemic,

making it an important public health problem [1–4]. Both pathogens Cryptococcus

neoformans and Cryptococcus gattii constitute species complex widely distributed in

the environment, being associated with bird feces and wood debris, respectively [5–9].

The infection occurs after inhalation contact with these sources, and the yeasts are

spread through the blood or internalized in macrophages ("Trojan horse" mechanism)

to reach the central nervous system, developing meningoencephalitis manifested with

secondary complications [10–13]. C. neoformans has been the most frequently

isolated species in individuals with HIV, being assigned to an estimated annual

occurrence of 1 million cases of meningoencephalitis in the world, resulting in

approximately 700,000 deaths [2].

Concrete estimates on the epidemiology of the disease in Brazil are scarce due

to negligence in non-notification of cases; however, data from the literature and the

Brazilian Ministry of Health revealed that almost 7,000 cases of cryptococcal

meningoencephalitis are diagnosed annually, mainly in the southeast region, of which

90% occur in patients with Aids and whose mortality rate associated with

cryptococcosis is approximately 35-40% [14,15].

In comparison, C. gattii infections are more rare and considered as primary

because they occur in individuals with no known risk factors; however, there is

evidence that intrinsic deficiencies in specific defense mechanisms may predispose

certain individuals to C. gattii, demonstrating its masked opportunism [16,17]. The

geographic occurrence of C. gattii has expanded beyond tropical and subtropical

regions, as in the north and northeast of Brazil, where it is endemic [18–22]. Its

importance has been attributed to the potential for genetic recombination that may

favor its adaptation in hostile environments, high genotypic diversity and emergence

as an agent causing outbreaks in North America, as well the lower susceptibility to

azoles [20,21,23–27].

The genotypic variability of cryptococcosis agents has been investigated

worldwide with techniques for detecting polymorphisms in DNA by PCR that initially

allowed the identification of molecular types VNI and VNII of C. neoformans var. grubii

39

(serotype A), VNIII (serotype AD) and VNIV of C. neoformans var. neoformans

(serotype D) and the genotypes VGI, VGII, VGIII and VGIV not correlated with

serotypes B and C of C. gattii [28,29]. Hybrid genotypes among species such as

VGI/VNIV (serotype BD) and VNI/VGI (serotypes AB) were also discovered [30,31].

However, it became necessary to use a method with greater reproducibility and

distinguishing ability among isolates of the same genotype, also facilitating

comparisons between strains of different geographical origins. A strategy was

proposed by a consensus of members of the International Society for Human and

Animal Mycology (ISHAM) to genotype C. neoformans and C. gattii by multilocus

sequence typing (MLST) and characterize isolates using genetic information obtained

from six conserved genes and the IGS region by DNA sequencing. The sub-genotypes

are defined via an online database (http://mlst.mycologylab.org) and are called

sequence types (STs) [32].

Several aspects of the molecular epidemiology of cryptococcosis in the

Amazonas state remain unclear. Previous regional studies are scarce, and most are

limited to the use of PCR-based tools that have demonstrated the prevalence of

molecular types VNI and VGII [6,33–35]. Sequence types of both species have already

been identified in the Amazonas, most of which are from the environment [26,36,37].

The characterization by MLST of regional clinical C. neoformans isolates is necessary

because of their high frequency in patients with Aids [33,34]. Its population genetic

structure and relation with other global isolates has not been investigated yet and is

still poorly understood in Brazil [38]. The report of the presence of the emerging

genotypes (VGIIa and VGIIb) in the Amazonian environment also demonstrate the

importance of using MLST to perform surveillance and to determine its frequency in

the region [26,36]. Clinical isolates with resistance to fluconazole have already been

detected in the Amazonas, and additional studies need to be performed to continue

this screening [33].

Therefore, the current study aimed to use MLST to identify the sequence types

of 38 clinical isolates of C. neoformans and C. gattii from Amazonas state and to

evaluate their genetic relationship with global isolates. Additionally, we sought to

describe the clinical and epidemiological characteristics of patients to evaluate the

current scenario of cryptococcosis in the region and seek associations with genotypes

and determine the susceptibility profile to the antifungal agents amphotericin B (AMB),

fluconazole (FLZ) and itraconazole (ITZ).

40

Materials and methods

Clinical isolates and standard strains

A total of 38 clinical isolates of Cryptococcus, including 34 C. neoformans and

four C. gattii isolates, were recovered from cerebrospinal fluid (CSF) samples (n=30)

and blood cultures (n=8) obtained from 30 patients hospitalized between February

2014 to May 2016 at the Tropical Medicine Foundation Dr. Heitor Vieira Dourado

[Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD)] in Manaus,

Amazonas state (AM). All isolates were maintained in Sabouraud dextrose agar tubes

and kept under refrigeration (4 °C) at the Medical Mycology Laboratory at FMT-HVD.

These microrganisms were hand-picked and purified twice on niger seed plates, and

then only one colony forming unit (CFU) was randomly chosen for further analysis.

Some of these units were recovered from serial CSF samples (n=8) of two patients,

and four isolates were recovered simultaneously from CSF and blood in two cases (S1

Table).

Collection of epidemiological and laboratory data

Medical, epidemiological and laboratory records of all patients were accessed

from the online database of FMT-HVD to obtain detailed case information. Data,

including age, gender, geographic location, most frequent initial symptoms and

developed sequelae, HIV infection status, CD4+ T cell count (were selected only results

obtained at the date closest to the initial diagnosis of cryptococcosis), clinical outcome

(death or survival), need of surgical intervention and hospitalization in the intensive

care unit (ICU) due to complications, clinical forms, time and number of hospitalizations

and the amount of positive cultures recovered in the initial diagnosis and during the

treatment, were described and compared to evaluate the differences in infection

caused by C. neoformans and C. gattii. This study was approved by the FMT-HVD

Human Research Ethical Committee (CAAE 53952416.1.0000.0005). Patients

enrolled in the study gave their written informed consent, and data were analyzed

anonymously.

