UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA

ESTUDOS BIOQUÍMICOS E MOLECULARES DE GENES DE

TRICHODERMA ENVOLVIDOS NO MECANISMO DE

MICOPARASITISMO

Saulo José Linhares de Siqueira

GOIÂNIA, 2012

I

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA

ESTUDOS BIOQUÍMICOS E MOLECULARES DE GENES DE

TRICHODERMA ENVOLVIDOS NO MECANISMO DE

MICOPARASITISMO

Tese apresentada ao programa de pós-graduação

em Biologia do Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Goiás para obtenção do

grau de Doutor em Biologia, área de concentração

Biologia Celular e Molecular.

Aluno: Saulo José Linhares de Siqueira

Orientador: Prof. Dr. Cirano José Ulhoa

GOIÂNIA, 2012

II

Trabalho realizado no Laboratório Enzimologia, do Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Goiás.

Banca Examinadora:

Titulares:

- Prof. Dr. Cirano José Ulhoa – Universidade Federal de Goiás – Orientador

- Profa. Dra. Eliane Ferreira Noronha – Universidade de Brasília – Examinador externo

- Prof. Dr. Marciano Régis Rubini – Universidade de Brasília – Examinador externo

- Profa. Dra. Fabrícia de Paula Faria – Universidade Federal de Goiás – Examinador Interno

- Profa. Dra. Silvana Petrofeza da Silva – Universidade Federal de Goiás – Examinador

Interno

Suplentes:

- Profa. Dra.Rosália Santos Amorim Jesuíno – Universidade Federal de Goiás

- Profa. Dra. Mariana Torquato Quezado de Magalhães – Universidade Federal de Goiás

III

“Em Jesus Cristo estão escondidos todos

os tesouros da sabedoria e da ciência.”

(Colossenses 2, 2-3)

IV

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pela graça que me concedeu de iniciar este projeto, por poder tê-lo

concluído, por todo aprendizado que obtive durante esse período e por tudo quanto tem feito a minha

vida. Louvo também a Deus, que por causa desta grande experiência em minha vida, colocou no meu

caminho pessoas maravilhosas que muito me ajudaram e que se tornaram grandes amigos, muitos

dos quais eu me dirijo a seguir.

Agradeço ao Professor e meu Orientador Cirano por ter me recebido em seu grupo de

pesquisa e por toda paciência e dedicação que teve comigo desde as insistentes ligações durante a

elaboração do projeto até a conclusão deste trabalho. Aprendi muito com você enquanto Pesquisador

e também enquanto pessoa. O cuidado que você com o ser humano é algo valioso que vou usar

sempre como exemplo em minha vida. Sou realmente grato por todo o cuidado que você teve comigo

durante esses anos!

Agradeço aos colegas pesquisadores e amigos do Laboratório de Enzimologia: Andrei,

Marcelo, Fabyano, Amanda Souza, Amanda Rafaela, João Paulo, Marcela, Thiago, Renata, Rogério,

Vanessa, Suelen, Pabline, Roberto, Valdirene e Dona Dora (também à Patrícia, Rachel, Rejane,

Luana, que já passaram pelo laboratório). O ambiente de cooperação e de companheirismo deste

laboratório é que faz com que todos amem trabalhar ali!

Agradeço também aos professores e colegas dos outros laboratórios de pesquisa da

Universidade Federal de Goiás que sempre ajudaram fornecendo um reagente ou um equipamento

para realização de experimentos. Agradeço especialmente ao Prof. Alexandre Siqueira Coelho por

todo o suporte de sequenciamento e de bioinformática e à Embrapa Cenargen na pessoa do Prof.

Carlos Bloch pelo uso do espectrômetro de massa.

Meu muito obrigado aos professores do curso de Pós-Graduação em Biologia do ICB da UFG

com quem aprendi bastante nas disciplinas. Meu obrigado aos colegas das disciplinas que cursei

durante este curso pelos momentos agradáveis durante o aprendizado. Agradeço também à Gleize e

o Higo, da secretaria do curso, pelo suporte burocrático e pelo carinho com que atendem os alunos.

Meu obrigado todo especial à minha namorada e esposa Poliana por todo o carinho e apoio

que me dedicou durante esse período da minha vida. Eu te amo demais! Aos meus pais, Dimas e

Ana, e à minha irmã Isabela, por todo amor e por sempre me incentivarem e me ajudarem durante

meus estudos. Aos meus sogros, Nilton e Edna, e ao cunhado Polieser por todo o carinho e confiança

que sempre me deram.

Obrigado a Capes e à UFG pelo apoio financeiro durante o curso.

E como eu já disse numa outra oportunidade: a todas as pessoas que sabem que

participaram desse momento da minha vida e que minha “ótima” memória não permitiu que fossem

mencionadas durante a elaboração deste texto, registro meus sinceros agradecimentos.

V

ÍNDICE

Índice de Figuras IX

Índice de Tabelas X

Resumo XI

Abstract XII

I. INTRODUÇÃO GERAL 1

I.1 – A agricultura e as doenças causadas por fungos 1

I.1.1 – O fungo Rhizoctonia solani 2

I.1.2 – O fungo Sclerotinia sclerotiorum 3

I.1.3 – O fungo Fusarium oxysporum 4

I.2 – O controle biológico e Trichoderma 5

I.2.1 – O gênero Trichoderma 6

I.2.2 – Trichoderma como agente de biocontrole 8

I.3 – Estudos do grupo de Enzimologia ICB/UFG 10

II. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 11

CAPÍTULO 1 - Análise da expressão de genes de β-1,3-glicanases de Trichoderma

asperellum em condição de micoparasitismo contra diferentes fungos fitopatógenos 17

1. INTRODUÇÃO 18

1.1 – O fungo Trichoderma asperellum 18

1.2 – O polímero β-1,3-glicana e as enzimas β-1,3-glicanases 20

1.3 – As β-1,3-glicanases de T. asperellum T00 21

2. OBJETIVOS 22

3. MATERIAL E MÉTODOS 23

3.1 – Microrganismos utilizados e condições de cultura 23

3.2 – Extração de DNA de T. aperellum 23

3.3 – Técnicas para clonagem de genes 24

VI

3.4 – Produção da parede celular de R. solani, S.sclerotiorum e F.oxysporum 24

3.5 – Cultivo de T. asperellum em diferentes fontes de carbono para produção de

β-1,3-glicanases e para extração de RNA 25

3.6 – Ensaio para detecção de açúcares redutores e de atividade de β-1,3-

glicanases 25

3.7 – Dosagem de proteínas totais. 25

3.8 – Eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-

PAGE) e não desnaturante 26

3.9 – Coloração de proteínas em gel com Coomassie Blue 26

3.10 – Coloração de proteínas em gel com nitrato de prata 26

3.11 – Atividade de β-1,3-glicanases em gel não-desnaturante 27

3.12 – Purificação da endo-β-1,3-glicanase de T. asperellum 27

3.13 – Preparo das amostras para análise por espectrometria de massas 28

3.14 – Espectrometria de massas, análise dos espectros e identificação das

proteínas. 29

3.15 – Ensaios de confronto de fungos em placa 29

3.16 – Extração de RNA total de T. asperellum T00 e síntese de cDNA 30

3.17 – Oligonucleotídios utilizados para clonagem e nas reações de RT-PCR em

tempo real 30

3.18 – Análise da expressão gênica por RT-PCR em tempo real 31

3.19 – Análises estatísticas 31

4. RESULTADOS 32

4.1 – Caracterização molecular do gene tag27 de T. asperellum 32

4.2 – Sequenciamento do gene tag27 de T. asperellum 33

4.3 – Análise da atividade enzimática total de β-1,3-glicanases nas culturas de T.

asperellum em paredes de diferentes fitopatógenos 38

4.4 – Perfil das β-1,3-glicanases de T. asperellum em zimograma nas culturas nas

diferentes paredes de fitopatógenos. 39

4.5 – Análise da expressão de tag83 e tag27 de T. asperellum durante o 40

VII

crescimento com parede celular de fitopatógenos

4.6 – Expressão de tag83 e tag27 em T. asperellum T00 em situação de confronto

com fitopatógenos 44

5. DISCUSSÃO 48

6. CONCLUSÕES 56

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 57

CAPÍTULO 2 – Análise de genes de Trichoderma harzianum expressos durante o

micoparasitismo com Rhizoctonia solani e Sclerotinia sclerotiorum identificados

usando hibridização subtrativa 62

1. INTRODUÇÃO 63

1.1 – O fungo Trichoderma harzianum 63

1.2 – O estudo do biocontrole 64

1.2.1 – Análise de bibliotecas subtrativas 64

2. OBJETIVOS 68

3. METODOLOGIA 69

3.1 – Microrganismos utilizados e condições de cultura 69

3.2 – Produção da parede celular de R. solani e S. sclerotiorum 69

3.3 – Cultivo de T. harzianum com parede de fitopatógenos e extração de RNA 69

3.4 – Purificação dos mRNAs a partir do RNA total de T. harzianum 70

3.5 – Construção das bibliotecas subtrativas e estoque dos transformantes 70

3.6 – Seqüenciamento dos fragmentos de cDNA clonados (ESTs) 70

3.7 – Tratamento das sequências de DNA e submissão ao banco de dados. 71

3.8 – Ensaios de confronto em placa 71

3.9 – Análise da expressão gênica por RT-PCR em tempo real 72

3.10 – Oligonucleotídios utilizados nas reações de RT-PCR em tempo real 72

3.11 – Análises estatísticas 72

4. RESULTADOS 74

VIII

4.1 – Construção e análise das bibliotecas subtrativas de T. harzianum crescido

em parede de R. solani e S. sclerotiorum 74

4.2 – Análise por RT-PCR em Tempo Real de genes identificados nas bibliotecas

subtrativas de T. harzianum 78

5. DISCUSSÃO 86

6. CONCLUSÕES 91

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 92

ANEXOS 96

IX

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.1. Características morfológicas de Trichoderma asperellum T00. 18

Figura 1.2. Eletroforese das proteínas recuperadas após cromatografia para

purificação da enzima TAG27. 32

Figura 1.3. Sequência de nucleotídeos do gene tag27 e de aminoácidos da enzima

endo-β-1,3-glicanase correspondente 34

Figura 1.4. Alinhamento entre as sequências de aminoácidos de TAG27 de T.

asperellum e algumas das sequências similares obtidas por busca nas bases de

dados de proteínas 37

Figura 1.5. Zimograma mostrando as bandas de atividade de β -1,3-glicanases de T.

asperellum nas diferentes culturas em 24 e 48 horas de crescimento 39

Figura 1.6. Análise da expressão dos genes tag83 e tag27, atividade específica de β-

1,3-glicanases e quantidade de glicose no meio de cultura durante crescimento de T.

asperellum em meio TLE contendo 1% de Glicose 43

Figura 1.7. Experimento de confronto em placa de petri entre T. asperellum T00 e

diferentes fitopatógenos (A a C) e contato entre colônias de T00 (D) na fase de pós-

contato. 44

Figura 1.8. Análise por PCR em tempo real da expressão relativa dos genes tag83

(linhas cheias) e tag27 (linhas tracejadas) de T. asperellum (T00) durante o confronto

com diferentes fungos fitopatógenos 46

Figura 2.1. Características morfológicas de Trichoderma harzianum ALL42 63

Figura 2.2. Expressão relativa dos genes de T. harzianum, identificados na biblioteca

subtrativa RS, durante o confronto em placa com R. solani (T x R) e S. sclerotiorum

(T x S) e a expressão de CFEM, identificado nas duas bibliotecas. 82

Figura 2.3. Expressão relativa dos genes de T. harzianum, identificados na biblioteca

subtrativa SR, durante o confronto com R. solani (T x R) e S. sclerotiorum (T x S). 83

Figura 2.4. Expressão relativa dos genes hsp98, hyp e serina-endopeptidase de T.

harzianum, identificados na biblioteca subtrativa SR, durante crescimento em meio

de cultura contendo parede celular de R. solani (pcRS) ou de S. sclerotiorum (pcSS) a

0,5% como fonte de carbono 85

X

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1.1. Oligonucleotídeos utilizados para amplificação do gene tag27 completo e

para as reações de PCR em tempo real 29

Tabela 1.2. Sequências obtidas por espectrometria de massas e identificação dos

peptídios obtidos a partir da proteína correspondente à Banda 1 33

Tabela 1.3. Sequências de endo-β-1,3(4)-glicanases similares à TAG27 de T.

asperellum. 35

Tabela 1.4. Valores de atividade enzimática de β-1,3-glicanases, proteínas totais e

atividade específica das diferentes culturas de T. asperellum em 24 e 48 horas de

crescimento 38

Tabela 1.5. Análise por PCR em tempo real da expressão relativa dos genes tag83 e

tag27 de T. asperellum durante o crescimento em meio de cultura contendo diferentes

fontes de carbono.em 24 e 48 horas 41

Tabela 2.1. Lista de genes analisados por PCR em tempo real e sequência de

oligonucleotídios sintetizados a partir das ESTs obtidas a partir das bibliotecas

subtrativas. 73

Tabela 2.2. Análise do processamento das sequencias obtidas das bibliotecas

subtrativas de T. harzianum. 75

Tabela 2.3. Função predita e características dos fragmentos de genes obtidos da

Biblioteca subtrativa RS 76

Tabela 2.4. Função predita e características dos fragmentos de genes obtidos da

Biblioteca subtrativa SR 77

Tabela 2.5. Análise da expressão por RT-qPCR de 18 genes escolhidos das

bibliotecas subtrativas. 79

Tabela 2.6. Genes escolhidos para a análise por PCR em Tempo Real dos confrontos

entre T. harzianum ALL42 R. solani ou S. sclerotiorum. 81

XI

RESUMO

Espécies do gênero Trichoderma são eficientes antagonistas de fungos

fitopatogênicos, como as espécies Rhizoctonia, Sclerotinia e Fusarium, e são

comercializados como agentes de controle biológico principalmente por sua característica de

micoparasita. Muitos estudos têm sido feitos para compreender as bases moleculares dos

mecanismos de biocontrole de Trichoderma e também para encontrar espécies com alto

potencial de antagonismo contra fitopatógenos. O objetivo deste trabalho foi analisar a

expressão de genes relacionados ao micoparasitismo de T. asperellum T00 e T. harzianum

ALL42 (Enzimologia ICB/UFG) que possuem potencial para uso como agente de

biocontrole. Este trabalho foi dividido em dois capítulos. O Capítulo 1 se refere ao fungo T.

asperellum T00 e suas β-1,3-glicanases (TAG83 e TAG27) que degradam componentes da

parede celular de fungos fitopatógenos. O gene tag27 codifica para uma endo-β-1,3-

glicanase de 27kDa que possui 285 resíduos de aminoácidos e apresentou 96% de

similaridade com uma enzima de T. atroviride. A enzima foi secretada em meio de cultura

contendo parede celular de Rhizoctonia solani e Sclerotinia sclerotiorum, mas não em meio

com parede de Fusarium oxysporum. A expressão dos genes tag83 e tag27 foi reprimida na

presença de glicose e ativada tanto na presença de parede celular dos fitopatógenos quanto

durante o contato entre os fungos em placa. O Capítulo 2 trata do fungo T. harzianum

isolado ALL42 e de genes identificados pela técnica de hibridização subtrativa relacionados

especificamente ao biocontrole contra R. solani e S. sclerotiorum. Foram construídas duas

bibliotecas subtrativas sendo que os RNAs utilizados como condição teste e controle da

subtração foram obtidos de T. harzianum crescido em meio contendo parede celular de R.

solani ou S. sclerotiorum. As bibliotecas foram sequenciadas resultando em 47 genes

relacionados ao crescimento em meio com R. solani e 114 genes relacionados ao

crescimento em meio com S. sclerotiorum. Dos 18 genes escolhidos para validação da

biblioteca por RT-PCR em tempo real, 9 se mostraram diferencialmente expressos na

condição correspondente à biblioteca em que foram identificados. Dentre estes, 5 genes se

mostraram também diferencialmente expressos em experimento de confronto em placa, 2

deles mais expressos contra R. solani (cutinase e alginato liase) e 3 contra S. sclerotiorum

(hsp98, serina endopeptidase e um de função hipotética). Os resultados obtidos com as

duas linhagens fornecem informações adicionais sobre genes de β-1,3-glicanases,

conhecidamente envolvidos no processo de micoparasitismo, e sobre genes relacionados ao

antagonismo de patógenos específicos, além de contribuir para o conhecimento relacionado

ao biocontrole realizado por fungos do gênero Trichoderma.

Palavras-chave: Trichoderma; micoparasitismo; β-1,3-glicanases; bibliotecas subtrativas;

XII

ABSTRACT

Species of Trichoderma are commercially applied as biological control agents and are

antagonists of important plant pathogenic fungi (as Rhizoctonia, Sclerotinia and Fusarium

species) due to its mycoparasitic characteristics. Research has been performed to have a

better comprehension of molecular aspects of the biocontrol mechanisms performed by

Trichoderma and to find isolates with high antagonistic potential against plant pathogens. In

the present study the expression of mycoparasitism-related genes was performed T.

asperellum T00 and T. harzianum ALL42 (Enzimologia group ICB/UFG fungal collection) that

have great potential as biocontrol agent. Each chapter of this work refers to one of the

species studied. In Chapter 1 T. asperellum isolate T00, known to produce high levels of cell

wall degrading enzymes, has its β-1,3-glucanases enzymes and genes (tag83 and tag27)

studied. The gene tag27 was cloned and characterized and codes to an 27kDa endo-β-1,3-

glucanase with and 285 aminoacids and 96% similar to a glucanases from T.atroviride. The

enzyme was detected when T. asperellum was grown in Rhizoctonia solani or Sclerotinia

sclerotiorum cell wall-containing media but not in Fusarium oxysporum cell wall-containing

media. The tag83 and tag27 genes was repressed in media containing glucose as carbon

source and upregulated in cell wall containing media and during plate confrontation tests with

pathogenic fungi. Chapter 2 shows T. harzianum isolate ALL42 genes involved in

mycoparasitism against R. solani or S. sclerotiorum detected using subtractive hybridization

approach. T. harzianum was grown with R. solani or S. sclerotiorum cell wall as carbon

source and the RNA used both as tester and driver in each of two subtractive library

constructed. Sequencing analysis resulted in 47 genes related with growth in R. solani cell

wall media and 114 genes related with growth in S. sclerotiorum cell wall media. To confirm

the obtained data, 18 genes were tested by quantitative real time RT-PCR and 9 were

differentially expressed in the same condition of the library they were detected. Five of these

genes were also differentially expressed during plate confrontation assay with the respective

pathogen, two of them expressed during contact with R. solani (cutinase and alginate lyase)

and 3 during contact with S. sclerotiorum (hsp98, serin endopeptidase and a hypotetic gene).

The results presented in this study provides additional information about the role of 1,3-

glucanase genes in mycoparasitism and of other genes related to antagonism against

specific pathogens, providing helpful insights in the mechanism of biocontrol performed by

Trichoderma.

Keywords: Trichoderma, mycoparasitism, β-1,3-glucanases, subtractive hybridization

libraries.

1

I. INTRODUÇÃO

I.1 – A agricultura e as doenças causadas por fungos

Grandes perdas são causadas na agricultura todos os anos em função de doenças

em plantações, que são causadas principalmente por fungos e bactérias. Essas perdas

podem resultar em diversos fatores, como diminuição dos estoques de alimento, diminuição

da qualidade do produto colhido e alta de preços. As doenças de origem fúngica costumam

ser as mais agressivas para as plantações, sendo que essas causam importantes danos do

ponto de vista econômico (BENÍTEZ et. al., 2004; MONTE; 2001).

O controle destas doenças ainda é feito, em grande parte, por agentes químicos.

Existem fungicidas de amplo espectro e fungicidas de ação específica. A constante

utilização desses componentes gera danos de valores incalculáveis, tanto para a natureza

quanto para a própria agricultura, como o desenvolvimento de organismos resistentes aos

fungicidas mais específicos, efeitos indesejáveis em diversos organismos com os fungicidas

de amplo espectro, além dos danos causados ao meio ambiente e à saúde humana

(BENÍTEZ et. al., 2004; PUNJA & UTKHEDE, 2003).

Pensando no desenvolvimento de sistemas de agricultura sustentáveis, formas

alternativas de controle de patógenos de plantas estão sendo intensivamente investigadas.

O desenvolvimento de fungicidas mais específicos, bem como as mudanças em práticas

agrícolas, o uso de técnicas de controle integrado e o surgimento de variedades de cultivo

mais resistentes, compõem a lista de estratégias utilizadas na tentativa de diminuir os

prejuízos causados pelas doenças fúngicas na agricultura e os impactos dos agentes de

controle químico no ambiente (BENÍTEZ et. al., 2004; MONTE, 2001; PUNJA & UTKHEDE,

2003; VINALE et al., 2008).

Independentemente da forma de cultivo, seja pelo método convencional ou orgânico,

ou ainda em estufas com condições controladas de manejo, as plantações não estão livres

da contaminação por patógenos fúngicos. Além disso, o estoque armazenado obtido da

colheita se torna alvo para o ataque de fungos. A ampla distribuição de espécies

fitopatogênicas de fungos na natureza atua como fator que favorece a contaminação de

diversos vegetais de importância econômica (BENÍTEZ et. al., 2004; PUNJA & UTKHEDE,

2003). Dentre vários fungos fitopatógenos, são considerados os mais conhecidos e

estudados os pertencentes aos gêneros Rhizoctonia, Sclerotinia, Fusarium, Phytium e

Botrytis, que causam danos em culturas de grande importância para o homem como feijão,

soja, algodão, tomate, batata, milho, arroz, dentre outras (GONZÁLEZ-FERNANDEZ &

JORRIN-NOVO, 2012; VERMA et al., 2007; YANG et al., 2009).

2

I.1.1 – O fungo Rhizoctonia solani

Os fungos do gênero Rhizoctonia apresentam distribuição ampla no planeta,

geralmente encontrados em solo de florestas e de plantações, na maioria das vezes

associados às raízes e são geralmente patógenos, apesar de existirem espécies saprofíticas

e simbiontes. O gênero foi descrito inicialmente em 1815 por De Candolle como sendo

constituído de fungos não esporulantes que atacam preferencialmente raízes e que produz

hifas a partir de escleródios. Em 1858, Julius Kühn descreveu um fungo que foi encontrado

em plantas doentes de batata e o classificou no gênero Rhizoctonia, nomeando-o de

Rhizoctonia solani (CASTRO, 2007; GONZALEZ et al., 2011). Atualmente é conhecido como

Rhizoctonia solani Kühn (teleomorfo Thanatephorus cucumeris Frank (Donk)) e se tornou a

espécie mais estudada do gênero por ser considerado um patógeno altamente destrutivo e

com ampla lista de hospedeiros (GARCÍA, ONCO & SUSAN, 2006).

A maioria dos isolados de R. solani não se reproduz sexuadamente e são

conhecidos em sua maioria por seu estágio assexual (fase anamórfica), representando um

grupo importante por causar doenças economicamente significativas em várias espécies

plantações em todo o mundo. No Brasil, diferentes isolados de R. solani causam perdas

consideráveis em culturas de importância econômica, como batata, soja, feijão e amendoim,

podendo ocorrer também em hortaliças como espinafre, pimentão, brócolis, tomate, além de

frutíferas, como o melão (CASTRO et al., 2007; SILVA-BARRETO et al., 2010). Outros

cultivares compõem a lista de plantas atacadas por R. solani, como beterraba, pepino,

cenoura, berinjela, melancia, repolho, alface, figo, algodão, feijão-caupi e arroz (CASTRO,

2007; NECHET & HALFELD-VIEIRA, 2007).

Na ausência de plantas hospedeiras, R. solani sobrevive como saprófita obtendo

nutrientes a partir de compostos orgânicos, como restos de cultura. Outra característica que

ajuda na permanência desse fungo no solo de áreas cultiváveis é a capacidade de produzir

escleródios, que são resistentes à degradação e podem permanecer viáveis por vários anos

mesmo na ausência de culturas (SILVA-BARRETO et al., 2010). Tanto o micélio quanto os

escleródios no solo ou em plantas podem produzir hifas vegetativas que atacam diversos

tipos de plantações. Além disso, em certas situações, R. solani pode produzir basidiósporos,

que servem como fonte de dispersão rápida e de longo alcance. Apesar de a maioria das

doenças serem causadas por micélio ou escleródios de R. solani, doenças importantes

causadas em tabaco, feijão e cana-de-açúcar são originadas a partir da germinação dos

basidiósporos, principalmente em períodos úmidos (GONZÁLEZ et al., 2011).

Além de R. solani infectar frequentemente plantações de regiões com temperaturas

médias elevadas, de chuvas frequentes e com alta umidade, suas características de

3

infectividade e permanência no solo são fatores que favorecem o aparecimento de doenças

em diversos cultivares. Outro fato que contribui para sua importância econômica é que os

sintomas causados por R. solani são bastante variados e costumam ser confundidos com

sintomas provocados por outros patógenos. (CASTRO, 2007; SILVA-BARRETO et al.,

2010). Os estudos relacionados a este fungo, comumente focados na descrição e

caracterização ecológica ou epidemiológica das doenças de plantas atribuídas a esse

organismo, além de taxonomia, sistemática molecular e genética, refletem sua ampla lista

de hospedeiros, sua prevalência em diferentes agroecosistemas e seu impacto na economia

(GARCÍA, ONCO & SUSAN, 2006; GONZÁLEZ et al., 2011).

I.1.2 – O fungo Sclerotinia sclerotiorum

O fungo ascomiceto Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary é um patógeno de plantas

conhecido há bastante tempo devido sua alta capacidade destrutiva, causando problemas

de ordem econômica tanto durante o cultivo quanto no produto colhido. Mais de 60 nomes

diferentes, como mofo branco, se referem a doenças causadas por esse fungo, que é um

patógeno necrotrófico (que capta nutrientes a partir de células mortas do hospedeiro) cuja

lista de hospedeiros abrange mais de 400 espécies de plantas, incluindo importantes

culturas e também ervas daninhas. Perdas anuais relacionadas à S. sclerotiorum nos

Estados Unidos já ultrapassaram os 200 milhões de dólares, enquanto que no Brasil,

somente no Estado de Goiás, as perdas chegaram a atingir 50% em culturas de feijão e

18,7% em soja (CHARCHAR, ANJOS & OSSIPI, 1999; LU, 2003). Sua distribuição é global

em diferentes áreas de cultura, mas predomina em regiões de clima temperado nas

Américas do Norte e do Sul, Europa e regiões da Nova Zelândia e Austrália (AMSELEM et

al., 2011; TU, 1997).

S. sclerotiorum foi descrito pela primeira vez em 1873 como Peziza Sclerotiorum por

Libert. Essa espécie foi depois transferida para o gênero atual por Fuckel e renomeada para

Scleortinia libertania Fuckel para homenagear Libert. Anos mais tarde, em 1979, foi

observado que de Bary usou o nome S. sclerotiorum em 1884 e então foi proposto que o

nome do fungo fosse Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary (MELVIN, THOMMA &

NELSON, 2006).

Como o nome sugere, S. sclerotiorum produz escleródios, que são estruturas rígidas,

melanizadas e assexuais de resistência compostas de células vegetativas que se

entrelaçam e se agregam. Elas são importantes no contexto econômico da agricultura, pois

são estruturas persistentes de dormência e de disseminação do fungo, podendo permanecer

por vários anos no solo. Esse fungo representa uma ameaça para importantes culturas

4

agrícolas como girassol, soja, canola, feijão, ervilha e diversos outros vegetais, afetando

também culturas de cebola e de tulipa (ERENTAL, DICKMAN & YARDEN, 2008; HEGEDUS

& RIMMER, 2005; MELVIN, THOMMA & NELSON, 2006).

Além do escleródio, possui outros 3 estágios no seu ciclo de vida: o apotécio, os

ascósporos e o micélio. A infecção de plantas pode ocorrer a partir de micélio, originado de

escleródios germinados no solo, e de ascósporos produzidos por apotécios, gerados

também a partir de esclerórios. Os ascósporos são espalhados pelo ar, germinam quando

alcançam partes sadias das plantas e penetra nos tecidos do hospedeiro. Conforme o fungo

cresce, novos escleródios são formados em diferentes partes da planta quando esta morre,

permanecendo nos pedaços da planta ou no solo para iniciar um novo ciclo (LU, 2003).

As doenças causadas por S. sclerotiorum são tradicionalmente difíceis de controlar e

os cultivares afetados geralmente não apresentam grande resistência a ele. A busca por

variedade de plantas que apresentam algum tipo de resistência pode representar um ganho

econômico na agricultura. Mas a falta de plantas que apresentam um nível desejado de

resistência faz com que os fungicidas representem o principal método de controle para as

doenças causadas por Sclerotinia. Mas além do problema da dispersão dos ascósporos, o

desenvolvimento de resistência a fungicidas é sempre uma ameaça juntamente com a

questão ambiental. Os estudos relacionados ao controle biológico, com o uso de

antagonistas representados por fungos ou bactérias encontrados na natureza (como

Trichoderma, por exemplo), tem sido uma tentativa no controle de Sclerotinia juntamente

com a possibilidade de redução da contaminação pelo uso de agentes químicos (TU, 1997;

MELVIN, THOMMA & NELSON, 2006).

