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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO CÂMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP
INSTITUTO DE CIÊNCIAS NATURAIS, HUMANAS E SOCIAIS Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais - PPGCAM
AVALIAÇÃO CITOTÓXICA, METABÓLICA E GENOTÓXICA EM RATOS WISTAR TRATADOS COM Morinda citrifolia, L.
JULIANA DE BRAZIL RIFFEL
Sinop - Mato Grosso Fevereiro /2017
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JULIANA DE BRAZIL RIFFEL
AVALIAÇÃO CITOTÓXICA, METABÓLICA E GENOTÓXICA EM RATOS WISTAR TRATADOS COM Morinda citrifolia, L.
Prof. Dr. Kleber Eduardo de Campos Prof(a). Dra. Marina Mariko Sugui
Defesa de dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais da Universidade Federal de Mato Grosso, Câmpus Universitário de Sinop, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciências Ambientais. Área de concentração: Bioprospecção.
Sinop - Mato Grosso
Fevereiro/2017
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Ficha Catalográfica
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Palavras-chave:
Sinopse:
Avaliaram-se efeitos citotóxicos, parâmetros metabólicos e atividade
genotóxica de ratos Wistar tratados a polpa de noni (Morinda citrifolia L).
Palavras-chave:
Metabolismo, genotoxicidade, Morinda citrifolia, rato.
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DEDICATÓRIA
DEDICO essa conquista a Deus o grande responsável por minha trajetória até aqui e a minha família que sempre esteve ao meu lado dando-me forças para que eu concluísse essa etapa da minha vida.
6
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, pela força е coragem durante toda esta
caminhada.
A minha família, obrigada pelo amor incondicional e suporte nos momentos em
que mais precisei de força. Aos meus pais Lucio e Neide e ao meu irmão Victor, minha
estrutura. A minha avó, Vilma, por suas palavras carinhosas e de otimismo. Ao meu noivo,
João Elisandro, pelo amor e companheirismo nos momentos de alegrias e dificuldades.
Ao meu Orientador Dr. Kleber Eduardo Campos e Co-orientadora Dra Marina
Mariko Sugui, agradeço ao apoio, paciência e a competência com que me auxiliaram.
À equipe do Laboratório de Fisiologia dos Sistemas e Toxicologia Reprodutiva
(FISIOTOX/UFMT) pela hospitalidade durante o período de realização do experimento.
À equipe do Laboratório LIPEQ/UFMT e ao CAIC/UFMT pelo auxílio e espaço
cedido para realização de alguns procedimentos experimentais.
Ao laboratorio Nossa Senhora de Fátima, que comprendeu a minha ausência por
diversos momentos.
A todos os meus amigos que acompanharam a minha caminhada, torcendo por
meu sucesso.
Aos demais docentes que tive ao longo deste período: O meu agradecimento.
A Universidade Federal de Mato Grosso e ao programa de Pós-graduação em
Ciências Ambientais, Câmpus de Sinop, pela oportunidade e por todo o conhecimento
adquirido durante esse período.
Enfim, a todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram para
realização deste trabalho.
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EPÍGRAFE
“Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível”.
Charles Chaplin
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RESUMO GERAL
Morinda citrifolia L., conhecido como noni, é muito utilizado na medicina popular para diversos fins. Todavia, ainda são muito controversos os efeitos biológicos apresentados pela polpa. Desta forma, este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos citotóxicos, metabólicos e genotóxicos em ratos Wistar tratados com Morinda citrifolia L. Os frutos foram colhidos durante a primavera e a polpa foi obtida, sem sementes. Para a realização do teste de citotoxicidade de atividade hemolítica foi coletado, aleatoriamente, 1 mL de sangue total de rato e procedidas diluições seriadas com concentrações decrescentes do extrato, iniciando com 100 mg/mL e finalizando com 0,01953 mg/mL. Para as análises metabólicas e genotóxicas foram utilizados grupos experimentais de ratos machos (n=7 cada grupo). O período de tratamento foi de 15 dias consecutivos em que os grupos controle receberam via oral 3mL de água filtrada e os tratados receberam polpa de Morinda citrifolia (243 mg/dia/rato). Semanalmente foi mensurado o peso corpóreo, consumo alimentar, ingesta energética e glicemia, e no 14º dia, foi realizado o teste oral de tolerância à glicose (TOTG). No 15º dia os ratos receberam via intraperitoneal solução salina (NaCl 0,9%) ou ciclofosfamida (CPA 25 mg/Kg) conforme o grupo de tratamento. No 16º dia foi estimado o ganho de peso corpóreo, bem como a coleta de sangue para mensurações bioquímicas e coleta de células da medula óssea para realização do teste do micronúcleo. Os resultados mostram atividade citotóxica do extrato na maioria das diluições seriadas. Em relação aos parâmetros metabólicos, não houve efeitos negativos, apresentando, ainda, uma ação hipoglicemiante. Na análise genotóxica, foi observado um comportamento bifásico da polpa, que exerceu tanta atividade mutagênica como também antimutagênica. Portanto, pode-se concluir que o tratamento com Morinda citrifolia ainda é controverso, não sendo recomendado livremente para uso da população. PALAVRAS-CHAVE: Metabolismo, genotoxicidade, Morinda citrifolia, rato.
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ABSTRACT
Morinda citrifolia L., as known as noni, is widely used in alternative medicine for various purposes. However, the biological effects of its pulp are still very controversial. Therefore, the objective of this study was to evaluate cytotoxic, metabolic and genotoxic effects, in rats treated with Morinda citrifolia L. The fruits were harvested in the spring period, and the pulp was obtained without seeds. To perform the cytotoxicity test of hemolytic activity, 1 mL of rat whole blood was randomly collected and serial dilutions were performed with decreasing concentrations of the extract, starting with 100 mg/mL and ending with 0.01953 mg/mL. For the metabolic and genotoxic analyzes, experimental groups of male rats were used (n=7 each group). The treatment period was 15 consecutive days, and control groups orally received 3.0 mL of tap water and treated groups received mL of Morinda citrifolia pulp (243 mg/day/rat). Weekly, body weight, food intake, energy intake and blood glucose were measured and on the 14th day, the oral glucose tolerance test (OGTT). On the 15th day, the rats received intraperitoneal saline solution (NaCl 0.9%) or cyclophosphamide (CPA 25mg/Kg) according to the treatment group. On the 16th day, body weight gain was estimated, as well as blood collection for biochemical measurements and collection of bone marrow cells for the micronucleus test. The results show cytotoxic activity of the extract in most serial dilutions. Regarding the metabolic parameters, there was no negative effect on the animals' organisms, also presenting a hypoglycemic action. For genotoxic analysis, a biphasic behavior of the pulp was observed, which exerted both mutagenic and antimutagenic activity. Thus, it can be concluded that the treatment with Morinda citrifolia L. is still controversial, not being recommended freely for use by the population.
KEYWORDS: Metabolism, genotoxicity, Morinda citrifolia, rat.