41

Molecular typing by URA5-RFLP

DNA extraction was performed using the phenol:chloroform:isoamyl-alcohol

method [39]. The major molecular types were first determined by URA5-RFLP analysis

with Sau96I and HhaI (Thermo Scientific, Waltham, USA) enzymes as described by

Meyer et al. (2003) [29]. The genotypes were assigned by comparison with the

respective reference strains: WM 148 (serotype A, VNI), WM 626 (serotype A, VNII),

WM 628 (serotype AD, VNIII), WM 629 (serotype D, VNIV), WM 179 (serotype B, VGI),

WM 178 (serotype B, VGII), WM 161 (serotype B, VGIII) and WM 779 (serotype C,

VGIV).

MLST and goeBURST analyses

MLST analysis was carried out by the individual amplification of the six

housekeeping genes CAP59, GPD1, LAC1, PLB1, SOD1, and URA5 along with the

IGS1 region according to the conditions published previously by the ISHAM [32]. The

PCR products were purified with a modified method employing polyethylene-

glycol/NaCl [40] and were bidirectionally sequenced on an ABI3130 DNA Analyzer with

BigDye Terminators v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) at the

Laboratory of Functional Genomic and Bioinformatics (Fiocruz, Rio de Janeiro, Brazil).

The sequences were manually edited using the software Sequencher 5.3 (Gene Codes

Corporation, Ann Arbor, MI, USA), and the contigs were aligned using the Muscle

algorithm linked to the program MEGA 6.06 [41]. All sequences were analyzed in the

MLST Database (http://mlst.mycologylab.org) to determine the allele number and the

respective ST. DNA sequences of the STs will be submitted to the MLST Database

and to GenBank.

The goeBURST algorithm of PHYLOVIZ software (http://www.phyloviz.net/)

was applied to construct a minimum-spanning tree based on the allelic profile of the

isolates to point the degree of genetic similarity among the regional STs against the

global genotype dataset. A review of the literature was carried out to identify the

42

geographical origin of the STs of VNI and VGII isolates deposited in the MLST

database, and only those with known origin were selected for analysis. The data

reported in two recent studies were also used to check the origin of the STs from Brazil

[26,38]. Distinct colors were applied to illustrate the geographical origins categorized

by continents, and specific colors were attributed to distinguish the STs identified in

Amazonas and in other Brazilian states. In the final diagram, the maximum differences

shown between the molecular subtypes were up to triple locus variants (TLVs) STs.

Antifungal susceptibility test

The antifungal susceptibility test was carried out using the microdilution method

in RPMI broth according to the M27-A3 guideline of Clinical and Laboratory Standards

Institute (CLSI) [42]. The microdilution of the drugs tested were perfomed in duplicate

and in the following ranges: 0.125–64 µg/ml for FLZ (Iberoquímica Magistral, Jundiaí,

Brazil) and 0.03–16 µg/ml for AMB (Sigma Aldrich, Saint Louis, USA) and ITZ (Sigma

Aldrich, Saint Louis, USA).

Cryptococcus isolates were picked twice onto Sabouraud dextrose agar for 48

h and incubated at 35°C. The yeast colonies were transfered to 5 ml of sterile saline

solution (0.85%) and adjusted to a density equivant to 0.5 McFarland standard scale.

Then, 20 µl were removed for counting in a Neubauer chamber, and the inocula were

adjusted to 2.5 × 103 cells in 10 ml of RPMI medium (Sigma Aldrich, Saint Louis, USA).

The 96-well microplates were incubated at 35°C for 72 h, and the MIC of amphotericin

B was determined as the lowest concentration able to completely inhibit fungal growth

(100%) and to the azoles that generated partial reduction (50%) compared with the

growth control wells. The interpretation of MIC values was based on the following

genotype-specific epidemiological cut-off values (ECVs): AMB (0.5 µg/ml), FLZ (8

µg/ml) and ITZ (0.25 µg/ml) to VNI and AMB (1 µg/ml), FLZ (32 µg/ml) and ITZ (0.5

µg/ml) to VGII strains [43,44].

Statistical analyses

43

Statistical data were analyzed with R Software version 3.3.1 (https://www.r-

project.org) and presented descriptively using relative frequency, mean and standard

deviation. The variables were compared between groups defined according to HIV

infection status and the corresponding infecting species. Fisher’s exact test was used

to analyze categorical variables due to values smaller than five in the contigency table.

Continuous variables were compared using Student’s t-test and the non-parametric

Wilcoxon Rank-Sum Test. Relative risk (RR) and the corresponding 95% confidence

interval (CI) were also calculated. All statistical tests were two-tailed, and a P value

<0.05 was considered as the level of statistical significance.

Results

Clinical and epidemiological data

Clinical, epidemiological and laboratory data were obtained for the 30 patients

investigated. Most of them were from Manaus (25; 83%) and from other municipalities

such as Manacapuru (1; 3%) in the metropolitan region, Manicoré (1; 3%) and Jutaí

city (1; 3%), located respectivelly in the south and southwest of Amazonas. Two non-

autochthonous cases were also diagnosed at FMT-HVD, one from Boa Vista (Roraima

State – North of Brazil) and the other from Rio de Janeiro (Southeast of Brazil) (Fig.

1).

Fig 1. Map of Brazil showing the cities of origin of the 30 patients studied and

the corresponding infecting species (indicated by circle and triangle shapes)

and sequence types (different colors) identified in each location. QGIS v.2.16.1

were used to construct the map.

