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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PARTICIPAÇÃO DOS GRUPAMENTOS NORADRENÉRGICOS
BULBARES A1 E A2 NA RECUPERAÇÃO CARDIOVASCULAR
INDUZIDA PELA ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA DE SOLUÇÃO
SALINA HIPERTÔNICA EM RATOS SUBMETIDOS À HEMORRAGIA
HIPOVOLÊMICA
STÉFANNE MADALENA MARQUES
GOIÂNIA-GO
2017
STÉFANNE MADALENA MARQUES
PARTICIPAÇÃO DOS GRUPAMENTOS NORADRENÉRGICOS
BULBARES A1 E A2 NA RECUPERAÇÃO CARDIOVASCULAR
INDUZIDA PELA ADMINISTRAÇÃO INTRAVENOSA DE SOLUÇÃO
SALINA HIPERTÔNICA EM RATOS SUBMETIDOS À HEMORRAGIA
HIPOVOLÊMICA
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Goiás, como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Ciências Biológicas.
Área de concentração: Farmacologia e Fisiologia
Orientador: Prof. Dr. Gustavo Rodrigues Pedrino
GOIÂNIA-GO
2017
Agradecimentos
Agradeço primeiramente à Deus por sua infinita misericórdia! À Universidade Federal de Goiás e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas pela incansável busca para oferecer aos seus alunos uma formação de qualidade. Aos órgãos de fomento CAPES, CNPq e FAPEG pelo apoio financeiro fundamental para a realização desse trabalho. Ao Prof. Dr. Gustavo Rodrigues Pedrino, pela orientação, oportunidade de aprendizado, apoio e por cada ensinamento. Nesses três anos de convivência, aprendi o valor da ética, do compromisso e da responsabilidade, lições que não são aplicadas apenas à vida acadêmica. Muito obrigada! Agradeço em especial à minha companheira de lesão, hemorragia, imuno, congresso e viagem, Lara! Essa pessoa linda, sem a qual a realização desse trabalho não seria possível, não tenho palavras que possam expressar minha gratidão. Muito obrigada por sua amizade, que possamos continuar a dividir as lágrimas e risadas, as conquistas e alegrias, rumo a realização de nossos sonhos. Aos meus pais, Sandoval e Abadia, pelo amor incondicional e por sempre lutarem para que os meus sonhos sejam realizados. À minha irmã, Jeniffer por ser minha fiel companheira e ter me dado o presente mais lindo, o pequeno Pietro, que sempre me faz sorrir e me transporta para o seu universo despreocupado. Aos professores e alunos do Centro de Pesquisa em Neurociência e Fisiologia Cardiovascular (CPNFC) pela convivência e aprendizado. Agradeço em especial à Aryanne, Paulo e Marina por serem sempre um porto seguro em que encontro um abraço amigo, palavra de ânimo e boas risadas. À minha mãe adotiva e bruxa Nathalia, que mesmo distante sempre me apoia e a quem tenho um imenso carinho.
À Kássia por ser um presente que a UFG me entregou e que tem me acompanhado nessa jornada nada normal e aos meus amigos de graduação, João Pedro e Millena, que mesmo diante da correria do dia a dia sempre procuram demonstrar o carinho que sentem por mim. Agradeço à Julyele pelo companheirismo e amizade, por sempre fazer de tudo para me animar, por todas as vezes que me obrigou a sair de casa, mesmo que eu estivesse cansada e desanimada, te amo linda! Aos meus amigos, Jota, Lucimeire, Welber, Rafael, Danyele, Núbia e Elanildo pelas noites de UNO, tentativas de assistir filme, carinho e auxílio através de suas orações.
À minha segunda família Alzira, Régis e Luciana, Pr. Sandro e Pra. Lídia, Pr. João e Pra. Gilvaina e minhas filhas lindas Karol, Duda e Jordana por cada oração, compreensão e pelo carinho.
Muito obrigada a todos!
“É melhor tentar e falhar, que preocupar-se e ver a vida passar.
É melhor tentar, ainda que em vão que sentar-se, fazendo nada até o final.
Eu prefiro na chuva caminhar, que em dias frios em casa me esconder.
Prefiro ser feliz embora louco, que em conformidade viver. ”
Martin Luther King
SUMÁRIO
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ....................................................................... i
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................. iii
LISTA DE TABELAS .................................................................................................. vi
RESUMO................................................................................................................... vii
ABSTRACT ................................................................................................................ ix
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 1
2 OBJETIVOS .......................................................................................................... 7
3 METODOLOGIA ................................................................................................... 8
3.1 MODELO ANIMAL UTILIZADO ...................................................................... 8
3.2 LESÃO DO GRUPAMENTOS NEURONAIS A1 E A2.................................... 8
3.3 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS GERAIS ................................................. 9
3.4 REGISTRO DA PRESSÃO ARTERIAL MÉDIA (PAM) E FREQUÊNCIA
CARDÍACA (FC) .............. ........................................................................................9
3.5 REGISTRO DO FLUXO SANGUÍNEO RENAL (FSR) E AÓRTICO (FSA) .. 10
3.6 HEMORRAGIA HIPOVOLÊMICA E SOBRECARGA DE SÓDIO ................ 11
3.7 IMUNOISTOQUÍMICA .................................................................................. 11
3.8 CONTAGEM NEURONAL ............................................................................ 12
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA .............................................................................. 12
4 RESULTADOS ................................................................................................... 13
4.1 EFEITO DA LESÃO DO GRUPO NORADRENÉRGICO A2 E DA LESÃO
CONJUNTA DOS GRUPAMENTOS A1 E A2 NOS AJUSTES
CARDIOVASCULARES INDUZIDOS PELA SOBRECARCA DE SÓDIO APÓS
HEMORRAGIA HIPOVOLÊMICA .......................................................................... 13
4.1.1 Avaliação da lesão dos neurônios catecolaminérgicos bulbares
induzidas pela nanoinjeção de saporina-anti-DβH na região NTS...................... 13
4.1.2 Ajustes cardiovasculares induzidos pela infusão de salina hipertônica
após a indução de hemorragia hipovolêmica em animais com lesão ou não do
grupamento A2 ................................................................................................... 16
4.1.3 Avaliação da lesão dos neurônios catecolaminérgicos bulbares
induzidas pela nanoinjeção de saporina-anti-DβH na região NTS e
bilateralmente na região CVLM .......................................................................... 20
4.1.4 Ajustes cardiovasculares induzidos pela infusão de salina hipertônica
após a indução de hemorragia hipovolêmica em animais com lesão
concomitante ou não dos grupamentos A1 e A2. ............................................... 24
5 DISCUSSÃO ....................................................................................................... 28
6 CONCLUSÃO ..................................................................................................... 33
7 REFERÊNCIAS .................................................................................................. 34
8 ANEXO ............................................................................................................... 42
i
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AV3V Região Anteroventral do III Ventrículo
CH Choque Hemorrágico
CVA Condutância Vascular Aórtica
CVLM Região Caudoventrolateral do Bulbo
CVR Condutância Vascular Renal
DβH Dopamina-β-Hidroxilase
E.P.M Erro Padrão da Média
ECG Eletrocardiograma
FC Frequência Cardíaca
FSA Fluxo Sanguíneo Aórtico
FSR Fluxo Sanguíneo Renal
G Grama
HH Hemorragia hipovolêmica
i.v. Intravenosa
IB ImmunoBuffer
Kg Quilograma
M Molar
Min Minuto
mL Mililitros
Mm Milímetros
mmHg Milímetros de Mercúrio
MnPO Núcleo Pré-Optico Mediano
Ng Nanograma
nL Nanolitro
NTS Núcleo do Trato Solitário
PA Pressão Arterial
PAM Pressão Arterial Média
PAP Pressão Arterial Pulsátil
PBS Phosphate-buffered saline
PFA Paraformaldeído
PVN Núcleo Paraventricular do Hipotálamo
ii
RVLM Região Rostroventrolateral do Bulbo
Saporina-anti-DβH Saporina-anti-Dopamina-β-Hidroxilase
SFO Órgão Subfornical
SH Salina Hipertônica
SNC Sistema Nervoso Central
SON Núcleo Supra-óptico
TH Tirosina Hidroxilase
VLM Medula Ventrolateral
µm Micrometros
iii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Corte sagital do encéfalo modificado de Bourque (2008),
destacando as projeções dos grupamentos noradrenérgicos A2
(NTS) e grupamento noradrenérgico A1 (CVLM) para o núcleo
pré-optico mediano, e desse para o núcleo paraventricular do
hipotálamo. Mostrando que esses grupamentos são ativados
por aumento da concentração plasmática de sódio e ativam
regiões prosencefálicas envolvidas no equilíbrio hidroeletrolítico,
modulando a resposta humoral e autonômica..............................
4
Figura 2. Fotomicrografia representativa dos cortes coronais do bulbo
(40μm) marcados pela técnica de imunoistoquímica. As setas
indicam a marcação dos neurônios tirosina hidroxilase (TH)
positivos no núcleo do trato solitário (NTS – grupamento
neuronal A2), na região caudoventrolateral do bulbo (CVLM –
grupamento neuronal A1) e rostroventrolateral do bulbo (RVLM
– grupamento neuronal C1) dos animais que receberam
nanoinjeções de saporina (controle A2) ou saporina-anti-DβH
(lesão A2) no NTS.........................................................................
14
Figura 3. Quantificação de células tirosina hidroxilase (TH) positivas nas
regiões bulbares. Média ± erro padrão da média (E.P.M) do
número de células TH positivas localizadas no núcleo do trato
solitário (NTS – grupamentos neuronais A2 e C2) e na região
ventrolateral do bulbo (VLM – grupamento neuronal A1 e C1)
dos animais que receberam nanoinjeções de saporina (Grupo
controle A2) ou de saporina-anti-DβH (Grupo lesão A2) na
região NTS. † Diferente do controle; p < 0,05...............................
15
iv
Figura 4.
Registro das variações de pressão arterial pulsátil (PAP), fluxo
sanguíneo renal (FSR), fluxo sanguíneo aórtico (FSA) e
frequência cardíaca (FC) induzidas pela sobrecarga de sódio
em um animal que recebeu nanoinjeção de saporina na região
do núcleo do trato solitário (controle A2; A) e um animal que
recebeu nanoinjeção de saporina-anti-DβH (lesão A2; B) após a
hemorragia hipovolêmica. Estão apresentados os traçados
representativos do período basal, dos tempos 10 e 20 min de
hemorragia destacados pelo quadro tracejado e dos tempos 30
e 60 min após a infusão de salina hipertônica 3M........................
18
Figura 5.