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................. 11
2. OBJETIVO..................................................................................................... 22
3. CAPÍTULO I ................................................................................................. 23
4. CONCLUSÃO GERAL .................................................................................. 52
5. ANEXOS........................................................................................................ 53
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1. INTRODUÇÃO GERAL
O estilo de vida moderno tem contribuído para o aumento de hábitos
comportamentais inadequados, com destaque para dietas alimentares não
saudáveis, alta ingesta de sódio, consumo de álcool, tabagismo e sedentarismo, os
quais tem sido um grave problema mundial, devido a propiciarem aumento na
prevalência de doenças de natureza crônica. Conforme dados da Organização
Mundial da Saúde, as doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) levaram a mais
mortes do que todas as outras causas juntas em todo o mundo, sendo que as
doenças cardiovasculares, câncer, doenças respiratórias crônicas e Diabetes
mellitus são as principais, representando 82% dos óbitos. Para o ano de 2030,
estima-se um total de 52 milhões de mortes (Who, 2014).
Desta forma, os fatores que o ser humano está exposto podem contribuir para
o surgimento de diversas modificações no organismo, sendo que reações anormais
envolvendo rotas metabólicas (especialmente relacionado com proteínas,
carboidratos e lipídios), podem provocar alterações biológicas que implicam em
simples acúmulo/escassez de substâncias ou em até sérios efeitos colaterais,
incluindo alterações no núcleo e na morfofunção do ácido desoxirribonucléico (DNA).
Assim, o tratamento com plantas medicinais pode auxiliar o organismo a prevenir
e/ou normalizar as funções celulares já prejudicadas (Mayes & Bender, 2003; Novelli
2005; França et al. 2008).
Além disso, o desenvolvimento do câncer é um processo complexo que
abrange o acúmulo de mutações, acarretando desregulações nos ciclos celulares
(Bild et al. 2006; Liu et al. 2016). Os fatores nutricionais têm impacto significativo na
incidência do câncer (Gonzalez & Riboli, 2010) como também nas doenças
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cardiovasculares (Reddy & Katan, 2004) e metabólicas (Feldeisen & Tucker, 2007).
As frutas e vegetais, por exemplo, podem auxiliar na prevenção de tumores (Vainio
& Weiderpass, 2006), sendo que alguns estudos já mostraram efeitos positivos na
redução do câncer de pulmão (Smith-Warner et al. 2003), gástrico (Fang et al. 2015)
e colorretal (Terry et al. 2001); além de diminuir o risco de diversas outras doenças e
contribuir com o controle de peso (Ledoux et al. 2010).
A inclusão de tais alimentos na dieta diária já é documentada como muito
importante devido à presença de diversos compostos bioativos, com propriedades
ditas quimiopreventivas (Pistollato et al. 2015), isto é, compostos naturais e/ou
sintéticos que possuem a capacidade de inibir a carcinogênese por mecanismos
moleculares variados (Landis-Piwowar & Lyer 2014), como também outras doenças
incluindo as cardiovasculares (Vasanthi et al. 2012).
Neste contexto, o meio ambiente apresenta um papel muito importante, pois
há centenas de anos o homem busca a obtenção de substâncias com propriedades
terapêuticas na biodiversidade (Pimentel et al. 2015). A prova disso situa-se no fato
de que mais de 50% de todas das drogas terapêuticas presentes no mercado
derivam de produtos de origem natural (Gurib-Fakim, 2006). Em relação aos
fármacos anticancerígenos, mais de dois terços são de origem natural (Efferth,
2010), como por exemplo, a vinca (Catharanthus roseus, L.) e também espécies do
gênero Podophyllum (Brandão et al. 2010; Efferth, 2010).
Atualmente, estudos já demonstraram efeitos tóxicos importantes a partir de
extratos vegetais, como a atividade mutagênica do chá de carqueja (Pinho, et al.
2009); toxicidade hepática, embrionária, neurológica, renal e imunológica de
algumas espécies de plantas (Rodrigues et al. 2011; Kristanc & Kreft, 2016) Com
isso, são também realizados estudos para a investigação dos efeitos metabólicos de
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plantas (You et al. 2014; Mestry et al. 2016; Akinyemi et al. 2016), análise genotóxica
(Goncalves et al. 2012; Hernandes et al. 2014 e Mendonça et al. 2016) e também
outros estudos avaliando a citotoxicidade de plantas através do teste de hemólise
(Mulky & Gandhi 1977; Gandhi & Cherian 2000).
A área de estudo da genotoxicidade avalia a capacidade que determinados
compostos apresentam em afetar a estrutura do DNA (Słoczyńska et al. 2014), por
meio de diversos testes, que são capazes de identificar indução de mutação, efeitos
clastogênicos e aneugênicos e anormalidades cromossômicas estruturais
(Sponchiado et al. 2016). O teste do Micronúcleo é um dos testes de
mutagenicidade muito utilizado para detectar potencial genotóxico de agentes
químicos e físicos estabelecendo assim seu risco ao homem (Ribeiro et al. 2003). O
teste de hemólise, por sua vez, é muito empregado para verificação da toxicidade de
extratos vegetais, em que se observa a capacidade destes compostos em produzir a
lise de eritrócitos (Pequeno & Soto-Blanco, 2006).
Neste contexto, Morinda citrifolia L. é uma das plantas que tem sido objeto de
estudos, apresentando alguns resultados controversos quanto aos seus efeitos e
toxicidade, exigindo mais investigações nesse sentido. É um pequeno arbusto,
conhecido popularmente como noni, pertencente à família Rubiaceae, nativo do
Sudeste Asiático e Austrália, sendo amplamente cultivado na Polinésia, Índia,
Caribe, América Central, Norte e Sul. Os polinésios utilizam o noni há mais de 2000
anos para fins medicinais. Além disso, todas as partes da planta podem ser
utilizadas como frutos, folhas, raízes, flores e cascas. O fruto é a parte mais
utilizada, como estimulante do sistema imunológico, antibacteriano, antiviral,
antiparasitário, antifúngico, antitumoral, anti-inflamatório, dentre outras patologias
(Chan-Blanco et al. 2006).
14
No Brasil, o cultivo de Morinda citrifolia L. é recente, sendo introduzido no país
por pessoas que trouxeram sementes oriundas do Caribe e Polinésia (Sousa, 2010).
Entretanto, conforme o Informe Técnico nº. 25, de 29 de maio de 2007, da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), não são permitidos a comercialização de
produtos contendo Morinda citrifolia L. no Brasil, até que seja comprovada a
segurança de seu uso (Brasil, 2007). O controle realizado pela ANVISA é de extrema
importância, visto que o consumo indiscriminado de plantas medicinais representa
um grande risco à saúde humana, principalmente, pelo fato de que grande parte da
população faz uso acreditando que por ser de origem natural não haverá
complicações (Veiga Junior et al. 2005). Morinda citrifolia L, por exemplo, em
estudos já realizados foram apresentados efeitos hepatóxicos (Mrljak et al. 2013;
Stadlbauer et al. 2005; West et al. 2009; Yu et al. 2011).