I.1.3 – O fungo Fusarium oxysporum

O gênero Fusarium foi inicialmente descrito por Link em 1809 e definido por Fries,

em 1821, baseado no fungo Fusarium roseum Link. Mais tarde, em 1935, Wollenweber e

Reinking publicaram um estudo que foi a base para a classificação do gênero, feita por

Synder e Hansen em 1945 e organizada por outros grupos de pesquisadores na década de

1980. Com a utilização de técnicas não morfológicas de sistemática e análise de sequências

de DNA foi possível entender as diferenças entre fungos, definindo melhor as espécies

(ROSSMAN & PALM-HERNÁNDEZ, 2008).

As espécies de Fusarium, também conhecidas por suas formas teleomorfas Nectria e

Gibberella (KERÉNYI et al., 2004), são habitantes comuns de solo e podem resistir nesse

ambiente por longos períodos na forma de micélio ou como esporos dormentes

(clamidósporos). O gênero é composto por espécies que são causadores de doenças de

5

importância econômica em plantas cultivadas e há diferentes formae speciales (f. sp.) para

várias dessas espécies patogênicas, baseadas na especificidade ao hospedeiro. Por

exemplo, F. oxysporum f. sp. lycopersici e F. oxysporum f. sp. cucumerinum causam

doenças somente em tomate e pepino, respectivamente. (PEREIRA, 2007; LIEVENS, REP

& THOMMA, 2008).

Todas as espécies causadoras das chamadas murchas vasculares são classificadas

como F. oxysporum. Essa espécie é bem representada em comunidades fúngicas e está

presente em vários tipos e solo no mundo, sendo considerada comum nas comunidades de

rizosfera de plantas. É a partir da interação na rizosfera que as linhagens patogênicas

induzem o apodrecimento da raiz e invadem o sistema vascular, causando sérios danos em

diversas plantações de importância econômica (FRAVEL, OLIVAIN & ALABOUVETTE,

2002). Entre elas, podem ser citadas o algodão (F. oxysporum f. sp. vasinfectum), tomate (F.

oxysporum f. sp. lycopersici), banana (F. oxysporum f. sp. cubense) e o feijão (F. oxysporum

f. sp. phaseoli e também F. solani f. sp. phaseoli). (PEREIRA, 2007).

Atualmente não há tratamento efetivo para controle dos sintomas causados por F.

oxysporum e as plantas infectadas devem ser removidas rapidamente para evitar que o

fungo se espalhe. Sendo assim, a maioria dos esforços é feita no sentido de prevenção. A

prevenção da doença ainda é feita por fumigação do solo, desinfestação de material vegetal

contaminado e, quando possível, o uso de cultivares resistentes. O controle da presença do

fungo no solo com manejo que minimiza a esporulação e o crescimento do patógeno solo,

ou ainda a alternância com culturas que não são hospedeiras também são práticas

adotadas. A dificuldade para se controlar a podridão causada por fusarium estimulou a

pesquisa com controle biológico mesmo antes da atual necessidade de proteção ambiental.

Estudos nesse campo estão sendo desenvolvidos com microrganismos antagonistas e

também linhagens não-patogênicas de F. oxysporum que atuam no biocontole. (LIEVENS,

REP & THOMA, 2008; FRAVEL, OLIVAIN & ALABOUVETTE, 2002).

I.2 – O controle biológico e Trichoderma

A necessidade de se aumentar a produção agrícola tem levado ao uso excessivo de

fertilizantes e agroquímicos que poluem o ambiente e reduzem a fertilidade do solo. Com

isso tem surgido a necessidade de se desenvolver formas de controle que sejam

sustentáveis e menos agressivas ao meio ambiente (HERMOSA et al., 2012; SHARMA et

al., 2011). O uso de Agentes de Controle Biológico (microrganismos que antagonizam os

patógenos de planta) tem sido bastante estudado por se tratar de um método que não causa

maiores impactos ambientais uma vez que aproveita de interações de microrganismos já

6

existentes na natureza (SILVA & MELLO, 2007; VERMA et al., 2007, VITERBO et al., 2002).

Diversos gêneros de bactérias (como Agrobacterium e Bacillus) e fungos (como Gliocladium

e Trichoderma) são estudados e alguns já utilizados comercialmente como agentes de

controle biológico (VINALE et al., 2008). Dentre os fungos já estudados como agentes de

controle biológico, diferentes linhagens de Trichoderma correspondem a 90% das

aplicações feitas em campo contra doenças de origem fúngica. Esses fungos são

amplamente estudados e utilizados devido o antagonismo contra outros fungos, uma vez

que usa várias das estratégias relacionadas aos organismos que fazem controle biológico

(BENÍTEZ et al., 2004; BROTMAN, KAPUGANTI & VITERBO; 2010; VINALE et al., 2008).

I.2.1 – O gênero Trichoderma

O gênero Trichoderma (divisão Ascomycota, ordem Hypocreales) compreende

espécies de fungos filamentosos que vivem no solo e são encontrados em uma grande

variedade de ecossistemas, sendo capazes de crescer em inúmeros substratos como

madeira, troncos e inclusive sobre outros fungos. Esses fungos são considerados

cosmopolitas por serem encontrados em todas as latitudes. Podem ser isolados

principalmente a partir de florestas ou solos de culturas agrícolas e também facilmente

cultivados in vitro, o que mostra seu alto potencial de adaptabilidade a diversas condições

ecológicas. Diferentes isolados de Trichoderma possuem algumas características em

comum, como micélio aéreo esparso com conídios esverdeados, conidióforos ramificados e

irregulares e um odor de coco característico, devido à produção de um antifúngico volátil, o

6-pentil-α-pyrone (BROTMAN, KAPUGANTI & VITERBO, 2010; DRUZHININA et al., 2011;

KUBICEK, KOMON-ZELAZOWSKA & DRUZHININA, 2008; SAMUELS, 1996).

Alguns desses fungos possuem características pleomórficas, ou seja, existem em

dois estágios morfológicos e fisiológicos distintos. A fase sexual (ou teleomórfica) é

conhecida pelo nome Hypocrea, enquanto a fase assexual (anamórfica ou mitospórica) é

chamada Trichoderma. Apesar de tal característica ter sido inicialmente sugerida por volta

de 1865, essa relação foi somente confirmada mais de 100 anos depois, em 1996, com os

fungos Trichoderma reesei e Hypocrea jecorina, sendo que o primeiro foi considerado como

um derivado clonal do segundo depois de diversas tentativas de cruzamento entre eles

(DRUZHININA et al., 2011; SCHUSTER & SCHMOLL, 2010). A nomenclatura desse fungo é

complicada devido essa característica, já que há espécies de Trichoderma que perderam a

capacidade de se reproduzirem sexualmente e outras espécies que possuem seu

teleomorfo correspondente. Apesar de a maioria da diversidade genética do gênero ser

representada pela forma sexual, a tendência atual é que o termo Trichoderma seja usado

7

em preferência ao nome Hypocrea e a partir de 2013 este último termo será abolido, de

acordo com o Código Internacional de Nomenclatura Botânica (ICBN – International Code of

Botanical Nomenclature) (DRUZHININA et al., 2011).

Originalmente o gênero foi descrito por Persoon em 1794 como Gasteromiceto, mas

demorou 50 anos para que a relação do gênero com os Ascomicetos fosse estabelecida.

Enquanto isso, as espécies eram classificadas com base na sua morfologia, mas caracteres

que eram utilizados para reconhecimento de anamorfos de ascomicetos eram difíceis de

descrever em Trichoderma. A classificação morfológica proposta por Rifai permitiu o

reconhecimento de 9 grupos de espécies e, apesar de o próprio autor concluir que sua

classificação não era completa em termos taxonômicos, seu trabalho se tornou a primeira

fonte de identificação para fungos do gênero (SAMUELS, 1996; SCHUSTER & SCHMOLL,

2010). Uma nova revisão do gênero, também com bases morfológicas, adotada por Bisset a

partir de 1984, permitiu que fossem criadas 5 novas seções, que incluíam alguns anamorfos

de Hypocrea anteriormente classificados como Gliocladium (LORITO et al., 2010;

SAMUELS, 1996). Desde então, diversas espécies de Hypocrea/Trichoderma foram

descobertas e identificadas, mas, devido às limitações da identificação somente por

características morfológicas, passou-se a acreditar que a classificação pudesse estar

inadequada. Dessa forma, a taxonomia molecular passou a fazer parte da classificação de

Trichoderma, inicialmente a partir do sequenciamento e anállise das regiões ITS (internal

trascribed spacers) 1 e 2 da região do rDNA e de diferentes fragmentos do fator 1- alfa de

elongação da tradução (tef1), auxiliando na identificação de novas espécies (KUBICEK,

KOMON-ZELAZOWSKA & DRUZHININA, 2008; LORITO et al., 2010; SCHUSTER &

SCHMOLL, 2010).

Enquanto se estudava sobre a taxonomia de Trichoderma, pesquisadores da área

aplicada atribuíam ao fungo novas atividades e propriedades biológicas. A capacidade de

Trichoderma para atuar no biocontrole e como micoparasita foi descoberta nos anos 1930

(LORITO et al., 2010). A grande capacidade de colonização dos seus hábitats foi vista como

reflexo da habilidade de secretar metabólitos antibióticos e enzimas, permitindo eficiente

utilização do substrato (SCHUSTER & SCHMOLL, 2010). Foi visto também que essas

características eram capazes de trazer benefícios para plantas devido à habilidade de

antagonizar os patógenos de solo. Além disso, hoje se sabe também que algumas linhagens

de Trichoderma realizam interações endofíticas com raízes, atuando como simbiontes

oportunistas não infecciosos, podendo ainda ativar sistemas de defesa da planta contra

outros patógenos (HARMAN et al., 2012; HERMOSA et al., 2012; KUBICEK et al., 2011).

Espécies de Tricoderma podem ainda obter nutrientes a partir de massa fúngica morta,

8

podendo então ser definido como micotrófico ao invés de somente micoparasita

(DRUZHININA et al., 2011).

Dessa forma, o gênero Trichoderma pode ser considerado como um grupo de fungos

que tem grande impacto na funcionalidade do ecossistema e também na vida humana. A

espécie T. reesei é conhecida e amplamente utilizada como produtora de enzimas,

principalmente celulases, e outras proteínas recombinantes em escala industrial (NAKARI-

SETALA et al., 2009). Há espécies que são utilizadas como agente de biocontrole contra

patógenos de plantas em plantações, inclusive nematoides. Isso contribui para a qualidade

do alimento produzido devido a possibilidade de redução do uso de agroquímicos e diminui

custos para os agricultores, além de acelerar as pesquisas para o uso de práticas agrícolas

que sejam menos nocivas ao meio-ambiente (HARMAN et al., 2012; KUBICEK et al., 2011).

O uso de Trichoderma como agente de controle biológico no campo aparece como

método promissor para reduzir ou eliminar o uso de fungicidas e pesticidas. A utilização

desse método como única forma de combate às doenças de plantas, porém ainda é menos

confiável que o uso do controle químico por se tratar de um mecanismo bastante complexo

(VINALE el al., 2008, MONTE, 2001). A eficácia do controle varia conforme o agente de

biocontrole utilizado, o patógeno a ser combatido, o cultivar a ser protegido e sofre

interferência de fatores como tipo de solo, temperatura, pH e de outros componentes da

microbiota local (HOWELL, 2003). Apesar de serem conhecidos os mecanismos envolvidos

no biocontrole, ainda é necessário um melhor entendimento do aspecto molecular do

processo para sua aplicação de forma ideal no campo (KUBICEK et al., 2011).

I.2.2 – Trichoderma como agente de biocontrole

A espécie Trichoderma harzianum é uma das mais estudadas para o entendimento

do biocontrole devido a sua grande capacidade de exploração de ambientes e de controle

de outros microrganismos, sendo reportada a produção de metabólitos com atividade

antibacteriana e antifúngica (PELTOLA et al., 2004). Essa espécie é tida como sistema

modelo de um típico micoparasita e usada como base para se demonstrar os mecanismos

do biocontrole (WICKLOW & SODERSTRÜM, 2007; ELAD, 2000). Outras espécies como

T.hamatum (CARPENTER et al.,2005), T. atroviride (SEIDL et al., 2009), T. viride

(LIECKFELDT et al., 1999), T. virens (HARMAN et al., 2004) e T. asperellum (LIU et al.,

2010; MARCELLO et al., 2010, WATANABE et al., 2007) tem sido bastante estudadas para

utilização no biocontrole.

O controle de fitopatógenos pelas espécies de Trichoderma é feito por diferentes

mecanismos, sendo que algumas espécies realizam mais de um mecanismo

9

simultaneamente. Trichoderma spp. antagonizam outros fungos por competição pois têm

capacidade de obter nutrientes de maneira mais eficiente que os patógenos e uma alta

capacidade de reprodução e crescimento. Outro método de antagonismo é a antibiose, em

que ocorre a produção de metabólitos secundários e compostos que atuam interferindo no

crescimento de outros fungos por meio de acidificação do solo, que atuam como

fungistáticos ou mesmo que matam as células dos antagonistas. Outro método de controle

de fitopatógenos que ocorre de forma indireta é chamado indução de resistência em plantas,

pois alguns compostos produzidos por Trichoderma exercem efeito positivo no crescimento

e nos mecanismos de defesa das plantas (HERMOSA et al., 2012; MONTE, 2001). Já o

micoparasitismo, considerado o método mais característico de controle de patógenos

realizado por Trichoderma, envolve o crescimento em direção à hifa hospedeira, o

reconhecimento da superfície da hifa do hospedeiro, fixação (e em alguns casos, o

enrolamento) em torno do hospedeiro, a produção de enzimas que degradam a parede

celular do fungo alvo e a entrada da hifa do parasita, que se alimenta do conteúdo citosólico

do hospedeiro (BENÍTEZ et al.,2004).

Durante o crescimento em direção à hifa hospedeira, Trichoderma produz

antibióticos voláteis e enzimas hidrolíticas que, ao degradar a parede celular do fungo

hospedeiro, liberam oligossacarídeos que irão ativar a expressão de genes envolvidos no

micoparasitismo (VINALE et al., 2008; GRUBER & SEIDL-SEIBOTH, 2012). Após o contato,

carboidratos da parede celular de Trichoderma interagem com lectinas presentes na parede

celular do hospedeiro, permitindo que o micoparasita cresça enrolando-se ao longo da hifa

hospedeira. Em algumas regiões da interação, Trichoderma forma estruturas semelhantes a

papilas, comumente chamadas apressórios (nome dado às estruturas produzidas por fungos

fitopatogênicos em interações com plantas), em que a extremidade da hifa fica com aspecto

achatado sobre o hospedeiro (DRUZHININA et al., 2011; HARMAN et al., 2004). Nos pontos

de formação desses apressórios ocorre a produção de enzimas hidrolíticas degradadoras de

parede, que facilitam tanto a entrada da hifa de Trichoderma no lúmen do fungo parasitado

quanto na assimilação do conteúdo da parede celular (BENÍTEZ et al., 2004).

As enzimas produzidas por Trichoderma durante o micoparasitismo estão

relacionadas à composição da parede celular do hospedeiro. Em geral, a parede celular

desses patógenos é composta de β-1,3-glicanas que fazem ligação cruzada com quitina.

Esse complexo glucana-quitina é covalentemente ligado a outros polissacarídeos, cuja

composição (que pode apresentar β-1,3-1,4-glicanas e β-1,6-glicanas) varia especificamente

conforme o hospedeiro. Proteínas também estão presentes no espaço extracelular, algumas

que modificam a parede celular e outras que estão ligadas covalentemente a

polissacarídeos na superfície da parede (LATGÉ, 2010; ALMEIDA et al., 2007). Devido essa

10

composição, a degradação da parede celular de fitopatógenos é feita principalmente por β-

1,3-glicanases, quitinases e proteases.

O micoparasitismo é um dos processos mais estudados e está relacionado a

linhagens de Trichoderma que são bons agentes de biocontrole. Assim, além de estudar o

papel das enzimas hidrolítcas relacionadas ao biocontrole, linhagens que se enrolam ao

redor da hifa do hospedeiro tem sido escolhidas para estudos em laboratório para se

entender melhor os aspectos moleculares do micoparasitismo (ALMEIDA et al., 2007).

I.3 – Estudos do grupo de Enzimologia ICB/UFG

O Laboratório de Enzimologia (ICB/UFG) tem estudado o fungo Trichoderma

buscando contribuir para a compreensão do processo de biocontrole, particularmente o

papel das enzimas relacionadas ao micoparasitismo. Enzimas envolvidas no processo de

micoparasitismo foram caracterizadas, como quitinases de T. harzianum (ULHOA &

PEBERDY, 1992), β-1,3-glicanases de T. harzianum (NORONHA & ULHOA, 2000;

NORONHA et al., 2000), T. asperellum (BARA, LIMA & ULHOA, 2003) e T. koningii

(MONTEIRO & ULHOA, 2006), diferentes N-acetil-β-D-glicosaminidases de T. harzianum

(SILVA et al., 2003) e uma fosfatase ácida de T. harzianum (LEITÃO et al., 2010).

Em 2002, LIMA isolou e classificou 46 isolados de Trichoderma provenientes do bioma

Cerrado e os caracterizou com base em aspectos morfológicos e moleculares. Das espécies

isoladas, a mais representativa era de T. harzianum com 34 isolados, seguido por T.

asperellum (4 isolados), T. koningii (3 isolados) e T. spirale (2 isolados). Também foi

avaliado o potencial antagônico dos isolados de T. harzianum pelo teste de pareamento de

culturas contra o fitopatógeno Rhizoctonia solani e a produção de enzimas hidrolíticas. Dos

isolados testados, T. harzianum ALL42 e T. asperellum T00 se destacaram como bons

produtores de enzimas hidrolíticas e bom micoparasita.

O grupo de pesquisa do Laboratório de Enzimologia (ICB / UFG) tem investigado o

fungo Trichoderma buscando compreender as bases do processo de biocontrole realizado

pelos fungos utilizando-se de técnicas de transcriptoma e proteômica. Além disso, em

parceria com a EMBRAPA, o grupo tem estudado diferentes isolados de Trichoderma que

possam promover proteção em plantas de feijão (Phaseolus vulgaris) contra os

fitopatógenos Rhizoctonia solani, Fusarium sp e Sclerotinia sclerotiorum, cujas doenças têm

causado grandes perdas de produtividade em lavouras de feijoeiro nas regiões Sudeste e

Centro-Oeste do Brasil. Isso mostra a importância dos estudos de uso de Trichoderma como

estratégia de controle para essas pragas na agricultura (MIRANDA, LOBO-JUNIOR &

CUNHA, 2007; GÖRGEN et al., 2008).

11

II. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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17

CAPÍTULO 1

Análise da expressão de genes de β-1,3-glicanases de Trichoderma asperellum em

condição de micoparasitismo contra diferentes fungos fitopatógenos

18

1. INTRODUÇÃO

1.1 – O fungo Trichoderma asperellum

O fungo Trichoderma asperellum representa uma espécie recentemente descrita e

identificada por Samuels, Lieckfeldt e Nirenberg (1999). Este fungo apresenta rápido

crescimento em cultura, densa conidiação formando anéis concêntricos e micélio aéreo

praticamente ausente. Seus conídios tem formato predominantemente ovoides e possuem

aspecto enrugado, suas fiálides tem formato de ampola e suas ramificações são pareadas

(SAMUELS, LIECKFELDT & NIRENBERG, 1999, LIMA, 2002). Essas características podem

ser observadas na Figura 1.1 com o isolado T00 de T. asperellum (LIMA, 2002).

Figura 1.1. Características morfológicas de Trichoderma asperellum T00 (linhagem utilizada neste

trabalho). T. asperellum T00 crescido em meio MYG (A) e BDA (B) mostrando a densa conidiação e a

formação dos anéis concênctricos, respectivamente. Microscopia óptica mostrando as fiálides

ampuliformes e pareadas (C) e conídios ovoides (D) (Barras = 5µm) e Micrografia eletrônica (MEV)

dos conídios (E) evidenciando seu aspecto verrugoso (Barra = 0,5 µm). (Fotos C, D e E – Adaptado

de LIMA, 2002).

A B

C D E

19

A espécie T. asperellum foi identificada a partir de tipos diferentes de T. virens que

apresentavam diferentes características morfológicas (MEYER & PLASKOWITZ; 1989).

Além das diferenças morfológicas encontradas e confirmadas posteriormente (SAMUELS,

LIECKFELDT & NIRENBERG, 1999), a análise molecular dos tipos I e II confirmou que cada

tipo correspondia a espécies diferentes por análises de sequenciamento da região ITS, PCR

fingerprint e polimorfismo de fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição (RFLP)

do gene da endoquitinase 42-kDa (LIECKFELDT, et al., 1999).

Diversos trabalhos tem mostrado características de T. asperellum que reforçam a

importância desse fungo como agente de biocontrole, seja promovendo crescimento em

plantas, seja como micoparasita. Após a definição da espécie, verificou-se que várias

linhagens identificadas como T. viride e que eram conhecidas como bons agentes de

biocontrole na verdade eram T. asperellum (LIECKFELDT, et al., 1999). Isolados de T.

asperellum obtidos a partir de adubos utilizados em tomate se mostraram capazes de

controlar a murcha causada por Fusarium. Foi relatado ainda que essa capacidade era

maior do que a de outras espécies de Trichoderma já descritas (COTXARRERA et al.,

2002). Viterbo e colaboradores (2002) mostraram que T. asperellum é capaz de secretar

uma quitinase (CHIT36) cuja produção era induzida tanto pela presença do fungo

Rhizoctonia. solani quanto por moléculas secretadas por ele. Trillas e colaboradores (2006)

mostraram também que T. asperllum, quando aplicado juntamente com o meio de

crescimento de plantas de pepino, reduziu a incidência de doenças em mudas previamente

infectadas por R. solani. T.asperellum se mostrou ainda capaz de parasitar fungos que

causam doenças em arroz (WATANABE et al., 2007), cacau (TONDJE et al., 2007),

pimentão (SLUSARSKI & PIETR, 2009) e abacaxi (WIJESINGHE et al., 2010), além de

parasitar ovos do nematoide Meloidogyne javanica, causador de doenças em plantas

(SHARON et al., 2007), e de promover proteção para plantas contra fitopatógenos

(SANTIAGO et al., 2009; SEGARRA et al., 2010).

A linhagem utilizada neste trabalho, chamada T. asperellum T00 (Figura 1.1) foi

identificada dentre diversos isolados obtidos de amostras de solo de Cerrado (LIMA, 2002) e

apresenta um grande potencial de micoparasitismo. Em teste de pareamento de cultura

contra o fungo fitopatógeno .R solani, T. asperlellum foi capaz de crescer enrolando suas

hifas sobre o hospedeiro (BARA, 2002). Essa linhagem também apresentou alta produção

de atividade de β-1,3-glicanases na presença de parede celular de R. solani, mostrando o

potencial do fungo na degradação de componentes da parede celular de fungos, a β-1,3-

glicana. (BARA, LIMA & ULHOA, 2003; AIRES, 2005; AIRES et al., 2012).

20

1.2 – O polímero β-1,3-glicana e as enzimas β-1,3-glicanases

O polímero β-1,3-glicana consiste em resíduos de glicose unidos por ligações do tipo

β em ligações glicosídicas. Alguns tipos desse polímero são basicamente lineares enquanto

que outros, como a laminarina e a escleroglucana apresentam estruturas mais complexas,

possuindo ramificações do tipo β-1,6 a cada 3 a 7 resíduos de glicose (MARTIN et al.,

2007). Esse polímero constitui um dos principais componentes estruturais da parede celular

de fungos juntamente com quitina e outros carboidratos, além de proteínas, conferindo

rigidez e resistência (LATGÉ, 2007; MARTIN et al., 2007). Devido sua importância para a

parede celular, as enzimas que degradam a β-glucana são importantes para fungos que

atuam no biocontrole.

As β-1,3-glicanases podem ser classificadas de acordo com o mecanismo de

hidrólise. As endo-β-1,3-glicanases (E.C. 3.2.1.39) clivam aleatoriamente a cadeia da β-1,3-

glicana, liberando oligossacarídeos menores e gerando maior número de extremidades

redutoras. As exo-β-1,3-glicanases (E.C. 3.2.1.58) hidrolisam cadeia de β-1,3-glicanas

removendo resíduos de glicose a partir de sua extremidade não redutora. Ações sinérgicas

entre estas duas enzimas, com diferentes modos de ação, são comuns em fungos que

degradam polímeros de β-1,3-glicanas (MARTIN et al., 2007; PITSON, SEVIOUR &

MCDOUGALL, 1993).

Devido à característica de micoparasita das espécies de Trichoderma, esses fungos

apresentam, em comparação a outros fungos, um número maior de cada uma das enzimas

que degradam a parede celular, inclusive de β-1,3-glicanases (KUBICEK et al., 2011).

Diversos fatores parecem estar relacionados à produção dessas enzimas. Existem enzimas

constitutivas e enzimas que são sintetizadas na presença de algum indutor e na ausência de

glicose, enquanto que os genes que codificam essas enzimas são regulados por indução e

repressão catabólica, respectivamente (MARTIN et al., 2007; NORONHA et al., 2000).

Indícios de regulação de produção de enzimas por disponibilidade de nitrogênio foram

relatados em T. atroviride, mostrando que a β-1,3-glicanase GLUC78 é sintetizada em

condições de baixa disponibilidade de sais de amônia (DONZELLI & HARMAN; 2001). As

maiores atividades enzimáticas, porém, foram encontradas em condições onde Trichoderma

foi crescido em substratos como laminarina ou parede celulares de fungos (BARA, LIMA &

ULHOA, 2003, NORONHA et al, 2000) e em situações de micoparasitismo na presença do

fungo antagonista (VÁZQUES-GARCIDUEÑAS, LEAL-MORALES & HERRERA-ESTRELA,

1998; MARCELLO et al., 2010).

21

1.3 – As β-1,3-glicanases de T. asperellum T00

Foram purificadas e caracterizadas duas β-1,3-glicanas de T. asperellum T00 com

importante papel na degradação das β-1,3-glicanas presentes em parede celular de fungos.

A TAG83, uma exo-β-1,3-glicanase, possui massa molecular de 83,1 kDa, temperatura e pH

ótimos de atividade de 55°C e 5,0, respectivamente, com Km de 0,087 mg/mL e é altamente

secretada quando o fungo é crescido em meio de cultura contendo parede celular de R.

solani como principal fonte de carbono (BARA, LIMA & ULHOA, 2003). A expressão do gene

tag83 (que codifica GLUC83) foi analisada por RT-PCR em tempo real e foi verificado um

alto nível de expressão desse gene em situação de confronto de T. asperellum com R.

solani (MARCELLO et al., 2010). A segunda enzima, a TAG27, é uma endo-β-1,3-glicanase,

com massa molecular de 27 kDa, temperatura e pH ótimos de atividade de 45°C e 3,6,

respectivamente, Km de 0,323 mg/mL e sua atividade foi detectada somente em cultura

com parede de R. solani como principal fonte de carbono (AIRES, 2005; AIRES et al, 2012).

Os estudos de expressão do gene que codifica a enzima TAG27 (chamado tag27)

ainda não haviam sido realizados por não se conhecer sua sequência de aminoácidos.

Devido à variedade de β-1,3-glicanases geralmente produzidas por Trichoderma é difícil

identificar o gene correspondente a uma enzima sem sua sequencia de aminoácidos ou

outros dados relacionados. Esses dados são necessários para que se possa fazer a análise

de expressão de uma β-glicanase específica nas diversas condições de cultivo (MARTIN et

al., 2007). Nesse contexto, informações importantes sobre as β-1,3-glicanases de T.

asperellum T00 podem ser obtidas para enriquecer o conhecimento sobre a biologia do

fungo e da atuação dessas enzimas no processo de micoparasitismo.

22

2. OBJETIVOS

2.1 – Objetivo geral

O objetivo deste trabalho foi fazer a analise da expressão dos genes tag83 e tag27,

que codificam as duas β-1,3-glicanases conhecidas deste fungo, em diferentes condições de

cultivo do fungo visando avaliar seu papel no micoparasitismo.