Efeitos da lesão do grupamento neuronal A2 sobre a pressão
arterial média (PAM; A), frequência cardíaca (FC; B), fluxo
sanguíneo renal (FSR; C), condutância vascular renal (CVR; D),
fluxo sanguíneo aórtico (FSA; E) e condutância vascular aórtica
(CVA; F) em animais com hemorragia hipovolêmica submetidos
a infusão de salina hipertônica. *Diferente do tempo 0; p <0.05.
A barra preta representa o período de hemorragia e a linha
tracejada representa a infusão de salina hipertônica 3M..............
19
Figura 6. Fotomicrografia representativa dos cortes coronais do bulbo
(40μm) marcados pela técnica de imunoistoquímica. As setas
indicam a marcação dos neurônios tirosina hidroxilase (TH)
positivos no núcleo do trato solitário (NTS – grupamento
neuronal A2), na região caudoventrolateral do bulbo (CVLM –
grupamento neuronal A1) e rostroventrolateral do bulbo (RVLM
– grupamento neuronal C1) dos animais que receberam
nanoinjeções de saporina (controle A1+A2) ou saporina-anti-
DβH (lesão A1+A2) no NTS e bilateralmente na CVLM............... 22
Figura 7.
Quantificação de células tirosina hidroxilase positivas nas
regiões bulbares. Média ± erro padrão da média (E.P.M) do
v
número de células TH positivas localizadas no núcleo do trato
solitário (NTS – grupamentos neuronais A2 e C2) e na região
ventrolateral do bulbo (VLM – grupamento neuronal A1 e C1)
dos animais que receberam nanoinjeções de saporina (grupo
controle A1+A2) ou de saporina-anti-DβH (grupo lesão A1+A2)
na região NTS e bilateralmente no CVLM. † Diferente do
controle; p < 0,05 .........................................................................
23
Figura 8.
Registro das variações de pressão arterial pulsátil (PAP), fluxo
sanguíneo renal (FSR), fluxo sanguíneo aórtico (FSA) e
frequência cardíaca (FC) induzidas pela sobrecarga de sódio
em um animal que recebeu nanoinjeções de saporina
(controle A1+A2; A) e um animal que recebeu saporina-anti-
DβH (lesão A1+A2; B) na região do NTS e bilateralmente na
CVLM após a hemorragia hipovolêmica. Estão apresentados
os traçados representativos do período basal, dos tempos 10
e 20 minutos de hemorragia destacados pelo quadro tracejado
e dos tempos 30 e 60 minutos após a infusão de salina
hipertônica 3M.............................................................................
26
Figura 9. Média ± EPM da pressão arterial média (PAM; A), frequência
cardíaca (FC; B), fluxo sanguíneo renal (FSR; C), condutância
vascular renal (CVR; D), fluxo sanguíneo aórtico (FSA; E) e
condutância vascular aórtica (CVA; F) em resposta a
sobrecarga de sódio após HH em animais submetidos a
nanoinjeção de saporina (grupo controle A1+A2) ou de
saporina-anti-DβH (grupo lesão A1+A2) na região NTS e
bilateralmente no CVLM. *Diferente do tempo 0; † Diferente do
grupo controle; p <0.05. A barra preta representa o período de
hemorragia hipovolêmica e a linha tracejada representa a
infusão de salina hipertônica 3M................................................ 27
vi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Valores basais de pressão arterial média (PAM), frequência
cardíaca (FC), fluxo sanguíneo renal (FSR), fluxo sanguíneo
aórtico (FSA), condutância vascular renal (CVR) e condutância
vascular aórtica (CVA) dos ratos controle e com lesão do
grupamento A2.............................................................................
16
Tabela 2.
Valores basais de pressão arterial média (PAM), frequência
cardíaca (FC), fluxo sanguíneo renal (FSR), fluxo sanguíneo
aórtico (FSA), condutância vascular renal (CVR) e condutância
vascular aórtica (CVA) dos ratos controle e com lesão do
grupamento A1 e A2..................................................................... 24
vii
RESUMO
Diversos estudos determinaram a importância da infusão intravenosa de solução de
cloreto de sódio (NaCl) hipertônica na recuperação cardiovascular da hemorragia
hipovolêmica (HH). Estudos mostraram o aumento de atividade dos grupamentos
noradrenérgicos bulbares A1 e A2 em resposta ao aumento da osmolaridade em
ratos normovolêmicos. No entanto, a participação destes neurônios na integração
das respostas reflexas que conduzem ao restabelecimento hemodinâmico e à
melhora cardiovascular induzida pela infusão de solução salina hipertônica (SH)
durante a hipovolemia ainda permanecem por ser esclarecidas. O presente estudo
procurou elucidar a participação dos grupamentos noradrenérgicos bulbares A1 e A2
na recuperação cardiovascular por infusão de SH após HH em ratos anestesiados.
Para isto, ratos Wistar receberam nanoinjeções de 100 nL de saporina (0,022 ng ∙ nl-
1) ou saporina-anti-DβH (0,105 ng ∙ nl-1) na região NTS e/ou bilateralmente no CVLM.
Após 15 dias, os animais foram instrumentalizados para registro dos parâmetros
cardiovasculares: pressão arterial média (PAM), frequência cardíaca (FC),
condutância vascular renal (CVR) e condutância vascular aórtica (CVA). A HH foi
induzida durante 20 min pela retirada de sangue até que a PAM atingisse
aproximadamente 60 mmHg. Em seguida, foi realizada a administração de solução
SH (NaCl; 3M; 1,8 ml ∙ kg-1), e os parâmetros cardiovasculares foram registrados por
mais 60 min. Os resultados mostraram que, nos animais com lesão do grupamento
A2, após a infusão de SH a PAM retornou aos valores basais de maneira similar ao
que ocorreu nos animais controle (sham A2: 109,4 ± 3,7 mmHg vs. Lesão A2: 108,6
± 5,1 mmHg, 60 min após a infusão de SH); a FC reduziu significativamente em
ratos controle e com lesão de A2 durante a HH e retornou aos níveis basais 10 min
após infusão de SH (controle A2: 406,0 ± 10,6 bpm vs. Lesão A2: 368.8.1 ± 17,9
bpm); a HH e a infusão de solução SH não promoveu alterações nos valores basais
de CVR em ambos os grupos (sham A2: ∆ 3,0 ± 22,3%; Lesão A2: ∆ -23,5 ± 16,6%, 20
min após a HH) e (sham A2: ∆ 2,3 ± 18,8 vs. Lesão A2: ∆ 7,3 ± 8,3%; 30 min após a
infusão de SH). A CVA não foi alterada pela HH (sham A2: ∆ -11,1 ± 6,6% vs Lesão
A2: ∆ 7,8 ± 11,6%; 20 min após a HH) ou infusão de SH (Sham: ∆ -20,6 ± 7,8% vs.
Lesão A2: ∆ -4,4 ± 5,1%, 30 min após a infusão de SH). Nos animais com lesão
combinada dos grupamentos A1 e A2, a infusão de SH não reestabeleceu os níveis
de PAM (controle A1+A2: 104,9 ± 5,7 vs Lesão A1+A2: 64,2 ± 4,5 mmHg; p <0,05;
30 min após a infusão SH), permanecendo estes em níveis hemorrágicos até o final
dos experimentos (controle A1+A2: 107,1 ± 3,3 vs Lesão A1+A2: 68,4 ± 4,2 mmHg;
p <0,05; 60 min após infusão SH). A HH não alterou os valores basais de CVR
(Sham A1+A2: ∆ 4,7 ± 20,2% vs. Lesão A1+A2: ∆ 2,9 ± 16,7%; 20 min após a HH); a
solução SH, também, não foi capaz de alterar esse parâmetro nos grupos de
animais controle e lesado (sham A1+A2: ∆: 0,1 ± 12,1% vs. Lesão A1+A2: ∆ 29,4 ±
25,9%; 30 min após a infusão de SH). No grupo submetido a lesão A1+A2, a CVA
não foi alterada pela HH em ambos os grupos (sham A1+A2: ∆ -1,5 ± 16.3% vs.
Lesão A1+A2: ∆ -18,6 ± 6,3%; 20 min após a HH) ou pela infusão de solução de SH
(sham A1+A2: ∆ 20 ± 117% vs. Lesão A1+A2: ∆ 9,5 ± 7,7%; 30 min após a infusão
de SH). Os resultados indicam que o grupamento neuronal A2 não parece estar
diretamente envolvido na recuperação cardiovascular por infusão de SH em ratos
submetidos a HH e que a lesão simultânea dos grupamentos A1 e A2 foi capaz de
viii
suprimir a restauração da PAM em resposta à SH após a HH, indicando que a
integridade desses grupamentos é essencial para a recuperação cardiovascular
mediante hipernatremia aguda após a hipovolemia. Nosso estudo indica ainda que
esses grupamentos não parecem estar diretamente envolvidos na regulação da
reatividade vascular dos leitos analisados.
Palavras chave: hiperosmolaridade, hipovolemia, CVLM, NTS, pressão arterial
ix
ABSTRACT
Several studies have determined the importance of intravenous infusion of sodium
chloride (NaCl) solution in the cardiovascular recovery of hypovolemic hemorrhage
(HH). Studies show the increased activity of the noradrenergic groups A1 and A2 in
response to increased osmolarity in normovolemic rats. However, the participation of
these neurons in the integration of the reflexive responses that lead to hemodynamic
recovery and to the cardiovascular improvement induced by the infusion of
hypertonic saline (HSI) solution during hypovolemia remain to be clarified. The
present study sought to elucidate the participation of the noradrenergic groups A1
and A2 in cardiovascular recovery by HSI after HH in anesthetized rats. For this,
mice should receive nanoinjections of 100 nL saporin (0.022 ng ∙ nl-1) or saporin-anti-
DβH (0.105 ng ∙ nl-1) in the NTS region and/or bilaterally in the CVLM. After 20 days,
the animals were instrumented to record the cardiovascular parameters: mean
arterial pressure (MAP), heart rate (HR), renal vascular conductance (RVC), and
aortic vascular conductance (AVC). HH was induced for 20 min by withdrawal of
blood until a MAP reached about 60 mm Hg. Then, HIS (NaCl, 3M, 1.8 ml ∙ kg-1) was
performed, and the cardiovascular parameters were recorded for a further 60 min.