Desta forma, tendo em vista o grande consumo pela população de
preparações contendo o fruto de Morinda citrifolia L., e poucos estudos voltados
para análise de parâmetros que confirmem a segurança de seu uso, o presente
estudo teve como objetivo avaliar a atividade citotóxica do extrato da polpa por meio
do teste de hemólise; verificar efeitos no metabolismo de proteínas, carboidratos e
lipídios; e também analisar o potencial mutagênico e antimutagênico por meio do
teste do micronúcleo em células de medula óssea, após tratamento com extrato da
polpa do fruto de Morinda citrifolia, em ratos machos Wistar.
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22
2. OBJETIVO
Objetivo Geral:
Avaliar os efeitos citotóxico, metabólico e genotóxico em ratos machos Wistar
após o tratamento com extrato aquoso da polpa de noni (Morinda citrifolia, L.).
Objetivos específicos:
Avaliar os efeitos do extrato aquoso de polpa de noni (Morinda citrifolia, L.) em
ratos Wistar quanto à (ao):
Parâmetros Citotóxicos: Teste de hemólise;
Parâmetros Antropométricos e Nutricionais:
- Peso corpóreo e ganho de massa corpórea;
- Consumo alimentar e ingesta energética;
Parâmetros Genotóxicos: Teste do micronúcleo (MN) na medula óssea;
Parâmetros Bioquímicos Séricos:
Análise proteica: proteínas totais, globulina, albumina, creatinina e ureia;
Análise de carboidratos: glicemia semanal, teste oral de tolerância a glicose
(TOTG) e área sob a curva glicêmica;
Análise de lipídios: colesterol total, triglicerídeos, lipoproteínas de densidade
alta (HDL), densidade baixa (LDL) e densidade muito baixa (VLDL), todos em
mg/dL;
Análise das transaminases hepáticas: alanina aminotransferase (ALT) e
aspartato aminotransferase (AST).
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3. CAPÍTULO I- ARTIGO
Avaliação citotóxica, metabólica e genotóxica em ratos tratados
com polpa de noni (Morinda citrifolia, L.)
Riffel, Juliana B.1; Sugui, Marina M.1; Campos, Kleber E.1*
1instituto de Ciências Naturais, Humanas e Sociais, Programa de Pós-graduação em
Ciências Ambientais-PPGCAM, Universidade Federal de Mato Grosso, Câmpus de
Sinop, Sinop, Mato Grosso, Brasil. Av. Alexandre Ferronato, 1200, Sinop/MT CEP
31270-020. *Autor para correspondência: [email protected].
O presente artigo será adequado para o periódico Revista Brasileira de Plantas
Medicinais. As instruções para os autores submeterem seus artigos seguem como
anexo final.
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Avaliação citotóxica, metabólica e genotóxica em ratos tratados
com polpa de noni (Morinda citrifolia, L.)
Riffel, Juliana B.1; Sugui, Marina M.1; Campos, Kleber E.1*
1instituto de Ciências Naturais, Humanas e Sociais, Programa de Pós-graduação em
Ciências Ambientais-PPGCAM, Universidade Federal de Mato Grosso, Câmpus de
Sinop, Sinop, Mato Grosso, Brasil. Av. Alexandre Ferronato, 1200, Sinop/MT CEP
31270-020. *Autor para correspondência: [email protected].
RESUMO. Este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos citotóxicos, metabólicos e genotóxicos, do tratamento da polpa de Morinda citrifolia em ratos machos. Os ratos foram divididos em grupos sendo tratado com água (controle) ou extrato aquoso de Morinda citrifolia (tratado) por 15 dias. Em seguida, foi administrada ciclofosfamida monohidratada (CPA) e após 24 horas, os ratos foram mortos e dados coletados para análise. Os resultados mostraram toxicidade através da lise de eritrócitos. Em relação aos parâmetros metabólicos, houve aumento do consumo alimentar, ingesta energética e diminuição da glicemia do grupo tratado com Morinda citrifolia, entretanto, não houve alteração do metabolismo proteico, lipídico e hepático. A análise genotóxica mostrou potencial mutagênico e antimutagênico do tratamento com a polpa. Conclui-se que o consumo do suco da polpa de Morinda citrifolia requer maiores cuidados, uma vez que, apresentou efeito citotóxico e genotóxico, apesar dos parâmetros metabólicos não estarem alterados, sendo ainda, observado uma ação hipoglicemiante. PALAVRAS-CHAVE: metabolismo, genotoxicidade, Morinda citrifolia, rato. ABSTRACT. Cytotoxic, metabolic and genotoxic evaluation in rats treated with noni pulp (Morinda citrifolia, L.). This study aimed to evaluate the cytotoxic,
metabolic and genotoxic effects from treatment of Morinda citrifolia pulp in male rats. The rats were divided into groups being treated with water (control) or aqueous extract of Morinda citrifolia (treated) for 15 days. After, it was administrated monohidrated cyclophosphamide (CPA) and, after 24 hours, the rats were killed and data were collected for analysis. The results showed toxicity through lysis of erythrocytes. In relation to metabolic parameters, there was an increase in food intake, energy intake and blood glucose lowering in the group treated with Morinda citrifolia, however, there was no change in protein, lipid and hepatic metabolism. The genotoxic analysis showed mutagenic and antimutagenic potential of the treatment with the pulp. It is concluded that the consumption of the juice of the pulp of Morinda citrifolia requires greater care, since it presented a cytotoxic and genotoxic effect, although the metabolic parameters were not altered, and also a hypoglycemic action was observed. KEYWORDS: Metabolism, genotoxicity, Morinda citrifolia, rat.
]
25
INTRODUÇÃO
O conhecimento popular no uso de plantas medicinais para a prevenção e
cura de doenças representa um recurso valioso visto que direciona estudos na
descoberta de novos medicamentos, aditivos alimentares e cosméticos (Rashid et al.
2016). Pesquisas avaliando ação de plantas no tratamento de doenças crônicas têm
sido crescente, sendo documentado na dislipidemia (Mohamed & Koriem, 2014),
obesidade (Cercato et al. 2015), Diabetes mellitus (Giovannini et al. 2016),
hipertensão arterial (Rawat et al. 2016), doença cardiovascular (Shayganni et al.
2016), câncer (Jacobo-Herrera et al. 2016), dentre outras patologias.
Em busca de novos compostos bioativos naturais para a cura e prevenção de
doenças, a análise tóxica deve ser considerada, visto que muitas plantas podem
provocar sérios prejuízos à saúde. Diversos fatores podem contribuir para que uma
espécie vegetal apresente toxicidade incluindo: características do indivíduo que a
consumiu, características da própria planta, modo e tempo de exposição e questões
relacionadas ao meio ambiente (Campos et al. 2016). Para isso, estudos
toxicológicos tornam-se úteis para garantir a segurança do uso de plantas medicinais
(Mounanga et al. 2015), destacando-se os testes de genotoxicidade e citotoxicidade.