The majority of the patients were male (19; 73%), and the mean age was 39.8

± 12.2 with a range of 19-68 years. HIV infection was reported for 26 patients (87%),

of which 17 (74%) presented CD4+ T-cell counts below 50 mm3/ml, and all of them

were affected only by C. neoformans. Neurocryptococcosis was the most frequent

clinical presentation (29; 97%), and, of these cases, 10 (34%) were also associated

with blood infection; only one HIV patient had fungemia alone. The most common initial

44

signs and symptoms were headache (28; 93%), fever (21; 70%), weight loss (17; 57%),

disorientation (14; 47%) and visual impairment (11; 37%). Four (13%) patients also

used CSF derivation systems to overcome intracranial hypertension. Neurological

sequelae, such as decreased visual acuity (10; 33%), hearing deficit (4; 13%), motor

deficit (3; 10%), hydrocephalus (3;10%) and hyposmia (2; 7%), were more frequent in

the HIV population. Moreover, in-hospital mortality was observed for half of the patients

(15; 50%), mainly those with HIV (14; 54%), during the first 100 days after admission

(Table 1).

Tabel 1. Comparison of clinical, epidemiological and laboratory features of

patientes with cryptococosis in Amazonas according to the HIV infection status.

Variables

HIV positive

C. neoformans

N = 26 (%)

Non-HIV

C. gattii

N = 4 (%)

P-value

(RR/CI)

Demographics

Male sex 19 (73) 1 (25)

Age in years (Mean ± SD) 39.2 ± 12.3 44.5 ± 12.1

Age (Range) 19-68 30-55

Clinical presentation at baseline

Headache 24 (92) 4 (100)

Nausea/Vomiting 18 (73) 4 (100)

Fever 18 (69) 3 (75)

Weight loss 14 (54) 3 (75)

Disorientation 12 (46) 2 (50)

Visual deficit 7 (27) 4 (100)

0.012

(0.2 / CI: 0.14 –

0.5)

Cough 7 (27) 2 (50)

Seizure 6 (23) 1 (25)

Dizziness 6 (23) 1 (25)

Dyspnea 4 (15) 1 (25)

Photophobia 4 (15) 1 (25)

Neck stiffness and others meningeal signals 3 (11.5) 1 (25)

Papilledema 1 (4) 1 (25)

CD4+ T cells/mm3 23 (88.5) 0

> 50 cells/mm3 6 (26) -

< 50 cells/mm3 17 (74) -

45

RR: relative risk, CI: confidence interval, SD: standard deviation.

To find significant differences in the clinical phenotype of the disease between

HIV and non-HV patients, the variables were compared between these two groups

(Table 1), but no statistically significant differences were found, with the exception of

visual deficit development (p = 0.012) at the baseline. The relative risk value (0.2, CI:

0.14 – 0.5) indicated that these impairments can be more clinically relevant in the non-

HIV patients affected by C. gattii.

Clinical forms

Neurocryptococosis 15 (58) 4 (100)

Neurocryptococosis + fungemia 10 (38) 0

Fungemia 1 (4) 0

Positive cultures (+) obtained on

hospitalization

(Mean ± SD) 2 (1 - 3.8) 1.5 (1 - 2.2)

Hospitalizations

(Mean ± SD) 1 (1 – 3) 1 (1 – 1.2)

Hospitalization Time

Days (Mean ± SD) 57 (36.2 – 84)

57 (48.8 –

67.5)

Need of CSF shunt 3 (11.5) 1 (25)

Outcome

Death 14 (54) 1 (25)

Hospital discharge 12 (46) 3 (75)

Admission to death (time in days)

< 100 7 (50) 1 (100)

101 – 200 1 (7)

>200 6 (43)

Sequels

Decreased visual acuity 10 (38) 1 (25)

Decreased hearing acuity 4 (15) 0

Motor deficit 3 (11.5) 0

Hydrocephalus 3 (11.5) 0

Hyposmia 2 (8) 0

46

MLST and phylogenetic analyses

URA5-RFLP analyses, identified 34 clinical C. neoformans and four C. gattii

isolates as the major molecular types VNI and VGII, respectively. In addition, MLST

analyses divided these 38 strains into five STs. Among the C. neoformans var. grubbii

(VNI) isolates were identified the previously known ST93 (33, 97%), having been the

first report of ST93 as the most prevalent sub-genotype of opportunistic strains that

affect immunosuppressed patients in northern Brazil. Only one strain showed the ST2

(3%), and this was recovered from the non-autochthounous case that came from Rio

de Janeiro (Fig. 1). Despite the few C. gattii strains obtained, MLST identified three

different STs as the previously known ST172 (2; 50%), ST5 (1; 25%) and newly

identified ST445 (1; 25%). No genotypic differences were observed among the strains

recovered from serial CSF samples and from clinical different specimens

simultaneously, excluding the possibility of mixed infections.

For the VNI isolates, the goeBURST algorithm identified that ST94, ST95,

ST177, ST195, and ST540 are closely related genetically with ST93 and that these

isolates differ from ST32 by only one locus (GPD1), which suggests this ST as the

probable evolutionary ancestor of ST93 (Fig. 2A). The ST128 of C. gattii were indicated

by this algorithm as having allelic profiles more similar to the new ST445 (triple locus

variant of ST128) (Fig. 2B). In a regional context, few STs of C. gattii from Amazonas

showed genetic similarities among themselves (CC288, CC20 respectively and its

SLVs) (Fig. 2C).

Fig 2. Minimum spanning trees (MST) constructed with goeBURST algorithm A) MST showing the genetic and geographic links of 92 STs of C. neoformans VNI. Data of geographic origin were obtained from Ferreira-Paim et al. (2017) (38). B) MST constructed with data of 124 STs of C. gattii VGII obtained from Souto et al. (2016) (26) and Alves (2016) (37). In the final diagram only the most genetic related (up to TLVs) STs were keeped, totalizing 93 STs. C) MST highlighting the allelic diferences among 14 STs, including those from Amazonas, the three main emergent VGII sub-genotypes (VGIIa, VGIIb and VGIIc) and also the most ancient VGII sequence type (ST278) from Brazil. The numbers inside the circles correponds to the STs identification. The circles size is proportional to the number of isolates per each ST. Circles surrounded by yellow lines represent the founder of each clonal complex. Numbers outside de circles indicate the amount of different locus between

47

the STs. Different colors were applied to categorize the STs according to their geographic origin: light green (STs found in Amazonas), dark green (other brazilian states), blue (Africa), purple (Asia), red (Europe), orange (Oceania), black (North America countries), dark yellow (Central America) and gray (Other South America countries).