The results showed that animals with group A2 lesion after an HSI to MAP returned
to baseline in a manner similar to that observed in control animals (sham A2: 109.4 ±
3.7 mmHg vs A2 lesion: 108.6 ± 5.1 mmHg, 60 min after an infusion of SH); One FC
significantly reduced in controlled and A2 lesion tests during one HH and returned to
baseline levels 10 min after HS infusion (A2 control: 406.0 ± 10.6 bpm vs. A2 lesion:
368.8.1 ± 17, 9 Bpm); HH and HIS-solution did not promote RVC values in both
groups (sham A2: Δ 3.0 ± 22.3% vs. A2 lesion: Δ -23.5 ± 16.6%; 20 min after HH)
and (A2 sham: Δ 2.3 ± 18.8 vs. A2 lesion: Δ 7.3 ± 8.3%, 30 min after HSI). The AVC
was not altered by HH (sham A2: Δ -11.1 ± 6.6% vs A2 Injury: Δ 7.8 ± 11.6%, 20 min
after HH) or HSI (Sham: Δ – 20.6 ± 7.8% vs. A2 lesion: Δ -4.4 ± 5.1%; 30 min after
HSI). In animals with combined lesions A1 and A2, an HS infusion did not restore
MAP levels (A1+A2 control: 104.9 ± 5.7 vs. A1+A2 lesion: 64.2 ± 4.5 mmHg; <0.05,
30 min after HSI), remained in hemorrhagic cells until the end of the experiments
(control A1+A2: 107.1 ± 3.3 vs lesion A1+A2: 68.4 ± 4.2 mmHg; <0.05; 60 min after
HSI). HH did not change the baseline RVC values (sham A1+A2: Δ 4.7 ± 20.2% vs.
A1 + A2 lesion: Δ 2.9 ± 16.7%, 20 min after HH); The HSI solution was also not able
to change this parameter in the controlled and tested animals (sham A1+ A2: Δ: 0.1 ±
12.1% vs. A1+A2 lesion: Δ 29.4 ± 25.9%; 30 min after HSI). A1 + A2, a AVC was not
altered by HH in both groups (sham A1 + A2: Δ -1.5 ± 16.3% vs. lesion A1 + A2: Δ -
18.6 ± 6.3 20 minutes after HH) or by infusion of SH solution (sham A1 + A2: Δ 20 ±
117% vs. A1 + A2 lesion: Δ 9.5 ± 7.7%). The results indicate that neuronal group A2
does not appear to be involved in cardiovascular recovery through HS infusion where
the treatments are adequate for HH and that the lesions of the two groups (A1 and
A2) were able to suppress a restoration of MAP in response To HSI after HH,
supporting the hypothesis that an integrity is essential for a cardiovascular recovery
through acute hypernatremia after hypovolemia. Our study also indicates that the
clusters are not involved and are involved in the regulation of vascular reactivity of
the analyzed beds.
x
Keywords: hyperosmolarity, hypovolemia, CVLM, NTS, arterial pressure
1
1 INTRODUÇÃO
A conservação da composição do meio interno do organismo é uma condição
essencial para a sobrevivência (1), envolvendo nesse processo a conservação da
tonicidade dos compartimentos extra e intracelulares, bem como a pressão arterial
em níveis normais e o funcionamento do sistema cardiovascular. Alterações de
volume e osmolaridade promovem desequilíbrio da homeostase levando a
alterações do metabolismo e funcionamento das células, como ocorre na hemorragia
hipovolêmica (HH).
A HH é caracterizada por uma condição de hipoperfusão tecidual, durante a HH
ocorre redução do volume sanguíneo, resultando na diminuição da pré-carga e do
débito cardíaco, o que implica em perfusão tecidual inadequada comprometendo a
distribuição e utilização do oxigênio nos tecidos. Em consequência disso, a
resistência vascular sistêmica aumenta para manter a pressão de perfusão nos
órgãos vitais (2). Independente da etiologia da HH, a manutenção de volume, em
níveis adequados para produzir um débito cardíaco efetivo, é o objetivo fundamental
para a manutenção das funções fisiológicas. Em vista disso, o tratamento do choque
hipovolêmico é baseado no controle do sangramento aliado a correções do déficit de
volume vascular (3–5). Inúmeros tipos de soluções têm sido empregados na
terapêutica desta patologia. Em âmbito pré-hospitalar destaca-se a utilização das
soluções hipertônicas, como a salina hipertônica (SH) (3).
Diversos estudos relatam os efeitos cardiovasculares das infusões de SH na
HH (3,4,6–9). Velasco et al., (1980) (8) mostraram que a infusão de SH (NaCl 1,25
M), em volume equivalente a 10% do volume retirado para gerar o choque
hemorrágico (CH) em cães, resultou em melhora hemodinâmica e promoveu
sobrevida desses animais, demostrando os benefícios da infusão de SH no
tratamento do CH. Costa et. al., (2009) (10) mostraram os benefícios promovidos
pelo uso de SH quando comparado com soluções isotônicas no modelo de HH.
Diferentes estudos demonstraram que o uso de SH é capaz de reestabelecer os
parâmetros cardiovasculares prejudicados durante a HH, promovendo elevação
instantânea da pressão arterial, aumento da pressão de pulso, retorno do débito
cardíaco ao valor basal e reestabelecimento da circulação mesentérica, renal e dos
membros posteriores (8,9,11).
Embora as respostas hemodinâmicas promovidas pelo uso de SH na
recuperação da HH sejam bem estabelecidas, pouco se sabe sobre o envolvimento
2
do sistema nervoso central (SNC) nas respostas cardiovasculares induzidas pela
sobrecarga de sódio em animais submetidos a hemorragia. Uma vez que os
mecanismos homeostáticos são regulados principalmente pelo SNC, através de
respostas autonômicas e humorais capazes de manter níveis adequados de pressão
arterial, resistência periférica e frequência cardíaca, novos estudos são necessários
para elucidação das vias centrais envolvidas na recuperação cardiovascular induzida
por SH em animais hemorrágicos.
De fato, diversos estudos relatam o papel dos aferentes aórtico e carotídeos,
quimiorreceptores e barorreceptores, na regulação da pressão arterial e na detecção
de variações da pressão parcial de O2 e CO2 e pH (12–14). Entretanto, estudos mais
recentes têm demonstrado que esses aferentes também podem estar envolvidos nos
ajustes cardiovasculares induzidos por alterações do volume e da composição do
compartimento extracelular (10,15–17). Recentemente, comprovou-se que esses
aferentes neuronais periféricos estão envolvidos nas respostas cardiovasculares e
na simpatoinibição renal induzidas por hipernatremia aguda (17). Estes resultados
mostram a importância de tais aferentes para os ajustes reflexos provocados por
mudanças na concentração plasmática de sódio e indicam uma possível via neural
envolvida nesses ajustes (17).
Ademais, já foi demonstrado que a restauração da pressão arterial por infusão
de SH durante a hipovolemia foi bloqueada após a desenervação não seletiva dos
barorreceptores (10). Mais recentemente, também foi evidenciado que a inativação
específica dos quimiorreceptores carotídeos aboliu a recuperação da pressão
arterial por infusão de SH em ratos submetidos à HH, demostrando a relevância dos
aferentes neuronais periféricos nas respostas à infusão de SH em estado de
hipovolemia (18).
A partir das informações anteriores, pode-se dizer que a restauração da
homeostase promovida pela sobrecarga de sódio durante quadros hemorrágicos
envolve o recrutamento de vias e mecanismos neuronais reflexos. No entanto, as
regiões do SNC responsáveis pela integração das respostas reflexas que conduzem
ao restabelecimento hemodinâmico e à melhora cardiovascular gerada pela infusão
de SH durante a hipovolemia ainda permanecem por ser esclarecidas.
O núcleo do trato solitário (NTS) está localizado no bulbo dorsal e é o sítio
primário de aferências cardiovasculares no SNC. Esta região recebe ainda
3
informações referentes a alterações da pressão arterial e do volume sanguíneo e
projeta-se para outras áreas do SNC envolvidas na regulação cardiovascular e
balanço hidroeletrolítico (19–21). As informações advindas de receptores periféricos,
como os barorreceptores arteriais (localizados no arco da aorta e nos seios
carotídeos) que respondem a variações de pressão arterial, osmorreceptores e os
receptores periféricos de sódio (localizados nos vasos renais, intestinais e
principalmente hepáticos) chegam ao NTS através das projeções do nervo vago e
glossofaríngeo (22–26). Após o processamento inicial dessas informações, elas têm
acesso a diferentes regiões do SNC através das projeções provenientes do NTS.
É bem descrito na literatura que as fibras aferentes dos nervos dos seios
carotídeos se projetam para a região comissural do NTS (27,28). Ademais, estudos
anatômicos, neurofisiológicos e farmacológicos demonstraram que existe uma via de
interação entre os neurônios localizados no NTS, na região caudoventrolateral do
bulbo (CVLM) e na região rostroventrolateral do bulbo (RVLM) e que tal interação
desempenha um papel crítico no controle da resposta simpática mediante o estímulo
do barorreflexo (29–31). Esses estudos mostraram ainda que existe projeção direta
do NTS para o RVLM, participando da via central dos quimiorreceptores, enquanto
que o CVLM mediaria a regulação simpática de neurônios catecolaminérgicos do
RVLM (grupamento C1), além de fornecer a modulação pós-sináptica diferencial de
neurônios C1 pelos neurônios do NTS (29–31).
O grupamento de neurônios noradrenérgicos do NTS (grupamento A2), é uma
região do SNC que recebe informações acerca de alterações da composição e do
volume circulante provenientes dos aferentes carotídeos e osmorreceptores
periféricos e as envia para outras regiões como a CVLM (16,32–34). A CVLM é uma
região crítica envolvida na regulação cardiovascular, uma vez que o grupo de
neurônios A1 está envolvido na homeostase de fluídos corporais e é ativado em
diferentes condições que afetam o volume e a composição do compartimento
extracelular (32,35,36). Já foi mostrado que a vasodilatação renal, um mecanismo
importante para aumentar a excreção de sódio, induzida por infusão de SH ou
expansão de volume isotônico é atenuada em animais submetidos a lesão A1 por
nanoinjeção de saporina-anti-dopamina-β-hidroxilase (saporina-anti-DβH) (37).
Ademais, a lesão do grupamento A1 promoveu maior ingestão de NaCl 0,3 M após
protocolos de desidratação celular, sugerindo um papel inibitório para os neurônios
4
catecolaminérgicos medulares no apetite ao sódio (38). Tanaka et al. (2002) (39)
sugeriram que os neurônios do CVLM medeiam informações sobre volume
sanguíneo através de projeções diretas para o órgão subfornical (SFO), uma região
livre de barreira hemato-encefálica, responsiva as alterações de osmolaridade. De
fato, já foi mostrado que as células A1 se projetam para regiões envolvidas na
homeostase da água e do sódio incluindo o SFO, o núcleo pré óptico mediano
(MnPO), neurônios secretores magnocelulares do núcleo paraventricular do
hipotálamo (PVN) e o núcleo supra-óptico (20,40,41) (figura 1).