Os testes de genotoxicidade vêm sendo realizados por diversos estudos com
a finalidade de avaliar a atividade antimutagênica de plantas medicinais (Sankar et
al. 2010; Vinod et al. 2011; Batista et al. 2016). Podem ser realizados in vivo e/ou in
vitro e são úteis na investigação de compostos com propriedades quimiopreventivas,
pois auxiliam a verificar se tais agentes são mutagênicos (Silva et al. 2007), ou
antimutagênicos (Słoczyńska et al. 2014). O teste do micronúcleo é considerado um
dos mais reconhecidos dentro da bateria de testes de mutagenicidade (Araldi et al.
26
2015). Já com relação ao ensaio de citotoxicidade da atividade hemolítica, tem sido
descrito por alguns autores, sendo utilizado com a finalidade de verificar a ação
tóxica de metabólitos presentes em plantas (Mulky & Gandhi, 1977; Gandhi &
Cherian, 2000).
Neste contexto, encontra-se Morinda citrifolia L. (noni), originária do sudeste
asiático e adaptável a áreas tropicais e subtropicais de todo o mundo (Deng et al.
2010), sendo o fruto sua parte mais consumida (Wang et al. 2002). Apresenta
diversos compostos químicos (Singh, 2012) como antraquinonas (Wang et al. 2016;
Bussmann et al. 2013); éster (Wang et al. 1999); compostos fenólicos antioxidantes
(Liu et al. 2007); fenóis totais, flavonoides, taninos condensados e escopoletina
(Yang et al. 2007). Entretanto, apesar de ser considerada uma planta
quimiopreventiva, Morinda citrifolia apresenta análise genotóxica muito restrita
(Kupradiun et al. 2011; Silva et al. 2012; Franchi et al. 2013;), e efeitos biológicos
controversos, sendo que alguns testes, in vitro e in vivo, já demonstraram vários
benefícios a saúde (Yang et al. 2007); como também outros reportaram toxicidade
(Millonig et al. 2005; Stadlbauer et al. 2005; Yu et al. 2011; Shalan et al. 2017).
Mediante a escassez de trabalhos científicos avaliando a citotoxicidade e
genotoxicidade de Morinda citrifolia, e a necessidade de mais estudos com a
finalidade de comprovar os efeitos deste no organismo, o presente estudo objetivou
avaliar a atividade citotóxica do extrato através do teste da hemólise; verificar
parâmetros metabólicos, e, determinar o potencial mutagênico e antimutagênico
através do teste do micronúcleo in vivo na medula óssea de ratos machos Wistar
após o tratamento com extrato da polpa de Morinda citrifolia.
27
MATERIAL E MÉTODOS
Animais
Todos os procedimentos seguiram o Guia de Experimentação Animal e
aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) UFMT, sob o protocolo nº
23108.701362/14-5. Foram utilizados 28 ratos machos da linhagem Wistar, em idade
adulta, com peso corpóreo 350±20g, do Laboratório de Fisiologia de Sistemas e
Toxicologia Reprodutiva (FISIOTOX) UFMT/Campus II do Araguaia. Os ratos foram
acondicionados em gaiolas coletivas, passaram por um período de adaptação de
sete dias, antes de iniciar o experimento e durante todo o período foram mantidos
em condições adequadas de temperatura (23±2°C), fotoperíodo de 12 horas,
umidade relativa de 60±5%, recebendo ração comercial (Purina®) e água filtrada ad
libitum.
Material Botânico
Foi utilizada a polpa do fruto noni (Morinda citrifolia L.), coletado durante a
primavera, na localização geográfica 12°40’57’’ S e 55°47’31” O. A planta foi
identificada e autenticada na Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), onde o
especimes voucher (09018) foi depositado. Em seguida, foram retiradas as cascas e
sementes dos frutos para serem peneiradas, obtendo-se somente sua polpa. Esta foi
acondicionada em frascos âmbar com quantidade suficiente para uso diário. Os
frascos foram armazenados a -20°C e descongelado previamente ao momento da
administração por via oral aos animais.
28
A dose escolhida para o estudo (3mL equivalente a 243mg/dia/rato de M.
citrifolia) foi determinada de acordo com o peso dos animais (1mL/100g de peso),
pois é a quantidade que estes conseguem suportar no estômago. Com a finalidade
de facilitar a administração do extrato, a dose foi padronizada para 3mL já que os
animais apresentavam peso aproximado. O preparo do extrato foi realizado a fim de
mimetizar a forma utilizada pela população.
Determinação da atividade citotóxica do extrato
Foi utilizado o teste de atividade hemolítica para a análise, pela metodologia
adaptada de Mulky & Gandhi (1977). Para a realização do teste, foi coletado 1mL de
sangue de um rato saudável, em tubos contendo o anticoagulante EDTA, e, em
seguida, lavados com solução PBS e centrifugados (3.000 rpm em 5’) por três vezes,
e ressuspendidos em solução fisiológica formando uma solução de 2%.
Posteriormente, realizou-se diluição seriada do extrato da polpa de M.
citrifolia, a partir da concentração inicial de 100mg/mL em microplacas com o fundo
em “U” e acrescentadas 25µL da solução de hemácias em cada concentração.
Como controle negativo foi utilizado 100µL de PBS 1% e 25µL da solução de
hemácias e, como controle positivo foi empregado 100µL de água destilada e 25µL
da solução de hemácias. Após duas horas de incubação foi realizada análise
qualitativa da microplaca, sendo os resultados fotografados e analisados
qualitativamente.
Como padrão para a leitura das microplacas, o resultado foi considerado
negativo para hemólise quando houve a formação de um botão de hemácias ao
fundo da microplaca; positivo quando se observou as hemácias distribuídas de
29
maneira homogênea, ocupando uma área maior do que 50% do fundo da
microplaca. Além disso, o resultado foi considerado indeterminado quando não foi
possível classificar em nenhuma das categorias, positivo ou negativo.
Agente químico
O agente químico utilizado foi à ciclofosfamida monohidratada (CPA) com o
nome comercial Genuxal® (Baxter). O agente foi diluído em solução salina 0,9% e
administrado intraperitonealmente nos ratos na concentração de 25mg/Kg p.c.
conforme metodologia apresentada por Delmanto et al. (2001).
Grupos experimentais, tratamento e coleta dos dados
Os ratos foram divididos em quatro grupos experimentais contendo 07
animais cada, conforme descrito na Figura 1.
30
Figura 1. Diagrama de fluxo do desenho experimental do estudo
Para a avaliação metabólica, foram coletados os dados dos grupos
experimentais CONT e NONI. Antes de iniciar a etapa de tratamento (dia 0), foi
mensurado o peso corpóreo, consumo alimentar e também a glicemia dos ratos.