2.2 – Objetivos específicos

- Obter a sequência de aminoácidos da endo-β-1,3-glicanase de Trichoderma

asperellum T00 por espectrometria de massas;

- Fazer a clonagem do gene tag27 que codifica a endo-β-1,3-glicanase de 27kDa e o

sequenciamento deste gene;

- Avaliar a atividade e a produção de β-1,3-glicanases por T. asperellum T00 quando

cultivado presença de glicose e parede celular de diferentes fitopatógenos como fontes de

carbono;

- Analisar a expressão dos genes tag83 e tag27 nas condições acima citadas por RT-

qPCR em tempo real;

- Analisar a expressão dos genes tag83 e tag27 em condições de confronto em placa

entre T. asperellum T00 e os fitopatógenos Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum e

Fusarium oxysporum e durante o contato entre diferentes colônias de T. asperellum.

23

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 – Microrganismos utilizados e condições de cultura

Trichoderma asperellum T00 foi obtido da coleção do Laboratório de Enzimologia

(ICB/UFG) e Rhizoctonia solani Kühn, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary e Fusarium

oxysporum f. sp. phaseoli foram obtidos da coleção da Embrapa – CNPAF. Os fungos foram

cultivados em meio MYG (0,5% de extrato de malte, 0,25% de extrato de levedura, 1% de

glicose e 2% de ágar) à temperatura ambiente por 7 dias e guardados a 4˚C. Culturas

periódicas foram feitas para a manutenção das culturas.

Para o procedimento de clonagem de DNA, a linhagem DH5-α de Escherichia coli

(Invitrogen) foi utilizada para manipulação de DNA, sendo cultivada em meio SOC (2%

Bacto triptona, 0,5% extrato de levedura, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM

MgSO4, 20 mM glicose) a 37 ºC e estocadas a -80 ºC em glicerol 25%. Os estoques de

células foram mantidos a -80 ºC em glicerol 25%.

3.2 – Extração de DNA de T. aperellum

Foram inoclulados 107 esporos do fungo Trichoderma asperellum isolado T00 (Lima,

2002) em meio TLE contendo 1,5% de glicose como fonte de carbono. O fungo foi crescido

em agitador rotatório a 28 °C e 180 rpm durante 24 horas. O micélio foi coletado por filtração

em papel de filtro com funil de Büchner, lavado com água destilada, congelado a -20 °C e

liofilizado. O micélio seco foi macerado e cerca de 100 mg foram transferidos para um tubo

eppendorf de 1,5 mL. Ao micélio macerado foram adicionados 700µL de Tampão de

Extração (CTAB 2,0% p/v; NaCl 8,12% p/v; EDTA 20mM; Tris-HCl pH 8,0 100mM; 2-

mercaptoetanol 0,2% v/v - no momento do uso) a solução foi homogeneizada e incubada em

banho-maria a 65ºC durante 1 hora, agitando o tubo a cada 15 minutos. O tubo foi retirado

do banho e após resfriado, foram acresentados 600 µL de uma solução clorofórmio/álcool

isoamílico (24:1). As soluções foram misturadas por inversão do tubo até a solução

apresentar aspecto homogêneo. O tubo foi então centrifugado durante 5 minutos a 13.000

rpm. A fase aquosa (superior) foi transferida para outro tubo contendo 400 µL de isopropanol

gelado. As soluções foram misturadas por inversão do tubo e centrifugadas a 10.000 rpm

durante 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e ao DNA precipitado foi adicionado 1 mL

de etanol 70% gelado. Após 10 munutos de incubação a temperatura ambiente, o tubo foi

centrifugado a 10.000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e 1 mL de etanol

100% foi adicionado ao tubo, que foi novamente centrifugado como na etapa anterior. O

etanol foi descartado e o tubo incubado à temperatura ambiente para evaporação do etanol

24

residual. O DNA foi ressuspendido em 100 µL de Tampão TE contendo 1µL de RNase A

10mg/mL, incubado a 37ºC por 2horas e estocado a -20 ºC.

3.3 – Produção da parede celular de R. solani, S. sclerotiorum e F. oxysporum.

A parede celular dos fungos fitopatógenos usadas como fonte de carbono para

crescimento de T. asperellum foi adaptado do protocolo utilizado por Potgieter e Alexander

(1966). Para a produção de parede celular, 10 discos (10 mm) de meio MYG contendo

micélio de cada fungo foram inoculados separadamente em frascos de 1L contendo 300 mL

de meio MYG. Estes frascos foram incubados à temperatura de 28 °C sob agitação

constante de 180 rpm em agitador rotatório, por 7 dias. O micélio de cada frasco foi coletado

por filtração, autoclavado, congelado a -20°C e liofilizado. Ao término da liofilização, os

micélios foram macerados utilizando graal e pistilo. A cada 5g do pó resultante da

maceração foram adicionados 200 mL de água destilada. Essa solução foi misturada por

agitação e centrifugada a 12.000 g por 15 minutos. Proteínas presentes no sobrenadante

foram quantificadas através do método descrito por BRADFORD (1976). A solução foi

filtrada e a parede do fungo coletada. Este processo foi repetido até não haver quantidades

detectáveis de proteínas no sobrenadante. A parede coletada ao final do processo foi

congelada, liofilizada e macerada novamente.

3.4 – Cultivo de T. asperellum em diferentes fontes de carbono para produção

de β-1,3-glicanases e para extração de RNA

Esporos do fungo Trichoderma asperellum T00 (107/mL) foram pré-cultivados em

25mL meio TLE (0,05 % Peptona; 0,14 % (NH4)2SO4; 0,20 % KH2PO4; 0,03 % MgSO4 .

7H2O; 0,02% CaCl2 . 2H2O; 2,0% solução de elementos traço - 250mg/L FeSO4.7H2O;

85mg/L MnSO4. H2O; 70mg/L MnSO4.7H2O; 100mg/LCaCl2 .2H2O) contendo 1% de glicose

como fonte de carbono sob agitação a 180 rpm e 28°C durante 24 horas. Em seguida, o

micélio foi coletado por filtração em capela de fluxo laminar e transferido para novos frascos

contendo 25mL de meio mínimo (0,14 % (NH4)2SO4; 0,20 % KH2PO4; 0,03 % MgSO4 . 7H2O;

0,02% CaCl2 . 2H2O; 2,0% solução de elementos traço) contendo glicose (0,5 ou 1%) ou

0,5% parede celular de R. solani, S. sclerotiorum ou F. oxysporum como fonte de carbono.

O fungo foi crescido sob agitação a 180 rpm e 28°C. As coletas dos micélios foram feitas

após 24 e 48 horas de crescimento (e em 0, 6, 12 e 24 horas durante a cinética em glicose

1%). Esses micélios foram coletados por filtração em funil de Büchner com papel de filtro,

lavados com água destilada e guardados em ultrafreezer a -80 °C para posterior extração

25

dos RNAs. Os sobrendantes de cada cultura foram dialisados e utilizados como fonte de

atividade de β-1,3-glicanases.

3.5 – Ensaio para detecção de açúcares redutores e de atividade de β-1,3-

glicanases

Para determinar a concentração de açúcares redutores e a atividade de β-1,3-

glicanases foi utilizado o ensaio descrito por Ramada et al. (2010). Os reagentes foram

misturados em placas de 96 poços de 200 μl e as reações foram incubadas em

termociclador. Para determinação da atividade, um volume de 10 μl de sobrenadante de

cultura foi adicionado a 20 μl de laminarina (Sigma) 0,75% (p/v) em tampão acetato de sódio

50 mM pH 5,0 e incubado a 50 °C por 10 minutos. Em seguida, 100 μl do reagente ácido

3,5-dinitrosalicílico (ADNS) (MILLER, 1959) foram adicionados e a reação incubada a 95°C

por 5 minutos. A reação foi resfriada por 2 minutos a 25 °C e 100 μl, transferida para placas

de cultura com 96 poços e a absorbância obtida a 550 nm em um espectrofotômetro de

microplacas. Uma unidade (U) de β-1,3-glicanase foi definida como a quantidade de enzima

necessária para a produção de 1 μmol de açúcar redutor em um minuto de reação.

A determinação dos açúcares redutores presentes no meio de cultura foi feita de

forma semelhante, misturando-se 10 μl da amostra a ser analisada a 20 μl de tampão

acetato de sódio 50 mM pH 5,0 e 100 μl do reagente ADNS. A mistura foi aquecida a 95°C

por 5 minutos, resfriada por 2 minutos e a absorbância lida como descrito anteriormente

para determinar a concentração de açúcares redutores em μmol/mL. Todas as leituras foram

feitas em triplicata.

3.6 – Dosagem de proteínas totais.

A concentração de proteínas foi determinada pelo método descrito por BRADFORD

(1976) utilizando albumina de soro bovino como padrão. A reação foi conduzida pela adição

de 100 μl de amostra e 1 mL do reagente de BRADFORD e incubado a temperatura

ambiente por 15 minutos. A leitura foi realizada em espectrofotômetro a 595 nm.

3.7 – Eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-

PAGE) e não desnaturante

Para análise do perfil de proteínas de T. asperellum, foi utilizado o sistema de

eletroforese MiniGel (Sigma) com gel de poliacrilamida 12% (p/v) em condições

desnaturantes conforme descrito por LAEMMLI (1970). As amostras de proteínas, após

26

tratadas, foram, ressuspendidas em tampão de amostra desnaturante para proteína (1x),

fervidas por 5 minutos e submetidas à eletroforese em gel. As eletroforeses foram realizadas

utilizando uma corrente 15mA por gel durante a eletroforese no gel concentrador e 25mA

por gel no gel separador, com duração de 2 a 3 horas.

O procedimento para os géis não desnaturantes foi o mesmo utilizado acima, exceto

que o tampão de amostra utilizado não continha β-mercaptoetanol, as amostras não foram

fervidas antes da eletroforese e o gel de poliacrilamida foi preparado para uma concentração

final de 10%. Para melhor separação das proteínas a eletroforese foi realizada durante pelo

menos 4 horas.

3.8 – Coloração de proteínas em gel com Coomassie Blue

O gel contendo submetido a eletroforese foi incubado em solução contendo

Coomassie Blue (Coomassie Blue G-250 0,1% p/v, metanol 25% v/v, ácido acético 5% v/v)

por uma hora. Em seguida o gel foi lavado com solução descorante de ácido acético 10%

para retirada do excesso de corante até a visualização das bandas de proteína.

3.9 – Coloração de proteínas em gel com nitrato de prata

Após a eletroforese, o gel foi transferido para solução fixadora (metanol 50% v/v,

ácido acético glacial 12% v/v e formaldeído 0,1% v/v) e incubado com agitação lenta e

constante por 60 minutos. Em seguida, o gel foi lavado três vezes com solução de etanol

50% (v/v) durante 20 minutos cada. Após as lavagens, o gel foi tratado por 1 minuto com

solução de tiossulfato de sódio (0,2 g/L) com leve agitação, lavando-se em seguida por 3

vezes com água destilada por 20 segundos cada. O gel foi incubado durante 20 minutos

com solução de nitrato de prata (2 g/L) contendo formaldeído (0,75 mL/L). Posteriormente,

foi lavado novamente com água destilada por duas vezes por dois minutos e a revelação foi

realizada com solução de carbonato de sódio 6,0% (p/v) contendo 2mL de tiossulfato de

sódio 0,2g/L e 50 μl de formaldeído. Após a visualização das bandas, a solução anterior foi

descartada e adicionada a solução de parada (metanol 50% v/v e ácido acético 12% v/v).

3.10 – Atividade de β-1,3-glicanases em gel não-desnaturante

O protocolo foi utilizado conforme Pan, Ye e Kuc (1989) com modificações. Após a

eletroforese em condições não-desnaturantes, o gel foi lavado em água destilada por 3

vezes. Em seguida, o gel foi incubado em tampão acetato de sódio 50mM pH 5,0 por 15

minutos sob leve agitação. Logo após o gel foi transferido para uma solução contendo

27

metanol 40% (v/v) e ácido acétido 16% (v/v), onde permanece por 5 minutos sob leve

agitação. A solução anterior foi removida e o gel lavado em água destilada. Em seguida o

gel foi transferido para uma solução contendo 0,3g de 2,3,4-trifeniltetrazólio (TTC) em

200mL de solução de NaOH 1,0 M. A solução foi lentamente aquecida em aparelho de

micro-ondas até o aparecimento das bandas de atividade. O gel foi em seguida transferido

para uma solução de ácido acétido 7,5%.

3.11 – Purificação da endo-β-1,3-glicanase de T. asperellum

A purificação da endo- β-1,3-glicanase de T. asperellum foi realizada de acordo com

o trabalho de AIRES (2005). T. asperellum foi cultivado e o filtrado de cultura coletado como

descrito no item 3.4. Um volume de 150 mL do filtrado da cultura dialisado foi aplicado em

uma coluna de troca iônica Q-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech - 1,5 cm

x 18,4 cm) equilibrada com tampão acetato de sódio (50 mM, pH 5,0), com um fluxo de 60

mL. h-1. Em seguida, a coluna foi lavada com 200 mL de tampão acetato de sódio (50 mM,

pH 5,0) e depois submetida a um gradiente crescente de 0 a 0,5 M de NaCl, sendo

aplicados 200mL de solução no total. Foram coletadas frações de 5 mL, usadas na

determinação de proteínas a 280 nm e na detecção da atividade de β-1,3-glicanases.

As frações do segundo pico que apresentaram atividade de β-1,3-glicanase foram

reunidas (aproximadamente 80 mL), dialisadas contra tampão acetato de sódio (10 mmol.L-

1) a 4°C, concentradas por liofilização. O material liofilizado foi diluído em 2mL de tampão

acetato de sódio (50 mM, pH 5,0), sendo 1mL aplicado em uma coluna de gel filtração

Sephacryl S-100 (2,5 x 48 cm), previamente equilibrada com tampão acetato de sódio (50

mmol.L-1, pH 5,0), contendo 100 mM de cloreto de sódio. O fluxo utilizado foi de 20 mL . h-1,

volume vazio de 90 mL e as frações de 2 mL coletadas foram utilizadas para quantificação

de proteínas a 280 nm e atividade de β-1,3-glicanase. As frações correspondentes ao pico

de atividade enzimática foram coletados, dialisados, liofilisados e mantidos a -20°C.

3.12 – Preparo das amostras para análise por espectrometria de massa.

As bandas de interesse foram recortadas dos géis SDS-PAGE corados com

Comassie e foram tratadas segundo Shevchenko et al. (1996) com modificações. As bandas

retiradas dos géis foram colocadas em tubos de 0,5 mL. Em seguida, 200 µL de uma

solução de bicarbonato de amônio 25 mM pH 8,0 em acetonitrila 50% (v/v) foram

adicionados as bandas, agitados em vórtex por 20 minutos e o sobrenadante descartado.

Esta etapa foi repetida até os pedaços de géis ficarem transparentes. Após o descarte, 100

µL de acetonitrila foram adicionados às amostras e agitados em vórtex por 5 minutos. O

28

sobrenadante foi descartado e as amostras foram completamente secas em uma centrífuga

tipo Speed-Vaccum.

Um volume de 40 µL de uma solução 10 mM de DTT em bicarbonato de amônio

25mM pH 8,0 foram adicionados as amostras e as mesmas foram incubadas à 56 °C por 60

minutos. Após descartar o sobrenadante, 40 µL de Iodoacetamida 55 mM em bicarbonato de

amônio 25mM pH 8,0 foram adicionados as amostras e estas incubadas a temperatura

ambiente ao abrigo da luz. O sobrenadante foi retirado e 100 µL de tampão bicarbonato de

amônio 25mM pH 8,0 foram adicionados a cada amostra e agitado em vórtex por 10

minutos. Após retirar o sobrenadante, 100 µL de bicarbonato de amônio 25mM pH 8,0 em

acetonitrila 50% (v/v) foram adicionados e as amostras agitadas por 10 minutos em vórtex.

O sobrenadante foi descartado e as amostras foram completamente secas em uma

centrifuga à vácuo.

Foram adicionados às amostras, 15 µL de uma solução de tripsina Gold-Mass V582A

(Promega) 10ng/µL em tampão bicarbonato de amônio 25 mM pH 8,0 no gelo. Após 15

minutos, 40µL de tampão bicarbonato de amônio 25 mM pH 8,0 foram adicionados e as

amostras incubadas à 37 °C por 16 horas. O sobrenadante foi transferido para tubos novos

de 0,5 mL. Aos pedaços de géis foram adicionados 50 µL de ácido trifluoroacético (TFA) 5%

(v/v) em acetonitrila e agitado em vórtex por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para

os tubos novos contendo o sobrenadante da etapa anterior. Esta etapa foi repetida e

produto da digestão foi secado em centrífuga Speed-vaccum.

As amostras foram ressuspendidas em 20 µL de água miliQ e 3 µl transferidas para

tubos novos de 0,5 mL contendo 9 µL de matriz (5 mg de ácido α-4-ciano-hidroxicinamico

em 500 µL de TFA 3% v/v e acetonitrila 50% v/v). Dessa mistura, 0,7 µL de cada amostra

foram aplicadas em poços diferentes, em triplicata, de uma placa de MALDI MTP 384

ground steel (Bruker Daltonics). Para a calibração do equipamento, foi utilizada a mistura de

calibradores 4700 Proteomics Analyzer Calibration Mixture (Applied Biosystems).

3.13 – Espectrometria de massa, análise dos espectros e identificação das

proteínas.

As amostras foram analisadas em um espectrômetro de massas Ultraflex III MALDI

TOF/TOF (Bruker Daltonics) no Laboratório de Espectrometria de Massas do

CENARGEN/EMBRAPA. Os dados de MS foram obtidos automaticamente, após

configuração de parâmetros no programa FlexControl (Bruker Daltonics). Foram obtidos

também dados de MS/MS, por fragmentação de íons precursores, para algumas amostras.

Os peptídeos foram seqüenciados manualmente através dos programas FlexAnalysis

29

(Bruker Daltonics) e PepSeq (MicroMass Co.). As seqüências obtidas foram submetidas à

comparação com o banco de dados de proteínas do NCBI, através do algoritmo blastp, para

identificação das proteínas retiradas do gel.

3.14 – Oligonucleotídios utilizados para clonagem e nas reações de RT-PCR em

tempo real

As sequências de aminoácidos dos peptídios obtidas por espectrometria de massas

foram submetidas à busca nas bases de dados dos genomas de Trichoderma (T. atroviride,

T. virens e T. reesei) disponíveis na base do Joint Genome Institute (genome.jgi-psf.org).

Em cada uma das bases de dados foi encontrada uma região correspondente a uma

proteína anotada como uma endo-β-1,3(4)-glicanase. A sequência da base de dados de T.

virens foi escolhida para desenhar os oligonucleotídeos Tag2F e Tag2R, que foram usados

na obtenção da sequência completa do gene de T. asperellum, bem como o

oligonucleotídeo Tag2 int3R, que, junto com Tag2F, foram usados nas reações de qPCR em

tempo real para estudo da expressão desse gene. A sequência dos oligonucleotídios

utilizados neste trabalho para a clonagem do gene tag27 e os experimentos de análise de

expressão de genes em tempo real estão mostradas na Tabela 1.1.

Tabela 1.1. Oligonucleotídeos utilizados para amplificação do gene tag27 completo e para as reações

de qPCR em tempo real.

Nome Sequência (5’ 3’) Bases Tm (˚C)

Tag2F ATGTGGTCTCCTAAGGTTGCTGCT 22 60,3

Tag2R TTTAGGTAGAGTATTGAGCGACGTA 25 55,0

Tag2 int3 R TTCCAGTTGCCCTGGTTATTATAA 24 54,1

Tag83B F* CACCCTACTACCAGCCAAATCC 22 58,0

Tag83B R* CAGAACTGCCGGAACAGGAG 20 58,0

aTubulina F TATCTGCTACCAGGCTCCCGAGAA 24 61,1

aTubulina R TGGTGTTGGACAGCATGCAGACAG 24 61,7

* - (Marcello et al., 2010)

3.15 – Técnicas do DNA Recombinante

As técnicas usadas para clonagem de genes (transformação bacteriana, digestão

com enzimas de restrição e ligação de moléculas de DNA) foram feitas conforme Sambrook

e Russel (2001).

30

3.16 – Ensaios de confronto de fungos em placa

Discos de 7mm de diâmetro foram retirados placas de petri contendo hifas em

crescimento (2 a 3 dias) de cada um dos fungos utilizados no experimento (T. asperellum

T00, R. solani, S. sclerotiorum e F. oxypsorum). Estes discos foram utilizados como inóculos

para o confronto entre Trichoderma e cada um dos fitopatógenos estudados. Cada disco foi

colocado em extremidades opostas de placas de petri de 9,0 cm de diâmetro contendo meio

MYG-ágar com 0,2% de glicose, este coberto com uma membrana de celofane. Os discos

de S. sclerotiorum ou F. oxysporum foram colocados nas placas pelo menos 48 horas antes

de se inocularem os discos de T. asperellum devido à diferença da velocidade de

crescimento. Pelo mesmo motivo, os discos de T. asperellum foram inoculados pelo menos

24 horas antes dos discos de R. solani.

As placas foram mantidas a 25 ºC ao abrigo da luz e os micélios foram coletados nas

fases chamadas de pré-contato (na qual as hifas estavam distantes 1 a 1,5 cm entre si),

contato (na qual as hifas estavam a uma distância de pelo menos 0,5 cm) e de pós-contato

(cerca de 48 horas após o contato) e imediatamente congelados em nitrogênio líquido. O

micélio da fase de pós-contato foi coletado de forma a conter apenas hifas de T.

asperelllum, a no máximo 0,5cm de distância da região de interação. Cada combinação

entre antagonista e patógeno foi feita em cinco placas, assim como a interação entre

colônias distintas de T. asperellum. O micélio de T. asperellum crescido sozinho em placa

(sem confronto) foi coletado após 24 horas e 48 horas de crescimento e os micélios

misturados para uma única extração de RNA.

3.17 – Extração de RNA total de T. asperellum T00 e síntese de cDNA

O RNA total de T. asperellum foi extraído utilizando o reagente TRIzol®

(Invitrogen™), conforme descrito a seguir.

O micélio filtrado de T. asperellum ou coletado a partir das placas de confronto foi

macerado com nitrogênio líquido usando gral e pistilo até conseguir um pó fino. Cerca de

100 mg desse pó foi transferido para tubo tipo eppendorf contendo em 1 mL do reagente

TRIzol (Invitrogen™), homogeneizado em vortex e incubado 5 minutos em temperatura

ambiente. Foram adicionados 0,2 mL de clorofórmio, agitado por 15 segundos e incubado

por 3 minutos a temperatura ambiente. Após isso a amostra foi centrifugada à 12000 g por

15 minutos a 4°C. Depois da centrifugação a fase aquosa foi transferida para um tubo com

0,25 mL de isopropanol e 0,25 mL de uma solução de citrado de sódio 0,8 M e NaCl 1,2 M

para a precipitação do RNA e retirada de carboidratos e proteoglicanas. Após a precipitação

31

por 15 minutos a temperatura ambiente e centrifugação por 10 minutos a 12000 g. O

sobrenadante foi removido e o pellet lavado com 1mL de etanol 75%, centrifugado a 7.500

rpm por 5 minutos a 4ºC. O álcool foi removido e o RNA foi secado a temperatura ambiente

por 10 minutos e ressuspendido em 50µL de água RNase free. Em seguida o RNA foi

quantificado por espectrofotometria utilizando o aparelho GeneQuant (Pharmacia).

Um volume adequado de RNA total de T. asperellum para síntese de cDNA foi

tratado com DNase (Sigma) conforme as recomendações do fabricante. Em seguida, as

sínteses dos cDNAs para uso nas reações de PCR em tempo real foram feitas usando-se o

kit RevertAid First Strand Synthesis ou Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-

qPCR (Fermentas), conforme recomendação do fabricante. Ao final da reação foram

adicionados 80µL de água MiliQ aos 20µL do cDNA para uso nas reações de PCR em

tempo real.

3.18 – Análise da expressão gênica por RT-qPCR em tempo real

As reações de RT-PCR em tempo real foram feitas utilizando o Sistema iQ5 Real-

Time PCR (BioRad). Cada reação era formada por 10 µL de Maxima SYBR-green PCR

Master mix (Fermentas), 0,5mM de cada oligonucleotídio (direto e reverso), 1 a 2 µL do

cDNA molde e água MiliQ para um volume final de 20 µL. As etapas da reação consistiram

em 1 ciclo de 10 minutos a 95ºC, 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC seguido de 1 minuto a

60ºC e uma curva de desnaturação com temperaturas de 60ºC a 95ºC, com aumento

gradativo de 0,5ºC e duração de 10 segundos em cada temperatura. A expressão dos genes

de interesse foi dada como relativa à quantidade de α-tubulina em cada reação, que foi

normalizada para cada condição testada. Os valores de expressão foram dados como média

de duas reações independentes e o valor 1 representa a expressão de α-tubulina. As

reações foram feitas em triplicata para cada amostra analisada.

3.19 – Análises estatísticas

Para comparar a expressão dos genes analisados nas condições experimentais com

a condição controle foi realizado uma análise de variância simples com teste de Dunnett

(α=5%), que compara os testes com o controle, usando o programa GraphPad Prism versão

5.00.

32

4. RESULTADOS

4.1 – Caracterização molecular do gene tag27 de T. asperellum

O fungo Trichoderma asperellum T00 foi crescido em meio TLE contendo parede

celular tratada de Rhizoctonia solani para indução da produção de β-1,3-glicanases. O

sobrenadante de cultura foi devidamente preparado com o objetivo de se purificar a endo-β-

1,3-glicanase produzida por T. asperellum. Para isso, foram realizadas duas etapas de

cromatografia, em que o sobrenadante de cultura foi submetido a separação por troca iônica

em resina Q-Sepharose seguida por uma gel filtração em Sephacryl S-100 (AIRES, 2005).

Uma alíquota das amostras, após as etapas de separação, foi observada em gel SDS-PAGE

(Figura 1.2). A banda de maior massa molecular foi chamada de Banda 1 e a de menor

massa de Banda 2. As duas bandas de proteínas foram recortadas de gel corado com

comassie e cada uma foi submetida a processo de extração do gel e digestão para análise

por espectrometria de massas em um MALDI TOF/TOF (Ultraflex III Bruker Daltonics).

Espectros de massa/carga (MS) gerados foram selecionados para fragmentação e obtenção

de espectros de MS/MS, que foram analisados manualmente.

Os espectros obtidos a partir da Banda 2 geraram sequências que foram

identificadas como uma proteína elicitora de defesa EPL1 de T. asperellum (dados não

mostrados). A partir da Banda 1 foram obtidas dois peptídios, de 22 e 26 resíduos de

aminoácidos, respectivamente. Suas sequências apresentaram alta similadade com endo-β-

1,3-glicanases de Aspergillus fumigatus. A Tabela 1.2 mostra as sequências dos peptídios

obtidos por espectrometria e o número de acesso da proteína correspondente após busca

no banco de dados.

kDa

116.0 66.2 45.0 35.0 25.0

Figura 1.2. Eletroforese das proteínas recuperadas após

cromatografia para purificação da enzima TAG27. Gel SDS-

PAGE 12% corado com prata. Linha 1 - alíquota do pico de

atividade de β-1,3-glicanase após as etapas de purificação

(quantidade não detectada). (M – Unstained Protein Molecular

Weight Marker Fermentas).

M 1

33

Tabela 1.2. Sequências obtidas por espectrometria de massas e identificação dos peptídios obtidos a

partir da proteína correspondente à Banda 1.

Sequência de aminoácidos obtida Proteína identificada

(N˚ de acesso) Organismo

pI e MM (kDa)

IESTYTFTPGAGKVTAVEASIR endo-1,3(4)-beta-glucanase

(XP_751328.1)

Aspergillus fumigatus

Af293 4,79/30,6

TPSSWQSETITWSLDGTNYFQITGSR endo-1,3(4)-beta-glucanase

(XP 748630.1)

Aspergillus fumigatus

Af293 5,09/31,1

4.2 – Sequenciamento do gene tag27 de T. asperellum

O par de oligonucleotídeos Tag2F e Tag2R foi utilizado em uma reação com o DNA

genômico de T. asperellum para amplificação do gene tag27. Um fragmento de

aproximadamente 1,0 kb foi amplificado e clonado no vetor pGEM-T easy, gerando o

plasmídio pGtag27, que foi seqüenciado usando os mesmos oligonucleotídeos da reação

anterior e também oligonucleotídeos universais para vetores de clonagem (T7 e SP6). As

sequências geradas foram analisadas, gerando-se a sequência de nucleotídeos mostrada

na Figura 1.3. A sequência de nucleotídeos de tag27 foi depositada na base de dados do

GenBank (NCBI) com o número JQ408672.