MIC results

An antifungal susceptibility test was perfomed with one strain per patient (n=30).

The antifungals AMB, FLZ and ITZ showed satisfactory inhibitory activity against all C.

neoformans and C. gattii strains considered as wild-type (susceptible) isolates

according to ECVs, regardles of the C. gattii isolates having showed a geometric mean

(GM) four times higher than those of C. neoformans. The highest MIC (32 µg/ml) for

FLZ was observed in both ST172 strains of C. gattii. The MIC range and geometric

mean of each drug tested are presented in Table 2.

Table 2. Differences in the MIC ranges and geometric means obtained of the wild

type VNI and VGII strains and the total of isolates with their respective MIC value.

48

Genotypes (total)

Amphotericin B

Fluconazole

Itraconazole

GM MIC (µg/ml)

GM MIC range (µg/ml)

GM MIC range (µg/ml)

0.03 0.06 0.125 0.25 2 4 8 16 32 0.03 0.06 0.125 0.25 0.5

VNI – ST93 (25) 0.06

10 6 5 4

4.57 2 15 8 - -

0.07 10 3 6 6 -

VNI – ST2 (1) - - 1 -

1 - - - -

1 - - - -

VGII – ST5 (1)

0.06

- 1 - -

19.0

- - - 1 -

0.29

- - 1 - -

VGII – ST172 (2) 1 - 1 - - - - - 2 - - - 1 1

VGII – ST445 (1) - 1 - - - - 1 - - - - - - 1

49

Discussion

We note that VNI and VGII are the genotypes of greater clinical importance in

Amazonas due to their endemicity, mainly of VNI in HIV patients [33,34]. In the current

study, some regional aspects of the molecular epidemiology of cryptococcosis were

elucidated for the first time by applying the MLST. Using this tool, we showed

indications that immunosuppressed patients from northern Brazil are affected by a

clonal group of VNI strains presenting ST93, a widely distributed subtype genetically

close to African and Asian STs [38,45–47]. These findings are new for the region and

demonstrate the low intragenotypic diversity of C. neoformans. For C. gattii isolates,

MLST revealed a new subtype (ST445), highlighting the high genetic diversification

ability of VGII strains from Brazil [26].

A more detailed and updated epidemiological picture of cryptococcosis in

Amazonas was also described in this current investigation, and we observed that the

clinical aspects of the disease among HIV and non-HIV patients were very similar. The

immunological condition of the patients can influence the development of eye injuries

and, consequently, a patient’s prognosis. Our results are thus the first to report the

antifungal susceptibility profile of these distinct STs; however, it was not possible to

establish correlations, as only the reduced susceptibility of C. gattii isolates, mainly

ST172, was noted.

Few studies on the epidemiology of cryptococcosis in Amazonas state (north of

Brazil) have been performed, and the scarce data has shown the endemicity of

cryptococcal meningitis caused by C. neoformans in our region [3,33,34]. According to

data obtained from records of the Mycology laboratory of the FMT-HVD in Manaus,

cryptococcosis was the most frequent systemic mycose diagnosed during the last 3

years, with an average annual occurrence of 33 cases, being more prevalent in HIV

patients (82%). Comparing this information with previous published data of the same

foundation, a slight increase in the frequency of the disease was observed [33].

No significant change in the epidemiological characteristics of the disease in

Amazonas was noticed, despite the slight increase in its occurence.

Meningoencephalitis caused by C. neoformans VNI remain the most important fungal

infection in HIV male patients aged between 20-45 years (mean of 39 years old), as

50

already reported by regional surveys [3,33,34]. These same profiles have been

observed in the Aids-associated cryptococcal meningoencephalitis cases reported

from African and Asiatic cohorts, as well as in other Brazilian studies, demonstrating

the epidemiological association of both diseases [1,4,38,48,49]. Especially in

Amazonas, the epidemic scenario of Aids cases that arose in the last few years can

explain the emergence of new cryptococcosis cases [4].

We also verified that 65% of HIV patients showed severe immunosuppression

(CD4+ count <50 cells/mm3) in the baseline, and all presented late for mycological

diagnosis with signs and symptoms of disseminated infection and neurological

impairment, which may have contributed to the high mortality (54%) observed in the

first hundred days after admission. The low adherence to antiretroviral therapy

(HAART), and even the absence of early detection strategies of HIV and related

opportunistic agents such as cryptococcosis, are factors that contribute to the

occurrence of such injuries [4]. The use of an immunoassay for the detection of

cryptococcal antigen (CRAG) incorporated to the HIV testing would overcome this

situation by screening asymptomatic patients with CD4 <200 cell/µl, allowing the

initiation of pre-emptive treatment and preventing morbidity and mortality [50]. Its

applicability in assessing the prevalence of antigenemia is still barely studied in Brazil

[51] and in Amazonas, where its use was recently initiated in the FMT-HVD for the

investigation of restricted cases, according to information from the mycology

department.

Despite the low number of patients evaluated, which is proportional to the

annual occurrence of cryptococcosis in the region, the frequency of initial symptoms

and the lethality that we describe is similar to larger studies conducted in areas with a

high burden of cryptococcal meningitis such as South Africa and in Brazil; however, a

lower proportion of deaths (28% after a year) were observed in HIV patients from the

United States, maybe because it is a developed country [47,48,52,53].

The altered mental status has been described as a contributing factor for death

in patients with Aids-related cryptococcal meningitis, and in the current study, this

condition was detected in 46% of cases, corroborating the demonstrated lethality

[48,52–54].