Tais parâmetros foram avaliados semanalmente até o término do tratamento (dias 7
e 15). Dos valores do peso corpóreo e consumo alimentar, foram estimados
parâmetros antropométricos (taxa de ganho de massa corpórea) e nutricionais
(ingesta energética) (Diniz et.al. 2005; Novelli 2007).
No 14º dia da etapa experimental, foi realizado o Teste oral de tolerância à
glicose (TOTG) em todos os ratos. Após jejum prolongado (±12 horas), foi coletada
31
uma gota de sangue para determinação glicêmica por glicosímetro convencional
OneTouch® Ultra® 2 (tempo 0 = jejum). Em seguida, os ratos receberam solução de
glicose (200g/L) via oral na dose de 2,0g/Kg peso corpóreo. Após 30, 60 e 120
minutos da administração da solução, as outras glicemias foram determinadas
(Moura et al. 2002). A resposta da glicose durante o TOTG foi avaliada pela
aparência da curva (Campos et al. 2007) e a estimativa total obtida na área sob a
curva pelo método trapezoidal (ASC), conforme descrito por Tai et al. (1994).
Aproximadamente 24 horas após o último dia de tratamento (16º dia), todos
os ratos foram anestesiados. Em seguida, foram mortos por decapitação para
obtenção das células da medula óssea e também o sangue total.
Para realização do Teste do Micronúcleo (MN), foi empregada a metodologia
de MacGregor et al. (1987). Para obtenção das células da medula óssea, foram
retirados os fêmures dos animais, lavados com soro fisiológico para remoção de
restos de tecidos, e em seguida, o material da medula óssea foi retirado e
conservado em tubos contendo soro fetal bovino que posteriormente foi centrifugado
por 5min a 2000rpm, o sobrenadante foi descartado e com o sedimento foi
preparado duas lâminas por animal que foram coradas com Leishman para
subsequente análise microscópica. As lâminas foram codificadas, para análise em
teste cego, sendo que um total de 2000 eritrócitos policromáticos (PCE) foi
observado por rato (1000/lâmina) (MacGregor et al. 1987; Hayashi et al. 1994;
Ribeiro et al. 2003).
As amostras de sangue total de cada rato foram coletadas em tubos de
ensaio livres de anticoagulantes e centrifugados a 3.000 rpm por 10 minutos. O
sobrenadante foi coletado e estocado a -20ºC para posteriores determinações. Os
parâmetros bioquímicos foram dosados através da metodologia proposta por Young
32
et al. (2001), utilizando kits de reagentes da marca Labtest® Diagnóstica SA, e
analisador bioquímico semiautomático Bioplus modelo BIO-2000. Foram
mensurados os níveis séricos de proteínas totais, albumina, globulina, creatinina,
ureia, colesterol total, triglicerídeos, lipoproteínas de alta densidade (HDL) e
atividade dos marcadores hepáticos alanina aminotransferase (ALT) e aspartato
aminotransferase (AST). As frações do lipidograma - Lipoproteína de baixa
densidade (LDL) e muito baixa densidade (VLDL)- foram estimados de acordo com o
cálculo proposto por Friedewald et al. (1972).
Análise estatística
A frequência de células micronucleadas (MN) em todos os grupos
experimentais foi comparada pelo teste de qui-quadrado de acordo com Pereira
(1991). A porcentagem de redução na frequência de MN foi calculada através da
equação proposta por Manohan et al. (1985) e Waters et al. (1990). Para os
biomarcadores metabólicos, os valores obtidos dos parâmetros dos grupos CONT e
NONI foram expressos como média ± desvio-padrão. Para comparação dos valores
médios entre os grupos foi empregado o teste t de Student. O limite de significância
estatístico considerado foi de 5% (p<0,05).
33
RESULTADOS
A Tabela 1 mostra a avaliação in vitro da atividade hemolítica apresentada
pela polpa de Morinda citrifolia, por meio de diluições seriadas em concentrações
decrescentes, partindo da concentração inicial de 100 mg/mL e finalizando com
0,01953 mg/mL. A polpa de M. citrifolia apresentou atividade hemolítica positiva até
a concentração de 3,125 mg/mL.
TABELA 1 - Atividade hemolítica do extrato aquoso da polpa de Morinda citrifolia L. em
concentrações decrescentes.
Morinda citrifolia
Controle Negativo -
Controle Positivo +
100 mg/mL +
50 mg/mL +
25 mg/mL +
12,5 mg/mL +
6,25 mg/mL +
3,125 mg/mL +
1,5625 mg/mL -
0,07812 mg/mL -
0,03906 mg/mL -
0,01953 mg/mL -
(-) ausência de hemólise, (+) hemólise.
A partir da concentração seguinte, (1,5625 mg/mL), as hemácias
permaneceram íntegras no fundo da placa sugerindo atividade hemolítica negativa,
conforme mostra a Figura 2:
34
Os valores médios dos parâmetros antropométricos e nutricionais estão
apresentados na Tabela 2. Embora não ocorreram diferenças nos parâmetros de peso
corpóreo e ganho de massa corpórea, o grupo NONI aumentou o consumo alimentar e
a ingesta calórica no dia 7 que se manteve até o dia 15 de tratamento em relação ao
início (dia zero). Além disso, no dia 15, tais biomarcadores aumentaram de valor em
comparação ao grupo CONT. O uso do extrato vegetal também proporcionou uma
diminuição da glicemia no dia 15, quando comparado ao dia zero do grupo NONI como
também ao dia 15 do grupo CONT.
Os biomarcadores lipídicos e protéicos estão mostrados na Tabela 3, nos
grupos experimentais. Não houve diferenças nos parâmetros, mesmo após o
tratamento com M. citrifolia. Além disso, o estudo não mostrou toxicidade hepática,
mostrando seus níveis de ALT e AST normalizados.
35
TABELA 2 – Parâmetros antropométricos e nutricionais de ratos controle tratados
com água (CONT) ou com extrato aquoso de Morinda citrifolia (NONI). Dados expressos como média ± desvio-padrão.
CONT NONI
Peso corpóreo (g)
Dia 0 364,1±30,3 362,9±21,0
Dia 7 383,7±30,1 385,4±23,3
Dia 15 391,7±31,7 393,4±28,4
Ganho de massa corpórea (g/Kg) 1,1±0,2 1,3±0,6
Consumo alimentar (g)
Dia 0 23,7±2,1 20,7±1,1
Dia 7 26,0±1,6 27,0±0,3*
Dia 15 22,7±2,3 27,1±3,2*#
Ingesta energética (Kcal/g)
Dia 0 81,8±7,2 71,4±3,8
Dia 7 89,7±5,5 93,2±1,0*
Dia 15 78,3±7,9 93,5±11,0*#
Glicemia (mg/dL)
Dia 0 111,6±19,8 90,9±7,0
Dia 7 99,9±9,9 88,7±4,3
Dia 15 92,4±14,8 81,7±5,9#
* diferença comparada ao dia zero, mesmo grupo (p<0,05 – teste t de Student). # diferença
comparada ao grupo CONT, mesmo dia (p<0,05 – teste t de Student).