A sequência de nucleotídeos do gene tag27 possui 919 pb e um íntron de 61pb, que

foi determinado alinhando-se a sequência obtida para tag27 com a sequência

correspondente ao cDNA de uma endo-β-1,3-glicanase de T. atroviride (dados não

mostrados). Os 858 nucleotídeos correspondentes à ORF codificam para 285 resíduos de

aminoácidos e os 19 resíduos do peptídio sinal foram determinados com base na sequencia

de T. atroviride (genome.jgi-psf.org/Triat1/). Os 11 resíduos que compõem o sítio ativo, dos

quais 3 estão envolvidos na catálise (Figura 1.3), foram identificados pelo programa NCBI

Conserved Domain Search (MARCHLER-BAUER et al., 2011), que é ativado durante a

submissão da sequência no programa BLAST. O Conserved Domain Search identificou

também a proteína como sendo componente da Família 16 das glicosil hidrolases (ou das

enzimas “laminarinase-like”). A sequência dos dois peptídios obtidas anteriormente por

espectrometria de massas (AIRES et al, 2012) estão em destaque na Figura 1.3.

A sequência de aminoácidos obtida pela tradução da sequência de nucleotídeos do

gene tag27 foi analisada pelo programa Peptide Mass do site Expasy

(web.expasy.org/peptide_mass/ - GASTEIGER et al., 2003). A massa predita para a

proteína foi de 30.3 kDa e o pI teórico foi de 4,63. A sequência de aminoácidos de TAG27 foi

também submetida à base de dados de proteína do NCBI e dos genomas de Trichoderma

para buscar por proteínas com sequências similares.

34

Figura 1.3. Sequência de nucleotídeos do gene tag27 e de aminoácidos da enzima endo-β-1,3-

glicanase correspondente. Os nucleotídeos em letra minúscula representam o íntron de 61 pb. (cont.)

1 ATG TGG TCT CCT AAG GTT GCT GCC GCT GTT CTC GCC TTC GTT GGA 45

1 M W S P K V A A A V L A F V G 15

46 GCT TCC AAC GCT TGG GCT CCT CCC TCG TAC TCC GGT TAC AAC CTT 90

16 A S N A W A P P S Y S G Y N L 30

91 ATT TGG TCC GAC TCC TTC GCC GGA AAT GGC GGT ACT TCT CCC AAC 135

31 I W S D S F A G N G G T S P N 45

136 ACG GGC AAC TGG AAC ATC ATC ACT GGT TAC CTA GGC GTC AAC AAC 180

46 T G N W N I I T G Y L G V N N 60

181 GAG CAG GAG ACC TAT TCT TCC AGC ACC CAG AAT GTT CAG CTC AGT 225

61 E Q E T Y S S S T Q N V Q L S 75

226 GGT GGA AAC ACT CTT CAG CTT GTC CCC TGG AAC AAC GGC GGC AGC 270

76 G G N T L Q L V P W N N G G S 90

271 TGG ACC TCT GGT CGT CTT GAG TCT ACT TAC ACT TTT ACT CCT GGT 315

91 W T S G R L E S T Y T F T P G 105

316 GCT GGC CAA GTG ACC GCT GTC GAG GCT TCC ATC CGC TTC GGT AAC 360

106 A G Q V T A V E A S I R F G N 120

361 AAC GCT CAG GGC AAC CAG CAG GGC ATG TGG CCC GCT TTC TGG ATG 405

121 N A Q G N Q Q G M W P A F W M 135

406 CTG GGT AAC TCG ATC CGT ACC GGT GGC AGC TGG CCC GCT TGT GGT 450

136 L G N S I R T G G S W P A C G 150

451 GAG ATC GAT ATC ATG GAG GTG GTC AAT GAC CTG CCT AGA GGT TAC 495

151 E* I D* I M E* V V N D L P R G Y 165

496 GGA ACC ATC CAC TGC GAT GTG TCT CCC GGC GGT ATC TGC AAC GAG 540

166 G T I H C D V S P G G I C N E 180

541 GGC AAT GGT ATT GGA GGC AAC ACT GCC ATC AAC GGT GGC AAC AAC 585

181 G N G I G G N T A I N G G N N 195

586 AAC TTC CAC ACT TGG CGT GTC CAG ATC GAC CGA ACG CCC AGC AGC 630

196 N F H T W R V Q I D R T P S S 210

631 TGG CAA TCC GAG ACC ATC ACC TGG TTC CTC GAT GGT GCT CAG TAC 675

211 W Q S E T I T W F L D G A Q Y 225

676 TTC CAA GTC TCT GGT TCC AGA ATT AAC GAC CAG AAT GTG TGG AAC 720

226 F Q V S G S R I N D Q N V W N 240

721 AGC CTT GCC CAC AGC CCT CTG TTT ATC ATC CTC AAC GTC GCT GTT 765

241 S L A H S P L F I I L N V A V 255

766 GGC GGT ACT TTC gtatgtattcccctttttctccgtacaccttccactataaaag 820

256 G G T F 259

821 ttactaacaagagaacag CCC GGA AAC ACC AAC GGC AAC ACC CTG GGC 868

260 P G N T N G N T L G 269

869 GGC TAC GGC AGC ATG ATG GAG GTT GGC TAC GTC GCT CAA TAC TCT 913

270 G Y G S M M E V G Y V A Q Y S 284

914 ACC TAA 919

285 T # 285

35

Os aminoácidos sublinhados indicam o peptídio sinal, os destacados em cinza são as sequências dos

peptídios obtidas por espectrometria de massas e os destacados em preto são os resíduos presentes

no sítio ativo, sendo que os resíduos 151, 153 e 156 (asterisco) compõem o sítio catalítico (Número

de acesso GenBank JQ408672).

A sequênica de TAG27 foi submetida a um alinhamento pelo algoritmo BLASTP com

uma base de dados local contendo as sequências das 13 proteínas pesquisadas. A Tabela

1.3 mostra a identidade e a similaridade de TAG27 em relação a essas proteínas, bem como

os dados de E-value e número de acesso de cada uma das sequências. A endo-β-1,3-

glicanase TAG27 de T. asperellum apresentou alta identidade com uma sequência de T.

atroviride (92%), contendo o mesmo número de resíduos de aminoácidos (285) e uma

similaridade de 96%. Duas outras sequências de Trichoderma apresentaram as maiores

identidades (T. reesei e T. virens – 75%). Dentre as sequências analisadas encontra-se

também uma proteína de Fusarium oxysporum, um dos fitopatógenos utlizados neste

estudo.

Tabela 1.3. Sequências de endo-β-1,3(4)-glicanases similares à TAG27 de T. asperellum. Dados de

identidade, similaridade e E-value obtidos por alinhamento local com o programa BLAST

Organismo Identificação da

Sequencia

Resíduos

de AAs

Identidade

com Tag27

Similaridade

com Tag27 E-value

Trichoderma atroviride

EHK44901.1 285 92% 96% 8e-154

Trichoderma reesei

EGR45305.1 287 75% 86% 3e-126

Trichoderma virens

EHK27028.1 287 75% 86% 1e-125

Giberella zeae

XP_384944.1 286 66% 78% 2e-103

Neosartorya fischeri

XP_001258587.1 285 64% 77% 3e-102

Talaromyces stipitatus

XP_002341849.1 288 63% 77% 4e-102

Aspergillus fumigatus

XP_748630.1 285 62% 76% 2e-101

Fusarium oxysporum

EGU82376.1 286 59% 74% 4e-101

Neosartorya fischeri

XP_001259029.1 285 67% 79% 4e-100

Aspergillus fumigatus

XP_751328.1 285 67% 79% 5e-100

Trichoderma atroviride

EHK44423.1 283 50% 68% 1e-077

Trichoderma reesei

EGR47490.1 287 49% 69% 4e-077

Trichoderma virens

EHK24178.1 284 47% 67% 7e-072

36

As duas endo-β-1,3-glicanases de Aspergillus fumigatus presentes na Tabela 02 são

as mesmas que apresentaram as maiores identidades com as sequências dos dois

peptídios obtidos por espectrometria de massas e submetidos à busca na base de dados do

NCBI (AIRES et al., 2011). Estas enzimas apresentaram identidade 62 e 67% com a TAG27

de T. asperellum.

Outras três sequências de endo-β-1,3-glicanases de Trichoderma mostraram

tamanho bastante próximo à TAG27 de T. asperellum, mas com baixa identidade, o que

pode indicar que T. asperellum possui mais de uma endo-β-1,3-glicanase de massa

molecular semelhante à TAG27.

A Figura 1.4 mostra o alinhamento entre a sequência de TAG27 de T. asperellum, as

três sequências mais similares das outras espécies de Trichoderma, as duas sequências de

Aspergillus fumigatus e a sequência de Fusarium oxysporum.

As sequências de Aspergillus foram escolhidas para o alinhamento por serem as

primeiras sequências alinhadas com resíduos de aminoácidos obtidos de TAG27 por

espectrometria de massas e a sequência de F. oxysporum foi escolhida para o alinhamento

por se tratar de um fungo que é filogeneticamente próximo a Trichoderma e por ter sido

utilizado nos experimentos de confronto para estudos de expressão dos genes de β-1,3-

glicanases.

É possível perceber pelo alinhamento que as sequências de T. asperellum e T.

atroviride são sutilmente distintas das de T. virens e T. reesei. TAG27 e a sequência de T.

atroviride apresentaram diferença na região entre os resíduos 86 e 93, sendo que uma

sequência com grande similaridade nas outras sequências foi interpretada como intervalo

em TAG27. Todos os resíduos que compõem o sítio ativo se mostraram idênticos em todas

as sequências analisadas.

37

Figura 1.4. Alinhamento entre as sequências de aminoácidos de TAG27 de T. asperellum e algumas

das sequências similares obtidas por busca nas bases de dados de proteínas. Os pontos

representam os resíduos idênticos ao da sequência base (TAG27); os traços representam os

intervalos (gaps) do alinhamento; os resíduos marcados em cinza representam os similares aos da

sequência de T. asperellum e os marcados em preto destacam os resíduos que formam o sítio

catalítico da enzima

10 20 30 40 50 60

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

T.asperellum 1 MWSPKVAAAVLAFVGASNAWAPPSYSGYNLIWSDSFAGNGGTSPNTGNWNIITGYLGVNN

T.atro_Scaf4 1 .....I........................V.........................N..G

T.vir_scaf1 1 .........I......T...Q....G.F..V.T.T....SA....Q........N.....

T.ree_scaf25 1 .........I.....L.........G.F..V.N.A...................N.N...

A.fum_XP74 1 -MRCQYSCFL..LASLVS..V.......T.Q...T...SA..L..SN.......NP...G

A.fum_XP75 1 -MCFLY.SLLP.LASLAL..........T.Q.......SSA.L..SN.......N....G

F.oxys 1 .FFKQPFTVL.SLSATAL..DA.G...FTRV.Q.P.S.AA..L.D.SR....Q...N..A

Clustal Consensus : :: . ** .*.*.*:. * *.*:* ..* *: ..**** * .**

70 80 90 100 110 120

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

T.asperellum 61 EQETYSSSTQNVQLSGGNTLQLVPWNNG---GSWTSGRLESTYTFTPGAGQVTAVEASIR

T.atro_Scaf4 61 .....................I......---................A..K.........

T.vir_scaf1 61 .L.......R...............KDSSTF.G........K.....Q..K..RA.....

T.ree_scaf25 61 .L.......K...............KDSSTF.G........K.....Q..K..RA.....

A.fum_XP74 60 .L...TN.NR...............RDSSVS.G........K.V...SS.KI.FA..N..

A.fum_XP75 60 .L...T...A.......S.......KDSSVS.G.....I..K.....S..K..IA..N..

F.oxys 61 .L.V.T..SR...R...D.......RDASALKG.....V..K.V...QP.K..RA..NL.

Clustal Consensus * *.*:.*. *** ***.***:***.:. .*****:**.*.*** .*::* .**.:*

130 140 150 160 170 180

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

T.asperellum 118 FGNNAQGNQQGMWPAFWMLGNSIRTGGSWPACGEIDIMEVVNDLPRGYGTIHCDVSPGGI

T.atro_Scaf4 118 ..T..PA....................G..S............QST.H.......Y....

T.vir_scaf1 121 ..S...A.K..I........D.L.H.....N......L.T..GQAT.H..L....Y....

T.ree_scaf25 121 M.S...A.K..I........DVL.H.....S......L.Q..GQ.T.H..L....Y....

A.fum_XP74 120 ..S.PTSAK..I............S.TP..G...L..L.TI.GQLT....A..N.Y....

A.fum_XP75 120 ..S.PTS.K..I.....I..S...S.TG..Q...L..L.NI.GNLV....A....N....

F.oxys 121 ..SCSIN.K..I.........IL.N.....S...L.V..T..GQLT....A....Y....

Clustal Consensus :*. . :**:*****:**. :* * ** ***:*::* :*. *:** **:* ****

190 200 210 220 230 240

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

T.asperellum 178 CNEGNGIGGNTAINGGNNNFHTWRVQIDRTPSSWQSETITWFLDGAQYFQVSGSRINDQN

T.atro_Scaf4 178 .........S.G.....T......................F..........A.....N..

T.vir_scaf1 181 .........PVN.ANI.-D......E....SNN.....L..S...TNF..IT....GN.G

T.ree_scaf25 181 .........PVNF.NP.-D......E....SNN..T..L..S...TNF..IT....GN..

A.fum_XP74 180 ...P..R..SI..PDQS--W....IVW.....T........YM..QFFH.IT..Q.G.S.

A.fum_XP75 180 ...P..L..SIT.PDQS--W.....TW.....N....K...YM..Q.FH.IT..Q.GNSG

F.oxys 181 ....T....TVGLPNQD--W....IEFN.AK...RD.........Q.FH.I..A...NEG

Clustal Consensus *** .* ** : . . :****: :*: ..*: *.:*: :** :.*::*::*.:..

250 260 270 280

....|....|....|....|....|....|....|....|....|...

T.asperellum 238 VWNSLAHSPLFIILNVAVGGTFPGNTNGNTLGGYGSMMEVGYVAQYST 285

T.atro_Scaf4 238 ....................S........................... 285

T.vir_scaf1 240 ...NI......F........NW...P..S..D................ 287

T.ree_scaf25 240 ...NI......F........SW...P.SA..D...A............ 287

A.fum_XP74 238 ..AT.C.D..YF.........W..YP.SA..D.......IA...V.VS 285

A.fum_XP75 238 ..AT.C.D...F........YW...P.S...D............V.VS 285

F.oxys 239 ...T.C...MYF.........W..YP....CD............H..N 286

Clustal Consensus ** .:.*.*:::******** :** .*. * .***:***:.*** * .

38

4.3 – Análise da atividade enzimática total de β-1,3-glicanases nas culturas de

T. asperellum em paredes de diferentes fitopatógenos

Para verificar o perfil de atividade de β-1,3-glicanases produzidas na presença das

paredes dos diferentes fitopatógenos, T. asperellum T00 foi pré-cultivado em meio TLE

contendo 1% de glicose durante 24 horas. O micélio foi então lavado e transferido para

frascos contendo meio TLE com 0,5% de parede celular dos fitopatógenos analisados. As

culturas com glicose 0,5% e 1,0% foram usadas como controle. Os valores de atividade total

e atividade específica de β-1,3-glicanases e a quantidade de proteína secretada para os

crescimentos nas diferentes fontes de carbono estão mostrados na Tabela 1.4.

Tabela 1.4. Atividade enzimática de β-1,3-glicanases, proteínas totais e atividade específica das

diferentes culturas de T. asperellum em 24 e 48 horas de crescimento.

Cultura Atividade enzimática (U/mL)

Proteínas totais (µg/mL)

Atividade específica (U/ µg)

24 h 48 h 24h 48h 24h 48h

Glicose 0,5% 0,264

(±0,050)

1,062

(±0,058)

0,7664

(±0,363)

3,032

(±0,198)

0,370

(±0,109)

0,350

(±0,003)

Glicose 1,0% 0,650

(±0,007)

1,595

(±0,030)

7,028

(±0,099)

7,098

(±0,396)

0,092

(±0,002)

0,225

(±0,008)

pcRS 0,5% 4,091

(±0,240)

5,474

(±0,241)

8,456

(±0,925)

18,102

(±0,231)

0,483

(±0,080)

0,302

(±0,172)

pcSS 0,5% 8,052

(±0,315)

7,363

(±0,378)

7.355

(±0,165)

14,457

(±,627)

1,095

(±0,067)

0,510

(±0,048)

pcFO 0,5% 3,386

(±0,044)

3,560

(±0,001)

5,906

(±0,297)

10,532

(±0,297)

0,573

(±0,021)

0,338

(±0,009)

pcRS – parede celular de R. solani, pcSS – parede celular de S. sclerotiorum, pcFO – parede celular

de F. oxysporum.

As paredes dos fitopatógenos R. solani, S. sclerotiorum e F. oxysporum induziram a

produção de β-1,3-glicanases por T. asperellum T00. Os maiores valores de atividade total

foram obtidos nas culturas com parede de S. sclerotiorum, tanto em 24 quanto em 48 horas.

A atividade total de β-1,3-glicanases em meio com parede de R. solani foi maior que na

cultura com parede de F. oxysporum. A cultura com parede de R. solani, porém, apresentou

maior quantidade de proteínas no meio de cultura que na cultura com parede de F.

oxysporum, fazendo com que a atividade específica dessas duas culturas apresentassem

valores próximos. Em todas as culturas com parede de fitopatógenos a atividade específica

de β-1,3-glicanases foi maior em 24 horas que em 48 horas devido ao aumento da

quantidade de proteínas secretadas por T. asperellum T00 após as primeiras 24 horas de

crescimento.

39

A atividade total de β-1,3-glicanases nas culturas com glicose foi consideravelmente

menor que nas culturas com paredes de fitopatógenos. A atividade total detectada em meio

contendo 1,0% de glicose foi maior que em 0,5% de glicose, bem como a quantidade de

proteínas secretadas no meio de cultura. Pode-se notar que a atividade específica de β-1,3-

glicanases nas culturas com glicose foi relativamente alta quando comparadas às culturas

com paredes de fitopatógenos. Esse fato ocorreu devido à pequena quantidade de proteínas

secretadas por T. asperellum T00 durante o crescimento, mesmo após 48 horas. Em T.

harzianum foi detectada uma atividade basal de β-1,3-glicanase após 48 horas de

crescimento em meio contendo 2,0% de glicose como fonte de carbono (VASQUES-

GARCIDUEÑAS, LEAL-MORALES & HERRERA-ESTRELA; 1998).

4.4 – Perfil das β-1,3-glicanases de T. asperellum em zimograma nas culturas

nas diferentes paredes de fitopatógenos.

O perfil das β-1,3-glicanases secretadas por T. asperellum nas diferentes culturas e

nos diferentes tempos foi analisado por atividade enzimática em gel não-desnaturante. A

Figura 1.5 mostra os padrões de bandas das β-1,3-glicanases identificados em gel.

Figura 1.5. Zimograma mostrando as bandas de atividade de β -1,3-glicanases de T. asperellum nas

diferentes culturas em 24 e 48 horas de crescimento. (pcRS – parede celular de R. solani, pcSS –

parede celular de S. sclerotiorum, pcFO – parede celular de F. oxysporum. Foram aplicados 15µg de

proteínas para cada condição.)

Nas culturas com parede de R. solani e S. sclerotiorum foram identificadas duas

bandas de atividade distintas, semelhantes às encontradas em trabalhos anteriores do

grupo de Enzimologia (ICB/UFG) (BARA, LIMA & ULHOA, 2003; AIRES et al., 2012),

indicando a presença de pelo menos duas β-1,3-glicanases. Estes trabalhos relacionam a

pcRS 0,5% pcSS 0,5% pcFO 0,5% Glicose 1%

24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h

40

banda mais alta do gel de atividade à exo-β-1,3-glicanase (TAG83) de 83 kDa codificada

pelo gene tag83 e a banda menor à endo-β-1,3-glicanase (TAG27) codificada pelo gene

tag27, clonado neste trabalho. A banda correspondente à enzima TAG27 se mostrou mais

intensa na cultura com parede de R. solani em 48 horas de cultivo.

Na cultura com parede de F. oxysporum foi detectado um padrão diferente de

atividade em gel, apenas com a banda de atividade de maior massa. Essa banda

apresentou também um padrão diferente dos identificados nas culturas com parede de R.

solani e S. sclerotiorum, com uma área menor. Aparentemente uma β-1,3-glicanase

secretada nas outras culturas com parede não foi produzida no crescimento de T.

asperellum com a parede de F. oxysporum. A banda de menor massa molecular também

não foi identificada em crescimento com a parede de F. oxysporum por atividade em gel.

No crescimento com 1% de glicose como fonte de carbono, nenhuma atividade foi

detectada em gel em 24 horas de crescimento de T. asperellum T00 e uma banda de área

pequena foi identificada em 48 horas de crescimento indicando que uma β-1,3-glicanase

com massa molecular semelhante à observada nas culturas com parede foi secretada. Um

padrão semelhante de banda em gel de atividade não-desnaturante foi observado quando T.

asperellum foi crescido em meio TLE sem nenhuma fonte de carbono após 24 horas

(AIRES, 2005, AIRES et al., 2012) e após 24 horas de crescimento em 0,5% de glicose

(MARCELLO et al., 2010), sugerindo que T. asperellum T00 secreta uma β-1,3-glicanase

quando há baixa ou nenhuma disponibilidade de fontes de carbono. Nas amostras de cultura

em glicose 0,5% analisadas em gel não foram identificadas bandas de atividade (dados não

mostrados), mesmo sendo detectada atividade nos ensaios enzimáticos.

4.5 – Análise da expressão de tag83 e tag27 de T. asperellum durante o

crescimento com parede celular de fitopatógenos.

O micélio de T. asperellum crescido nas condições com as diferentes paredes de

fitopatógenos ou com glicose como fonte de carbono foram coletados e a expressão dos

genes de tag83 e tag27 foi analisada por PCR em Tempo Real. A Tabela 1.5 mostra níveis

de transcritos detectados durante o crescimento como valores relativos aos do gene de α-

tubulina utilizado como controle (ver oligonucleotídios na Tabela1.1).

41

Tabela1. 5. Análise por RT-qPCR em tempo real da expressão relativa dos genes tag83 e tag27 de T.

asperellum durante o crescimento em meio de cultura contendo diferentes fontes de carbono por 24 e

48 horas. Os dados representam a expressão relativa ao gene de α-tubulina, usado como controle.

Fonte de carbono

Nível de expressão relativa (± Desv. Pad)

tag83 tag27

24 h 48 h 24 h 48 h

Glicose 0,5% 2,456

(±0,498)

4,301

(±0,686)

0,690

(±0,218)

0,759

(±0,226)

Glicose 1,0% 2,958

(±0,303)

10,655

(±1,088)

0,371

(±0,007)

0,861

(±0,082)

pcRS 0,5% 0,091

(±0,014)

0,751

(±0,126)

0,524

(±0,240)

0,796

(±0,166)

pcSS 0,5% 0,293

(±0,048)

0,345

(±0,042)

0,342

(±0,315)

1,043

(±0,185)

pcFO 0,5% 0,022

(±0,010)

0,034

(±0,003)

0,020

(±0,044)

1,268

(±0,133)

pcRS – parede celular de R. solani, pcSS – parede celular de S. sclerotiorum, pcFO – parede celular

de F. oxysporum.

Na cultura com parede celular de R. solani o gene tag83 apresentou o maior nível de

expressão quando comparado com as paredes dos outros fitopatógenos, sofrendo aumento

de 8,25 vezes na expressão de 24 para 48 horas. No tempo de 24 horas o gene tag27

apresentou maior nível de transcritos que o gene tag83. O gene tag27, porém, sofreu pouca

variação nos níveis de transcritos (aumento de 1,52 vezes) de 24 para 48 horas.

Com parede celular de S. sclerotiorum a maior variação apresentada foi do gene

tag27, chegando a ser 3,22 vezes mais expresso em 48 horas quando comparado ao nível

de transcritos em 24 horas. O gene tag83 praticamente não aumentou o nível de transcritos

de 24 para 48 horas, mas o nível de transcritos nas primeiras 24 horas de crescimento era

maior quando comparado com o mesmo período de crescimento na cultura com parede de

R. solani. Em 24 horas de crescimento, os níveis de transcritos de tag83 e tag27 eram

praticamente iguais, enquanto que em 48 horas, tag27 apresentou cerca de 3 vezes mais

transcritos que tag83.

Em presença de parede celular de F. oxysporum foram detectados os menores

níveis de transcritos em 24 horas em relação ao crescimento nas outras paredes. O gene

tag83 apresentou o mesmo nível de transcritos em 24 e em 48 horas de crescimento e

valores mais baixos quando comparados com o cultivo nas outras paredes. O gene tag27,

porém apresentou uma expressão 63,4 vezes maior em 48 horas que em 24 horas de

42

crescimento e 37,2 vezes maior que de tag83 em 48 horas, chegando a níveis comparáveis

aos do crescimento de S. sclerotiorum em 48 horas.

No geral, nas culturas com parede celular de fitopatógenos, os níveis de transcritos

de tag27 encontrados foram maiores que os de transcritos de tag83. Isso foi notado

principalmente no tempo de 24 horas de crescimento com parede de R. solani e em 48

horas no crescimento com parede de F. oxysporum.

Devido ao baixo nível de transcritos do gene tag83 e da baixa atividade de β-1,3-

glicanases apresentados nas culturas de T. asperellum com parede de F. oxysporum

acredita-se que a estrutura da parede deste fungo seja menos suscetível a ataque

enzimático por β-1,3-glicanases quando comparado à parede dos outros fitopatógenos

(SIVAN & CHET, 1989).

Nas culturas de T. asperellum em meio contendo glicose como fonte de carbono os

níveis de transcritos dos genes tag83 e tag27 mostraram padrão diferente dos encontrados

nas culturas com paredes de fitopatógenos. Os níveis de transcritos de tag83 se

apresentaram maiores que os observados na presença de parede, mesmo em 24 horas de

crescimento. Em glicose 0,5%, tag83 aumentou 1,75 vezes de 24 para 48 horas de

crescimento, e chegou a aumentar 3,6 vezes no mesmo período na cultura com 1,0% de

glicose. A variação de tag27 nos tempos de cultura analisados foi menor, chegando a 2,32

vezes na cultura com 1,0% de glicose. Diferente do apresentado nas culturas com parede,

os níveis de transcritos de tag27 foram sempre menores que os níveis de tag83.

Para entender o comportamento das β-1,3-glicanases de T. asperellum T00 na

presença de glicose, a expressão de tag83 e tag27 e a atividade de β-1,3-glicanases foi

analisada em uma cinética de crescimento em meio de cultura contendo 1,0% de glicose. O

micélio e o sobrenadante de cultura foram coletados logo após o pré-crescimento dos

esporos em meio contendo 1,0% de glicose (que foi chamado de tempo zero) e após 6, 12 e

24 horas de crescimento em 1,0% de glicose. A Figura 1.6 mostra os dados de qPCR em

Tempo Real para a detecção dos transcritos, a atividade de β-1,3-glicanases e a quantidade

de glicose no meio de cultura.

43

Figura 1.6. Análise da expressão dos genes tag83 e tag27, atividade específica de β-1,3-glicanases e

quantidade de glicose no meio de cultura durante crescimento de T. asperellum em meio TLE

contendo 1% de Glicose. (Linhas cheias – dados de expressão gênica. ■ – gene tag83; ♦ - gene

tag27. Linhas tracejadas. ∆ - Atividade específica de β-1,3-glicanases, O – Glicose no meio de

cultura. Os dados de expressão gênica representam a expressão relativa ao gene de α-tubulina,

usado como controle).

Logo após o período de pré-crescimento de T. asperellum em meio contendo 1% de

glicose, cerca de metade desta fonte de carbono havia sido consumida. Nesse momento os

níveis de transcritos de tag83 e tag27 se apresentavam baixos. Ao ser transferido para o

novo meio contendo mais glicose (aumento representado pelo ponto de 2 horas na curva de

açúcares redutores no meio de cultura – Figura 1.6), a maior disponibilidade dessa fonte de

carbono fez com que os níveis de transcritos dos genes das β-1,3-glicanases ficassem ainda

menores em 6 horas de crescimento. Após 12 horas de crescimento, toda a glicose do meio

de cultura havia sido consumida e os transcritos de tag83 e tag27 aumentaram, com

destaque para tag83 que apresentou um aumento de cerca de 150 vezes. Apesar do

aumento na quantidade de transcritos, a atividade de β-1,3-glicanases se mostrou muito

baixa. Em 24 horas de crescimento, a atividade de β-1,3-glicanases apresentou um aumento

e, devido ao grande período de ausência de glicose no meio, os transcritos dos genes de β-

1,3-glicanases analisados apresentaram ainda um aumento. Esse procedimento confirma

que a expressão de tag83 e tag27 é reprimida na presença de glicose e que a atividade das

44

enzimas codificadas por esses genes está possivelmente relacionada à organização da

parede celular e nutrição do fungo na ausência de fontes de carbono disponíveis no meio

(DE LA CRUZ et al., 1995).