51

Visual impairment may occur as a secondary manifestation of cryptococcal

meningitis in 20-40% of cases, both in patients with and without HIV, and a similar rate

was also observed in the present study (36.6%) [48,53]. The causes are multifactorial

and could be to neuritis and compression of the optic nerve, direct parasitism,

papilledema and increased intracranial pressure being the most suggestive [55–57]. A

low frequency of papilloedema was observed, being described in only 2 patients, one

with and one without HIV. The use of a CSF shunt reported in 4 cases serves as an

indication of complications due to an increase in intracranial pressure; however, the

frequency of visual deficit was greater, demonstrating that other etiological

mechanisms could be involved, thus making it necessary to carry out a more detailed

investigation for a better understanding of its etiopathogeny.

Interestingly, when comparing groups (HIV and non-HIV), visual impairment

was the only variable whose frequency was statistically different between the groups

HIV and non-HIV, being more important in the immunocompetent patients affected by

C. gattii, since HIV infection was considered a protection factor; this can be explained

by the more exacerbated inflammatory responses developed by immunocompetent

individuals [58,59]. However, 38% of individuals with HIV developed or maintained a

visual deficit as a neurological sequel, which may have occurred due to the action of

HAART-induced immune reconstitution [58]. More patients need to be evaluated to

confirm these observations, and an investigation of the immunological mechanisms

involved is required.

For the first time, we report that ST93 is the main sub-genotype of VNI strains

that affect immunosuppressed patients in the north of Brazil. Alves (2016)37 isolated

this ST from household dust in a rural community close to Manaus, demonstrating that

it is established and widely distributed in the region. These results corroborate with

data recently released by an unique Brazilian study that analyzed a greater number of

isolates from Minas Gerais state and described a high prevalence of ST93 in

individuals with Aids as well as in environmental samples [38]. This ST has also been

observed in Aids cases from African and Asian countries, mainly South Africa and

India, as highlighted by goeBURST analysis [45–47].

Despite the limited number of isolates analyzed that could have decreased the

chance to detect other STs, our findings are pioneering in the region and important for

providing indications that regional VNI strains show a low intragenotypic diversity.

52

Similar results were described by two broad molecular investigations conducted in

Asia, and this limited genetic diversity can be assigned to a lesser ability to perform

genetic recombination favoring the occurrence of clonal reproduction and expansion

of these isolates [38,46,60]. However, VNI isolates from Africa are the most diversified

when compared with global isolates due to their ability to reproduce both clonally or

sexually, which can lead to recombinations and mutations in the genome and thus in

genotypic variability. Phylogenetic and population genetic analyses have indicated that

global VNI isolates descend from African strains and that pigeons facilitated their global

dispersal, which justifies the presence of ST93 in different continents, including the

North of Brazil [38,47,60–62].

Only 1 isolate of C. neoformans presented ST2, and this was not considered as

belonging to Amazonas because it was obtained from a patient in Rio de Janeiro

(Southeast Region). This is the first clinical report in Brazil, since it was only identified

in a single environmental sample in Minas Gerais, demonstrating that this subtype

occurs in low frequency in this region [38]. The same ST has already been identified

in Africa and the United States and shows a high prevalence in Germany [47,63,64].

Regarding the VGII isolates, we describe the identification of the new ST445

(whose alleles were already known) and two cases of meningoencephalitis by ST172

in patients coming from rural areas of Amazonas, being one from Manaus and the

other from the municipality of Jutaí in the Southwest of the state, and this is the first

report of this ST in the region, as it was only identified previously in a clinical strain

from São Paulo (southeastern Brazil) [26]. ST5 was isolated from a HIV-negative male

patient, who was a user of illicit drugs that died even when treated with liposomal

amphotericin. This ST was reported in Australia in a single veterinarian isolate and was

identified in Brazil only in the northern region in the states of Pará and Amazonas,

where it is one of the most frequent subtypes, probably because it is better adapted to

the local environmental conditions; however, there are no clinical data or evidence of

virulence related to this subtype [24,26].

Using goeBURST analysis, we also observed that ST5 is genetically close

(SLV) to the ST288 identified exclusively in Amazonas, suggesting that its origin is

local [26]. The aerial dispersion of propagules favored by climatic events and human

or animal migration are supposed mechanisms that justify the presence of a ST in

different regions as observed in this study, also contributing to the introduction of

53

genetically recombinant strains into new ecological niches with potential virulence to

develop outbreaks. In this small group of VGII isolates analyzed, three STs were

detected, complementing the high genetic diversity already described in Brazil, which

is attributed to the potential for recombination in the genome induced by sexual

reproduction events [24,26,65].

According to the ECVs, all isolates were considered sensitive to the three

antifungal agents evaluated, although C. gattii VGII presented geometric mean values

more accentuated for azoles, mainly to FLZ, with ST172 being identified with the

highest MIC (32 µg/ml). This Brazilian ST was recently identified, and there are no

other data reporting their reduced susceptibility to FLZ, ours being the first [26].

An association of the VGII genotype with a lower susceptibility to FLZ has been

widely described [25,66,67], even in Amazonas, where a disc-diffusion assay noted

the occurrence of two clinical isolates with FLZ resistance [33]. However, is important

to describe which VGII STs may be strongly associated with this reduced susceptibility

and if there are differences in the susceptibility profile of similar STs obtained from

different locations, since the data are scarce and still need broader investigations to

state an accurate correlation. Preliminary data were shown by Iqbal et al. (2010) [68],

who demonstrated that distinct subtypes can present significant differences in MIC, as

observed with the STs from the Pacific Northwest of the United States, being ST6

(VGIIc), ST7 (VGIIb) and ST20 (VGIIa), considered as the least susceptible to azoles.