Entre estas estruturas que recebem projeções dos grupamentos bulbares A1 e
A2 destaca-se o MnPO. Este núcleo é uma das principais áreas do circuito neural
que regula o equilíbrio hidroeletrolítico e tem sido alvo de vários estudos no que se
refere ao seu papel na regulação cardiovascular e homeostase dos fluidos corporais
(32,42–44). Evidências neuroanatômicas mostraram ainda que o MnPO envia
densas projeções para PVN, importante região para a regulação autonômica e
neuroendócrina (45).
Figura1. Corte sagital do encéfalo modificado de Bourque (2008), destacando as
projeções dos grupamentos noradrenérgicos A2 (NTS) e grupamento noradrenérgico
A1 (CVLM) para o núcleo pré-optico mediano, e desse para o núcleo paraventricular
do hipotálamo. Mostrando que esses grupamentos são ativados por aumento da
concentração plasmática de sódio e ativam regiões prosencefálicas envolvidas no
equilíbrio hidroeletrolítico, modulando a resposta humoral e autonômica.
5
De fato, à importância dos grupamentos A1, A2 e da neurotransmissão
adrenérgica no MnPO nas respostas a hiperosmolaridade já foi demonstrada em
animais normovolêmicos (46–48). Pedrino et al., (2008) (47) utilizou saporina-anti-
dopamina-β-hidroxilase para promover lesão de neurônios noradrenérgicos na
região CVLM e mostrou que tal lesão foi capaz de abolir a resposta simpática renal
induzida por hipernatremia aguda, indicando que a integridade dessa região é
essencial para a resposta simpatoinibitória por aumento agudo dos níveis
plasmáticos de sódio. Similarmente, foi demonstrado que a vasodilatação renal
induzida por hipernatremia é abolida após o bloqueio dos α-adrenoreceptores no
MnPO, sugerindo que as projeções dos neurônios A1 para o MnPO agem para inibir
a atividade do nervo simpático renal (46). Ademais, já foi mostrado que os neurônios
noradrenérgicos A2 são componentes das vias neurais que regulam a composição
do fluido extracelular e estão envolvidos na simpatoinibição induzida por aumento da
osmolaridade (48). Esses resultados mostram a importância dos neurônios
noradrenérgicos A1 e A2 na redução da atividade do nervo simpático renal induzida
por alterações da concentração plasmática de sódio, corroborando com a hipótese
de que os neurônios adrenérgicos do MnPO e os grupamentos A1 e A2 participariam
das vias e mecanismos neurais que regulam as respostas reflexas por sobrecarga
de sódio após o quadro de hipovolemia.
Estudos realizados em nosso laboratório, mostraram que o bloqueio
farmacológico do MnPO, utilizando Muscimol (agonista GABAérgico), inibiu a
recuperação da pressão arterial média (PAM) e da condutância vascular renal (CVR)
induzida por SH em ratos submetidos à HH (49). Entretanto, o papel da
neurotransmissão adrenérgica no MnPO sobre as respostas cardiovasculares e
autonômicas por infusão de SH em modelos de hipovolemia ainda não foi avaliado.
Nesse sentido, é lícito supor a participação da neurotransmissão adrenérgica no
MnPO nessas respostas. Ademais, resultados recentes do nosso laboratório
mostraram que a redução farmacológica de 62% do número de neurônios A1,
através de nanoinjeções de saporina-anti-DβH, não alterou a recuperação da PAM
promovida pela infusão de SH (Lara Marques Naves, Stéfanne Madalena Marques
Gustavo Rodrigues Pedrino; dados não publicados). Estes resultados parecem
contrapor a hipótese de que o grupamento A1 contribuiria para a recuperação
cardiovascular provocada pela sobrecarga de sódio em quadros de HH. Entretanto,
6
é necessário destacar que a região CVLM é uma projeção indireta do NTS para o
MnPO, justificando assim uma possível influência de outras áreas que poderiam
auxiliar a manutenção da resposta na ausência do grupamento A1. O NTS pode ser
uma região capaz de suprir tal via, uma vez que recebe informações a respeito de
alterações na osmolaridade plasmática e se projeta diretamente para o MnPO.
Assim, não podemos descartar que o SNC trabalha em paralelo com outras
vias (como a hormonal, por exemplo) e que vias do próprio SNC atuam em paralelo.
Desse modo, considerando que os neurônios A1 e A2 possuem a mesma origem
embriológica (50–53), projeções similares para o MnPO e PVN (54,55) e comportam-
se de modo semelhante frente a estímulos hiperosmóticos (47,48,56), podemos
considerar esses grupamentos atuam como vias paralelas de ação. Desse modo, a
perda de parte da via A1 poderia ser suprida pela A2.
Diante do exposto, nota-se que a melhor compreensão das vias e estruturas
neuronais envolvidas no reestabelecimento da homeostase induzida por sobrecarga
de sódio durante a hipovolemia é necessária. Deste modo, torna-se plausível
investigar o envolvimento dos neurônios noradrenérgicos A1 e A2 nas respostas
cardiovasculares promovidas pela infusão de solução de SH em animais submetidos
a HH.
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2 OBJETIVOS
No presente trabalho, buscamos determinar a participação dos neurônios
noradrenérgicos A1 e A2 nos ajustes cardiovasculares induzidos por sobrecarga
aguda de sódio durante a HH. Mais especificamente:
Determinar o efeito da lesão específica do grupamento noradrenérgico A2
sobre as respostas cardiovasculares – pressão arterial média (PAM),
frequência cardíaca (FC), fluxo sanguíneo renal (FSR), fluxo sanguíneo
aórtico (FSA), condutância vascular renal (CVR) e condutância vascular
aórtica (CVA) – induzidas pela administração intravenosa de SH em ratos
anestesiados submetidos a HH.
Determinar o efeito da lesão concomitante dos grupamentos noradrenérgicos
A1 e A2 nas respostas cardiovasculares – PAM, FC, FSR, FSA, CVR e CVA –
induzidas pela infusão de SH em ratos anestesiados submetidos a HH.
8
3 METODOLOGIA
3.1 ANIMAL
Foram utilizados ratos adultos da linhagem Wistar entre 8 e 10 semanas (290-
320 g), fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Federal de Goiás (UFG). Os
animais foram mantidos sob condições de luz controlada ciclo claro-escuro de 12
horas, em salas climatizadas com temperatura controlada (22-24°C) e tiveram
acessos ad libitum à água e ração, atendendo a todas as normas de manejo e
cuidado animal. Todos os protocolos utilizados foram aprovados pela Comissão de
Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Goiás (nº034/12,
Anexo).
3.2 LESÃO DOS GRUPAMENTOS NEURONAIS A1 E A2
Os animais foram anestesiados (ketamina 10%; 1 mL · kg-1 e xilazina 2%; 0,7
mL · kg-1; Syntec, Santana de Parnaíba, SP, Brasil) e posicionados em decúbito
ventral em um aparelho estereotáxico (Insight Ltda., Ribeirão Preto, SP, Brasil). A
musculatura da nuca foi rebatida, o osso occipital removido e a dura-máter
seccionada, expondo o calamus scriptorius, o qual foi utilizado como ponto de
referência para obtenção das coordenadas estereotáxicas.
As lesões específicas dos neurônios catecolaminérgicos da região CVLM
(grupamento de neurônios A1) e NTS (grupamento de neurônios A2) foram
realizadas através de nanoinjeções do complexo saporina-anti-dopamina-β-
hidroxilase (saporina-anti-DβH; 0,105 ng · nL-1; Advanced Targeting Systems, San
Diego, CA, USA). Nos grupos controle foram injetadas doses equimolares de
Saporina (0,022 ng · nL-1; Advanced Targeting Systems, San Diego, CA, USA). As
nanoinjeções foram realizadas utilizando micropipetas de vidros acopladas a um
sistema de pressão. O controle do volume injetado de cada toxina foi realizado pelo
deslocamento do menisco da solução na micropipeta.
Para realização das nanoinjeções no NTS, uma micropipeta de vidro foi
posicionada 0,0 e -0,5 mm caudal ao calamus scriptorius, 0,0 mm lateral a linha
média ventral e 0,3 milímetros da superfície dorsal. Para as nanoinjeções feitas no
CVLM, uma micropipeta de vidro foi posicionada 0,3 mm rostral e 0,3 mm caudal a
partir do calamus scriptorius, 1,8 mm lateral a linha média e 1,5 mm ventral a partir
da superfície dorsal. Estas coordenadas foram definidas com base na região do
9
CVLM e NTS que consiste no grupo A1 e A2, respectivamente (48,56).
Após as nanoinjeções, a micropipeta foi deixada no lugar durante 3 min para
evitar o arrastamento da toxina injetada durante a retirada da pipeta, a incisão foi
suturada, e os animais foram colocados numa almofada aquecida para manter a
temperatura do corpo durante a recuperação. Uma dose profiláctica de antibiótico
(penicilina, 60,000 IU · Kg-1, i.m. Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) foi administrada
após a cirurgia.
Após o procedimento cirúrgico os animais foram mantidos em gaiolas com
água e ração ad libitum por um período de 15 dias para recuperação cirúrgica e
estabelecimento das lesões nos grupos experimentais.
3.3 PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS GERAIS
Após o período de 15 dias de recuperação, os animais foram anestesiados com
uretano (1,2 g · kg-1, i.v.; Sigma-Aldrich, MO, EUA) após indução anestésica com
halotano 2% (Tanohalo; Cristália, Itapira, SP, Brasil) em O2 a 100%. A artéria e veia
femoral foram canuladas com cateteres constituídos por tubos de polietileno PE-10 e
PE-50 soldados para registro da PA e a infusão de drogas, respectivamente. Cateter
adicional foi inserido na artéria carótida direita para retirada de sangue durante à HH.
Foi realizada traqueostomia a fim de reduzir a resistência das vias aéreas superiores
e facilitar a remoção de secreções. Posteriormente, os animais foram fixados em
decúbito ventral em aparelho estereotáxico (David Kopf Inst., CA, EUA). Através de
incisões retroperitoniais, sondas em miniatura (probe 1RB; Transonic Systems, Inc.,
Ithaca, NY, EUA) foram implantadas ao redor da artéria renal e da aorta abdominal
para registro do fluxo sanguíneo renal e aórtico, respectivamente. A temperatura dos
animais foi mantida entre 36 e 37º C.