4.6 – Expressão de tag83 e tag27 em T. asperellum T00 em situação de

confronto com fitopatógenos.

Com os experimentos de confronto em placa foi observado que T. asperellum inibiu o

crescimento dos fitopatógenos R. solani, S. sclerotiorum e F. oxysporum, sendo que as hifas

desses fungos não avançaram em crescimento após o encontro com o antagonista. Já no

confronto entre duas colônias distintas de T. asperellum, não foi observado sobreposição no

crescimento após o encontro entre as colônias. Na região de encontro entre as colônias, os

fungos esporularam e cessaram o crescimento (dados não mostrados). A Figura 1.7 mostra

fotos de placas que ilustram a fase de pós-contato de cada um desses confrontos.

Figura 1.7. Experimento de confronto em placa de petri entre T. asperellum T00 e diferentes

fitopatógenos (A a C) e contato entre colônias de T00 (D) na fase de pós-contato. (A – T00 x R.

solani; B – T00 x S. sclerotiorum; C – T00 x F. oxysporum; D – T00 x T00).

A B

\

B

C D

45

Para tentar compreender como atuam as enzimas TAG83 e TAG27 de T. asperellum

durante o micoparasitismo, foi realizado o experimento de interação in vivo por confronto em

placa entre T. asperellum T00 e os fitopatógenos R. solani, S. sclerotiorum e F. oxysporum.

A expressão dos respectivos genes foi analisada por PCR em tempo real. A mesma análise

foi feita na interação entre colônias de T. asperellum e com este fungo crescendo sozinho

em placa, condição que foi usada como controle. O nível de expressão de cada um dos

genes analisados nas diferentes condições está mostrado na Figura 1.8.

Na condição de crescimento de T. asperellum sozinho em placa, foi detectado que o

nível basal médio de expressão de tag83 é mais alto (cerca de 9 vezes) que do gene tag27.

Já nas condições de confronto de T. asperellum (tanto em contato com outros fungos quanto

em contato com hifas de outra colônia do mesmo fungo,) o padrão de expressão dos genes

das β-1,3-glicanases analisadas foi diferente do crescimento sozinho em placa. A maior

variação na expressão de ambos os genes foi no período de pós-contato, no qual T.

asperellum foi coletado cerca de 48 horas depois do contato entre as colônias na placa.

Na interação entre colônias de T. asperellum T00 (Fig. 1.8 A), tag27 não apresentou

diferenças significativas (ANOVA com teste de Dunnet) de expressão durante o período de

pré-contato e contato entre as colônias quando comparado com o crescimento de T.

asperellum sozinho em placa. Houve um aumento expressivo (cerca de 100 vezes) no nível

de transcritos desse gene durante o período de pós-contato entre as duas colônias. A

expressão do gene tag83 apresentou pouca variação de expressão nos diferentes

períodosde contato entre colônias de Trichoderma. Apesar de o teste ANOVA apontar para

diferenças significativas de expressão durante o contato e o pós-contato entre as colônias,

os aumentos de expressão de tag83 nesses pontos foram de 2,4 e 5,5 vezes,

respectivamente.

No experimento de interação entre T. asperellum e R. solani (Fig. 1.8 B), os transcritos de

tag83 e tag27 antes do contato entre os fungos foram detectados em níveis semelhantes

(ANOVA com teste de Dunnet) aos encontrados em T. asperellum crescendo sozinho em

placa. No contato entre os fungos, os transcritos de ambos genes não aumentaram

significativamente pelo teste estatístico, apesar de tag27 ter aumentado em 5,5 vezes os

níveis de transcritos quando comparado à condição sem confronto. Após o contato, tag83

apresentou os mais altos níveis de transcritos registrados, sendo cerca de 100 vezes maior

que a expressão basal registrada na condição controle. Apesar de apresentar menor nível

de transcritos quando comparado com tag83, o gene tag27 apresentou significativo aumento

quando comparado ao controle, sendo 135 vezes maior que o apresentado na condição

controle.

46

Figura 1.8. Análise por PCR em tempo real da expressão relativa dos genes tag83 (linhas cheias) e tag27 (linhas tracejadas) de T. asperellum

(T00) durante o confronto com diferentes fungos fitopatógenos. Os dados representam a expressão relativa ao gene de α-tubulina, usado como

normalizador (A – T. asperellum T00 x T00, B – T00 x R. solani, C – T00 x S. sclerotiorum, D – T00 x F. oxysporum. * - Média dos confrontos

para tag83 diferem da média do controle; ⱡ - Média dos confrontos para tag27 diferem da média do controle. Pontos não marcados não diferem

do controle).

A B

C D

*

ⱡ

*

ⱡ

ⱡ

ⱡ

*

*

* *

46

ⱡ

47

Durante a interação entre T. asperellum e S. sclerotiorum (Fig. 1.8 C) os transcritos

dos genes analisados permaneceram semelhantes aos da condição controle antes do

contato entre os fungos. Já no contato entre os fungos, foi observado aqui o mesmo que no

experimento com R. solani: os transcritos de tag27 aumentaram 5,3 vezes enquanto que os

de tag83 apresentaram pequeno aumento (ambos não significativos em relação ao controle

pelo teste estatístico aplicado). Foi observado aumento nos níveis de transcritos de ambos

os genes após o contato, sendo que tag83 apresentou aumento de cerca de 20 vezes e

tag27 aumento de 70 vezes em relação à condição controle. Comparando-se os níveis de

transcritos entre os genes no período de pós-contato, pode-se perceber que a expressão foi

semelhante.

O experimento de interação entre T. asperellum e F. oxsporum (Fig. 1.8 D) mostrou

um comportamento diferente dos experimentos anteriormente descritos no que se refere à

expressão dos genes das β-1,3-glicanases. Antes do contato entre os fungos, os níveis de

transcritos apresentaram padrão semelhante aos da condição controle. Durante o contato

entre os fungos, os níveis de transcritos de tag83 aumentaram cerca de 17 vezes enquanto

que os de tag27 aumentaram cerca de 680 vezes em relação ao nível da condição controle.

Já após o contato, o aumento de tag83 foi discreto (2,3 vezes), enquanto que a expressão

de tag27 na fase de pós-contato foi 3,6 vezes maior que durante o contato e 2400 vezes

mais expresso que na condição controle. Somente no contato entre T. asperellum e F.

oxysporum é que os transcritos de tag27 superaram os de tag28 tanto no contato quanto no

pós-contato entre os fungos.

48

5. DISCUSSÃO

Diferentes produtos contendo o fungo Trichoderma já são comercializados para

utilização na agricultura com o objetivo de aproveitar os benefícios do controle biológico

contra microrganismos fitopatogênicos. Muitos estudos, porém, ainda estão sendo feitos

para compreender melhor os mecanismos de biocontrole realizados por Trichoderma,

principalmente a ação de enzimas que degradam a parede celular dos fungos fitopatógenos,

já que apresentam papel importante no micoparasitismo (HARMAN et al., 2004; LORITO et

al., 2010). Este trabalho buscou ampliar os conhecimentos acerca das β-1,3-glicanases de

Trichoderma fazendo a clonagem de um gene de uma endo-β-1,3-glicanase de T.

asperellum, chamado tag27, e analisando a expressão dos genes tag83 e tag27 deste fungo

em condições que simulam o micoparasitismo.

O gene tag27 obtido a partir do DNA de T. asperellum T00 possui 919 pb e contém

um íntron de 61 pb. Seu transcrito codifica para uma enzima que possui 285 resíduos de

aminoácidos e pertence à família 16 das glicosil hidrolases. Compõem o sítio catalítico

dessa enzima os resíduos glu151, asp153 e glu156, aminoácidos que são tidos como

resíduos catalíticos de outras β-1,3-glicanases com base em estudos de similaridade com

sítios catalíticos conhecidos (MARTIN et al., 2007). A sequência de aminoácidos da enzima

TAG27 apresentou identidade de 92% com uma sequência de T. atroviride depositada em

banco de dados e obtida a partir do genoma do mesmo, mas ainda não caracterizada.

Sequencias de outras endo-β-1,3-glicanases de Trichoderma obtidas em banco de dados

apresentaram identidades mais baixas (75%), o que ilustra a grande diversidade de β-1,3-

glicanases produzidas por Trichoderma (MARTIN et al., 2007; KULMINSKAYA et al., 2001;

VÁZQUES-GARCIDUEÑAS, LEAL-MORALES & HERRERA-ESTRELA, 1998).

Neste trabalho, paredes celulares de três importantes fitopatógenos conhecidamente

parasitados por Trichoderma (Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum e Fusarium

oxysporum) foram usadas como fontes de carbono para crescimento de T. asperellum T00

em cultura com o objetivo de se quantificar a atividade das β-1,3-glicanases e analisar o

perfil de atividade em gel. Como a atividade de TAG27 em géis de atividade não-

desnaturantes realizados em trabalhos anteriores foi detectada somente em parede celular

de R. solani e não em outros açúcares simples (AIRES, 2005; BARA, 2002; MARCELLO et

al., 2010), apenas paredes de fungos foram usadas nas análises deste trabalho. Além disso,

em grande parte dos trabalhos publicados, os maiores valores de atividade de β-1,3-

glicanases foram encontrados em meio contendo parede celular de fitopatógenos (BARA,

LIMA & ULHOA, 2003; DE LA CRUZ et al., 1995; MARCELLO et al., 2010; MONTEIRO &

ULHOA, 2006; NORONHA et al., 2000)

49

Os maiores valores de atividade total de β-1,3-glicanases foram encontrados nas

paredes de S. sclerotiorum e R. solani, respecivamente. A atividade enzimática de β-1,3-

glicanases no meio contendo parede de F. oxysporum foi menor quando comparada às

atividades encontradas nas outras paredes (Tabela 1.4). Isso pode ser explicado devido ao

menor número de β-1,3-glicanases secretadas no meio com esta fonte de carbono, como

observado na Figura 1.5. Nos géis de atividade mostrados não foi detectada a banda de

menor massa molecular correspondente à TAG27 (AIRES et al., 2012) nos tempos da

cultura com parede de F. oxysporum. Foi possível observar também que o padrão da banda

de maior massa molecular nesta cultura foi diferente do observado para as culturas com

parede de R. solani e S. scleroriorum. Estes dados sugerem que a banda de maior massa

molecular observada nos géis de atividade corresponde a pelo menos duas enzimas, uma

das quais não foi secretada no meio com parede de F. oxysporum. A ação das β-1,3-

glicanases sobre o polímero de β-1,3-glicanas é mais eficiente quando pelo menos uma

endo e uma exo enzima estão presentes. As duas atuam em sinergismo, sendo que as

endoglicanases atuam no meio das cadeias de β-glicanas gerando extremidades redutoras

livres para a ação das exoglicanases (PITSON, SEVIOUR & MCDOUGAL, 1993;

KULMINSKAYA et al., 2001).

A atividade enzimática de β-1,3-glicanases de um determinado fungo parece variar

conforme a composição e estrutura da parede do fungo usada como fonte de carbono, bem

como da quantidade de β-1,3-glicana presente na parede. A atividade específica de β-1,3-

glicanases produzida por T. harzianum foi maior em culturas com parede que continham

mais β-1,3-glicana (Neurospora crassa e S. cerevisiae, entre 20 a 55%) que em parede de

Mucor rouxii, que não possui níveis detectáveis de β-1,3-glicanas em sua parede

(VÁZQUES-GARCIDUEÑAS, LEAL-MORALES & HERRERA-ESTRELA; 1998).

Um perfil de atividade de β-1,3-glicanases semelhante ao encontrado nesse trabalho

foi visto para as enzimas de T. harzianum T-35, cuja atividade específica foi maior em meio

contendo parede de Sclerotium rolfsii, seguido de parede de R. solani e as menores

atividades encontradas em paredes de F. oxysporum (SIVAN & CHET, 1989). A parede de

S. sclerotiorum possui cerca de 60% de carboidrados em sua composição, 40% deles de β-

glucana. Esse polímero se encontra em uma região mais externa da parede, formando um

composto de natureza gelatinosa chamado esclerotana que só é completamente degradado

na presença das atividades endo e exo de β-1,3-glicanases (JONES, 1970; JONES,

GORDON & BACON, 1974; BACON, GORDON, JONES, 1972). A parede de R. solani

contém cerca de 38% de carboidratos em sua composição, com glicose correspondendo a

22% do peso seco da parede. Foram também encontrados resíduos de manose, 4% de

ácido glucurônico e galacturônico e 8,5% de um composto semelhante à melanina, que

50

confere resistência à degradação da parede por enzimas hidrolíticas (JONES et al, 1972;

POTGIETER & ALEXANDER, 1966). A composição da parede de F. oxysporum possui

cerca de 11% de N-acetil-glicosaminas e 28% de glicose, porém, parece conter mais

proteínas (11%) que paredes de outros fungos, o que parece exercer efeito protetor contra a

degradação das cadeias de açúcares de sua parde (a estrutura da parede de F. oxysporum

é discutida mais adiante) (SCHOFFELMEER et al., 1999, SIVAN & CHET, 1989).

As variações observadas nos níveis de expressão dos genes tag83 e tag27 (Tabela

1.5) foram condizentes com as respectivas atividades enzimáticas totais observadas em

cada cultura (Tabela 1.4). No crescimento com parede de R. solani, houve um aumento da

atividade enzimática total de 24 para 48 horas. Foi observado também um aumento nos

níveis de transcritos de tag83 nesse período, enquanto que os níveis de transcritos para

tag27 permaneceram estáveis. Para o crescimento com parede de S. sclerotiorum, foi

observado uma pequena queda na atividade enzimática total enquanto que a análise dos

transcritos mostrou um aumento considerável na expressão de tag27, mas um pequeno

aumento da expressão de tag83.

Em parede de F. oxysporum a atividade enzimática total de β-1,3-glicanases

permaneceu estável de 24 para 48 horas de crescimento. O mesmo aconteceu com o nível

de expressão de tag83 que, além de não variar, apresentou o menor valor quando

comparado com as outras culturas com parede. A expressão de tag27, porém, apresentou

aumento de 37 vezes, mas aparentemente não interferiu na atividade enzimática do fungo

neste meio de cultura. Apesar dos altos níveis de expressão de tag27, a banda de atividade

de menor massa molecular não foi detectada em ensaio de atividade enzimática em gel para

este cultivo (Figura 1.5). A não detecção da banda de menor massa molecular foi atribuída

anteriormente por Marcello (2008) a possíveis perdas de atividade durante a diálise. Neste

trabalho, porém, todas as amostras receberam o mesmo tratamento e a banda de menor

massa molecular foi detectada nas culturas com parede de R. solani e S. sclerotiorum.

Outra observação a ser feita está entre os baixos níveis de transcritos de tag83 e o

padrão da banda de maior massa molecular no gel de atividade para a cultura de F.

oxysporum, que apresenta uma diferença na região inferior em relação as bandas das

culturas com parede de R. solani e S. sclerotiorum. Considerando-se essas observações,

novos experimentos devem ser feitos para saber quais genes se referem às bandas

identificadas nos géis de atividade para cada condição analisada. Os experimentos, porém,

indicam que T. asperellum possui pelo menos três enzimas com atividade de β-1,3-

glicanase. Sanz e colaboradores (2004) identificaram três bandas de atividade de β-1,3-

glicanase na linhagem T53 de T. asperellum crescido em meio líquido contendo glicose e

quitina.

51

Os experimentos realizados com T. asperellum crescendo em meio contendo glicose

mostraram como tag83 e tag27 são expressos na presença desta fonte de carbono. Altos

níveis de transcritos de ambos os genes foram detectados após 24 e 48 horas de

crescimento de T. asperellum em glicose, tanto a 0,5% quanto a 1%. A expressão de tag83

foi maior que a de tag27 em ambos os tempos e nas duas concentrações de glicose (Tabela

1.5). Quanto à expressão de tag27, foi possível observar que, em 0,5% de glicose, o nível

de expressão chegou a atingir valores próximos tanto em 24 quanto em 48 horas, indicando

que o fungo já havia consumido toda glicose antes das 24 de crescimento. Já em 1,0% de

glicose, a expressão observada em 24 horas foi menor que em 48 horas. O valor de

expressão de tag27 nas culturas de glicose alcançou valores próximos aos observados nas

culturas com paredes de fitopatógenos.

Em relação ao gene tag83, níveis de expressão equivalentes foram detectados em

24 horas de crescimento nas duas concentrações de glicose testadas. Em 1,0% de glicose,

porém, o nível de expressão de tag83 após 48 horas foi 2,5 vezes maior que em 0,5% de

glicose e 10 vezes maior do que os valores encontrados nos cultivos de T. asperellum em

parede celular de fitopatógenos. Mesmo com a expressão elevada dos genes, nenhuma

banda de atividade enzimática foi detectada no tempo de 24 horas da cultura de T.

asperellum em 1,0% e apenas uma banda em no tempo de 48 horas (Figura 1.5). Não é

possível afirmar que a banda de atividade observada nesta condição se refere à

exoglicanase expressa por tag83, uma vez que uma banda de altura correspondente foi

observada no gel de atividade de T. asperelum crescido em parede de F. oxysporum, onde

os níveis de transcritos de tag83 foram os mais baixos observados nos experimentos.

Para observar a expressão de tag83 e tag27 na presença de glicose, o micélio de T.

asperellum foi coletado após 6 e 12 horas de crescimento em meio contendo 1,0% de

glicose, uma vez que não foram detectados açúcares redutores no meio de cultura após 24

e 48 horas de crescimento. Foi observado que T. asperellum consumiu toda a glicose no

meio de cultura entre 6 e 12 horas de crescimento (Figura 1.6). A presença de glicose no

meio de cultura fez com que os níveis de transcritos dos genes analisados diminuíssem.

Após o consumo da glicose, a expressão aumentou chegando aos maiores valores

observados. Estes dados sugerem que a regulação da expressão desses genes é feita a

nível traducional, uma vez que a atividade de β-1,3-glicanases nos meios com glicose era

baixa, mesmo com a alta quantidade de transcritos.

Os dados de expressão mostraram que enquanto a glicose era abundante no meio

de cultura, a expressão das β-1,3-glicanases de T. asperellum era reprimida, especialmente

tag83 e tag27. À medida que a concentração de glicose diminui, o fungo investiu energia na

produção dos transcritos das β-1,3-glicanases TAG83 e TAG27 (Figura 1.6), mas manteve

52

um nível basal de produção de enzimas, uma vez que a atividade observada foi baixa. T.

asperellum continuou gerando transcritos de tag83 e tag27 até pelo menos 48 horas de

crescimento, período em que foi observada a presença de uma das β-1,3-glicanases do

fungo (Figura 1.5). A atividade da enzima detectada após 48 horas de crescimento em

glicose pode estar associada à mobilização de reservas de energia a partir dos açúcares da

parede em situação de limitação de carbono (MARTIN et al, 2007) e também à detecção de

β-glucanas no ambiente, o que serviria para ajudar na ativação das outras glicanases

quando este substrato fosse encontrado (DE LA CRUZ, 1995; RAMOT, COHEN-KUPIEK,

CHET, 2000).

Comportamento semelhante foi observado em diferentes trabalhos sobre β-1,3-

glicanases de T. harzianum. Noronha e colaboradores (2000) mostraram que apenas uma

endo-β-1,3-glicanase de 36 kDa foi secretada por T. harzianum Tc após 72 horas de

crescimento em meio contendo apenas glicose como fonte de carbono. Toda a glicose foi

consumida em 36 horas de crescimento e a atividade enzimática foi detectada até 96 horas

de crescimento. Acredita-se que nessas condições, essa enzima esteja associada à

sobrevivência e degradação de polissacarídios externos. A mesma enzima também foi

detectada em todas outras fontes de carbono testadas, inclusive paredes celulares de outros

fungos. No trabalho de Ramot, Cohen-Kupiek e Chet (2000), T. harzianum T-Y, que

produziu 5 diferentes enzimas durante crescimento em meio contendo laminarina, secretou

somente uma exo-β-1,3-glicanase 200 kDa em meio sem nenhuma fonte de carbono. Este

fungo apresentou aumento na atividade específica de β-1,3-glicanases até 10 horas após o

crescimento neste meio, indicando que a glicanase de 200kDa era uma das proteínas mais

secretadas. Outras linhagens analisadas neste trabalho secretaram duas ou mais β-1,3-

glicanases durante o crescimento com glicose. E em T. koningii, uma exo-β-1,3-glicanase

também foi secretada em meio contendo glicose (MONTEIRO & ULHOA, 2006).

Neste trabalho T. asperellum apresentou aumento na atividade específica de β-1,3-

glicanases até 48 horas de crescimento em meio contendo glicose, sendo que na

concentração de 1%, foi observado que toda a glicose havia sido consumida antes de 12

horas de crescimento, indicando que o fungo passou pelo menos 36 horas crescendo sem

fonte de carbono disponível no meio. A análise dos transcritos dos genes tag83 e tag27 de

T. asperellum neste trabalho permitiu identificar que, durante o crescimento do fungo após o

consumo da glicose no meio, uma das β-1,3-glicanases do fungo é secretada e que o fungo

investiu energia na produção de transcritos dos genes tag83 e tag27. Conforme foi

observado nos resultados (Figura 1.5), uma das β-1,3-glicanases está envolvida no

crescimento de T. asperellum na ausência de fontes de carbono e que tag83 e tag27 sofrem

53

repressão catabólica na presença de glicose no meio de cultura (NORONHA et al., 2000;

RAMOT, COHEN-KUPIEK & CHET, 2000).

O fungo Trichoderma asperellum tem sido uma das espécies mais estudadas devido

à capacidade de antagonismo contra fitopatógenos usando principalmente a estratégia do

micoparasitismo (DRUZHININA et al., 2011). Em estudos de parasitismo contra o causador

da podridão negra do abacaxi, Thielaviopsis paradoxa (WIJESINGHE et al., 2010), e contra

um causador de doenças em arroz, Giberella fujikuroi (WATANABE et al., 2007), as

linhagens de T. asperellum apresentaram crescimento enrolando suas hifas sobre ao redor

dos patógenos. Foi observado ainda que T. asperellum é capaz de aderir suas hifas sobre a

superfície de ovos do nematoide Meloidogyne javanica, causador de doenças em

plantações (SHARON et al., 2007). Com o isolado utilizado neste trabalho, T. asperellum

T00, Bara (2002) detectou o enrolamento de hifas em R. solani em confronto em placa.

Para verificar o papel dos genes tag83 e tag27 no micoparasitismo de T. asperellum

T00 contra os fitopatógenos estudados, o perfil de expressão desses genes foi avaliado

durante o ensaio de interação in vivo em placa. Na fase de pré-contato entre os fungos,

ambos os genes apresentaram padrão de expressão semelhante ao observado na condição

controle (T. asperellum sozinho em placa) em todos os confrontos testados. A partir da fase

de contato, o perfil de transcrição dos genes em no confronto com F. oxysporum foi diferente

do observado em R. solani e S. sclerotiorum.

No confronto entre T. asperellum e R. solani ou S. sclerotiorum, a expressão dos

genes tag83 e tag27 apresentou diferença significativa em relação ao controle somente na

fase de pós-contato. Em ambos os casos, os níveis de transcritos de tag83 foram maiores

que os de tag27, sendo que no confronto com R. solani, a expressão de tag83 foi a mais alta

observada. Os resultados confirmam a atuação da enzima TAG83 no micoparasitismo de R.

solani, já observado anteriormente (BARA, LIMA & ULHOA, 2003; MARCELLO et al., 2010),

e mostram que a enzima TAG27 também atua neste processo. Sabendo que T. asperellum

T00 se enrola nas hifas de R. solani (BARA, 2002), pode-se dizer que essas enzimas são

secretadas diretamente na região de interação entre os fungos. O perfil de expressão de

tag83 e tag27 durante o confronto com S. sclerotiorum permite afirmar que esses genes

estão relacionados ao micoparasitismo de T. asperellum contra esse fitopatógeno.

Já no confronto entre T. asperellum T00 e F. oxysporum, foi observado aumento

significativo na expressão de tag83 e tag27 na fase de contato entre os fungos, o que não

foi observado nos confrontos anteriores. Na fase pós-contato, tag83 apresentou discreto

aumento nos níveis de transcritos em relação à fase anterior, enquanto que tag27

apresentou um grande aumento na sua expressão. Nesta fase, diferente do que foi

54

observado para R. solani e S. sclerotiorum, os níveis de transcritos de tag27 superaram os

de tag83. Essas diferenças podem estar relacionadas à diferença no modo de ação de T.

asperellum com F. oxysporum.

Não se sabe se T. asperellum T00 cresce por enrolamento sobre as hifas de F.

oxysporum. Foi observado, porém, nos experimentos em placa, que T. asperellum foi capaz

de inibir o crescimento de F. oxysporum. Estudos identificaram que a parede celular de F.

oxysporum apresenta uma densa camada externa composta principalmente de

glicoproteínas, que está firmemente ligada a uma camada interna que contém quitina e β-

glucana (SCHOFFELMEER et al., 1999). A presença dessa camada protéica foi considerada

responsável pela maior resistência de F. oxysporum à lise celular por ação de quitinases e

β-1,3-glicanases de linhagens de T. harzianum que hifas de R. solani e Sclerotium rolfsii.

Sabendo que a linhagem T-35 de T. harzianum exercia controle sobre F. oxysporum, foi

proposto que mecanismos como competição ou produção de antibióticos eram utilizados

para esse fungo ao invés do micoparasitismo, que foi observado nos outros patógenos

estudados (SIVAN & CHET, 1989). Os altos níveis de tag83 e principalmente tag27

expressos por T. asperellum já na fase de contato entre os fungos pode indicar maior

necessidade da ação das β-1,3-glicanases, especialmente de TAG27, para a degradação da

parede de F. oxysporum associadas à camada de glicoproteínas, (AIRES et al., 2012). Mais

estudos, porém, são necessários para confirmar o modo de ação de T. asperellum T00

sobre F. oxysporum e o papel dessas enzimas no biocontrole deste fungo.

T. asperellum parece secretar enzimas relacionadas à degradação de componentes

de parede celular de fungos preferencialmente após o contato com seu hospedeiro. Viterbo

e colaboradores (2002) construíram linhagens transformantes de T. asperellum que

expressavam a proteína verde fluorescente (GFP) sob o controle do promotor do gene

chit36, que codifica para uma endoquitinase. A GFP só foi produzida, em situação de

confronto, após o contato entre T. asperellum e R. solani. A proteína também foi produzida,

com menor intensidade, quando T. asperellum foi crescido em uma placa onde R. solani foi

previamente crescido em membrana de celofane e posteriormente retirado, indicando que

alguma molécula produzida pelo fungo ativa a transcrição de chit36. Liu e colaboradores

(2010), também utilizando linhagens de T. asperelum, observaram que a expressão de

echi42 (endoquitinase) e de um gene que codifica para uma endo-β-1,3(4)-glicanase

alcançaram nível máximo de expressão 24 e 36 horas, respectivamente, após o contato com

os fitopatógenos R. solani e S. sclerotiorum. Padrão diferente foi observado para linhagens

de T. gamsii durante o confronto com F. graminearum e F. culmorum, nos quais grande

parte dos genes de quitinases analisados eram mais expressos na fase de pré-contato entre

os fungos (MATARESE et al., 2012)

55

No contato entre duas colônias de T. asperellum T00, o perfil de expressão de tag83

e tag27 foi diferente do observado entre os fitopatógenos. Apesar de considerada

significativa pelos testes estatísticos aplicados, o aumento da expressão de tag83 nas fases

de contato e pós-contato foram baixos comparados com os confrontos com os

fitopatógenos. A expressão de tag27, só foi significativa na fase de pós-contato entre as

hifas e o nível de expressão observado foi maior que o de tag83. As colônias não

apresentaram crescimento uma sobre a outra após o contato e esporos já eram observados

na região do encontro das colônias durante a coleta da fase de pós-contato. O aumento da

expressão de tag27 após o encontro das colônias de T. asperellum pode estar relacionado

com o contato entre as hifas e o processo de reconhecimento ou ainda na síntese das

estruturas para produção de esporos (MARTIN et al., 2007)

Muito do que se sabe hoje sobre o reconhecimento por Trichoderma de parede dos

antagonistas ou de sua própria parede está baseado em dados obtidos a partir de genomas

de Trichoderma e nos estudos das enzimas relacionadas à degradação de componentes da

parede celular, como quitinases, β-1,3 e β-1,6 glicanases e proteases. O modelo proposto

atualmente (GRUBER & SEIDL-SEIBOTH, 2012) é que não existam enzimas específicas

que atuem no reconhecimento da própria parede de Trichoderma, sendo que as mesmas

enzimas atuam tanto na degradação da parede dos antagonistas quanto no auto-

reconhecimento. As enzimas produzidas terão maior ou menor acesso ao substrato

dependendo da proteção existente na parede, no caso, feita por proteínas. Na natureza,

juntamente com outras moléculas produzidas por Trichoderma, como metabólitos voláteis,

as enzimas contribuem para o enfraquecimento das hifas de outros fungos e isso faz com

que o dano aumente, enquanto que a parede de Trichoderma está protegida contra a ação

de suas enzimas (GRUBER & SEIDL-SEIBOTH, 2012). Proteínas que se ligam a

carboidratos e proteínas hidrofóbicas (como QID74) presentes na parede podem estar

envolvidas na proteção da célula contra o ataque de suas próprias hidrolases (ROSADO et

al., 2007; GRUBER & SEIDL-SEIBOTH, 2012). Ainda há muito que ser estudado em

relação ao sistema de reconhecimento de paredes por Trichoderma e particularmente o

papel das β-1,3-glicanases neste processo. Porém, a partir do perfil de expressão dos genes

para tag83 e tag27, foi observado que a expressão desses genes em T. asperellum T00 foi

alterada tanto no contato com fungos fitopatógenos quanto no contato com hifas do próprio

fungo.