TABELA 3 – Biomarcadores lipídicos e proteicos séricos em ratos controle tratados com água (CONT) ou com extrato aquoso de Morinda citrifolia L. (NONI). Dados expressos como média ± desvio-padrão. CONT NONI
Colesterol total (mg/dL) 69,6±5,7 64,5±9,8
Triglicerídeos (mg/dL) 82,6±24,9 91,2±39,1
HDL (mg/dL) 64,1±11,9 56,5±9,1
VLDL (mg/dL) 17,0±5,0 18,2±7,8
LDL (mg/dL) 19,8±8,3 26,3±13,7
Proteínas totais (g/dL) 4,3±0,3 4,2±0,1
Albumina (g/dL) 4,1±0,2 4,0±0,5
Globulina (g/dL) 0,4±0,2 0,5±0,2
Creatinina (mg/dL) 1,2±0,1 1,3±0,0
Uréia (mg/dL) 53,0±5,4 54,7±4,4
ALT (U/L) 66,6±8,8 61,8±8,5
AST (U/L) 208,8±40,5 181,3±37,7
36
As curvas glicêmicas do Teste oral de tolerância à glicose (TOTG) estão
mostradas na Figura 3A. Como não houve diferenças entre os valores 120min e
jejum (0min) em ambos os grupos, houve um retorno glicêmico adequado. Além
disso, durante o teste, a glicemia foi aumentada no tempo 30min em ambos os
grupos e 60min no grupo controle. Na análise das áreas parciais e total sob a curva
(Figura 3B), o tratamento do extrato vegetal diminuiu nos momentos 30-60min e 60-
120min, além de toda a área total.
FIGURA 3 – Teste oral de tolerância à glicose (Figura 3A) e área parcial e total sob a
curva glicêmica (Figura 3B) de ratos controle tratados com água (CONT) ou com extrato aquoso de Morinda citrifolia. Dados expressos como média ± desvio-padrão. * diferença comparada ao dia zero, mesmo grupo. # diferença comparada ao grupo CONT (p<0,05 –
teste t de Student).
3 A
3 B
#
#
#
*
* *
37
A Tabela 4 mostra os efeitos na medula óssea dos ratos pré-tratados com M.
citrifolia e após a administração do agente indutor de dano CPA. O grupo NONI +
CPA mostrou uma redução na frequência de micronúcleos em 39% quando
comparado com o grupo controle positivo (CPA). Por outro lado, o grupo NONI
apresentou aumento na frequência de micronúcleos em eritrócitos policromáticos de
medula óssea quando comparado com o grupo controle negativo (CONT),
evidenciando efeito mutagênico nesta dose.
TABELA 4 - Frequência de micronúcleo em eritrócito policromático (MNPCEs) em
células de medula óssea de ratos após tratamento de extrato de Morinda citrifolia L. e ciclofosfamida (CPA).
Grupos experimentais
N° de células analisadas
MNPCEs
Nº %
% de Redução
CONT
14.000 155 1,6
CPA
12.000a 461 4,6
NONI
14.000 208 2,1**
NONI+CPA
14.000 342 3,4*
39,0
a morte de 01 animal, * diferença ao grupo CPA ** diferença ao grupo CONT. CONT- Controle; CPA-
ciclofosfamida; NONI- Extrato de Morinda citrifolia.
DISCUSSÃO
O tratamento com a polpa mostrou citotoxicidade in vitro na maioria das
diluições seriadas. Lagarto et al. (2013) não observaram atividade hemolítica dos
eritrócitos quando realizaram estudo com as folhas de Morinda citrifolia. Desta
forma, sugere-se que a atividade hemolítica pode ser atribuída a metabólitos
presentes no fruto e não nas folhas, como também o fruto poderia apresentar
38
concentrações mais elevadas de determinados compostos que levou a lise dos
eritrócitos.
De acordo com Correia (2010), o aumento do consumo alimentar e da ingesta
calórica dos ratos tratados com M. citrifolia pode estar relacionada com o potencial
energético encontrado nos frutos (sacarose, glicose e frutose). Além disso, Bui et al.
(2006) relataram que esta planta é predominantemente composta por carboidratos e
rico em polissacarídeos pécticos. Por outro lado, as diferenças encontradas nos
valores glicêmicos sugerem efeito hipoglicemiante e aumento da sensibilidade
insulínica após tratamento com a polpa. O efeito normoglicêmico já é conhecido,
sendo demonstrado tanto em ratos diabéticos (Nayak et al. 2011; Haque & Rao,
2013), como também em camundongos saudáveis (Lee et al. 2012), e camundongos
diabéticos (Kamiya et al. 2008). Além disso, foi também relatada uma melhora na
sensibilidade à insulina em ratos com dieta hiperlipídica (Nerukar et al. 2012). Tais
relatos corroboram com nosso estudo, em que o aumento da sensibilidade da
insulina endógena foi mostrado durante o TOTG, bem como nos menores valores da
área sob a curva. Alguns mecanismos são propostos por estudos para ação da
polpa de M. citrifolia na regulação do metabolismo glicídico, incluindo o aumento da
secreção da insulina proposto por Haque & Rao (2013), e, normalização dos níveis
glicêmicos por meio do fator de transcrição hepático FOXO1, que atua controlando
enzimas envolvidas no metabolismo da glicose proposto por Nerukar et al. (2012).
O efeito antimutagênico observado no grupo NONI+CPA está de acordo com
outros estudos já realizados em diferentes metodologias e espécies animais.
Kupradiun et al. (2011), avaliaram efeito quimioprotetor das folhas e frutos de M.
citrifolia à agentes mutagênicos Mitomicina C e CPA em camundongos; enquanto
que Franchi et al. (2013) encontraram efeito protetor às lesões moleculares
39
induzidas por mitomicina C e doxorrubicina em Drosophila melanogaster. Além
disso, M. citrifolia também foi testada em organismos vegetais, em que, através do
teste do micronúcleo em cebola (Allium cepa), realizado por Silva et al. (2012), foi
observada alta atividade antimutagênica; efeito também observado no sistema
methG1 em Aspergillus nidulans (Palioto et al., 2009). M. citrifolia também
apresentou efeito benéfico ao tratamento em ensaios in vitro, como cultura de
células de melanoma B16-F10 (Cândida et al. 2014), e também em células com
câncer mamário (Wang et al. 2013) e cervical (Gupta et al. 2013).