3.4 REGISTRO DA PRESSÃO ARTERIAL MÉDIA (PAM) E
FREQUÊNCIA CARDÍACA (FC)
O sinal da pressão arterial pulsátil (PAP) foi obtido pela conexão do cateter da
artéria femoral a um transdutor de pressão (MLT0699, ADInstruments, Bella Vista,
Austrália) acoplado a um amplificador (Bridge Amp, FE221, ADInstruments, Bella
Vista, Austrália). Os dados foram digitalizados utilizando um conversor analógico
digital (PowerLab 4/25, ML845, ADInstruments, Bella Vista, Austrália). A PAM foi
calculada a partir da integral do sinal da PAP (LabChart 7 v7.3.7; ADInstruments,
10
Bella Vista, Austrália). A FC foi calculada como uma frequência instantânea a partir
do sinal da PAP (PowerLab 4/25, ML845, ADInstruments, Bella Vista, Australia).
3.5 REGISTRO DO FLUXO SANGUÍNEO RENAL (FSR) E AÓRTICO
(FSA)
Uma sonda em miniatura (probe 1RB, Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY,
EUA) foi implantada ao redor da artéria renal esquerda e artéria abdominal e
conectada a um fluxômetro T206 (Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY, EUA), que
permite determinar o fluxo em valores absolutos (ml ∙ min-1). Os sinais obtidos foram
enviados ao sistema de aquisição e análise de dados (PowerLab System;
ADInstruments, Colorado Springs, CO, EUA). Os dados foram digitalizados em uma
frequência de 1000 amostras ∙ s-1. As variações do FSR e do FSA foram calculadas
como a razão percentual em relação ao valor basal (%FSR). Os valores de CVR e
CVA foram obtidas pela razão entre o FSR e a PAM e entre o FSA e a PAM,
respectivamente. As variações da CVR e CVA foram calculadas como variação
percentual em relação ao valor basal (%CVR e %CVA). As fórmulas utilizadas estão
descritas no quadro a seguir.
Variação do FSR (%FSR) %FSR = FSR final – FSR basal x 100
FSR basal
Variação do FSA (%FSA) %FSR = FSR final – FSR basal x 100
FSR basal
Condutância Vascular Renal (CVR) CVR = FSR
PAM
Condutância Vascular Aórtica (CVA) CVA = FSA
PAM
Variação da CVR (%CVR) %CVR = CVR final – CVR basal x 100
CVR basal
Variação da CVA (%CVA) %CVA = CVA final – CVA basal x 100
CVA basal
Quadro1. Resumo das fórmulas utilizadas para cálculo %FSR, %FSA, CVR, CVA, %CVR e %CVA
11
3.6 HEMORRAGIA HIPOVOLÊMICA E SOBRECARGA DE SÓDIO
A HH foi promovida por meio da retirada de sangue pela artéria carótida direita
ao longo de 10 min, até que PAM atingisse valores próximo a 60 mmHg.
Posteriormente esse nível de PAM foi mantido por mais 10 min por retirada e
reinfusão de sangue, quando necessário. A sobrecarga de sódio foi promovida por
meio da infusão intravenosa de SH (NaCl 3 M; 60 s; 1,8 ml ∙ kg-1; Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO, EUA) após 20 min do início da indução da HH.
3.7 IMUNOISTOQUÍMICA
Ao final dos experimentos os animais foram submetidos a perfusão
transcardíaca com soro fisiológico (NaCl; 0,15 M; 500 mL) seguido por solução de
paraformaldeído 4% (PFA; 500 mL; LabSynth, Diadema, SP, Brasil) em tampão
fosfato 0,1 M (pH 7,4; LabSynth, Diadema, SP, Brasil). A perfusão foi realizada pela
inserção de um cateter de polietileno, acoplado a uma bomba de perfusão, no
ventrículo esquerdo. Em seguida, o bulbo e o encéfalo dos animais foram
removidos, mantidos em PFA 4% por 2 horas e criopreservados em solução de
sacarose 0,8 M (LabSynth, Diadema, SP, Brasil). As regiões bulbares foram
seccionadas em cortes coronais de 40 μm de espessura com o auxílio de um
micrótomo de congelamento (Leica; Wetzlar, Alemanha) e armazenadas em solução
salina tamponada com fosfato (PBS; 0,01 M; Sigma; pH 7,4).
Os cortes bulbares foram processados pela técnica de imunoistoquímica para a
marcação das células tirosina hidroxilase (TH) positivas. Os cortes foram lavados em
tampão fosfato salina (PBS; 0,01M; LabSynth, Diadema, SP, Brasil) e em seguida
lavados com ImmunoBuffer (IB; Triton 0,3% em PBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
EUA) para aumentar a solubilidade da membrana plasmática. Posteriormente, foram
incubados com soro normal de cavalo (2% em IB; Vector Laboratories, Inc.,
Burlingame, CA, EUA) por 30 min, para bloqueio de sítios inespecíficos de ligação.
Após a pré-incubação, os cortes foram incubados em solução contendo anticorpo
primário anti-tirosina-hidroxilase feito em camundongo (1:2000; ImmunoStar, Inc.,
Hudson, WI, EUA) e soro normal de cavalo (2% em IB; Vector Laboratories, Inc.,
Burlingame, CA, EUA), por 18 a 24 horas. No dia seguinte, os cortes foram
novamente lavados em tampão PBS 0,01 M e incubados em solução contendo
anticorpo secundário biotinilado anti-IgG de camundongo obtido em cavalo (1:500;
12
Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EUA) e soro normal de cavalo (1% em IB)
por 18 a 24 horas. Posteriormente, os cortes foram lavados em PBS 0,01 M e
incubados em solução contendo o conjugado avidina-biotina-peroxidase (1:200; ABC
kit standard; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EUA) por 4 horas. Por fim, os
cortes foram incubados com solução contendo Diaminobenzidina (DAB) e peróxido
de hidrogênio (peroxidase substrate kit DAB; Vector Laboratories, Inc., Burlingame,
CA, EUA). A reação foi interrompida após 2 minutos por meio de lavagens
sucessivas em tampão PBS 0,01M e os cortes montados em lâminas de vidro e
posteriormente recobertos com lamínulas.
3.8 CONTAGEM NEURONAL
Os neurônios marcados para TH foram contados em cada quarta seção do
bulbo (40 de cada 160 µm). Todas as células nas quais foi possível identificar o
corpo celular e pelo menos uma de suas ramificações (dendrito ou axônio) na
medula ventrolateral (VLM; grupamentos de neurônios A1/C1) e no NTS
(grupamentos de neurônios A2/C2), foram contadas bilateralmente para quantificar a
extensão da lesão induzida por saporina-anti-DβH nos grupamentos A1 e A2. Os
neurônios foram contados em aumento de duzentas vezes (200X) utilizando um
microscópio óptico (Leica DM500, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha) acoplado
a um sistema digital de aquisição de imagens (Leica Application Suite, V.3.10, Leica
Microsystems, Wetzlar, Alemanha).
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism
(v 6.01; GraphPad Software, Inc. San Diego, California, USA). Os valores foram
expressos como média ± erro padrão da média (EPM). Os valores basais foram
comparados utilizando teste t Student não pareado. As variações na PAM, FC, FSR,
FSA, CVR, CVA e ANSR induzidas por infusão de SH em ratos hemorrágicos foram
analisadas usando análise de variância de duas vias (ANOVA two way) seguido pelo
pós-teste de Bonferroni. A contagem celular foi comparada por análise de variância
de uma via (ANOVA one way) seguido pelo pós-teste de Bonferroni. Valor de p <0,05
foi considerado para denotar diferença significativa.
13
4 RESULTADOS
4.1 EFEITO DA LESÃO DO GRUPO NORADRENÉRGICO A2 E DA
LESÃO CONJUNTA DOS GRUPAMENTOS A1 E A2 NOS AJUSTES
CARDIOVASCULARES INDUZIDOS PELA SOBRECARCA DE SÓDIO APÓS
HEMORRAGIA HIPOVOLÊMICA
4.1.1 Avaliação da lesão dos neurônios catecolaminérgicos bulbares
induzida pela nanoinjeção de saporina-anti-DβH na região do NTS
A análise qualitativa evidenciou que a nanoinjeção de saporina-anti-DβH na
região NTS promoveu diminuição dos neurônios TH-positivos localizados nessa
região (figura 2). Após a confirmação qualitativa da lesão catecolaminérgica foi
realizada a quantificação desta lesão, para isto, todas as células que tiveram
marcação positiva para TH encontradas na região VLM e no NTS, regiões
compreendidas entre 1.900 μm caudal e 1.900 μm rostral ao óbex (Atlas de Paxinos
& Watson, 1998) foram contadas (figura 3).
Os animais que receberam nanoinjeções de saporina na região NTS (grupo
controle; n=6) apresentaram em média 30 células por seção na região compreendida
entre o óbex e 1900μm caudal ao óbex, a qual abrange o grupamento neuronal A2
(figura 3). Também foi observado o número de neurônios catecolaminérgicos C2
localizados na região que compreende 1900μm rostral ao óbex (grupamento C2), o
número de células TH-positivas por corte foi em média 20 células (figura 3). Em
relação ao VLM, foi evidenciado que na região que compreende 1900μm caudal e
1900 μm rostral ao óbex, o número de células TH-positivas por corte foi em média
de 36 células (figura 3).
Nos animais que receberam nanoinjeções de saporina-anti-DβH no NTS
(grupo lesão A2; n=8), foi evidenciado redução no número de células para, em
média, 10 células por secção, em relação ao grupo controle. Assim, a redução
percentual do número de neurônios A2 no grupo experimental foi de
aproximadamente 66% em comparação ao grupo controle (figura 2 e 3). A análise
dos neurônios catecolaminérgicos C2 evidenciou que as nanoinjeções de saporina-
anti-DβH no NTS não promoveram alterações significativas no número de células
TH-positivas nesta região (18 células por corte). Na região VLM, localizada entre
1900μm rostral e 1900μm caudal ao óbex, região que abrange o grupamento
neuronal A1 e C1, não foram observadas mudanças significativas no número de
14
células ( 26 e 42, respectivamente) TH-positivas por corte (figura 2).
Figura 2. Fotomicrografia representativa dos cortes coronais do bulbo (40μm)
marcados pela técnica de imunoistoquímica. As setas indicam a marcação dos
neurônios tirosina hidroxilase (TH) positivos no núcleo do trato solitário (NTS –
grupamento neuronal A2), na região caudoventrolateral do bulbo (CVLM –
grupamento neuronal A1) e rostroventrolateral do bulbo (RVLM – grupamento
neuronal C1) dos animais que receberam nanoinjeções de saporina (controle A2) ou
saporina-anti-DβH (lesão A2) no NTS.