56

6. CONCLUSÕES

Após as análises dos resultados deste trabalho, foi possível concluir que:

- A enzima endo-β-1,3-glicanase produzida por T. asperellum possui 285 resíduos de

aminoácidos e pertence à família 16 das glicosil hidrolases. O gene que codifica para esta

proteína, tag27, possui 919 pb e contém um íntron de 61 pb;

- A atividade de β-1,3-glicanases produzida por T. asperellum nas condições

analisadas foi maior em parede celular de Scerotinia sclerotiorum e Rhizoctonia solani que

em parede de Fusarium oxysporum e glicose;

- T. asperellum secretou pelo menos 3 enzimas com atividade de β-1,3-glicanase em

meio de cultura com parede celular de R. solani e S. sclerotiorum após 24 horas e pelo

menos uma em parede celular de F. oxysporum após 24 horas e em glicose após 48 horas;

- Os genes tag83 e tag27 apresentaram variação na expressão entre 24 e 48 horas

na presença de parede celular de R. solani e S. sclerotiorum enquanto apenas tag27

apresentou variação na expressão no mesmo período de tempo em parede de F.

oxysporum;

- A transcrição dos genes tag83 e tag27 é reprimida em T. asperellum T00 na

presença de glicose e aumenta à medida em que esta fonte de carbono é consumida no

meio de cultura;

- Os genes tag83 e tag27 apresentaram aumento de expressão em condição de

confronto de T. asperellum T00 com cada um dos fitopatógenos R. solani, S. sclerotiorum e

F. oxysporum;

- Os genes tag83 e principalmente tag27 apresentaram aumento de expressão

durante contato entre diferentes colônias de T. asperellum T00.

57

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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62

CAPÍTULO 2

Análise de genes de Trichoderma harzianum expressos durante o micoparasitismo

com Rhizoctonia solani e Sclerotinia sclerotiorum identificados usando

hibridização subtrativa.

63

1. INTRODUÇÃO

1.1 – O fungo Trichoderma harzianum

A espécie Trichoderma harzianum é considerada uma das mais comuns do gênero e

está presente em diferentes tipos de solo (LIMA, 2002, KUBICEK et al., 2008). Suas

colônias apresentam diversidade na apresentação macroscópica, podendo ser de coloração

verde clara, escura ou amarelada, com a formação de anéis de intensa conidiação em

placa. Os fungos desta espécie são caracterizados por apresentarem conídios pequenos e

subglobosos, mas apresentam variações morfológicas principalmente em relação às

características de suas fiálides (LIMA, 2002). Algumas das características macroscópicas

podem ser observadas na Figura 2.1 para o isolado ALL 42 de T. harzianum identificado em

solo de Cerrado (LIMA, 2002).

Figura 2.1. Características morfológicas de Trichoderma harzianum ALL42 (linhagem utilizada neste

trabalho). T. harzianum ALL42 crescido em meio MYG (A) e BDA (B) mostrando o padrão de

conidiação e a formação dos anéis de conidiação, respectivamente.

Além de ser uma das espécies mais frequentemente encontradas na natureza em

relação às outras espécies do gênero, T. harzianum é considerada a mais importante por

ser a mais estudada como modelo de controle biológico de fungos fitopatogênicos e também

por ser utilizada comercialmente para este fim (ELAD, 2000; PELTOLA et al., 2004). Este

fungo já foi utilizado como modelo em diversos estudos para identificação de genes

relacionados ao micoparasitismo e a outros processos relacionados ao biocontrole (LORITO

et al, 2010).

64

1.2 – O estudo do biocontrole

O entendimento do processo sobre como os agentes de biocontrole efetivamente

exercem seu efeito de proteção é um requisito para sua aplicação prática. Diversas técnicas

têm sido usadas nos campos da microbiologia, microscopia e bioquímica nos últimos anos

para elucidar esses mecanismos, mas sem ainda demonstrá-los completamente. Mais

recentemente, técnicas de biologia molecular têm fornecido alternativas inovadoras para

avançar no conhecimento dos mecanismos de antagonismo do biocontrole (MASSART &

JIJAKLI, 2007).

Acredita-se que aproximadamente 15% dos genes de eucariotos superiores são

expressos somente em um determinado estado fisiológico. A identificação dos genes que

são expressos preferencialmente em uma determinada situação pode levar a interessantes

descobertas sobre um determinado processo biológico (HUANG et al., 2007). Como visto

anteriormente, diversas moléculas estão envolvidas durante o processo de biocontrole

realizado por Trichoderma: enzimas hidrolíticas, antibióticos, metabólitos voláteis, moléculas

de resistência ao estresse e de indução de resistência em plantas. Moléculas liberadas pelo

hospedeiro e pela ação das enzimas hidrolíticas sobre a parede do hospedeiro disparam a

expressão de genes envolvidos que preparam o fungo para o confronto com seu antagonista

(VITERBO et al., 2002). A variedade de genes que se imagina estarem diretamente

envolvidos somente no micoparasitismo, por exemplo, em T. atroviride (67 genes) e em T.

virens (21 genes), ilustra a complexidade da base genética do biocontrole (MASSART &

JIJAKLI, 2007).

Além da diversidade de genes envolvidos no biocontrole, a escolha de espécies ou

linhagens de Trichoderma que podem ser bons biocontroladores, micoparasitas ou indutores

de defesa de plantas são feitas em estudos que avaliam centenas de linhagens, muitas

delas menos ativas (LORITO et al., 2010). Por esse motivo, técnicas de análise de genes

em larga escala (seqüenciamento de bibliotecas de cDNA) e de identificação em menor

escala (como as bibliotecas subtrativas) têm sido amplamente utilizadas nos estudos para

desvendar a regulação de genes relacionados ao biocontrole.

1.2.1 – Análise de bibliotecas subtrativas

A hibridização subtrativa é um método utilizado para isolar e clonar genes

diferencialmente expressos entre duas populações de cDNA, sinetizados a partir de mRNAs

obtidos de condições distintas. Tem a vantagem de poder ser usado quando há pouca ou

nenhuma sequência disponível para o organismo em estudo (HUANG et al., 2007).

65

Uma de suas variações, a hibridização subtrativa por supressão (suppression

subtractive hybridization – SSH), utiliza o princípio da hibridização de ácidos nucléicos em

duas etapas distintas, para eliminar fragmentos que existem em comum nas duas

populações de cDNA. Explicando de forma simplificada, os cDNAs da condição que

pretende isolar as sequências diferencialmente expressas (condição teste) é misturada a

uma grande quantidade (pelo menos 10 vezes mais) de cDNA da condição chamada

controle. O cDNA da condição teste é digerido e separado em dois grupos para serem

ligados, cada um, a adaptadores distintos, que possuem regiões de anelamento para

iniciadores para uma futura reação de PCR. Na primeira etapa de hibridização, os dois

conjuntos do cDNA teste são misturados ao cDNA controle separadamente. Na segunda

etapa de hibridização, as duas hibridizações são misturadas e novamente hibridizadas. Isso

permite com que moléculas de fita simples dos genes que são diferencialmente expressos

formem híbridos contendo, em cada fita, cada um dos dois adaptadores. Em seguida, por

PCR, fragmentos de genes diferencialmente expressos são preferencialmente amplificados

e podem ser clonados (DIATCHENKO et al., 1996, SAGERSTRÖM, SUN, SIVE; 1997).

Essa técnica permite o enriquecimento dos transcritos diferencialmente expressos em até

5.000 vezes, facilitando a clonagem de genes que estão relacionados a um processo

específico, apresentando as vantagens de se analisar uma quantidade relativamente

pequena de amostras (principalmente comparado à construção de bibliotecas de cDNA) e

de ser bastante eficiente para a obtenção de genes pouco abundantes (HUANG et al.,

2007).

A técnica foi usada por Carpenter e colaboradores (2005) para identificar genes

envolvidos na interação entre T. hamatum e Sclerotinia sclerotiorum. O RNA da condição

teste foi extraído em situação de confronto em placa de cultura entre os fungos, sendo que o

RNA da condição controle foi uma mistura de RNAs dos fungos crescidos em placas

separadas. Foram obtidos 25 genes, dentre os quais foram identificados sequências de 3

monoxigenases (envolvidas em síntese de metabólitos secundários), uma metalopeptidase,

uma gluconato desidrogenase (envolvido em síntese de toxinas em bactérias) e uma próton

ATPase, além do gene hex1 de T. reesei, que codifica para uma proteína relacionada aos

corpúsculos de Woronin. Dos 25 genes obtidos pela técnica, 19 apresentaram maior

expressão durante a condição de micoparasitismo, quando comparado com a situação

controle, mostrando que a técnica é capaz de detectar genes relacionados ao processo de

interesse.

Outros dois trabalhos fizeram uso da técnica de SSH para identificar genes

diferencialmente expressos entre mutantes de T. virens e a linhagem selvagem. Em um

mutante para o gene tvk1, que codifica para uma MAP kinase, quatro genes que codificam

66

para hidrofobinas e um gene de uma proteína envolvida em controle circadiano foram mais

expressos que no mutante na mesma condição de crescimento, enquanto que um gene que

codifica para uma proteína de parede celular (qid74) e uma outra hidrofobina foram

negativamente regulados (MENDOZA-MENDOZA et al., 2007). No mutante para o gene

tac1 (que codifica para uma adenilato ciclase), foram detectados 11 genes que sofreram

regulação negativa, sendo que 9 deles foram homólogos a genes relacionados ao

metabolismo secundário (MUKHERJEE, MUKHERJEE & KALE, 2007). Esses trabalhos

demonstram que essa técnica pode detectar diferenças entre situações onde a variação

expressão gênica pode ser sutil.

A outra variação da técnica de subtração, chamada RaSH (Rapid Subtraction

Hybridization – Hibridização Subtrativa Rápida) também foi aplicada para estudos de

expressão gênica em Trichoderma. Seus idealizadores propõem apenas uma hibridização e

a eliminação dos fragmentos de genes comuns entre a condição teste e a controle é

baseada na ligação de adaptadores que favorecem a clonagem dos genes presentes

apenas na condição teste (JIANG et al., 2000). Essa técnica propõe um método mais

simples e que permite detectar mudanças mais sutis na expressão de genes (LORITO et al.,

2010).

Schmoll e colaboradores (2004) utilizaram RaSH em Trichoderma para detectar

genes expressos em condição de indução para produção de celulases. De um total de 224

clones, 22 fragmentos de genes correspondendo a 20 genes diferentes foram analisados. A

maioria dos genes detectados apresentou função desconhecida após a análise pela base de

dados de ESTs do NCBI (National Center for Biotechnology Information). Foram

identificados: o gene de uma proteína com domínio PAS (que está envolvida em transdução

de sinal), o gene de uma proteína relacionada à migração nuclear, o gene tef1 codificando

para o fator de elongação da tradução 1α e uma mio-inositol-1-fosfato sintase. Os autores

consideraram que a maioria dos genes identificados pela técnica de subtração foi realmente

induzida pela presença de indutores de celulases.

A técnica de hibridização subtrativa rápida foi utilizada para estudo de genes

relacionados ao biocontrole por Scherm e colaboradores (2009). O objetivo do grupo foi

tentar encontrar genes que possam funcionar como marcadores para linhagens com alto

potencial de antagonismo contra fitopatógenos. O RNA da condição teste foi obtido

crescendo-se T. harzianum sobre placas contendo o fungo R. solani coberto por uma

membrana de celofane. Um total de 400 clones selecionados foram analisados por Northern

blot para identificação somente dos genes mais expressos na condição teste. Foram

selecionados 50 clones para o seqüenciamento e o resultado foi submetido à base de dados

do genoma de T. reesei, no qual 36 clones apresentaram resultado positivo. No total, 25

67

genes únicos foram identificados e separados em genes de proteínas envolvidas na

transcrição e síntese protéica (como proteínas ribossomais S10 e 40S e uma poliubiquitina)

e genes que codificam para hidrolases extracelulares (protease, lipase, fosfatase,

endoglicanase, succinato desidrogenase, oxidase, dentre outras). Desses genes, três

receberam destaque como potenciais candidatos a serem utilizados como marcadores de

linhagens para biocontrole: uma NADH-desidrogenase, uma acetil-xilano esterase e uma

endoglicanase Cel61b, que apresentaram alto nível de expressão, detectada por Northern

blot, quando comparado à condição controle.

Apesar de não ser necessário obter o genoma completo para obtenção dos dados de

bibliotecas subtrativas, a submissão dos dados de seqüenciamento em bancos de dados

públicos, no caso de estudos de Trichoderma, retorna ainda resultados de proteínas com

função hipotética ou que não foram identificados. Ainda não há um genoma completo de

Trichoderma anotado totalmente disponível nas bases de dados públicas para submissão de

dados em massa. Em casos de submissão das sequências obtidas por subtração em

bancos de dados públicos, resultados que retornam como proteínas de organismos de

outros reinos (bactérias, plantas e até mamíferos) indicam que a identificação pode estar

errada e as análises devem ser feitas com cuidado, pois podem se tratar de genes ainda

não descritos em fungos (SCHERM et al., 2009).

O grupo de pesquisa do laboratório de Enzimologia (ICB/UFG) tem feito uso de

técnicas de identificação em massa de genes e proteínas, em estudos de transcriptoma

(STEINDORFF, 2010) e proteoma (MONTEIRO et al., 2010; RAMADA, 2010) de T.

harzianum ALL42, buscando esclarecer o processo de micoparasitismo usando esta espécie

como modelo. Além de buscar esclarecer o mecanismo de biocontrole, as técnicas de

identificação em massa podem ser usadas para identificar genes que podem estar

envolvidos mais caracteristicamente no controle de Trichoderma por um dos diferentes

fitopatógenos estudados. A construção de bibliotecas de cDNA usando técnica de

hibridização subtrativa por supressão tem potencial para ser utilizada nesse tipo de estudo

pois permite comparar amostras de RNA de Trichoderma obtidas em diferentes condições

de crescimento pela análise de um pequeno número de fragmentos de cDNA clonados. A

identificação de genes relacionados especificamente a cada um dos diferentes fitopatógenos

pode ajudar a direcionar os estudos do biocontrole de T. harzianum no campo para cada

praga a ser combatida.

68

2. OBJETIVOS

2.1 – Objetivo geral

Este trabalho tem por objetivo identificar genes diferencialmente expressos por

Trichoderma harzianum ALL42 durante interação com Sclerotinia sclerotiorum ou

Rhizoctonia solani

do fungo Trichoderma harzianum ALL42 que sejam biocontrole de Sclerotinia

sclerotiorum e Rhizoctonia solani por meio da análise de genes obtidos a partir bibliotecas

de cDNA geradas pelo método de hibridização subtrativa SSH.

2.2 – Objetivos específicos

- Construir bibliotecas subtrativas de cDNA de Trichoderma harzianum nas seguintes

condições: cDNA de T. harzianum crescido em parede celular de R. solani subtraído de

cDNA de T. harzianum crescido em parede celular de S. sclerotiorum e a biblioteca na

condição inversa;

- Sequenciar os fragmentos obtidos em cada biblioteca e fazer a análise dos

transcritos obtidos;

- Identificar genes diferencialmente expressos para cada fitopatógeno a partir da

análise de expressão em condição de confronto in vivo por RT-PCR em tempo real;

69

3. METODOLOGIA

3.1 – Microrganismos utilizados e condições de cultura

Trichoderma harzianum ALL42 foi obtido da coleção do Laboratório de Enzimologia

(ICB/UFG) e Rhizoctonia solani Kühn e Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary foram obtidos

da coleção da Embrapa – CNPAF. Os fungos foram cultivados em meio MYG (0,5% de

extrato de malte, 0,25% de extrato de levedura, 1% de glicose e 2% de ágar) à temperatura

ambiente por 7 dias e guardados a 4˚C. Culturas periódicas foram feitas para a manutenção

das culturas.

A linhaagem DH5-α de Escherichia coli (Invitrogen) foi utilizada para manipulação de

DNA, sendo cultivada em meio LB ou SOC (2% Bacto triptona, 0,5% extrato de levedura, 10

mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glicose) a 37 ºC e estocadas

a -80 ºC em glicerol 25%. Os estoques de células foram mantidos a -80 ºC em glicerol 25%.

3.2 – Produção da parede celular de R. solani e S. sclerotiorum

Para a produção de parede celular, 10 discos (10 mm) de meio MYG, contendo

micélio de cada fungo foram inoculados em frascos de 1L contendo 300 mL de meio MYG.

Estes frascos foram incubados à temperatura de 28 °C sob agitação constante de 180 rpm

em agitador rotatório, por 4 dias. O micélio de cada frasco foi coletado por filtração,

autoclavado, congelado a - 20 °C e liofilizado. Ao término da liofilização, os micélios foram

macerados utilizando graal e pistilo. A cada 1g do pó resultante da maceração, foi

adicionado 200 ml de água destilada. Essa solução foi agitada e centrifugada a 12.000 g por

15 minutos. Proteínas presentes no sobrenadante foram quantificadas através do método

descrito por Bradford (1976). A solução foi filtrada e a parede do fungo coletada. Este

processo foi repetido até não haver quantidades detectáveis de proteínas no sobrenadante.

A parede coletada ao final do processo foi congelada, liofilizada e macerada novamente.

3.3 – Cultivo de T. harzianum com parede de fitopatógenos e extração de RNA

Esporos (107/mL) do fungo Trichoderma harzianum isolado ALL-42 (Lima, 2002)

foram inoclulados em meio TLE (Peptona 0,05 %, Uréia 0,03 % , (NH4)2SO4 0,14 %, KH2PO4

0,20 %, MgSO4 . 7H2O 0,03 %, CaCl2 . 2H2O, 0,02%) contendo como fonte de carbono,

0,5% de parede celular lavada de R. solani ou S. sclerotiorum. O fungo foi crescido em

agitador rotatório a 28 °C 180 rpm. As coletas dos micélios foram feitas após 24, 36 e 48

horas de crescimento. Os micélios foram coletados por filtração em funil de Büchner com

papel de filtro, lavados com água destilada e guardados em ultrafreezer a -80 °C para

70

posterior extração dos RNAs. O RNA total de T. harzianum foi extraído pelo método do

reagente TRIzol® (Invitrogen™), seguindo as orientações do fabricante.

3.4 – Purificação dos mRNAs a partir do RNA total de T. harzianum.

Para a purificação dos mRNAs de T. harzianum crescido com as paredes celulares

dos diferentes fitopatógenos, foram misturadas 250µg de RNA total correspondente a cada

um dos tempos de cultura coletados (24, 36 e 48h) de cada uma das condições de

crescimento (T. harzianum crescido em parede de R. solani e T. harzianum crescido em

parede de S. sclerotiorum), totalizando 750µg de RNA total de cada amostra Os mRNAs de

cada condição.foram purificados utilizado o kit Oligotex mRNA Mini Kit (Qiagen) de acordo

com as recomendações do fabricante.

3.5 – Construção das bibliotecas subtrativas e estoque dos transformantes.

As bibliotecas subtrativas foram feitas a partir dos mRNAs purificados obtidos a partir

do crescimento de T. harzianum em meioTLE com parede celular de R. solani e em meio

TLE com parede celular de S. sclerotiorum. As bibliotecas foram construídas sutraíndo-se o

mRNA teste do mRNA da condição controle utilizando o kit PCR-SELECT cDNA Subtractin

Kit (Clontech, USA), de acordo com as instruções do fabricante. Cada um dos mRNAs

obtidos foi usado como teste e condição controle nas respectivas bibliotecas. O cDNAs

amplificados obtidos na etapa final do uso do kit foram ligados ao plasmídio de clonagem

pGEMT-easy (Promega). O sitema de ligação foi transformado em E. coli e os

transformantes contendo os fragmentos de cDNA clonados foram selecionados em placas

de LB-agar contendo 100µL de X-gal 2% e ampicilina (100µg/mL). Cada transformante foi

inoculado em um poço de placa de cultura (96 poços) contendo 100uL de meio LB com

ampicilina. As placas foram incubadas a 37 ºC durante a noite, adicionadas de 100 uL de

Glicerol 50% e estocadas a -80 ºC.

3.6 – Seqüenciamento dos fragmentos de cDNA clonados (ESTs)

Para a reação de seqüenciamento foi utilizado 1 μL de DNA plasmídial (~ 250 ηg) e

seguido protocolo do kit DYEnamic ET terminator (GE healthcare) (com modificações). A

reação foi realizada utilizando 1 μL do mix de DYEnamic e 2,5 ρM de primer Universal T7

em um volume final de reação de 10 μL. As amostras foram seqüenciadas no aparelho ABI

prisma 3100 (Applied Biosystems).

71

3.7 – Tratamento das sequências de DNA e submissão ao banco de dados.

Todos os eletroferogramas obtidos foram submetidos ao base-calling utilizando-se o

programa PHRED (EWING & GREEN, 1998). Foram considerados válidos os reads que

apresentarem um mínimo de 100 pares de bases com valor PHRED igual ou superior a 20.

As seqüências de qualidade obtidas foram inicialmente submetidas à análise pelo programa

CrossMatch (http://www.genome.washington.edu /UWGC/analysistools/Swat.cfm) visando,

principalmente, a remoção de seqüências contaminantes de vetores e adaptadores. Uma

vez processados, as sequências obtidas foram submetidos à clusterização utilizando-se a o

software CAP3 (HUANG & MADAN, 1999) para obtenção dos contigs. Os contigs e singlets

obtidos (unigenes) foram submetidos a comparação com o banco de dados de sequências

não redundantes do NCBI usando o algoritmo BLASTX pelo o programa Blast2GO

(CONESA et al., 2005; GÖTZ et al., 2008; www.blast2go.org). Para evitar a anotação de

pequenas sequências com baixos E-value, o filtro de tamanho mínimo de alinhamento

(HSP-lengh) foi usado com seu valor padrão.

3.8 – Ensaios de confronto de fungos em placa

Discos de 7mm de diâmetro foram retirados placas de petri contendo hifas em

crescimento (2 a 3 dias) de cada um dos fungos utilizados no experimento (T. harzianum

ALL42, R. solani e S. sclerotiorum). Estes discos foram utilizados como inóculos para o

confronto entre Trichoderma e cada um dos fitopatógenos estudados. Cada disco foi

colocado em extremidades opostas de placas de petri de 9,0 cm de diâmetro contendo meio

BDA com 0,2% de glicose e coberto com uma membrana de celofane. Os discos de S.

sclerotiorum foram colocados nas placas cerca de 48 horas antes de se inocularem os

discos de T. harzianum devido à diferença de crescimento. Pelo mesmo motivo, os discos

de T. hazianum foram inoculados pelo menos 24 horas antes dos discos de R. solani. As

placas foram mantidas a 25 ºC ao abrigo da luz e os micélios foram coletados durante a fase

de contato (na qual as hifas estavam a uma distância de pelo menos 0,5 cm) e de pós-

contato (cerca de 48 horas após o contato) e imediatamente congelados em nitrogênio

líquido. O micélio da fase de pós-contato foi coletado de forma a conter apenas hifas de T.

harzianum, a no máximo 0,5cm de distância da região de interação. Cada combinação entre

antagonista e patógeno foi feita em cinco placas, assim como a interação entre colônias

distintas de T. harzianum. Após a extração, 8µg dos RNAs de T. harzianum coletados em

cada confronto e no controle foram tratados com DNase (Sigma) e utilizado na síntese de

cDNA com o kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Fermentas), conforme

recomendação do fabricante.

72

3.9 – Análise da expressão gênica por RT-PCR em tempo real

As reações de RT-PCR em tempo real foram feitas no utilizando o Sistema iQ5 Real-

Time PCR (BioRad). Cada reação era formada por 10µL de Maxima SYBR-green PCR

Master mix (Fermentas), 0,5mM de cada oligonucleotídio (direto e reverso), o cDNA a ser

usado como molde e água MiliQ para um volume final de 20µL. As etapas da reação

consistiram em 1 ciclo de 10 minutos a 95ºC, 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC seguido de 1

minuto a 60ºC e uma curva de desnaturação com temperaturas de 60ºC a 95ºC, com

aumento gradativo de 0,5ºC e duração de 10 segundos em cada temperatura. A expressão

dos genes de interesse foi dada como relativa à quantidade de α-tubulina em cada reação,

que foi normalizada, para cada condição testada. Os valores de expressão foram dados

como média de duas reações independentes e o valor 1 representa a expressão de α-

tubulina. As reações foram feitas em triplicata para cada amostra analisada.

3.10 – Oligonucleotídios utilizados nas reações de RT-PCR em tempo real

A sequência dos oligonucleotídios utilizados para os experimentos de análise de

expressão de genes em tempo real estão mostradas na Tabela 2.1.

3.11 – Análises estatísticas

As reações de RT-PCR em tempo real foram comparadas por testes estatísticos para

confirmar as diferenças de expressão. Nas reações de validação das bibliotecas a

comparação entre a expressão gênica em parede de R. solani ou S. sclerotiorum foi feita

utilizado o teste t não pareado com intervalo de confiança de 95%. Para comparar a

expressão dos genes analisados nas condições de confronto em placa de T. harzianum com

a condição controle e entre os testes foi realizado uma análise de variância simples com

teste de Tukey (α=5%). As comparações foram feitas somente entre as mesmas condições

(contato ou pós-contato) entre os diferentes experimentos (controle e testes). Todos as

análises foram feitas com o programa GraphPad Prism versão 5.00.

73

Tabela 2.1. Lista de genes analisados por PCR em tempo real e sequência de oligonucleotídios

sintetizados a partir das ESTs obtidas a partir das bibliotecas subtrativas.

Gene (Abreviação) Sequência dos Oligonucleotídios

plasma memb. snare protein (SNARE) F: AGATCGACGACGGTCTTACCGAAT

R: ATTTGCGTGTTCTGAGCATCCACC

hexose transporter (TrHex) F: GGAGTCCCATTTGCTCGAAGTGAT

R: CGTGCTCATCGTCTTCTTCTTCGT

alginate lyase 2( Alg Lya) F: ACGGTGGAGCATTGAAGACCCTAA

R: TAGTGCTGAACAGTGAGGCCGAAA

pl. memb h+-atpase pma1 (ATP pma) F: CGCAAGCGCAAGGATACCATTGTT

R: TGTCAATAGCCTTGTCAGCGAGGA

Cutinase F: AATGGCAGGCCTGTTGCCAATTAC

R: ACGTCAAATGAGGCAGCAGGATGA

triacylglycerol lipase fgl2 (FGL2) F: AGATTACTTCTGGAGGCTCGGACT

R: TAACTCTTCGTCATGAGGCGCA

Cfem domain-containing protein (CFEM) F: GCGTCCGCAAAAGAAACAACCTTCT

R: TCTCACCGATGGTTTGACCGTAGA

42kda endochitinase (42Echi) F: AAGGGTTACTACAGCTACAACGCC

R: ACTTGAGGTAGGCAACCTTGGTGT

pyruvate decarboxylase (PirD) F: GCAGGTGTTGGTCAATTCCTTCAG

R: AACGCCAGATGGGAACTTGGTATC

duf895 dom. memb. protein (DUF895) F: TCCAATCCTTGCCGACGTAGTTGA

R: TGCCAAGATCACATGGGTCGTTCT

Hydrophobin 1 (Hyd 1) F: ATTGAACGCCGTACGCCTAGTATG

R: TGCTGCCCATCTTGTTGCTGTTCT

heat shock protein hsp98 (HSP98) F: TTGAGCGTCGTTTCCAACAGGTTC

R: TGTCGAGAATGCTGACCTTGTGGT

exo-rhamnogalacturonase b (Rham) F: TTACCTGAAGACATGGGCGGGAAT

R: GCCTTCCGCCAATCAGCTTAACAT

heat shock protein 90 (HSP90) F: AGTTCGACAATGTTACAGCGCCT

R: TCTCATCACCAGACTTGGAGT

serin endopeptidase (Serin Endo) F: TGGAAGGGAGTGACCAACCCT

R: GGAAAGGTCAGGAGTGCTATCGGG

c2h2 finger domain (c2h2) F: GCAGACCTTGCACTTGTGCTTCTT

R: AATGTTGTCGACCTCACTGCCT

chitinase 33 (CHIT33) F: TGGAGCTCAACAGGCGCTGC

R: ACGACGGCACTGCCAAAGGG

hypothetical protein (HYP) F: TGCTGCCTTCCTTGGATGTAGTAG

R: AAACATGGTGGCAACGGGTAACG

α-tubulina* F: TATCTGCTACCAGGCTCCCGAGAA

R: TGGTGTTGGACAGCATGCAGACAG

* - Gene usado como normalizador da quantidade de RNA nas reações.