As diversas propriedades apresentadas pela polpa de M. citrifolia podem estar
atribuídas à presença de substâncias com elevado potencial antioxidante incluindo
alto teor de vitamina C (West et al. 2011) e também os flavonoides. A atividade
antioxidande ocorre através da redução e quelação de ferro e remoção de radicais
de óxido nítrico, superóxido e hidroxila (Ruhomally et al. 2016). Já o efeito
anticancerígeno ocorre de forma que este impede a formação de aductos de DNA
nas primeiras etapas da carcinogênese. Desta forma, o bloqueio de aductos de DNA
associada à forte atividade antioxidante do extrato de M. citrifolia pode contribuir
prevenindo o câncer na fase precoce (Wang & Su, 2001; Ahmad et al.2016). Por
outro lado, quando o extrato foi avaliado individualmente (grupo NONI), ocorreu um
efeito mutagênico. Tal resposta biológica também foi evidenciada em camundongos
tratados com o pó da fruta de M. citrifolia por Kupradiun et al. (2011). De acordo com
Zeiger (2003), muitas substâncias com relatos de atividades antimutagênica e
anticancerígena também podem apresentar o efeito inverso, ou seja, mutagênica e
cancerígena, principalmente por efeito pró-oxidante. Alguns estudos já
demonstraram o potencial genotóxico de compostos fenólicos como os flavonoides
(Silva et al. 2002; León-Gonzalez et al. 2015) e derivado semi-sintético de isoflavona
40
(Belcavello et al. 2012); vitamina C (Kramarenko et al. 2006; Chen et al. 2005;
Hardaway et al. 2012) e alcaloides (Guterres et al. 2013).
Em relação ao efeito pró-oxidante da vitamina C e flavonoides, estudos
mostram que ocorre síntese não controlada de espécies reativas de oxigênio, como
o peróxido de hidrogênio e superóxido o que pode desencadear eventos
mutagênicos (Silva et al. 2002; Kramarenko et al. 2006; Belcavello et al. 2012; León-
Gonzalez et al. 2015). De acordo com León-Gonzalez et al. (2015), as condições
para que os flavonoides exerçam atividade pró-oxidante incluem altas
concentrações, pH elevado e presença de metais de transição redox-ativos,
enquanto que a ação pró-oxidante da vitamina C pode ocorrer apenas em dose
elevadas (Podmore et al. 1998; Chen et al. 2005; Levine et al. 2011).
Portanto, tanto o efeito antimutagênico como também mutagênico observado
no tratamento com o extrato de M. citrifolia, podem ser atribuídos à presença de
metabólitos secundários, bem como o local de cultivo do arbusto, contribuíndo para
uma variação nos teores de compostos ativos. Com isso, sugere-se que os efeitos
pró-oxidantes possam ter ocorrido durante a metabolização do fruto, levando a
eventos mutagênicos no DNA dos ratos tratados somente com a polpa. Desta forma,
conclui-se que o tratamento de Morinda citrifolia teria efeito protetor à severas
injurias biológicas sendo antimutagênico; porém também possui efeito citotóxico,
mutagênico e hipoglicemiante em modelos biológicos saudáveis, não sendo
recomendado livremente para uso da população, mas, podendo ser, futuramente,
uma opção para síntese de fármacos para tratamentos de doenças crônicas.
41
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Chemical Toxicology, v. 50, p. 996–1000, 2012.
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4. CONCLUSÃO GERAL
A análise citotóxica traz preocupações, visto que o extrato apresentou
toxicidade na maioria das concentrações utilizadas. Com relação aos parâmetros
metabólicos analisados neste estudo, estes não foram negativamente afetados,
observados por meio das análises bioquímicas dos ratos, mostrando, ainda, uma
ação hipoglicemiante. Porém, a análise genotóxica também fornece preocupação
visto que a polpa apresentou um comportamento bifásico, atuando como mutagênico
e também antimutagênico, dependendo das condições de análise.
Portanto, este estudo abre novas perspectivas sobre o uso desta planta, além
disso, pesquisas mais aprofundada precisam ser efetuadas, a fim de comprovar os
reais efeitos biológicos da polpa de Morinda citrifolia L. O isolamento de cada
composto químico presente no fruto dever ser considerado para em seguida
proceder a testes experimentais in vitro e in vivo e fundamentar a atividade
desempenhada por cada composto bioativo.
53
5. ANEXOS
ANEXO A – Normas Revista
ISSN 1516-0572 versão
impressa
ISSN 1983-084X versão on-line
INSTRUÇÕES AOS AUTORES
Escopo e política Forma e preparação de manuscritos
Envio de manuscritos
Escopo e política
A Revista Brasileira de Plantas Medicinais - RBPM é publicação trimestral, exclusivamente eletrônica a partir de 2012, e destina-se à divulgação de trabalhos científicos originais, revisões bibliográficas, e notas prévias, que deverão ser inéditos e contemplar as grandes áreas relativas ao estudo de plantas medicinais. Manuscritos que envolvam ensaios clínicos deverão vir acompanhados de autorização da Comissão de Ética pertinente para realização da pesquisa. Os artigos podem ser redigidos em português, inglês ou espanhol, sendo obrigatória a apresentação do resumo em português e em inglês, independente do idioma utilizado. Os artigos devem ser enviados por e-mail: [email protected], com letra Arial 12, espaço
duplo, margens de 2 cm, em "Word for Windows". Os artigos, em qualquer modalidade, não devem exceder 20 paginas. No e-mail, enviar telefone para eventuais contatos urgentes. Para a publicação, os artigos aprovados submetidos à RBPM a partir de 1º de Abril de 2013 (inclusive), terão custo de tramite de 300 reais (trezentos reais) a ser efetivado pelos autores/responsáveis somente na ocasião do recebimento da carta de aceitação do artigo, quando receberão o respectivo boleto e instruções para o pagamento.