The higher geometric mean of FLZ for C. gattii isolates, as well as the variability

in MIC values among identical STs, can be attributed to the mechanism of

heteroresistance. Subpopulations of cells of a given isolate, independent of the

pathogenic species, innately have the ability to duplicate chromosomes containing

genes of FLZ resistance. Thus, they become able to tolerate increasing concentrations

of this antifungal, featuring a survival mechanism of such agents against the stress

generated by the drug in vitro or in vivo, and evidence showed that heteroresistance

in C. gattii is more pronounced than in C. neoformans [69–71].

The VNI isolates from this study were totally susceptible to the antifungal

agents, and these data corroborate with the literature, including information obtained

on VNI strains from Brazil and with previous data of Amazonas [6,25,33,72]. However,

we demonstrated for the first time that ST93 strains from this state are sensitive to

54

AMB and to azoles, and these data are new for Brazil. Contradictory results were

obtained by Khayhan et. al (2013) [46] when analyzing the antifungal susceptibility of

52 Asian ST93 strains; they observed the occurrence of simultaneous resistance to

FLZ and to flucytosine in 5 isolates from Indonesia. Comparing these facts, it is

possible to note that similar STs may have different susceptibility profiles, probably due

to the environmental and climatic differences of their different regions of origin that may

influence the antifungal response [67].

Conclusion

In conclusion, C. neoformans VNI strains from Amazonas compose a

genetically homogeneous group of isolates that commonly presented ST93. This ST

showed a great clinical and epidemiological importance due to the frequent morbidity

and mortality associated with cryptococcal meningoencephalitis in individuals with Aids

in this state and probably in northern Brazil. Some authors speculate that the

establishment and predominance of some subtypes of C. neoformans in Brazil may

have been favored by isolated events of genetic recombination in its African ancestors,

which later spread to several continents and maintained a clonal expansion

mechanism. The identification of three STs of C. gattii among 4 isolates confirmed the

high genetic diversity of VGII strains in South America, being noted as a close genetic

relation of these subtypes with other Brazilian STs. The clinical features of the disease

among HIV and non-HIV patients were very similar, but the more evident inflammatory

response in immune-competent individuals was demonstrated to be a factor that

differentiates the clinical phenotype, assigned as one of the mechanisms that trigger

the visual deficit. Based on the MIC values obtained by in vitro conditions, all isolates

were considered as susceptible to the antifungal drugs evaluated, but the use of FLZ

deserves attention due to its limited ability to inhibit the growth of C. gattii strains, and

these data can be predictive of clinical failure.

Acknowledgments

55

We thank the medical staff of the FMT-HVD, and all participating patients for the clinical

and epidemiological data generated. We thank the Mycology and Mycobacteriology

laboratories of the National Research Institute of Amazonia (INPA) for assistance with

equipment and reagents. To Joycenéa da Silva Matsuda, Antônio Alcirley Balieiro and

Fernanda Rodrigues Fonseca of Lêonidas & Maria Deane Institute, Oswaldo Cruz

Foundation (ILMD, FIOCRUZ-AM) for help in using the software for statistical analysis

and on the elaboration of the map. In addition, we are also thankful to the Laboratory

of Functional Genomics and Bioinformatics of Oswaldo Cruz Institute (Fiocruz, RJ) for

the indispensable support in the DNA sequencing reactions.

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62

Fig 1.

63

Fig 2A.

64

Fig 2B.

65

Fig 2C.

66

Fig 2. Color legend.

67

Supporting information

S1 Table. Patients informations and molecular data of all isolates analysed.

Allelic profile

Patient code

(Gender/age)

HIV

infection Origin

Year of

diagnosis

Samples

obtained Genotypes CAP59 GPD1 IGS1 LAC1 PLB1 SOD1 URA5 ST

1 (F/32) Yes Manaus, AM 2014 CSF VNI 1 23 10 3 4 1 1 ST93

2 (M/35) Yes Manaus, AM 2014 CSF VNI 1 23 10 3 4 1 1 ST93

Blood VNI 1 23 10 3 4 1 1 ST93



5 (F/28) Yes Manicoré, AM 2014 CSF VNI 1 23 10 3 4 1 1 ST93

6 (F/36) Yes Manaus, AM 2014

CSF VNI 1 23 10 3 4 1 1 ST93

CSF VNI 1 23 10 3 4 1 1 ST93

CSF VNI 1 23 10 3 4 1 1 ST93

CSF VNI 1 23 10 3 4 1 1 ST93

CSF VNI 1 23 10 3 4 1 1 ST93


8 (F/55) No Jutaí, AM 2015 CSF VGII 4 17 80 16 1 88 7 ST172

9 (M/68) Yes Manaus, AM 2015 Blood VNI 1 23 10 3 4 1 1 ST93


11 (M/51) Yes Rio de Janeiro, RJ 2015 CSF VNI 7 1 1 1 1 1 2 ST2



68


15 (F/39) No Manaus, AM 2015 CSF VGII 4 17 80 16 1 88 7 ST172






Blood VNI 1 23 10 3 4 1 1 ST93



23 (F/52) Yes Manaus, AM 2016

CSF VNI 1 23 10 3 4 1 1 ST93

CSF VNI 1 23 10 3 4 1 1 ST93

CSF VNI 1 23 10 3 4 1 1 ST93

24 (F/57) Yes Manacapuru, AM 2016 CSF VNI 1 23 10 3 4 1 1 ST93



27 (M/55) Yes Boa Vista, RR 2016 Blood VNI 1 23 10 3 4 1 1 ST93

28 (M/54) No Manaus, AM 2016 CSF VGII 3 16 15 4 9 23 2 ST5


30 (F/30) No Manaus, AM 2016 CSF VGII 2 6 26 21 1 27 7 ST445

69

5 CONCLUSÃO

A Neurocriptococose causada por C. neoformans VNI é endêmica em indivíduos

com HIV no Amazonas e seus aspectos clínico-epidemiológicos são um reflexo da

pandemia de Aids. A morbimortalidade regional é significativa e semelhante a de

outras localidades, no entanto o negligenciamento por parte dos órgãos de saúde

competentes limitam o estabelecimento de estratégias de prevenção e de diagnóstico

precoce contribuindo para a crescente frequência da criptococose e de seus agravos.