15
Figura 3. Quantificação de células tirosina hidroxilase (TH) positivas nas regiões
bulbares. Média ± erro padrão da média (E.P.M) do número de células TH positivas
localizadas no núcleo do trato solitário (NTS – grupamentos neuronais A2 e C2) e na
região ventrolateral do bulbo (VLM – grupamento neuronal A1 e C1) dos animais que
receberam nanoinjeções de saporina (Grupo controle A2) ou de saporina-anti-DβH
(Grupo lesão A2) na região NTS. † Diferente do controle; p < 0,05.
16
4.1.2 Ajustes cardiovasculares induzidos pela infusão de salina
hipertônica após a indução de hemorragia hipovolêmica em animais com
lesão ou não do grupamento A2
Os valores basais médios de pressão arterial média (PAM), frequência
cardíaca (FC), fluxo sanguíneo renal (FSR), fluxo sanguíneo aórtico (FSA),
condutância vascular renal (CVR) e condutância vascular aórtica (CVA) foram
similares entre os animais que receberam nanoinjeções de saporina (grupo controle
A2; n-6) ou saporina-anti-DβH (grupo lesão de A2; n=8) no NTS e estão expressos
na Tabela 1. Durante a HH, o volume de sangue retirado foi semelhante entre os
grupos (controle A2: 4,1 ± 0,3 ml e lesão A2: 4,3 ± 0,5 ml).
Tabela1. Valores basais de pressão arterial média (PAM), frequência cardíaca (FC),
fluxo sanguíneo renal (FSR), fluxo sanguíneo aórtico (FSA), condutância vascular
renal (CVR) e condutância vascular aórtica (CVA) dos ratos controle e com lesão do
grupamento A2
Grupo N PAM
(mmHg)
FC
(bpm)
FSR
(ml/min)
FSA
(ml/min)
CVR
ml/(min*mmHg)
CVA
ml/(min*mmHg)
Controle A2 6 108,7 ± 5,4 394,6 ± 12,4 4,0 ± 0,8 52,3 ± 9,7 0,03 ± 0,012 0,48 ± 0,15
Lesão A2 8 108,3 ± 1,9 403,8 ± 12,7 3,2 ± 0,4 50,8 ± 4,0 0,03 ± 0,006 0,46 ± 0,06
Valores são expressos como média ± erro padrão da media (E.P.M); N: número de
animais.
A HH reduziu a PAM em ratos controle (108,7 ± 5,4 mmHg para 60,0 ± 0,6
mmHg; 20 min após a HH; p<0,05; figura 4A e 5A) e com lesão de A2 de (108,3 ±
1,9 mmHg para 60,0 ± 0,6 mmHg; 20 min após a HH; p<0,05; figura 4B e 5A). A PAM
retornou aos valores basais imediatamente após a infusão de SH em ambos os
grupos (controle A2: 106,5 ± 4,6 mmHg vs. Lesão A2: 106,1 ± 2,7 mmHg, 10 min
após SH) e manteve-se em níveis normais até o final do período experimental
(controle A2: 109,4 ± 3,7 mmHg vs. lesão A2: 108,6 ± 5,1 mmHg, 60 min após a
infusão de SH; Figura 4 e 5A).
A FC reduziu significativamente durante a HH nos animais controle (394,6 ±
12,4 bpm para 340,6 ± 18,4; 20 min após a HH) e lesão A2 (403,8 ± 12,7 bpm para
17
330,1 ± 17,9 bpm; 20 min após a HH). 10 min após a sobrecarga de sódio, a FC
retornou aos níveis basais tanto no grupo controle (406,0 ± 10,6 bpm; figura 4A e 5B)
como no lesado (368.8.1 ± 17,9 bpm; figura 4B e 5B).
Foi observado redução no FSR em ratos controle (∆: -45,7 ± 9,9%; figura 3A e
4C) e com lesão de A2 (∆: -53,4 ± 11,5%; figura 4B e 5C) promovido pela HH. Após a
infusão de SH, o FSR retornou aos valores basais em ambos os grupos (controle A2:
-8,3 ± 12,8%; lesão A2: 12,1 ± 11,0%; 10 min após infusão de SH; figura 4 e 5C). Em
ambos os grupos não foram encontradas alterações da CVR tanto após a HH
(controle A2: ∆ 3,0 ± 22,3%; lesão A2: ∆ -23,5 ± 16,6%; 20 min após a HH) como
após a infusão de SH (controle A2: 2,3 ± 18,8; lesão A2: 7,3 ± 8,3%; 10 min após a
infusão de SH; figura 5D).
A HH reduziu significativamente o FSA nos animais controle (∆: -49,9 ± 5,4%,
20 min após a hemorragia; p<0,05; figura 4A e 5E) e nos animais submetidos à lesão
do grupamento neuronal A2 (∆: -47,8 ± 6,7%, 20 min após a hemorragia; p<0,05;
Figura 4B e 5E). A infusão de SH promoveu imediata restauração do FSA aos níveis
basais no grupo controle A2 (∆: -23,5 ± 5,4%; 10 min após a infusão de SH; figura 4A
e 5E) e lesão A2 (∆: -6,2 ± 5,7%; 10 min após a infusão de SH; figura 4B e 5E).
Entretanto, a HH não foi capaz de alterar a CVA em ambos os grupos (controle A2:
∆: -11,1 ± 6,6%; lesão A2: ∆: -7,8 ± 11,6%; 20 min após a hemorragia; figura 5F). A
infusão de SH não alterou a CVA de ambos os grupos (controle A2: ∆: -22,7 ± 5,2%;
lesão A2: ∆: 4,1 ± 7,5%; 10 min após a infusão de SH; figura 5F).
18
Figura 4. Registro das variações de pressão arterial pulsátil (PAP), fluxo sanguíneo
renal (FSR), fluxo sanguíneo aórtico (FSA) e frequência cardíaca (FC) induzidas pela
sobrecarga de sódio em um animal que recebeu nanoinjeção de saporina na região
do núcleo do trato solitário (controle A2; A) e um animal que recebeu nanoinjeção de
saporina-anti-DβH (lesão A2; B) após a hemorragia hipovolêmica. Estão
apresentados os traçados representativos do período basal, dos tempos 10 e 20 min
de hemorragia destacados pelo quadro tracejado e dos tempos 30 e 60 min após a
infusão de salina hipertônica 3M.
19
Figura 5. Efeitos da lesão do grupamento neuronal A2 sobre a pressão arterial
média (PAM; A), frequência cardíaca (FC; B), fluxo sanguíneo renal (FSR; C),
condutância vascular renal (CVR; D), fluxo sanguíneo aórtico (FSA; E) e condutância
vascular aórtica (CVA; F) em animais com hemorragia hipovolêmica submetidos a
infusão de salina hipertônica. *Diferente do tempo 0; p <0.05. A barra preta
representa o período de hemorragia e a linha tracejada representa a infusão de
salina hipertônica 3M.
20
4.1.3 Avaliação da lesão dos neurônios catecolaminérgicos bulbares
induzida pela nanoinjeção de saporina-anti-DβH na região do NTS e
bilateralmente na região CVLM
A análise histológica qualitativa mostrou que a nanoinjeção de saporina-anti-
DβH na região NTS e que a nanoinjeção bilateral de saporina-anti-DβH na região
CVLM promoveu diminuição dos neurônios TH-positivos localizados nestas regiões
(grupamento noradrenérgico A2 e grupamento noradrenérgico A1 respectivamente;
figura 6). Após a confirmação qualitativa da lesão catecolaminérgica foi feita a
quantificação desta lesão, para isso todas as células que tiveram marcação positiva
para TH encontradas na região VLM e na superfície dorsal do bulbo (NTS) entre
aproximadamente 1900 µm caudal e 1900 µm rostral ao óbex foram contadas (figura
7).
Nos animais controles (n=7) foi evidenciado que na região onde estão
localizados os neurônios noradrenérgicos A2 (compreendida entre o óbex e 1800μm
caudal ao óbex), o número de células TH-positivas observado foi em média de 33
células por corte (figura 6). O número de neurônios noradrenérgicos C2 localizados
na região que compreende de 1900 μm rostral ao óbex foi em média 23 células TH-
positivas por corte. Em relação a região onde estão localizados os neurônios
noradrenérgicos A1 (entre 200 e 1900 μm caudal ao óbex), o número de células TH-
positivas observado foi em média de 31 células por corte (figura 7). Também foi
observado que o número de neurônios adrenérgicos C1 localizados entre 200 caudal
e 1900 μm rostral ao óbex foi em média de 42 células por corte (figura 7).
Nos animais submetidos à nanoinjeção de saporina-anti-DβH no NTS
concomitante a nanoinjeções bilaterais de saporina-anti-DβH no CVLM (n=6) foi
observado redução no número de neurônios TH-positivo. Na região do NTS onde
estão localizados os neurônios do grupamento A2, o número de neurônios TH-
positivos observado foi em média de 17 células por corte, o que representa uma
redução aproximada de 50% quando comparado ao grupo controle (figura 7). Em
relação aos neurônios A1, localizados na região CVLM, foi observado em média 14
células TH-positivas por corte, o que representa uma redução aproximada de 54%
do número de células TH-positivas em relação ao controle (figura 7). Na análise do
grupamento C2 localizado na superfície dorsal do bulbo foram quantificadas em
média 22 células por corte, mostrando não houve redução em relação ao controle.
Os neurônios adrenérgicos C1 não mostraram redução no número de células TH-
21
positivas observadas, foram contadas em média 40 células por corte (figura 7).
Sumarizando, estes resultados demonstram que a nanoinjeção de saporina-
anti-DβH na região NTS e na região CVLM promoveu redução das células TH-
positiva do grupamento A2 (≅ 50%) e grupamento A1 (≅ 54%). Não foram
observadas alterações significantes no número de células localizados no
grupamento C2 (≅ 1%) e no grupamento C1 (≅ 2%). Assim, atribuiremos os
resultados obtidos, principalmente, a lesão concomitante dos neurônios A1 e A2.
22
Figura 6. Fotomicrografia representativa dos cortes coronais do bulbo (40μm)
marcados pela técnica de imunoistoquímica. As setas indicam a marcação dos
neurônios tirosina hidroxilase (TH) positivos no núcleo do trato solitário (NTS –
grupamento neuronal A2), na região caudoventrolateral do bulbo (CVLM –
grupamento neuronal A1) e rostroventrolateral do bulbo (RVLM – grupamento
neuronal C1) dos animais que receberam nanoinjeções de saporina (controle
A1+A2) ou saporina-anti-DβH (lesão A1+A2) no NTS e bilateralmente na CVLM.