Forma e preparação de manuscritos
REVISÕES BIBLIOGRÁFICAS E NOTAS PRÉVIAS
Revisões e Notas prévias deverão ser organizadas basicamente em: Título, Autores, Resumo, Palavras-chave, Abstract, Key words, Texto, Agradecimento (se houver) e Referência Bibliográfica. Atenção especial deve ser dada aos artigos de Revisão evitando a citação Ipsis-litteris de textos, que configura plágio por lei. ARTIGO CIENTÍFICO Os artigos deverão ser organizados em:
54
TÍTULO: Deverá ser claro e conciso, escrito apenas com a inicial maiúscula, negrito, centralizado, na parte superior da página. Se houver subtítulo, deverá ser em seguida ao título, em minúscula, podendo ser precedido de um número de ordem em algarismo romano. Os nomes comuns das plantas
medicinais devem ser seguidos pelo nome científico (binômio latino e autor) entre parênteses. AUTORES: Começar pelo último sobrenome dos autores por extenso (nomes intermediários somente iniciais, sem espaço entre elas) em letras maiúsculas, 2 linhas abaixo do título. Após o nome de cada autor deverá ser colocado um número sobrescrito que deverá corresponder ao endereço: instituição, endereço da instituição (rua e número ou Caixa Postal, cidade, sigla do estado, CEP, e-mail). Indicar o autor que deverá receber a correspondência. Os autores devem ser separados com ponto e vírgula. RESUMO: Deverá constar da mesma página onde estão o título e os autores, duas linhas abaixo dos autores. O resumo deverá ser escrito em um único parágrafo, contendo objetivo,
resumo do material e método, principais resultados e conclusão. Não deverá apresentar citação bibliográfica. Palavras-chave: Deverão ser colocadas uma linha abaixo do resumo, na margem esquerda, podendo constar até cinco palavras. ABSTRACT: Apresentar o título e resumo em inglês, no mesmo formato do redigido em português, com exceção do título, apenas com a inicial em maiúscula, que virá após a palavra ABSTRACT. Key words: Abaixo do Abstract deverão ser colocadas as palavras-chave em inglês, podendo constar até cinco palavras. INTRODUÇÃO: Na introdução deverá constar breve revisão de literatura e os objetivos do trabalho. As citações de
autores no texto deverão ser feitas de acordo com os seguintes exemplos: Silva (1996); Pereira & Antunes (1985); (Souza & Silva, 1986) ou quando houver mais de dois autores Santos et al. (1996). MATERIAL E MÉTODO (CASUÍSTICA): Deverá ser feita apresentação completa das técnicas originais empregadas ou com referências de trabalhos anteriores que as descrevam. As análises estatísticas deverão ser igualmente referenciadas. Na
metodologia deverão constar os seguintes dados da espécie estudada: nome popular; nome científico com autor e indicação da família botânica; nome do botânico responsável pela identificação taxonômica; nome do herbário onde a exsicata está depositada, e o respectivo número (Voucher Number); época e local de coleta, bem como, a parte da planta utilizada. RESULTADO E DISCUSSÃO: Poderão ser apresentados separados, ou como um só capítulo, contendo a conclusão sumarizada no final. AGRADECIMENTO: deverá ser colocado neste capítulo (quando houver). REFERÊNCIA: As referências devem seguir as normas da ABNT 6023 e de acordo com os exemplos:
Periódicos: AUTOR(ES) separados por ponto e vírgula, sem espaço entre
55
as iniciais. Título do artigo. Nome da Revista, por extenso, volume, número, página inicial-página final, ano. KAWAGISHI, H. et al. Fractionation and antitumor activity of the water-insoluble residue of Agaricus blazei fruiting bodies.Carbohydrate Research, v.186, n.2, p.267-73,
1989. Livros: AUTOR. Título do livro. Edição. Local de publicação: Editora, Ano. Total de páginas. MURRIA, R.D.H.; MÉNDEZ, J.; BROWN, S.A. The natural coumarins: occurrence, chemistry and biochemistry. 3.ed. Chinchester: John Wiley & Sons, 1982. 702p. Capítulos de livros: AUTOR(ES) DO CAPÍTULO. Título do Capítulo. In: AUTOR (ES) do LIVRO. Título do livro: subtítulo. Edição. Local de Publicação: Editora, ano, página inicial-página final. HUFFAKER, R.C. Protein metabolism. In: STEWARD, F.C. (Ed.). Plant physiology: a treatise. Orlando: Academic Press, 1983. p.267-33.
Tese ou Dissertação: AUTOR. Título em destaque: subtítulo. Ano. Total de páginas. Categoria (grau e área de concentração) - Instituição, Universidade, Local. OLIVEIRA, A.F.M. Caracterização de Acanthaceae medicinais conhecidas como anador no nordeste do Brasil. 1995. 125p. Dissertação (Mestrado - Área de Concentração em Botânica) - Departamento de Botânica, Universidade Federal de Pernambuco, Recife. Trabalho de Evento: AUTOR(ES). Título do trabalho. In: Nome do evento em caixa alta, número, ano, local. Tipo de publicação em destaque... Local: Editora, ano. página inicial-página final. VIEIRA, R.F.; MARTINS, M.V.M. Estudos etnobotânicos de
espécies medicinais de uso popular no Cerrado. In: INTERNATIONAL SAVANNA SYMPOSIUM, 3., 1996, Brasília. Proceedings… Brasília: Embrapa, 1996. p.169-71. Publicação Eletrônica: AUTOR(ES). Título do artigo. Título do periódico em destaque, volume, número, página inicial-página final, ano. Local: editora, ano. Páginas. Disponível em: <http://www........>. Acesso em: dia mês (abreviado) ano.
PEREIRA, R.S. et al. Atividade antibacteriana de óleos essenciais em cepas isoladas de infecção urinária. Revista de Saúde Pública, v.38, n.2, p.326-8, 2004. Disponível em: http://www.scielo.br. Acesso em: 18 abr. 2005. Não citar resumos e relatórios de pesquisa, a não ser que a informação seja muito importante e não tenha sido publicada de outra forma. Comunicações pessoais devem ser colocadas no rodapé da página onde aparecem no texto e evitadas se possível. Devem ser também evitadas citações do tipo: Almeida (1994) citado por Souza (1997). TABELAS: Devem ser inseridas no texto, com letra do tipo Arial 10, espaço simples. A palavra TABELA (Arial 12) deve ser em letras maiúsculas, seguidas por algarismo arábico; já quando citadas no texto devem ser em letras minúsculas
(Tabela). FIGURAS: As ilustrações (gráficos, fotográficas, desenhos,
56
mapas) devem ser em letras maiúsculas seguidas por algarismo arábico, Arial 12, e inseridas no texto. Quando citadas no texto devem ser em letras minúsculas (Figura). As legendas e eixos devem ser em Arial 10, enviadas em arquivos separados, com resolução 300 DPI, 800x600, com
extensão JPG ou TIFF, para impressão de publicação. Processo de avaliação: Os manuscritos são analisados por, pelo menos, dois pareceristas, segundo um roteiro de análise baseado principalmente no conteúdo científico. Os pareceristas recomendarão a aceitação com ou sem necessidade de retornar; recusa, ou sugerir reformulações, e que, neste caso, o artigo reformulado retornará ao parecerista até que a avaliação seja concluída. Quando no mínimo 2 pareceristas aprovarem, sem necessidade de retornar, o artigo estará pronto para ser publicado e o autor receberá a carta de aceite bem como as instruções para pagamento dos custos de tramite (R$300 reais)*. Os nomes dos pareceristas permanecerão em sigilo, omitindo-se também perante estes os nomes dos autores.
* Somente os artigos aprovados que foram submetidos a partir de 1º de abril de 2013 terão custo para publicação. Direitos autorais: Ao encaminhar um manuscrito para a RBPM os autores devem estar cientes de que, se aprovado para publicação, o copyright do artigo, incluindo os direitos de reprodução em todas as mídias e formatos, deverá ser concedido exclusivamente para as Memórias. ATENÇÃO: Artigos que não estiverem de acordo com essas normas serão devolvidos. Observação: São de exclusiva responsabilidade dos autores as opiniões e conceitos emitidos nos trabalhos. Contudo, reserva-se ao Conselho Editorial, o direito de sugerir ou solicitar modificações que julgarem necessárias.
Envio de manuscritos
Os artigos devem ser enviados por e-mail: [email protected]
57
Anexo B – Parecer do Comitê de Ética