Casos por C. gattii em indivíduos sem HIV ou outros fatores de risco conhecidos

ocorrem em menor frequência, porém anualmente e com gravidade similar ao dos

pacientes com HIV.

Indivíduos com e sem HIV podem desenvolver déficit visual de forma secundária

a meningoencefalite criptocócica e tal condição é de etiologia multifatorial, sendo o

processo inflamatório um dos mecanismos responsáveis e correspondente a

capacidade de gerar resposta imune eficaz que é mais evidente nos pacientes hígidos.

O ST93 é o subtipo molecular mais prevalente dentre as cepas clínicas VNI do

Amazonas, que demonstraram ser um grupo homogêneo de isolados com

características indicativas de expansão e reprodução clonal. Este ST tem uma

importância clínica e epidemiológica por estar associado com frequente

morbimortalidade por meningoencefalite criptocócica em indivíduos com Aids neste

estado e provavelmente no norte do Brasil. O ST93 apresenta ampla distribuição

geográfica, sendo também endêmico em áreas de alta prevalência de criptococose

oportunista como na Ásia e África e seu perfil alélico é semelhante ao de STs destas

localidades, principalmente com os africanos.

Ao contrário do observado nas cepas VNI, isolados clínicos VGII do Amazonas

apresentam diversidade de STs, cujo perfil alélico é próximo ao de outros STs de

origem brasileira.

Os casos de infecção por C. gattii VGII mesmo sendo mais raros, necessitam

de vigilância clínica e laboratorial devido a susceptibilidade reduzida dos isolados ao

Fluconazol que pode ser preditiva de falência terapêutica.

70

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7 ANEXOS 7.1 Anexo A - Primers dos sete lócus analisados pelo mlst e suas respectivas temperaturas de amplificação.

pb= pares de bases; Cu = Cobre; Zn = Zinco; F (Foward) = primer senso; R (Reverse) = antisenso; min = minutos; seg = segundos. Adaptado

de Meyer et al. (2009)72.

Lócus (pb)

Produto gênico Iniciadores Condições de amplificação

CAP59 (559)

Proteína capsular (fator de virulência)

CAP59 F 5′ CTCTACGTCGAGCAAGTCAAG 3′ CAP59 R 5′ TCCGCTGCACAAGTGATACCC 3′

94°C por 3 min / 40 ciclos: 94 °C por 30 seg, 56 °C por 30 seg, 72 °C por 1 min / 72 °C por 6 min

LAC1 (469)

Lacase (fator de virulência)

LAC1 F 5′ AACATGTTCCCTGGGCCTGTG 3′ LAC1 R 5′ ATGAGAATTGAATCGCCTTGT 3′

94 °C por 3 min / 40 ciclos: 94 °C por 30 seg, 58 °C por 30 seg, 72 °C por 1 min / 72 °C por 6 min

PLB1 (532)

Fosfolipase (fator de virulência)

PLB1 F 5′ CTTCAGGCGGAGAGAGGTTT 3′ PLB1 R 5′ GATTTGGCGTTGGTTTCAGT 3′

94°C por 3 min / 40 ciclos: 94°C por 45 seg, 61°C por 45 seg, 72°C por 1 min / 72 °C por 6 min

URA5 (601)

Orotidina monofosfato pirofosforilase

URA5 F 5′ ATGTCCTCCCAAGCCCTCGAC 3′ URA5 R 5′ TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC 3′

94°C por 3 min / 40 ciclos: 94°C por 45 seg, 63°C por 1 min, 72°C por 2 min / 72 °C por 6 min

GPD1 (543)

Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

GPD1 F 5′ CCACCGAACCCTTCTAGGATA 3′ GPD1 R 5′ CTTCTTGGCACCTCCCTTGAG 3′

94°C por 3 min / 40 ciclos: 94°C por 45 seg, 63°C por 1 min, 72°C por 2 min / 72 °C por 6 min

SOD1CN (700)

Cu, Zn superóxido dismutase

Primers para Cryptococcus neoformans SOD1CN F 5′AAGCCTCTCATCCATATCTT 3′

SOD1CN R 5′TTCAACCACGAATATGTA 3′ 94°C por 3 min / 40 ciclos: 94°C por 30 seg, 52°C

por 30 seg, 72°C por 1.5 min / 72 °C por 6 min

SOD1CG (700)

Primers for Cryptococcus gattii SOD1CG F 5′ GATCCTCACGCCATTACG 3′

SOD1CG R 5′ GAATGATGCGCTTAGTTGGA 3′

IGS1 (723)

Espaço intergênico do RNA ribossomal

IGS1 F 5′ ATCCTTTGCAGACGACTTGA 3′ IGS1 R 5′ GTGATCAGTGCATTGCATGA 3′

94°C por 3 min / 40 ciclos: 94°C por 30 seg, 60°C por 30 seg, 72°C por 1 min / 72 °C por 6 min

80

7.2 Anexo B – Parecer do CEP da FMT-HVD

81

7.3 Anexo C - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)

86

7.4 Anexo D - Formulário aplicado para entrevista e coleta de dados clínico-epidemiológicos e laboratoriais

Prontuário: Código do paciente: Entrada na FMT-HVD: Veio de outro hospital?