74

4. RESULTADOS

4.1 – Construção e análise das bibliotecas subtrativas de T. harzianum crescido

em parede de R. solani e S. sclerotiorum

Foram construídas duas bibliotecas subtrativas com cDNA de Trichoderma

harzianum ALL42. Duas culturas independentes foram realizadas, nas quais T. harzianum

foi crescido em meio TLE contendo parede celular lavada de Rhizoctonia solani ou

Sclerotinia sclerotiorum. Foram isolados os RNAs de cada cultura nos tempos de 24, 36 e

48 horas para permitir a identificação de transcritos acumulados em diferentes tempos de

interação com a parede. Os mRNAs isolados de cada tempo foram misturados e foi feita a

síntese do cDNA correspondente a cada cultura. Em cada uma das bibliotecas o cDNA

obtido de cada uma das condições de indução foi usado como condição teste, enquanto o

outro cDNA foi usado como condição controle. A biblioteca em que o cDNA de T. harzianum

crescido em parede de R. solani foi subtraído do cDNA de T. harzianum crescido em parede

de S. sclerotiorum foi chamada de Biblioteca RS, enquanto que a biblioteca obtida na

condição oposta foi chamada de Biblioteca SR.

Com a intenção de se fazer uma boa cobertura dos transcritos obtidos em cada

condição de subtração, foram seqüenciadas um total de 8 placas (768 clones) de cada

biblioteca. Do total de 1536 clones sequenciados, 1022 (66,5%) resultaram em sequencias

que continham mais de 100pb com PHRED maior que 20, sendo 489 para a biblioteca RS

e 533 para a biblioteca SR. O tamanho das sequências de qualidade obtidas variaram

entre 152 e 628 pb. Foram obtidas 158 sequências únicas para a biblioteca RS, sendo 66

contigs e 92 singlets, das quais 56 (35,4%) foram identificadas. Para a biblioteca SR, 261

sequências únicas foram obtidas, sendo 95 contigs e 166 singlets, num total de 150 (57,8%)

identificadas Após a submissão das sequências ao banco de dados de proteínas, foram

identificados 47 produtos gênicos para a biblioteca R-S e 114 para a biblioteca S-R. Os

dados das análises das sequências das bibliotecas estão apresentados na Tabela 2.2.

75

Tabela 2.2. Análise do processamento das sequencias obtidas das bibliotecas subtrativas de

T. harzianum.

Descrição Biblioteca Subtrativa

RS SR

Total de amostras sequenciadas 768 768

ESTs com 100 bases de qual. Phred > 20 489 (63,6%) 533 (69,4%)

CONTIGS 66 95

SINGLETS 92 166

Sequências Únicas (Unigenes) 158 261

CONTIGS identificados 31 66

SINGLETS identificados 25 84

Unigenes identificados 56 (35,4%) 150 (57,8%)

Genes identificados 47 114

A Tabela 2.3 mostra os 20 genes que tiveram o maior número de ESTs detectadas

na Biblioteca RS e a Tabela 2.4 os mesmos dados referentes à Biblioteca SR. A

freqüência em que um determinado fragmento foi seqüenciado, no caso de bibliotecas

subtrativas, não indica que o gene correspondente foi altamente expresso pois ocorre uma

etapa de amplificação por PCR dos cDNAs diferencialmente expressos, não havendo uma

amplificação proporcional dos fragmentos. As Tabelas contendo todos os genes

identificados em cada biblioteca se encontram nos anexos deste trabalho.

Dos 47 produtos gênicos identificados na Biblioteca RS, 8 corresponderam a

proteínas de organismos de outros reinos. Dos genes cujas funções estão listadas na

Tabela 2.3, 7 foram também identificados na biblioteca de T. harzianum crescido em parede

de Fusarium solani (STEINDORFF, 2010): o transportador de hexose (RSctg12), a proteína

carreadora (RSctg21), a monoxigenase ligante de flavina (RSctg39), a histona h2a

(RSctg33), o transportador MFS (RSctg35), a ATPase H+ (RSctg48) e a metionina

aminopeptidase (RS02e08). Somente 3 coincidiram com o que foi identificado na biblioteca

subtrativa de T. harzianum crescido em micélio de Rhizoctonia solani (SCHERM et al.,

2009): transportador de hexose (RSctg12), transportador MFS (RSctg35), e a lipase de

triacilglicerol (RSctg60),

76

Tabela 2.3. Função predita e características dos fragmentos de genes obtidos da Biblioteca subtrativa RS

Cód.Seq Função Predita e N˚ de acesso da proteína correspondente E-value Organismo Frequência

1RSctg03 plasma membrane snare protein EFZ03166.1 1,25E-18 Metarhizium anisopliae 21

2RSctg04 dihydroxy-2-butanone 4-phosphate synthase EFQ30223.1 3,46E-07 Glomerella graminicola 19

3RSctg06 duf833 domain-containing protein EFZ02783.1 8,80E-24 Metarhizium anisopliae 17

4RSctg12 hexose transporter CBV37357.1 1,76E-13 Glomerella graminicola 9

5RSctg14 ubiquitin-activating enzyme e1 1 XP_956143.1 2,90E-51 Neurospora crassa 8

6RSctg17 alginate lyase 2 EFY94774.1 1,34E-10 Metarhizium anisopliae 6

7RSctg21 carrier protein EFZ01315.1 4,47E-21 Metarhizium anisopliae 5

8RSctg28 c4-dicarboxylate transporter malic acid transport EFY99010.1 1,38E-13 Metarhizium anisopliae 4

9RSctg30 hypothetical protein NECHADRAFT_84688 XP_003050388.1 2,18E-16 Nectria haematococca 4

10RSctg37 Aspartic peptidase 1S2B_A 3,22E-28 Scytalidium lignicola 3

11RSctg32 conserved hypothetical protein XP_002481031.1 2,17E-05 Talaromyces stipitatus 3

12RSctg39 flavin-binding monooxygenase-like family EFY94846.1 6,93E-31 Metarhizium anisopliae 3

13RSctg33 histone h2a EFY99543.1 2,72E-22 Metarhizium anisopliae 3

14RSctg35 MFS transporter, putative EFY96694.1 3,68E-05 Metarhizium anisopliae 3

15RSctg46 alcohol dehydrogenase XP_002481042. 1,99E-08 Talaromyces stipitatus 2

16RSctg48 plasma membrane h+-atpase pma1 ABV53589.1 4,74E-33 Trichoderma hamatum 2

17RSctg63 Cutinase ABN48556.1 9,00E-28 Hypocrea lixii 2

18RSctg60 triacylglycerol lipase fgl2 XP_003003525.1 2,97E-15 Verticillium albo-atrum 2

19RSctg58 Cfem domain-containing protein EFQ25862.1 3.16E-12 Glomerella graminicola 2

20RS02e08 Methionine aminopeptidase EFZ01875.1 3,00E-15 Metarhizium anisopliae 2

76

77

Tabela 2.4. Função predita e características dos fragmentos de genes obtidos da Biblioteca subtrativa SR

Cód.Seq Função Predita e N˚ de acesso da proteína correspondente E-value Organismo Frequência

01SRctg01 serine proteinase EFY96733.1 3,98E-07 Metarhizium anisopliae 28

02SRctg02 42kda endochitinase ADB89220.1 1,76E-40 Trichoderma saturnisporum 23

03SRctg05 pyruvate decarboxylase XP_001587745.1 2,92E-30 Grosmannia clavigera 15

04SRctg04 protein (hypothetical) XP_001230225.1 5,87E-25 Chaetomium globosum 13

05SRctg06 glyoxal oxidase precursor EFY98849.1 1,48E-06 Metarhizium anisopliae 12

06SRctg07 rna polymerase rpb1 repeat domain ptn XP_384016.1 8,16E-05 Giberella zeae 11

07SRctg08 duf895 domain membrane protein XP_003006789.1 1,97E-39 Verticillium albo-atrum 10

08SRctg18 Hydrophobin 1 AAZ66376.1 1,14E-22 Trichoderma asperellum 9

09SRctg17 alpha- -glucanase CAC80493.1 4,67E-12 Hypocrea lixii 8

10SRctg21 qi74 protein CAA64974.1 1,21E-32 Hypocrea lixii 8

11SRctg09 hypothetical protein PICST_57317 XP_001383614.1 5,09E-02 Scheffersomyces stipitis 7

12SRctg10 hypothetical protein MAA_04006 EFZ00229.1 2,37E-26 Metarhizium anisopliae 6

13SRctg25 Oxidoreductin XP_003053957.1 6,38E-16 Nectria haematococca 6

14SRctg11 sarcosine oxidase XP_003053020.1 8,46E-20 Nectria haematococca 6

15SRctg16 glucan endo- -alpha-glucosidase agn1 CBF78568.1 1,04E-28 Aspergillus nidulans 5

16SRctg15 heat shock protein hsp98 EFY88940.1 3,48E-53 Metarhizium acridum 5

17SRctg14 sugar transporter CAC81782.1 7,97E-39 Hypocrea lixii 5

18SRctg23 lipase serine EFZ01901.1 2,59E-22 Metarhizium anisopliae 4

19SRctg63 manganese superoxide dismutase CAD42938.2 9,76E-06 Taiwanofungus camphoratus 4

20SRctg46 beta-mannosidase EEA25354. 1,00E-12 Penicillium marneffei 3

77

78

Em relação à Biblioteca SR, 8 genes corresponderam a proteínas de organismos

de outros reinos. Oito dos fragmentos listados na Tabela 2.4 foram identificados no trabalho

de Steindorff (2010): a piruvato descarboxilase (SRctg05), a proteína com domínio

duf895(SRctg08), a hidrofobina 1 (SRctg18) , a proteína QI74 (SRctg21), a alfa-glicanase

(SRctg17), a endo-alfa-glicanase agn1 (SRctg16), a manganês superóxido dismutase

(SRctg63) e a beta-manosidase (SRctg46). Genes com função semelhante aos encontrados

na biblioteca subtrativa de T. hamatum contra S. sclerotiorum (CARPENTER et al., 2005)

foram identificados na biblioteca SR: monoxigenases, uma endonuclease, uma ubiquitina

e proteínas ribossomais 40S e 60S.

Apesar do grande número de genes identificados, apenas 3 genes foram detectados

em ambas bibliotecas. A sequência identificada como cfem domain-containing protein foi

identificada nas duas bibliotecas com o mesmo número de acesso (EFQ25862.1). Outros

dois genes, que codificam para uma hsp 70 e para um transportador com domínio MFS,

foram identificados em comum nas duas bibliotecas, mas com números de acesso distintos

entre elas (dados não mostrados), podendo se tratar de proteínas diferentes com mesma

função.

4.2 – Análise por RT-PCR em Tempo Real de genes identificados nas

bibliotecas subtrativas de T.harzianum.

Após as análises das bibliotecas subtrativas, foram escolhidos 18 genes para a

validação por RT-PCR em tempo real. Os RNAs foram extraídos de micélios de T.

harzianum crescidos nas mesmas condições em que foram construídas as bibliotecas (24,

36 e 48 horas para cada parede celular de fungo usada como fonte de carbono) e

misturados formando um conjunto (pool) dos genes expressos nos diferentes tempos.

Alguns dos genes escolhidos foram identificados em outros estudos do Laboratório

de Enzimologia (ICB/UFG) e estão relacionados ao processo de micoparasitismo

(STEINDORFF, 2010; VIEIRA, dados não publicados), e também genes que foram

identificados nas bibliotecas obtidas neste trabalho que diferiram dos trabalhos anteriores. A

Tabela 2.5 mostra a função predita, número de acesso da proteína correspondente e

organismo dos genes analisados, a biblioteca em que foi identificado, a condição em que foi

mais expresso a diferença de expressão entre as condições.

79

Tabela 2.5. Análise da expressão por RT-qPCR de 18 genes escolhidos das bibliotecas subtrativas. São mostradas as funções preditas dos genes a biblioteca em que foi identificado, em qual condição foi mais expresso o nível de expressão

Função Predita (Abreviação) N˚ de acesso da

proteína Organismo Biblioteca

Mais expresso em

Vezes mais expresso

plasma membrane snare protein (SNARE) EFZ03166.1 M. anisopliae RS Pool S** 1,47

hexose transporter (TrHex) CBV37357.1 Glo. graminicola RS Pool R* 1,79

alginate lyase 2( Alg Lya) EFY94774.1 M. anisopliae RS Pool R 88,9

plasma memb h+-atpase pma1 (ATP pma) ABV53589.1 T. hamatum RS Igual 1,06

Cutinase ABN48556.1 H. lixii RS Pool R 2,07

triacylglycerol lipase fgl2 (FGL2) XP_003003525.1 V. albo-atrum RS Pool S 1,81

Cfem domain-containing protein (CFEM) EFQ25862.1 Glo. graminicola Ambas Pool R 3,21

42kda endochitinase (42Echi) ADB89220.1 H. virens SR Pool R 2,62

pyruvate decarboxylase (PirD) XP_001587745.1 Gro. clavigera SR Pool S 1,97

duf895 domain memb protein (DUF895) XP_003006789.1 V. albo-atrum SR Pool R 2,59

Hydrophobin 1 (Hyd 1) AAZ66376.1 T. asperellum SR Pool S 1,32

heat shock protein hsp98 (HSP98) EFY88940.1 M. acridum SR Pool S 6,41

exo-rhamnogalacturonase b (Rham) EFY99815.1 M. anisopliae SR Pool S 1,82

heat shock protein 90 (HSP90) EFY99797.1 M. anisopliae SR Igual 1,04

serin endopeptidase (Serin Endo) CAL25575.1 H. lixii SR Pool S 1,66

c2h2 finger domain (c2h2) EFY98881.1 M. anisopliae SR Pool R 2,47

chitinase 33 (CHIT33) ACJ04784.1 H. virens SR Pool R 3,64

hypothetical protein (HYP) EGN91569.1 S. lacrymans SR Pool S 22,4

* Pool R – mistura dos RNAs T. harzianumALL42 crescido em meio contendo parede celular de Rhizoctonia solani coletado nos diferentes tempos (Ver metodologia). ** Pool S – RNAs de T. harzianum ALL42 crescido em meio contendo parede celular de S. sclerotiorum coletado nos diferentes tempos (Ver metodologia). (M. – Metarhizium; Glo. – Glomerella; Gro. – Grossmania; S. – Serpula; T. – Trichoderma; H. – Hypocrea; V. – Verticillum).

79

80

Dos 18 genes analisados, 9 apresentaram relação entre a condição em que foi mais

expresso e a parede usada como condição teste para construção da biblioteca, 7

apresentaram relação inversa entre a condição mais expressa e a biblioteca onde foi

identificado e 2 apresentaram expressão semelhante em ambas condições. De todos os

genes estudados, apenas 5 apresentaram diferença de expressão acima de 3 vezes. Dos

genes que apresentaram relação entre a condição analisada e a biblioteca em que o gene

foi identificado, as maiores diferenças de expressão foram observadas nos genes da

alginato liase, hsp98 e da proteína sem função definida (hyp).

Os 18 escolhidos anteriormente também tiveram sua expressão analisada em

situação de confronto em placa entre T. harzianum ALL42 e R. solani ou S. sclerotiorum. Os

micélios de ALL 42 foram coletados em placa quando estavam próximos de encontrar com o

antagonista (condição chamada de CONTATO) e cerca de 48 horas após o contato entre os

fungos (condição chamada de PÓS-CONTATO). Os ensaios controle foram realizados

fazendo-se o encontro de duas colônias distindas de T. harzianum ALL42. A Tabela 2.6

mostra a biblioteca na qual foi identificado, qual fitopatógeno o gene apresentou maior nível

de expressão e em qual fase do contato e quantas vezes o gene foi mais expresso em

relação ao outro confronto. As Figuras 2.2 e 2.3 mostram os níveis de expressão relativos

de cada um dos genes de T. harzianum crescido em situação de confronto em placa contra

R. solani ou S. sclerotiorum e na condição controle contra T. harzianum ALL42. A expressão

dos genes nos confrontos entre as colônias de T. harzianum ALL42 foram mostradas a título

de comparação.

Dos 18 genes analisados, 6 apresentaram expressão diferencial em relação à

identificação feita nas análises das bibliotecas (SNARE, TrHex, 42Echi, DUF895, Hyd1 e

chit33). Esses três genes apresentaram diferença de expressão menor que 5 vezes entre os

confrontos de T. harzianum contra R. solani e S. sclerotiorum. DUF895, chit33 e

hyd1apresentaram padrão bastante semelhante de expressão nas duas condições entre os

diferentes confrontos.

O gene cfem (Figura 2.2), que foi identificado em dois clones na biblioteca RS e

em um na biblioteca SR, apresentou padrão de expressão semelhante em ambos

confrontos de T. harzianum contra os fitopatógenos analisados. Pode-se observar que esse

gene foi reprimido na presença dos fitopatógenos e teve sua expressão praticamente

inalterada na presença do próprio fungo. Os genes de Piruvato Descarboxilase (PirD), da

exo-rhamnogalacturonase b (Rham) e da proteína com domínio c2h2 foram mais expressos

em confronto com S. sclerotiorum que contra R. solani, mas não chegou a uma diferença

maior que 3 vezes.

81

TABELA 2.6. Genes escolhidos para a análise por PCR em Tempo Real dos confrontos

entre T. harzianum ALL42 R. solani ou S. sclerotiorum.

Gene Biblioteca Mais expresso (fase do confonto) Vezes mais exp.*

SNARE RS S. sclerotiorum (Contato) 3,80

TrHex RS S. sclerotiorum (Pós-contato) 4,54

Alg Lya RS R. solani (Pós-contato) 11,50

ATP pma RS R. solani (Contato) 18,20

Cutinase RS R. solani (Contato) 3,02

FGL2 RS R.solani (Contato) 3,74

CFEM Ambas Ambos 1,45

42Echi SR R. solani (Contato) 3,00

PirD SR S. sclerotiorum (Contato) 1,62

DUF895 SR Ambos 1,34

Hyd 1 SR Ambos 2,01

HSP98 SR S. sclerotiorum (Pós-contato) 350,00

Rham SR S. sclerotiorum (Contato) 2,56

HSP90 SR S. sclerotiorum (Contato) 24,21

Serin Endo SR S. sclerotiorum (Pós-contato) 65,10

c2h2 SR S. sclerotiorum (Pós-contato) 2,97

CHIT33 SR Ambos 1,97

HYP SR S. sclerotiorum (Pós-contato) 7,93

* Foram considerados diferencialmente expressos os genes que apresentaram expressão maior que 2 vezes

em pelo menos uma das fases do confronto entre T. harzianum e R. solani e S. sclerotiorum.

82

Figura 2.2. Expressão relativa dos genes de T. harzianum, identificados na biblioteca subtrativa

RS, durante o confronto em placa com R. solani (T x R) e S. sclerotiorum (T x S) e a

expressão de CFEM, identificado nas duas bibliotecas. O experimento controle foi realizado

com o confronto entre duas colônias distintas de T. harzianum (T x T). Os dados representam a

expressão relativa ao gene de α-tubulina, usado como normalizador. (As letras sobre as barras

representam os testes estatísticos realizados. Letras minúsculas se referem à fase de contato;

letras maiúsculas se referem à fase de pós-contato. Letras diferentes indicam diferenças

estatísticas entre os confrontos.).

Nív

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xp

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ela

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83

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A B

B

a b

a A

B

C

Figura 2.3. Expressão relativa dos genes de T. harzianum, identificados na biblioteca (cont.)

84

subtrativa SR, durante o confronto em placa com R. solani (T x R) e S. sclerotiorum (T x S). O

experimento controle foi realizado com o confronto entre duas colônias distintas de T. harzianum (T x

T). Os dados representam a expressão relativa ao gene de α-tubulina, usado como normalizador. (As

letras sobre as barras representam os testes estatísticos realizados. Letras minúsculas se referem à

fase de contato; letras maiúsculas se referem à fase de pós-contato. Letras diferentes indicam

diferenças estatísticas entre os confrontos. Alguns gráficos foram exibidos em escala logarítmica para

evidenciar grandes diferenças entre a expressão gênica em diferentes condições.).

Os genes da lipase fgl2 e da cutinase, cujas expressões foram maiores no confronto

entre T. harzianum e R. solani e o gene da proteína hipotética, mais expresso no confronto

entre ALL42 e S. sclerotiorum, apresentaram diferenças um pouco maiores nos níveis e

expressão, mas não foram maiores que 10 vezes em relação à condição em que foi menos

expresso. As maiores variações de expressão fora encontradas nos genes da alginato liase,

atpase pma1, hsp98, hsp90, serina endopeptidase. O gene hsp98, por exemplo, foi

expresso 300 vezes mais no pós-contato entre T. harzianum e S. sclerotiorum que no pós-

contato com R. solani.

Um aspecto a ser observado é que os genes que apresentaram maior

representatividade nas bibliotecas não confirmaram alta expressão no confronto com o

fungo correspondente, enquanto que genes que foram identificados apenas uma vez

apresentaram grandes diferenças no padãro de expressão entre os confrontos. O gene que

codifica para uma serina-endopeptidase foi identificada em apenas um clone na biblioteca

SR, mas sua expressão foi 65 vezes maior após o contato e T. harzianum e S. sclerotinia

quando comparado ao confronto com R. solani. O gene mfs identificado na biblioteca SR,

mesmo tendo sido identificado em um único clone, chegou a ser 130 vezes mais expresso

em na presença de S. sclerotiorum que no confronto entre T. harzianum e R. solani.

Dos genes analisados, os que apresentaram padrão de expressão distinto dos outros

confrontos é que podem ser chamados de diferencialmente expressos. Observando-se os

gráficos, é possível perceber esse padrão em relação aos genes alginato liase, cutinase,

lipase fgl2, hsp98, serina-endopeptidase e o gene com função hipotética. Esses são

possíveis candidatos a genes marcadores de micoparasitismo entre T. harzianum e os

fitopatógenos R. solani e S. sclerotiorum.

A expressão dos genes hsp98, serina-endopeptidase e o da proteína hipotética de S.

lacrymans foi testada fazendo-se o crescimento de T. harzianum em meio contendo parede

celular de R. solani ou de S. sclerotiorum durante 48 horas, analisando-se os tempos de 24,

36 e 48 horas. Os três genes analisados foram identificados na biblioteca SR. A Figura 2.4

85

mostra os níveis de expressão dos genes em cada tempo dos crescimentos de T. harzianum

em meio contendo as paredes dos fitopatógenos. Durante as 48 horas de crescimento, os

genes analisados não apresentaram aumento na sua expressão no meio com parede de R.

solani como fonte de carbono. Já no meio com parede de S. sclerotiorum, os níveis de

expressão foram maiores que os observados em parede de R. solani e variaram ao longo do

tempo. Para estes genes um padrão de expressão semelhante foi identificado nos

experimentos de confronto em placa no período de pós-contato entre os fungos, mostrando

que a parede celular de fungos fitopatógenos podem ativar a expressão de genes

relacionados ao micoparasitismo assim como na interação entre os fungos em placa.

Figura 2.4. Expressão relativa dos genes hsp98, hyp e serina-endopeptidase de T. harzianum,

identificados na biblioteca subtrativa SR, durante crescimento em meio de cultura contendo parede

celular de R. solani (pcRS) ou de S. sclerotiorum (pcSS) a 0,5% como fonte de carbono. (Os micélios

foram coletados após 24, 36 e 48 horas de crescimento. Os resultados representam a média e o

desvio padrão de dois experimentos distintos, com duplicata em cada tempo de crescimento).

Nív

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xpre

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o R

ela

tivo

Nív

el de E

xpre

ssã

o R

ela

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86

5. DISCUSSÃO

Diversos trabalhos tem utilizado a técnica de construção de bibliotecas de cDNA para

identificar genes que estejam relacionados com o micoparasitismo. Alguns pesquisadores

fazem o cultivo de Trichoderma em meio de cultura contendo parede de fungos como fonte

de carbono para simular o mecanismo de micoparasitsmo (LIU E YANG, 2005; VIZCAÍNO et

al., 2006; VIZCAÍNO et al., 2007). Nos trabalhos que realizaram a técnica de hibridização

subtrativa (RaSH ou SSH) (CARPENTER et al., 2005; SCHERM et al., 2009), o RNA da

condição de teste para a construção da biblioteca foi obtido a partir do crescimento de

Trichoderma em placa em situação de confronto com o fitopatógeno estudado. Já o RNA da

condição controle foi obtido a partir do contato entre colônias do mesmo fungo ou de

crescimento em placa contendo meio rico com glicose como principal fonte de carbono.

Neste trabalho, os RNAs para a construção das bibliotecas foram obtidos a partir do

crescimento de T. harzianum em meio líquido contendo parede celular de Rhizoctonia solani

ou de Sclerotinia sclerotiorum como principal fonte de carbono, e as subtrações foram feitas

entre os RNAs dessas duas condições. Foram sequenciados 768 clones para cada uma das

bibliotecas construídas, o que permitiu identificar 47 genes possívelmente relacionados ao

biocontrole de T. harzianum sobre R. solani e 114 genes possivelmente relacionados ao

biocontrole sobre S. sclerotiorum (Tabela 2.2). Funções semelhantes foram encontradas

para 3 genes em comum entre as bibliotecas, sendo que um deles foi identificado em ambas

com o mesmo número e acesso (proteína com domínio CFEM). Apesar disso, e

considerando ainda os possíveis falsos positivos em cada biblioteca, os dados mostram que

a expressão de genes por T. harzianum difere durante a interação com a parede celular de

R. solani e S. sclerotiorum e indicam que mais genes estão envolvidos na interação com S.

sclerotiorum que com R. solani nas condições estudadas.

Do total de sequências únicas obtidas em cada biblioteca, uma grande quantidade

delas permaneceu não identificada pelo banco de dados público do NCBI (64,6% para a

biblioteca RS e 42,2% para a biblioteca SR). Isso mostra que pode haver ainda muitos

genes relacionados ao micoparasitismo do que os atualmente descritos. A dificuldade em

identificar esses genes e de interpretar claramente os dados obtidos por estudos de

transcriptomas e proteomas de Trichoderma em parte se deve à falta de genomas das

diferentes espécies usadas nos estudos, como por exemplo, de T. harzianum (CARPENTER

et al., 2005; KUBICEK et al., 2011)

Nas duas bibliotecas foram observados genes com diversas funções, não somente

relacionados ao micoparasitismo ou ao biocontrole. Além de enzimas que degradam

87

componentes da parede celular, como proteases e quitinases, foram identificados também

genes cujas proteínas estão relacionados ao metabolismo, ao transporte de moléculas pela

membrana, à aderência e contato com o ambiente, proteínas de resposta ao estresse e

proteínas relacionadas à expressão gênica (Tabelas 2.3 e 2.4). A utilização de técnicas de

clonagem e identificação de genes em larga escala permitiu observar que genes de

Trichoderma que apresentam homologia com genes de fungos que não são micoparasitas

também são ativados durante o processo de micoparasitismo, interligando esse mecanismo

com outros processos que ocorrem normalmente nas células (CARPENTER et al., 2005).

Para testar a eficiência da técnica de SSH em identificar genes de T. harzianum

diferencialmente expressos no micoparasitismo entre os fitopatógenos R. solani e S.

sclerotiorum, foram analisadas por RT-PCR em tempo real a expressão de 18 genes com

diferentes funções entre as duas bibliotecas obtidas (Tabela 2.5). Destes, 9 foram mais

expressos na presença da parede que foi usada como condição teste para construção da

biblioteca: 3 genes identificados na Biblioteca RS (na qual a condição teste é T. harzianum

crescido em parede de R. solani) se mostraram mais expressos nos diferentes tempos de

crescimento de ALL42 em parede de R. solani e 6 genes identificados na Biblioteca SR

(na qual a condição teste é T. harzianum crescido em parede de S. sclerotiorum) foram mais

expressos em parede de S. sclerotiorum. Apenas 3 dos 9 genes mencionados anteriormente

apresentaram diferença de expressão maior que 3 vezes entre as condições analisadas.