23
Figura 7. Quantificação de células tirosina hidroxilase positivas nas regiões
bulbares. Média ± erro padrão da média (E.P.M) do número de células TH positivas
localizadas no núcleo do trato solitário (NTS – grupamentos neuronais A2 e C2) e na
região ventrolateral do bulbo (VLM – grupamento neuronal A1 e C1) dos animais que
receberam nanoinjeções de saporina (grupo controle A1+A2) ou de saporina-anti-
DβH (grupo lesão A1+A2) na região NTS e bilateralmente no CVLM. † Diferente do
controle; p < 0,05.
24
4.1.4 Ajustes cardiovasculares induzidos pela infusão de salina
hipertônica após a indução de hemorragia hipovolêmica em animais com
lesão concomitante ou não dos grupamentos A1 e A2.
Os valores basais médios de pressão arterial média (PAM), frequência
cardíaca (FC), fluxo sanguíneo renal (FSR), fluxo sanguíneo aórtico (FSA),
condutância vascular renal (CVR) e condutância vascular aórtica (CVA) foram
similares entre os animais que receberam nanoinjeções de saporina (grupo controle
A1 + A2; n=7) ou saporina-anti-DβH (grupo lesão de A1 + A2; n=6) no NTS e
bilateralmente no CVLM e estão expressos na Tabela 2. Durante a HH, o volume de
sangue retirado foi semelhante entre os grupos (controle A1 + A2: 3,8 ± 0,4 mL vs
Lesão A1 + A2: 4,1 ± 0,4 mL).
Tabela 2. Valores basais de pressão arterial média (PAM), frequência cardíaca (FC),
fluxo sanguíneo renal (FSR), fluxo sanguíneo aórtico (FSA), condutância vascular
renal (CVR) e condutância vascular aórtica (CVA) dos ratos controle e com lesão do
grupamento A1 e A2.
Grupo N PAM
(mmHg)
FC
(bpm)
FSR
(ml/min)
FSA
(ml/min)
CVR
ml/(min*mmHg)
CVA
ml/ (min*mmHg)
Controle
A1+A2 7 104,7 ± 5,8 396,8 ± 19,5 3,3 ± 0,3 45,5 ± 7,2 0,03 ± 0,003 0,43 ± 0,06
Lesão
A1+A2 6 109,1 ± 7,9 413,6 ± 8,6 3,3 ± 0,5 43,4 ± 8,6 0,03 ± 0,006 0,40 ± 0,08
Valores são expressos como média ± erro padrão da media (E.P.M); N: número de
animais.
A HH induziu hipotensão em ratos controle A1+A2 (de: 104,7 ± 5,8 mmHg
para 61,4 ± 0,4 mmHg 20 min após HH) e lesão A1+A2 (de: 109,1 ± 7,9 mmHg para
60,7 ± 0,7 mmHg 20 min após HH; p<0,05; figura 8 e 9A). A infusão de SH foi capaz
de restaurar os valores de PAM nos animais controle ao valor basal (109, 15 ± 5,7
mmHg; 10 min após a infusão de SH), sendo estes valores mantido durante todo o
registro (104,9 ± 5,7 mmHg e 107,0 ± 3,3 mmHg; 30 e 60 min após a infusão de SH
respectivamente; figura 8A e 9A). No entanto, a SH não promoveu o
reestabelecimento os níveis de PAM nos animais com lesão dos grupamentos
noradrenérgicos A1 e A2 (64,2 ± 4,5 mmHg; p <0,05; 30 min após infusão de SH;
figura 8B e 9A). A PAM foi mantida em níveis hemorrágicos até o final dos
25
experimentos nos animais do grupo lesão A1+A2 (68,4 ± 4,2 mmHg; p <0,05; 60 min
após infusão de SH; figura 8B e 9A).
Na FC, a indução da HH promoveu redução desse parâmetro no grupo
controle A1 + A2 em relação ao basal (basal: 406,9 ± 18,2 bpm vs 336,8 ± 12,6 bpm;
p <0,05; 20 min depois de hemorragia; figura 8A - 9B). A FC retornou ao basal após
a infusão de SH, no grupo controle A1 + A2 (382,8 ± 17,7 bpm, 10 min após a
infusão de SH) e se manteve até o final do experimento (391, 20,0 bpm; 60 min após
a infusão de SH; figura 8A e 9B). A FC do grupo lesão A1+A2 não alterou de forma
significativa durante a HH (basal: 414,3 ± 7,7 bpm vs. 404,6 ± 7,4 bpm; 20 min após
a HH; figura 8A e 9B). A infusão de SH, também não alterou a FC do grupo lesão A1
+ A2 em relação ao basal (374,0 ± 10,6 bpm e 387,0 ± 13,0 bpm; 30 e 60 min após a
infusão de SH respectivamente; figura 8A e 9B).
A HH reduziu o FSR no grupo controle A1+A2 (∆: -45,9 ± 9,6% do basal, 20
min após a HH; p<0,05) e Lesão A1+A2 (∆: -40,8 ± 9,8% do basal, após 20 min de
HH; p<0,05; figura 7 e 8C). A infusão de SH restaurou o FSR aos níveis basais nos
animais controle (∆: -7,4 ± 15,2% do basal e -13,1 ± 16,8% do basal, 30 e 60 min
após a infusão de SH; figura 8A e 9C). No grupo submetido a lesão A1+A2, a infusão
de SH promoveu aumento transitório no FSR (∆: -21,7 ± 15,5% do basal e -38,4 ±
13,5% do basal, 30 e 60 min após a infusão de SH, figura 8B e 9C). A CVR não
alterou em ambos os grupos durante a HH (controle A1+A2: ∆: 4,7 ± 20,2%; lesão
A1+A2: ∆: 2,9 ± 16,7%; 20 min após a HH; figura 9D). A sobrecarga de sódio não
modificou a CVR nos animais controle A1+A2 (∆: 0,1 ± 12,1%; 10 min após infusão
de SH; figura 9D) e com lesão A1+A2 (∆: 29,4 ± 25,9%; 10 min após infusão de SH;
figura 9D).
Em relação ao FSA, houve redução desse parâmetro durante a HH nos
grupos controle A1+A2 (∆: -46,9 ± 10,5%) e lesão A1+A2 (∆: -52,4 ± 5,6%, 20 min
após hemorragia; p<0,05). A infusão de SH restaurou o FSA aos níveis basais no
grupo controle A1+A2 (∆: -9,0 ± 12,2%, 10 min após a infusão de SH; figura 8A e
9E). No grupo lesão A1+A2, a infusão de SH não restabeleceu o FSA (∆: -33,0 ±
7,8% do basal, 10 min após a infusão de SH; p<0,05; figura 8B e 9E). A CVA não foi
alterada em ambos os grupos durante a HH (controle A1+A2: ∆: -1,5 ± 16,3%; lesão
A1+A2: ∆: -18,6 ± 6,3%; 20 min após a hemorragia), assim como após a infusão de
SH (controle A1+A2: ∆: 2,0 ± 11,7%; lesão A1+A2: ∆: 9,5 ± 7,7%; 10 min após a
infusão de SH; Figura 9F).
26
Figura 8. Registro das variações de pressão arterial pulsátil (PAP), fluxo sanguíneo
renal (FSR), fluxo sanguíneo aórtico (FSA) e frequência cardíaca (FC) induzidas pela
sobrecarga de sódio em um animal que recebeu nanoinjeções de saporina (controle
A1+A2; A) e um animal que recebeu saporina-anti-DβH (lesão A1+A2; B) na região
do NTS e bilateralmente na CVLM após a hemorragia hipovolêmica. Estão
apresentados os traçados representativos do período basal, dos tempos 10 e 20
minutos de hemorragia destacados pelo quadro tracejado e dos tempos 30 e 60
minutos após a infusão de salina hipertônica 3M.
27
Figura 9. Média ± EPM da pressão arterial média (PAM; A), frequência cardíaca (FC;
B), fluxo sanguíneo renal (FSR; C), condutância vascular renal (CVR; D), fluxo
sanguíneo aórtico (FSA; E) e condutância vascular aórtica (CVA; F) em resposta a
sobrecarga de sódio após HH em animais submetidos a nanoinjeção de saporina
(grupo controle A1+A2) ou de saporina-anti-DβH (grupo lesão A1+A2) na região NTS
e bilateralmente no CVLM. *Diferente do tempo 0; † Diferente do grupo controle; p
<0.05. A barra preta representa o período de hemorragia hipovolêmica e a linha
tracejada representa a infusão de salina hipertônica 3M.
28
5 DISCUSSÃO
Estudos prévios demonstram que os grupamentos neuronais A1 e A2 estão
envolvidos na regulação dos fluidos corporais e nas respostas cardiovasculares e
autonômicas promovidas por infusão de SH em animais normovolêmicos
(16,25,47,56–58). Entretanto, em animais hipovolêmicos, a participação destes
neurônios ainda não havia sido avaliada. Assim, no presente estudo demonstramos
que: i) a HH promove diminuição da PAM e FC, não alterando a CVR e CVA nos
animais controle; ii) a infusão de SH após a HH reestabelece a PAM, FC e não
modifica a CVR e CVA nos animais controle; iii) a lesão específica do grupamento
A2 não altera os padrões de resposta cardiovascular obtida no grupo controle
durante a HH ou após a infusão de SH; iv) a lesão simultânea de A1 e A2 não altera
as respostas cardiovasculares induzidas pela HH, entretanto abole a recuperação
cardiovascular induzida pela infusão de SH em ratos submetidos a HH.
A avaliação da função dos componentes neurais em resposta à diferentes
estímulos, pode ser feita de diferentes maneiras, tais como lesões químicas e
eletrolíticas. Embora vários estudos anteriores tenham utilizado as lesões
eletrolíticas, essa técnica é controversa porque compromete não apenas a região
alvo, mas também todas as fibras neurais que passam por esta região. A lesão
química dos grupos neurais apresenta a vantagem de manter a preservação das
fibras de passagem, assegurando que a lesão é restrita aos neurônios da região
alvo (59–61).
Diversos estudos validam a lesão catecolaminérgica induzida pela
nanoinjeção central de saporina-anti- dopamina-β-hidroxilase (DβH) (37,47,48). O
complexo saporina-anti-DβH é constituído pela proteína saporina conjugada ao
anticorpo monoclonal contra a enzima DβH. A saporina é uma proteína de inativação
ribossomal capaz de bloquear a subunidade 60S inibindo, assim, a síntese de
proteínas, o que leva a perda de função e subsequente morte da célula (62). A DβH
é uma enzima da cascata de síntese das catecolaminas, responsável por promover
a hidroxilação da dopamina convertendo-a em noradrenalina. O possível mecanismo
para estas lesões locais é a internalização do complexo através dos corpos celulares
ou dos dendritos, uma vez que durante a exocitose somatodendrítica de neurônios
catecolaminérgicos, ocorre a exposição da enzima DβH. Desta forma, somente as
29
células que contém a enzima DβH podem absorver a toxina acoplada ao anticorpo,
ocasionando lesões específicas (62).