INFORMAÇÕES SOCIODEMOGRÁFICAS

Nome do paciente:

Nome da mãe:

Idade: Sexo: Masculino Feminino Naturalidade: Profissão atual:

Endereço atual: CEP:

Tempo nesta moradia: Tipo de residência: Alvenaria Madeira sem pintura Madeira com pintura

ATIVIDADES OU EXPOSIÇÕES DE RISCO

Construção civil Visita a cavernas Criação de aves em domicílio Exposição a fezes de Pombo Agricultura Mineração

Morador de rua Jardinagem Carpintaria Marcenaria Nenhuma dessas condições Trabalha em Demolições Mora próximo a madeireira Contato com Galinheiro Visita a Áreas Endêmicas (Austrália, Canadá, . Costa do Pacífico EUA, Nordeste Brasileiro)

Outros:

FATORES DE RISCO PRÉ-EXISTENTES

Alcoolismo Tabagismo Uso de drogas ilícitas Diabetes mellitus Cirrose HAS Hepatite Qual____________ Transplante Qual:_______________________________ Gravidez Neoplasia Qual: ______________________________

Doença cardiovascular Doença renal crônica TB Leucemia Linfoma Doença auto-imune Qual:_____________________ Uso de anti-TNF Qual:___________________________ Data Início ___/___/___ Data Término ___/___/___ Uso de corticoesteróides

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Qual:________________________Data Início ___/___/___ Data Término ___/___/___ Outro Imunossupressor Qual:________________________

HIV: Sim Não Uso da TARV: Regular Irregular Não iniciada Esquema TARV: Data Início: ___/___/___

Data em que foi diagnosticado com HIV: ___/___/___ A criptococose foi a doença definidora de AIDS? Sim Não

Outro fator de risco? Qual? Não apresentou nenhum fator de risco (imunocompetente)

MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS

Cefaleia Febre Náuseas Vômitos Anisocoria Convulsão Desorientação Tosse Dispnéia Perda Ponderal >10% <10% Tontura Dor Torácica Déficit de memória Bradicardia Hipertensão Zumbido Fotofobia Estrabismo Amaurose Diplopia Déficit Focal Diminuição Acuidade Auditiva Diminuição Acuidade Visual Papiledema Descerebração (extensão de membros superiores e inferiores) Desvio conjugado do olhar Rigidez de nuca Síndrome Cerebelar

Lesão pulmonar: Sim Não / Tipo: Infiltrado intersticial Nodular Cavitário Derrame pleural

TC Crânio Não Sim Data: ___/___/___ Lesões no SNC: Não Sim Sinais Hipertensão Intracraniana Hidrocefalia Criptococomas Nodulos miliares Ventriculite Dilatação de EVR Pseudocistos gelatinosos ou mucinosos Rx Tórax Normal Alterado Infiltrado Alveolar Infiltrado Intersticial Infiltrado Misto Nódulo Infiltrado Hilar/Mediastinal Cavitação Derrame Pleural

Lesões cutâneas: Sim Não Tipo: Maculopapular Nodulares Celulites Abscessos Úlceras Erupções acneiformes

Foi internado: Sim Não / Qual enfermaria? / Foi para a UTI: Sim Não / Data de entrada na UTI: Saída:

F F F F F

F

F F

F

F

F F F

F F F F

88

EXAMES LABORATORIAIS

ANÁLISE DA PRIMEIRA AMOSTRA DE LÍQUOR POSITIVA Coleta: ___/___/___ Requisição:

TESTES SOROLÓGICOS

Glicose: Proteínas: Lactato: CrAg no LCR

Cloretos: Citometria global: Positivo Negativo Não realizado

Citometria diferenciada: CrAg no soro

Resultado exame direto pelo Gram: Positivo Negativo Não realizado

Result. Ex. Direto p/ Ziehl-Neelsen: Cont. células CD4: CD8: Data: ___/___/___

Result. Ex. Direto nanquim: Carga Viral: Log: Data: ___/___/___

ANÁLISE PELO LABORATÓRIO DE MICOLOGIA DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS SUCESSIVAS

Tipo de Amostra: Data de entrada: : ___/___/___ N⁰ da Requisição: N⁰ de identificação da Amostra: Resultado do exame direto com tinta nanquim: Negativo Raros Frequentes Numerosos Incontáveis Resul. da cultura em Ágar Níger: Negativa Positiva / Quant. De UFC´s: CGB: C.neoformans C. gattii Não realizado Contag. de cels. em 10 µL de LCR não centrifugado (nanquim) – Gemulantes: Não gemulantes: Total: Quant. Cels em 1 mL:


Tipo de Amostra: Data de entrada: : ___/___/___ N⁰ da Requisição: N⁰ de identificação da Amostra: Resultado do exame direto com tinta nanquim: Negativo Raros Frequentes Numerosos Incontáveis Resul. da cultura em Ágar Níger: Negativa Positiva / Quant. De UFC´s: CGB: C.neoformans C. gattii Não realizado

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Contag. de cels. em 10 µL de LCR não centrifugado (nanquim) – Gemulantes: Não gemulantes: Total: Quant. Cels em 1 mL:





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TRATAMENTO

SEQUELAS DESENVOLVIDAS DURANTE A INFECÇÃO Fase de indução

Diminuição da capacidade mental Hidrocefalia Amaurose Início Antifúngico utilizado Dose Fim do trat

Diminuição da acuidade visual Paralisia de nervos cranianos ___/___/___ ___/___/___

RECORRÊNCIA DA CRIPTOCOCOSE DURANTE O TRATAMENTO Fase de consolidação

Recaída (Cultura + após 6 meses de tratamento) Sim Não Data___/___/___

Início Antifúngico utilizado Dose Fim do trat

___/___/___ ___/___/___

DESFECHO CLÍNICO Fase de manutenção

Transferido (Data: ___/___/___) Óbito (Data: ___/___/___) Início Antifúngico utilizado Dose Fim do trat

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Alta hospitalar (Data: ___/___/___) Em atendi (Data: ___/___/___) ___/___/___

___/___/___

Foram realizadas punções de alívio: Sim Não / Quantas: / Quantas amostras de LCR apresentaram cultivo positivo?

universidade do estado do amazonas fundaÇÃo de medicina tropical … · 2018. 7. 24. · medicina...

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