Até o momento dois trabalhos na literatura utilizaram de técnicas de hibridização

subtrativa para identificar genes relacionados ao micoparasitismo de Trichoderma. No

trabalho de Carpenter e colaboradores (2005), um total de 25 clones foram analisados para

identificar genes de T. hamatum relacionados ao micoparasitismo contra S. sclerotiorum,

sendo que 9 foram expressos apenas no confronto entre os fungos, 14 expressos também

na condição controle e dois clones que não apresentaram expressão. Os 25 clones foram

sequenciados retornando 15 funções gênicas distintas. Já no trabalho de Scherm e

colaboraores (2009), que identificaram genes relacionados ao micoparasitismo de linhagens

de T. harzianum contra R. solani, foram analisados 400 clones, dos quais 50 se mostraram

diferencialmente expressos entre as condições analisadas. Destes, 36 genes foram

identificados a partir do genoma de T. reesei e 9 a partir da base de dados do GenBank

(NCBI). Considerando-se os clones que apresentaram a mesma função, ao final foram

identificados 25 genes diferentes relacionados ao micoparasitismo. Após a validação da

biblioteca, 13 genes foram analisados novamente nas condições em que a biblioteca foi

construída e somente 4 genes mostraram padrão de expressão diferente entre a condição

teste e a condição controle.

88

Estudos sobre a técnica de hibridização subtrativa têm explorado suas

funcionalidades a fim de auxiliar a interpretação dos dados obtidos. Uma das desvantagens

da utilização da SSH é que o procedimento pode não excluir todos os genes não

diferencialmente expressos e alguns dos clones podem ser falsos positivos. Para que um

gene diferencialmente expresso esteja representado na biblioteca é estimado que a

diferença de expressão entre as condições seja de pelo menos 5 vezes. Quando essa

diferença é menor, outros genes são amplificados aleatoriamente durante a PCR e vão fazer

parte da biblioteca de cDNA (WAN et al, 2002). Por isso, em alguns casos, o número de

falsos positivos pode superar os genes que seriam esperados em algumas bibliotecas

(HUANG et al., 2007).

Apesar da baixa quantidade de genes que apresentaram relação positiva entre a

biblioteca em que foi identificado e a condição em que foi mais expresso durante a validação

(9 genes), a abordagem utilizada neste trabalho foi diferente dos trabalhos anteriores que

usaram a técnica de hibridização subtrativa para Trichoderma. Um número maior de clones

foi sequenciado permitindo a identificação de mais genes possivelmente relacionados ao

micoparasitismo para cada um dos fitopatógenos estudados. Mais genes precisam, no

entanto, serem analisados para confirmar quantos se tratam de falsos positivos e quantos

são diferencialmente expressos entre as condições estudadas. Esta é a abordagem

sugerida para análise de bibliotecas obtidas por SSH caso se queira identificar genes cuja

expressão varie pouco entre as condições analisadas (WAN et al, 2002).

Os 18 genes escolhidos para validar a biblioteca tiveram sua expressão analisada

durante o confronto em placa entre T. harzianum e os fitopatógenos e também durante o

contato entre colônias distintas do micoparasita, condição que foi considerada como

controle. Doze genes apresentaram diferenças de expressão entre os confrontos de T.

harzianum e cada um dos fitopatógenos, mas apenas 7 (AlgLya, Cutinase, pirD, hsp98,

Rham, SerinEndo e HYP) apresentaram correlação entre o que foi identificado na validação

da biblioteca. Na condição de confronto as diferenças de expressão entre os confrontos

contra R. solani e S. sclerotiorum foram maiores que as observadas para o crescimento em

parede sendo que 5 genes apresentaram diferença de expressão maior que 3 vezes em

pelo menos uma das fases do confronto (contato ou pós-contato).

Em relação aos 5 genes mencionados anteriormente (AlgLya, Cutinase, hsp98,

SerinEndo e HYP), três são hidrolases e possivelmente estão relacionados à composição da

parede dos fungos fitopatógenos. A enzima alginato liase pertence à família das

polisacarídio liases e degrada polímeros de poliuronatos formados por α-L-guluronato (G)

e/ou β-D-manuronato. Dentre os açúcares que compõem a parede de R. solani se encontra

o ácido glucurônico (JONES et al., 1972), componente que pode ser responsável pela

89

atividade desta enzima. Já a parede de S. sclerotiorum contém 2% de rhamnose (JONES et

al., 1972) e rhamnogalacturonana é um polímero que contém L-rhamnose na sua estrutura.

Desta forma, a atividade de exo-rhamnogalacturonase pode estar mais relacionada à

composição da parede de S. sclerotiorum.

A atividade de cutinase também foi encontrada preferencialmente na presença de

parede ou de micélio de R. solani. Cutinases são serina esterases são capazes de hidrolisar

ésteres de ácidos graxos e triacilgliceróis emulsificados, assim como algumas lipases. A

parede de R. solani possui cerca de 7% de lipídios associados (POTGIETER &

ALEXANDER, 1966) e estes podem ser responsáveis por induzir a expressão da cutinase

em T. harzianum. A expressão dos genes de cutinase e também da lipase FGL2 foram

maiores durante a fase de contato entre T. harzianum e R. solani que no contato entre .S.

sclerotiorum e no controle (interação entre colônias de T. harzianum).

O gene da serina endopeptidase foi mais transcrito durante a fase de pós-contato

entre T. harzianum e S. sclerotiorum que nos outros ensaios realizados em placa. Proteases

atuam na degradação da parede celular do fungo parasitado e também pode atuar como

inativadores de proteínas e enzimas secretados pelo patógeno (LIU et al., 2010). Muitos

genes que codificam para proteases são expressos antes e durante o contato com o

patógeno durante o micoparasitismo de Trichoderma. A maioria dessas proteases pertence

ao grupo de serina proteases e são altamente representadas em bibliotecas de EST de

Trichoderma crescido em condições de biocontrole (DRUZHININA et al., 2011). A serina

endopeptidase estudada neste trabalho também apresentou aumento nos níveis de

transcritos durante o contato entre as diferentes colônias de T. harzianum ALL42.

O gene hsp98, devido a grande diferença de expressão na fase de pós-contato entre

os diferentes fitopatógenos, pode ser considerado como diferencialmente expresso entre R.

solani e S. sclerotiorum. As HSPs são proteínas relacionadas a estresse e são

conhecidamente produzidas durante a interação entre Trichoderma e outros fungos ou

plantas (LORITO et al., 2010). A expressão de hsp98 também aumentou após a fase de

contato entre as colônias de T. harzianum, mas permaneceu inalterada após o contato com

R. solani, indicando que essa proteína pode ter relação com o reconhecimento de

Trichoderma pela própria hifa. Mais experimentos são necessários para confirmar o papel de

HSP98 no micoparasitismo de T. harzianum em S. sclerotiorum. O gene de função

hipotética (hyp) foi mais expresso na fase de pós-contato de T. harzianum e S. sclerotiorum

quando comparado às outras condições e também deve ser caracterizado para que seu

papel no micoparasitismo seja esclarecido.

90

Apesar do número de falsos positivos encontrados neste trabalho, o sequenciamento

de um número maior de clones das bibliotecas subtrativas obtidas permitiu a identificação de

genes que parecem estar relacionados ao processo de micoparasitismo de T. harzinum

contra R. solani que não são ativados durante o micoparasitismmo contra S. sclerotiorum e

vice-versa. Sabe-se que Trichoderma apresenta diferentes padrões de resposta a

hospedeiros distintos (LIU et al., 2010) e, mesmo que as diferenças sejam sutis, métodos de

clonagem de genes diferencialmente expressos que não exijam o processamento de muitas

amostras podem ser utilizadas para identificar esses genes. Mais genes obtidos nas

bibliotecas contruídas neste trabalho devem ser analisados para verificar a eficácia da

técnica e para identificar mais genes relacionados ao micoparasitismo de Trichoderma

contra R.solani e S. sclerotiorum.

91

6. CONCLUSÕES

A partir dos dados obtidos neste trabalho foi possível chegar às seguintes

conclusões:

- Foram construídas duas bibliotecas de cDNA de Trichoderma harzianum ALL42

pela técnica de hibridização subtrativa por supressão após crescimento em culturas

contendo, respectivamente, parede celular dos fitopatógenos Rhizoctonia solani e

Sclerotinia sclerotiorum;

- Após a análise das bibliotecas foram identificados 47 genes de T. harzianum ALL

42 possivelmente relacionados ao micoparasitismo de Rhizoctonia solani e 115 genes

possivelmente relacionados ao micoparasitismo de Sclerotinia sclerotiorum;

- Dentre 18 genes selecionados dentre os identificados nas bibliotecas subtrativas, 9

apresentaram ser mais expressos nas mesmas condições de indução que foram utilizadas

para a construção das bibliotecas;

- Dos 9 genes obtidos pela análise das bibliotecas, 5 apresentaram relação positiva

entre a parede utilizada como teste na construção da biblioteca, expressão durante o

crescimento com parede celular e a expressão durante o confronto em placa para o mesmo

fungo fitopatógeno: AlgLya e Cutinase para R. solani e exo-rhamnogalacturonase b, serina

endopeptidase e da proteína com função hipotética para S. sclerotiorum;

- Dentre os genes analisados, os que codificam para as enzimas alginato liase e

cutinase parecem estar relacionados ao contato entre T. harzianum e R. solani e hsp98,

serina endopeptidase e o gene da proteína hipotética parecem estar relacionados ao

micoparasitismo contra S. sclerotiorum;

- A análise de bibliotecas de cDNA obtidas pela técnica de hibridização subtrativa se

mostrou uma ferramenta que pode ser empregada na identificação de genes relacionados

ao micoparasitismo de Trichoderma contra patógenos específicos.

92

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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96

ANEXOS

TABELA A. Função predita e características dos fragmentos de genes obtidos da Biblioteca subtrativa RS

Cód.Seq Função Predita e N˚ de acesso da proteína correspondente E-value Organismo Frequência

1RSctg03 plasma membrane snare protein EFZ03166.1 1,25E-18 Metarhizium anisopliae 21

2RSctg04 dihydroxy-2-butanone 4-phosphate synthase EFQ30223.1 3,46E-07 Glomerella graminicola 19

3RSctg06 duf833 domain-containing protein EFZ02783.1 8,80E-24 Metarhizium anisopliae 17

4RSctg12 hexose transporter CBV37357.1 1,76E-13 Glomerella graminicola 9

5RSctg14 ubiquitin-activating enzyme e1 1 XP_956143.1 2,90E-51 Neurospora crassa 8

6RSctg17 alginate lyase 2 EFY94774.1 1,34E-10 Metarhizium anisopliae 6

7RSctg21 carrier protein EFZ01315.1 4,47E-21 Metarhizium anisopliae 5

8RSctg28 c4-dicarboxylate transporter malic acid transport EFY99010.1 1,38E-13 Metarhizium anisopliae 4

9RSctg30 hypothetical protein NECHADRAFT_84688 XP_003050388.1 2,18E-16 Nectria haematococca 4

10RSctg37 Aspartic peptidase 1S2B_A 3,22E-28 Scytalidium lignicola 3

11RSctg32 conserved hypothetical protein XP_002481031.1 2,17E-05 Talaromyces stipitatus 3

12RSctg39 flavin-binding monooxygenase-like family EFY94846.1 6,93E-31 Metarhizium anisopliae 3

13RSctg33 histone h2a EFY99543.1 2,72E-22 Metarhizium anisopliae 3

14RSctg35 MFS transporter, putative EFY96694.1 3,68E-05 Metarhizium anisopliae 3

15RSctg46 alcohol dehydrogenase XP_002481042. 1,99E-08 Talaromyces stipitatus 2

16RSctg48 plasma membrane h+-atpase pma1 ABV53589.1 4,74E-33 Trichoderma hamatum 2

17RSctg63 Cutinase ABN48556.1 9,00E-28 Hypocrea lixii 2

18RSctg54 fructose- -bisphosphatase EFY99287.1 1,21E-43 Metarhizium anisopliae 2

19RSctg60 triacylglycerol lipase fgl2 XP_003003525.1 2,97E-15 Verticillium albo-atrum 2

20RS02e08 Methionine aminopeptidase EFZ01875.1 3,00E-15 Metarhizium anisopliae 2

Cód.Seq Função Predita e N˚ de acesso da proteína correspondente E-value Organismo Frequência

21RSctg59 Manganese superoxide dismutase CAD42938.2 9.84E-6 Taiwanofungus camophratus

2

22 Mitochondrial phosphate Carrier protein EFY95190.1 4.85E-13 Metarhizium anisopliae 2

23RSctg38 hypothetical protein NECHADRAFT_84003 XP_003048505.1 1.78E-7 Nectria haematococca 3

24RSctg51 Peroxisomal targeting signal receptor EFZ00125.1 1.99E-10 Metarhizium anisopliae 2

25RS2D06 hypothetical protein NCU00607 XP_965747.1 6.38E-5 Neurospora crassa 1

26RS3G07 hypothetical protein GLRG_ EFQ33272.1 1.69E-10 Glomerella graminicola 1

27RS2H12 hypothetical protein FG02201. XP_382377.1 5.00E-15 Giberella zeae 1

28RS3G02 hsp70 chaperone XP_002375072. 1.78E-15 Aspergillus flavus 1

29RS6G04 Secretory lipase family protein EFY94339.1 1.31E-18 Metarhizium anisopliae 1

30RS4B09 glucose-regulated protein EFZ02560.1 1.44E-17 Metarhizium anisopliae 1

31RS3C09 fungal specific transcription factor domain-containing protein

EFQ32804.1 1.50E-9 Glomerella graminicola 1

32RS4B03 flavohemoglobin EFY87064.1 1.02E-7 Metarhizium acridum 1

33RS2C09 endo- -beta- (endo-1,3(4)-beta-glucanase) XP_002481822. 1 5.17E-15 Talaromyces stipitatus 1

34RS4C07 duf1237 domain protein EFY88460.1 1.02E-23 Metarhizium acridum 1

35RS4H05 atp-dependent rna helicase EFZ03166.1 4.93E-10 Metarhizium anisopliae 2

36RS6D04 1 concanamycin induced protein c EFY89297.1 1.98E-14 Metarhizium acridum 1

37RS1A03 Glucose transporter CAC81782.1 1.96E-6 Hypocrea lixii 1

38RSctg58 Cfem domain-containing protein EFQ25862.1 3.16E-12 Glomerella graminicola 2

39RS4E01 Phosphoglycerate mutase family XP_383204.1 8.2E-5 Metarhizium anisopliae 1

40RSctg62 nitrite reductase BAH95949.1 1.26E-5 Uncultured bacterium 2

41RSctg11 transposase is630 CAL47051.1 1.07E-4 Listonella anguillarum 12

Cód.Seq Função Predita e N˚ de acesso da proteína correspondente E-value Organismo Frequência

42RS4H05 ubiquitin CAA80337.1 7.05E-12 Tetrahymena pyriformis 1

43RSctg47 hemagglutinin esterase CAR56929. 1 1.73E-6 Salmon anemia virus 2

44RS1H06 allatotropin neuropeptide precursor CAD98809.1 3.72E-5 Spodoptera frugiperda 1

45RSctg43 Methyl-coenzyme reductase alpha subunit CBF64719. 5.32E-4 Uncultured archaeon 1

46RSctg16 Fructose dehydrogenase small subunit BAH36945.1 6.72E-7 Gluconobacter frateurii 14

47RSctg29 Splicing factor prp8 AAZ32862.1 8.3E-5 Medicago sativa planta 4

TABELA B. Função predita e características dos fragmentos de genes obtidos da Biblioteca subtrativa SR

Cód.Seq Função Predita e N˚ de acesso da proteína correspondente E-value Organismo Frequência

01SRctg01 serine proteinase EFY96733.1 3,98E-12 Metarhizium anisopliae 28

02SRctg02 42kda endochitinase ADB89220.1 1,76E-40 Trichoderma saturnisporum 23

03SRctg05 pyruvate decarboxylase XP_001587745.1 2,92E-30 Grosmannia clavigera 15

04SRctg04 protein (hypothetical) XP_001230225.1 5,87E-25 Chaetomium globosum 13

05SRctg06 glyoxal oxidase precursor EFY98849.1 1,48E-06 Metarhizium anisopliae 12

06SRctg07 rna polymerase rpb1 repeat domain ptn XP_384016.1 8,16E-05 Giberella zeae 11

07SRctg08 duf895 domain membrane protein XP_003006789.1 1,97E-39 Verticillium albo-atrum 10

08SRctg18 Hydrophobin 1 AAZ66376.1 1,14E-22 Trichoderma asperellum 9

09SRctg17 alpha- -glucanase CAC80493.1 4,67E-12 Hypocrea lixii 8

10SRctg21 qi74 protein CAA64974.1 1,21E-32 Hypocrea lixii 8

11SRctg09 hypothetical protein PICST_57317 XP_001383614.1 5,09E-07 Scheffersomyces stipitis 7

12SRctg10 hypothetical protein MAA_04006 EFZ00229.1 2,37E-26 Metarhizium anisopliae 6

13SRctg25 Oxidoreductin XP_003053957.1 6,38E-16 Nectria haematococca 6

14SRctg11 sarcosine oxidase XP_003053020.1 8,46E-20 Nectria haematococca 6

15SRctg16 glucan endo- -alpha-glucosidase agn1 CBF78568.1 1,04E-28 Aspergillus nidulans 5

16SRctg15 heat shock protein hsp98 EFY88940.1 3,48E-53 Metarhizium acridum 5

17SRctg14 sugar transporter CAC81782.1 7,97E-39 Hypocrea lixii 5

18SRctg23 lipase serine EFZ01901.1 2,59E-22 Metarhizium anisopliae 4

19SRctg63 manganese superoxide dismutase CAD42938.2 9,76E-06 Taiwanofungus camphoratus 4

20SRctg46 beta-mannosidase EEA25354. 1,00E-12 Penicillium marneffei 3

Cód.Seq Função Predita e N˚ de acesso da proteína correspondente E-value Organismo Frequência

21SRctg59 carrier protein EFZ01315.1 6,55E-21 Metarhizium anisopliae 3

22SRctg28 exo-rhamnogalacturonase b EFY99815.1 3,63E-32 Metarhizium anisopliae 3

23SRctg42 glycosyl hydrolase EFY92740.1 4,19E-09 Metarhizium acridum 3

24SRctg26 peptide transporter ptr2-a CAI30793.1 2,11E-65 Hypocra lixii 3

25SRctg62 predicted protein [ mpVI 77-13-4] EEU40970. 3,58E-03 Nectria haematococca 3

26SRctg41 protein (hypothetical) CBX96391.1 8,74E-17 Leptosphaeria maculans 3

27SRctg33 ras small monomeric gtpase rab6 EFY85784.1 8,14E-32 Metarhizium acridum 3

28SRctg44 uncharacterized protein ylr154c-g Q3E813.1 8,57E-05 Saccharomyces cerevisiae 3

29SRctg90 beta 1,3 exoglucanase ABY19519.1 1,24E-11 Trichoderma asperellum 2

30SRctg79 bzip transcription factor EFQ35152.1 7,44E-17 Nectria haematococca 2

31SRctg60 caib baif family enzyme EFY91151.1 6,84E-31 Metarhizium acridum 2

32SRctg69 cellulose signalling related protein ooc1 AAY25948.1 2,46E-28 Hypocrea jecorina 2

33SR2E02 cytochrome p450 family protein EFY99729.1 3,18E-04 Metarhizium anisopliae 2

34SRctg55 elongation factor 1-alpha ABI36616.1 5,72E-38 Hypocrea alcalifuscenscens 2

35SRctg75 geranylgeranyl pyrophosphate synthetase EFQ25845.1 4,32E-09 Glomerella graminicola 2

36SRctg92 glucose-methanol-choline oxidoreductase XP_001727378. 1 6,90E-15 Aspergillus oryzae 2

37SR5E02 glutathione peroxidase EFQ27967.1 6,43E-15 Glomerella graminicola 2

38SRctg65 heat shock protein 90 EFY99797.1 1,33E-07 Metarhizium anisopliae 2

39SRctg64 histone h2a EFY93636.1 3,85E-13 Metarhizium acridum 2

40SRctg53 hydrophobin ABN64104.1 2,58E-22 Hypocrea lixii 2

41SRctg68 hypothetical protein [Hypocrea virens] ABE60720.1 4,53E-23 Hypocra virens 2

42SR8F11 hypothetical protein XP_001911934.1 6,79E-12 Podospora anserina 2

43SRctg56 quinate permease EFY87274.1 5,63E-22 Metarhizium acridum 2

Cód.Seq Função Predita e N˚ de acesso da proteína correspondente E-value Organismo Frequência

44SRctg77 rna binding EFY98001.1 2,81E-24 Metarhizium anisopliae 2

45SRctg57 signal recognition particle 68 kda protein XP_003009147.1 5,55E-09 Verticillium albo-atrum 2

46SRctg72 sodium calcium Exchanging protein EFY97138.1 4,41E-17 Metarhizium anisopliae 2

47SRctg94 transketolase XP_003008956. 1 1,08E-15 Verticillium albo-atrum 2

48SR8G12 ubiquitin EFY91215.1 9,05E-23 Metarhizium acridum 2

49SR8C01 3-ketosteroid-delta-1- EFY97685.1 1,74E-10 Metarhizium anisopliae 1

50SR2B01 40s ribosomal protein s18 EFY87768. 1 2,73E-19 Metarhizium acridum 1

51SR7C11 40s ribosomal protein s4 XP_003172932.1 1,39E-12 Artrhoderma gypseum 1

52SR7F12 60s ribosomal protein l11 EFY88628.1 2,91E-13 Metarhizium acridum 1

53SR8B05 60s ribosomal protein l19 EFY96331.1 6,90E-15 Metarhizium anisopliae 1

54SR5C04 60s ribosomal protein l44 EFQ28243.1 2,42E-15 Glomerella graminicola 1

55SR3C11 60s ribosomal protein l6 EFQ26483.1 5,56E-13 Glomerella graminicola 1

56SR1A04 Acid sphingomyelinase EFY91799.1 8,84E-15 Metarhizium acridum 1

57SR6G06 actin cortical patch protein EFY89095.1 3,34E-17 Metarhizium acridum 1

58SR8F12 alkaline proteinase (serin endopeptidase) EFY89095.1 1,23E-19 Hypocrea lixii 1

59SR2F06 allergen asp f4- EFZ01528.1 5,99E-11 Metarhizium anisopliae 1

60SR6H06 amine oxidase EFY94324.1 6,92E-15 Metarhizium anisopliae 1

61SR1H04 amino-acid permease inda1 EFY94324.1 1,07E-15 Hypocrea lixii 1

62SR2G11 aspartic peptidase a1 CAI91181.1 1,86E-12 Hypocrea lixii 1

63SR7C09 atp synthase subunit beta ACD85901.1 2,15E-40 Hypocrea lixii 1

64SR8B07 atp-dependent rna helicase EFY87866.1 2,46E-09 Metarhizium acridum 1

65SR7E01 beta- -glucanosyltransferase EFZ01775.1 1,99E-06 Metarhizium anisopliae 1

66SR5B04 c2h2 finger domain EFY98881.1 1,06E-23 Metarhizium anisopliae 1

Cód.Seq Função Predita e N˚ de acesso da proteína correspondente E-value Organismo Frequência

67SR7C05 cfem domain-containing protein EFQ25862.1 2,69E-11 Glomerella graminicola 1

68SR6G08 chitinase 18-5 (endochitinase42) ADP37575.1 2,41E-37 Hypocrea virens 1

69SR8F01 chitinase 33 ACJ04784.1 6,98E-12 Hypocrea virens 1

70SR2E04 conserved hypothetical protein EEH44517.1 2,16E-05 Paracoccidioides brasiliensis 1

71SR3F07 conserved hypothetical protein XP_003007876. 1 4,22E-20 Verticillium albo-atrum 1

72SR3D05 covalently-linked cell wall protein XP_001936024. 1 1,58E-08 Pyrenophora tritici-repentis 1

73SR6C07 cyclin-dependent kinase regulatory subunit EFQ25446.1 9,61E-09 Glomerella graminicola 1

74SR3G08 electron transfer flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase ACB30146.1 1,61E-19 Epichloe festucae

1

75SR6D11 Endochitinase (GH Family 18 protein) ABO38127.1 1,90E-12 Trichoderma atroviride 1

76SR8E06 enolase EFZ03156.1 1,89E-20 Metarhizium anisopliae 1

77SR6D05 fha domain containing protein EFY95612.1 3,30E-09 Metarhizium anisopliae 1

78SR6D11 flavin-containing monooxygenase XP_748309.1 2,73E-27 Aspergillus fumigatus 1

79SR5E03 flavohemoprotein XP_002377474. 1,83E-15 Aspergillus flavus 1

80SR5B06 frequency clock protein Q00586.1 1,97E-06 Hypocrea spinulosa 1

81SR5F05 fructose-bisphosphate aldolase EFZ03205.1 3,21E-23 Metarhizium anisopliae 1

82SR8D07 glutaminase EFZ01959.1 1,41E-07 Metarhizium anisopliae 1

83RS2H07 glycerate-and formate-dehydrogenase EEH49540.1 3,92E-18 Paracoccidioides brasiliensis 1

84SR5H04 g-protein beta subunit XP_003002475.1 4,87E-39 Verticillum albo-atrum 1

85SR6A09 heat shock protein 70 EFY91041.1 3,81E-10 Hypocrea lixii 1

86SR3A02 hydrophobin precursor ABS59379.1 2,93E-10 Hypocra virens 1

87SR6E07 hypothetical protein [Gibberella fujikuroi] CAG28692.1 3,67E-05 Gibberella fujikuroi 1

88SR8E07 hypothetical protein ATEG_0597 XP_001215155. 1 1,86E-04 Aspergillus terreus 1

Cód.Seq Função Predita e N˚ de acesso da proteína correspondente E-value Organismo Frequência

89SR2H09 hypothetical protein MAA_03606 EFZ01010.1 2,89E-11 Metarhizium anisopliae 1

90SR3B10 hypothetical protein MAA_05915 EFY98776.1 3,00E-18 Metarhizium asinoplieae 1

91SR2F04 leucine rich repeat domain protein EFZ02102.1 1,81E-15 Metarhizium anisopliae 1

92SR7H01 l-xylulose reductase Q8NK50.1 8,97E-39 Hypocrea jecorina 1

93SR3C06 mca1_botfb ame: full=metacaspase-1 flags: precursor XP_001587752.1 1,75E-42 Sclerotinia sclerotiorum

1

94SR2F03 mfs monosaccharide EFQ27448.1 9,86E-21 Glomerella graminicola 1

95SR7G05 mitochondrial hypoxia responsive domain containing protein EFY87737.1 9,91E-39 Metarhizium acridum

1

96SR3F09 myb dna-binding domain protein EFZ02851.1 2,66E-22 Metarhizium anisopliae 1

97SR7F05 n-acetylglucosaminidase precursor (exochitinase) AAB47060.1 7,69E-30 Hypocrea lixii

1

98SR3A09 ndt80 like dna-binding family protein EEU44303.1 5,89E-30 Nectria haematococca 1

99SR6D10 neutral ceramidase precursor EFY90494.1 3,27E-12 Metarhizium acridum 1

100S2D12 phosphatidylglycerol phosphatidylinositol transfer protein EFY84185.1 3,18E-09 Metarhizium acridum

1

101S3E07 rheb small monomeric gtpase EEU44230.1 4,98E-05 Nectria haematococca 1

102S8G01 rna interference and gene silencing protein EFY90521.1 3,10E-15 Metarhizium acridum 1

103S6A10 secretory pathway protein EFZ02197.1 9,58E-06 Glomerella graminicola 1

104S6A10 small secreted protein EEU42732.1 2,74E-11 Nectria haematococca 1

105S7H11 trna-splicing endonuclease subunit EEU44822.1 1,52E-14 Nectria haematococca 1

106ctg37 hypothetical protein MAC_04227 [Metarhizium acridum CQMa 102] EFY89795.1 7,74E-07 Metarhizium acridum

3

107Sctg38 chk1 checkpoint-like protein EGN91569.1 2,95E-05 Serpula lacrymans 3

Cód.Seq Função Predita e N˚ de acesso da proteína correspondente E-value Organismo Frequência

108S1G04 fructose dehydrogenase small subunit BAH36945.1 3,35E-06 Gluconobacter frateurii 1

109Sctg31 methyl-coenzyme m reductase alpha subunit CBF64715.1 1,98E-06 archaea 10

110Sctg73 transposase is630 CAL47051.1 3,16E-07 Listonella anguillarum 2

111Sctg32 allatotropin neuropeptide precursor CAD98809.1 6,99E-05 Spodoptera frugiperda 3

112Sctg54 hypothetical protein DAPPUDRAFT_68692 [Daphnia pulex] EFX61784.1 2,30E-15 Daphnia pulex

3

113Sctg76 adenine nucleotide translocator EEF48878.1 3,69E-08 Ricinus communis 2

114Sctg40 hemagglutinin esterase CAR56929.1 5,08E-07 Anemia virus 7