Resultados obtidos em estudos recentes utilizando saporina-anti-DβH na
CVLM mostraram uma redução de aproximadamente 79% e 81 % dos neurônios
noradrenérgicos desta região (37,56). Em outro trabalho, houve redução de cerca de
70% dos neurônios noradrenérgicos A2 por nanoinjeções de saporina-anti-DβH no
NTS (48). Nossos dados demonstram que as nanoinjeções de saporina-anti-DβH
provocaram uma redução de 68% dos neurônios A2 no grupo com lesão específica
desses neurônios, não afetando os demais grupamentos catecolaminérgicos
bulbares (grupos C2 e A1/C1), indicando a especificidade populacional da lesão.
Além disso, as nanoinjeções de saporina-anti-DβH nos grupamentos A1/A2
provocaram redução de 54% e 50% nessas regiões específicas. A porcentagem de
lesão obtida no presente trabalho foi menor do que a mostrada nos trabalhos
anteriores, no entanto estes resultados não deixam de mostrar a efetividade da
saporina-anti-DβH em lesionar células catecolaminérgicas localizadas no sítio de
nanoinjeção. Ademais já foi mostrado que a lesão de 62% de neurônios
noradrenérgicos é o suficiente para promover alterações de resposta por infusão de
SH (47).
Protocolos anteriores mostraram que a retirada de aproximadamente 15-25%
de volume sanguíneo total é o suficiente para promover um estado de hipotensão
que caracteriza a HH (49,63). Nosso protocolo foi similar ao descrito por Amaral, et
al (2014) (49), em que volume sanguíneo foi retirado até que a PAM atingisse
valores próximos a 60 mmHg. Já está bem estabelecido que a rápida perda de
volume que ocorre durante a hemorragia promove diminuição de retorno venoso e
FC, ocasionando a diminuição da PA (18,64). Ademais, estudos mostram que essa
hipotensão é, pelo menos em parte, devido a diminuição do débito cardíaco (65).
Entretanto, nosso estudo demonstra pela primeira vez na literatura que, a HH não
promove alterações na condutância vascular periférica nos leitos renal e aórtico.
Assim, podemos atribuir a queda da PA, em parte, à queda da FC. No entanto, não
podemos destacar vasoconstrição em outros leitos não avaliados em nosso estudo,
como o mesentérico, o que resultaria em aumento de pós-carga e consequente
diminuição do débito cardíaco observadas em outros estudos (8,65).
30
As respostas hemodinâmicas à infusão de SH já estão bem descritas na
literatura. Velasco et al., (1980)(8), mostraram que a administração de um pequeno
volume de SH é eficaz para a restauração da PA e o débito cardíaco em animais
hipovolêmicos. Ademais, diversos achados evidenciam o uso de SH como um
recurso efetivo no tratamento da HH (3,6–9,66). Vários estudos demonstram, ainda,
que a infusão de SH aumenta a pressão arterial e provoca vasodilatação renal e
alterações regionalmente distintas na atividade do nervo simpático (37,67–69).
Embora, a infusão de SH promova aumento da concentração plasmática de sódio
(49,70), ocasionando o aumento do volume plasmático, somente a expansão de
volume plasmático não é suficiente para explicar o reestabelecimento cardiovascular
ocasionado pela infusão de SH (4).
De fato, estudos evidenciam que ativação do SNC é fundamental para o
reestabelecimento das condições fisiológicas. Nesse sentido, estudos demonstram
que os aferentes aórticos e carotídeos, quiorreceptores e barorreceptores, estão
envolvidos na recuperação cardiovascular induzida por SH após a HH. Estudos do
nosso grupo de pesquisa demonstram que a desenervação não seletiva dos
barorreceptores abole a recuperação da PA induzida por SH em ratos submetidos a
hemorragia (10). Mais recentemente, também foi evidenciado que a inativação
específica dos quimiorreceptores carotídeos abole a recuperação da pressão arterial
por SH após a HH (18). Em conjunto estes resultados demostrando a relevância dos
aferentes neuronais periféricos nas respostas à infusão de SH em estado de
hipovolemia.
Estudos anteriores do nosso laboratório mostraram que a inibição
farmacológica do MnPO, utilizando muscimol, aboliu a recuperação da resposta
cardiovascular induzida pela infusão de SH em ratos submetidos a hemorragia (49).
Dentre as principais regiões que recebe informações dos sensores periféricos e
projetam-se para o MnPO, destacam-se os neurônios noradrenérgicos A1 e A2.
Ademais, estudos demostraram a importância dos grupamentos noradrenérgicos A1
e A2 na integração dos mecanismos envolvidos na função cardiovascular e na
transmissão de informações acerca das alterações da osmolaridade plasmática para
regiões hipotalâmicas (48,56,71–75). De fato, em animais normovolêmicos, a
importância dos grupamentos A1 na resposta à hiperosmolaridade já foi
demonstrada, uma vez que a lesão dessas regiões bulbares eliminou as respostas
31
cardiovasculares e autonômicas por sobrecarga aguda de sódio (47,48). A lesão
específica do grupamento noradrenérgico A1 atenua a vasodilatação renal e a
excreção de sódio induzidas por hipernatremia aguda (37,56). Ademais, a lesão
destes neurônios abole a simpatoinibição renal induzida por SH (47).
A importância do grupamento A2 foi demonstrada durante a hemorragia
(73,76,77). Estudos demonstraram que as respostas hemorrágicas foram
modificadas em animais submetidos à lesão do grupo A2 (73). Além disso, estudos
sugerem que a hemorragia hipotensiva induz a ativação de células neuroendócrinas
mediada por células noradrenérgicas A1 (76). Entretanto, a participação dos
neurônios A1 e A2 na recuperação da PAM induzida por infusão de SH ainda não
havia sido demonstrada. No presente estudo, demonstramos que a lesão simultânea
de A1 e A2 impediu a recuperação da PAM. Assim, pela primeira vez na literatura,
mostramos que a lesão do grupamento noradrenérgico A1 e A2 impede a
recuperação da PAM por infusão de SH após a HH. Estes resultados confirmam a
presença de um componente neuronal na regulação dessa resposta. Desse modo,
podemos sugerir que a integridade da via que conecta os aferentes periféricos
(barorreceptores e quimiorreceptores) ao MnPO, através das projeções dos
neurônios A1 e A2, é fundamental para o reestabelecimento da PAM induzida por
infusão de SH em ratos hemorrágicos.
Por outro lado, a lesão específica dos neurônios A2 não impediu a
recuperação da PAM por infusão de SH após a HH. Mais recentemente, estudos do
nosso laboratório mostraram que a lesão do grupamento A1, não abole a
recuperação dos parâmetros cardiovasculares por infusão de SH após a HH. Esses
resultados poderiam ser justificados devido à baixa porcentagem de lesão
alcançada. De fato, estudos mostram que são necessárias lesões acima de 90% dos
neurônios da substância negra para promover uma lesão com resposta semelhante
a doença de Parkinson (78,79). No entanto, já foi demonstrado que a lesão de 62%
do grupamento noradrenérgico A1 por nanoinjeção de saporina-anti-DβH promove
abolição da resposta simpática à infusão de SH (47). Podem ocorrer, também,
mecanismos de up regulation dos receptores α-adrenérgicos presentes nos
neurônios do MnPO, uma vez que já foi sugerido que a região A1 atuam
aumentando a atividade dos neurônios do MnPO por ativação dos receptores α-
adrenérgicos (55) e que a integridade da neurotransmissão adrenérgica no MnPO é
32
essencial para a vasodilatação renal que se segue a aumentos agudos da
concentração sanguínea de sódio (46). Desse modo, quando se promove a redução
de pequena porcentagem dos neurônios A1 ou A2 poderia ocorrer o aumento na
quantidade desses receptores para que a reposta a fosse suprida. De fato, estudos
mostram que outros receptores do MnPO são regulados, como os receptores de
angiotensina II que são regulados pelo estradiol e progesterona em ratos
ovariectomizados (80).
Não podemos descartar ainda que o SNC trabalha em paralelo com outras
vias (hormonais, por exemplo) e que vias do próprio SNC atuam em paralelo. Esses
achados corroboram com estudos de Moreira et al., (2009) (61), em que lesões
eletrolíticas no NTS comissural e na região anteroventral do terceiro ventrículo
(AV3V) foram utilizadas para avaliar as respostas de PAM e FC em ratos
espontaneamente hipertensos (SHR). As lesões no NTS comissural promoveram
uma diminuição aguda da PAM enquanto as lesões na região AV3V não
promoveram grandes alterações deste parâmetro. Entretanto, quando da lesão
combinada dessas duas regiões, a PAM de animais SHR foi reduzida cronicamente,
sugerindo que, na ausência do NTS comissural, a região AV3V contribui para a
hipertensão observada em SHR. Ademais, outros estudos apoiam a hipótese de que
um componente neural pode fornecer uma resposta específica se um outro
componente está prejudicado (81,82).
Neste contexto, a hipótese de que as lesões associadas de CVLM (neurônios
A1) e NTS (neurônios A2) causam a perda total destas respostas compensatórias
torna-se válida. Para testar este modelo conceitual, no presente estudo realizamos
lesão associada de neurônios A1 e A2 e mostramos que a lesão combinada dos
neurônios abole esse possível mecanismo compensatório. Considerando ainda que
os neurônios A1 e A2 possuem a mesma origem embriológica (50–53), projeções
similares para o MnPO e PVN (54,55), comportando-se de modo semelhante frente
a estímulos hiperosmóticos (47,48,56), podemos considerar esses grupamentos
como vias paralelas de ação. Desse modo, a perda de parte da via A1-MnPO/PVN
pode ser suprida pela via A2-MnPO/PVN e vice-versa. Assim, apenas quando as
duas vias são lesionadas, não se observa a recuperação cardiovascular induzida por
HS em ratos submetidos à HH.
33
6 CONCLUSÃO
Os resultados obtidos no presente estudo demonstram que a lesão específica
do grupamento noradrenérgico A2 não altera as respostas cardiovasculares em
resposta à solução de salina hipertônica após hemorragia hipovolêmica e que a
lesão combinada dos grupamentos A1 e A2 é capaz de suprimir a restauração da
pressão arterial média em resposta à solução de salina hipertônica após hemorragia
hipovolêmica.
34
7 REFERÊNCIAS
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8 ANEXO
Parecer consubstanciado da CEUA/UFG
43