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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS

COINFECÇÃO DO PLASMODIUM VIVAX E ENTEROPARASITOS NO MUNICÍPIO

DO OIAPOQUE, ESTADO DO AMAPÁ, FRONTEIRA BRASIL-GUIANA

FRANCESA

RUBENS ALEX DE OLIVEIRA MENEZES

Belém-Pará

2017

Dados Internacionais de Catalogação- na-Publicação (CIP) Biblioteca do Instituto de Ciências Biológicas - UFPA

Menezes, Rubens Alex de Oliveira

Coinfecção do Plasmodium vivax e enteroparasitos no município do

Oiapoque, estado do Amapá, fronteira Brasil-Guiana Francesa / Rubens

Alex de Oliveira Menezes ; Orientador, Ricardo Luiz Dantas Machado. -

2017.

139 f.: il.

Inclui bibliografias

Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Pará, Instituto de

Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biologia de Agentes

Infecciosos e Parasitários, Belém, 2017.

1. Doenças parasitárias – Oiapoque (AP). 2. Plasmodium vivax –

Oiapoque (AP). 3. Parasitos intestinais. 4. Malária – Oiapoque (AP) I.

Machado, Ricardo Luiz Dantas, orientador. II. Titulo.

CDD – 22 ed. 571.999098116




FRANCESA

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários

do Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal do Pará como requisito

parcial para a obtenção do grau de Doutor em

Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.

Orientador: Prof. Dr. Ricardo Luiz Dantas

Machado

Belém-Pará

2017

1




FRANCESA

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como

requisito parcial para o grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.

Orientador: Prof. Dr. Ricardo Luiz Dantas Machado

Departamento de Microbiologia e Parasitologia

Universidade Federal Fluminense

Banca examinadora: Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário Vallinoto

Laboratório de Virologia ICB, UFPA

Prof. Dra. Ana Maria Revorêdo da Silva Ventura

Instituto Evandro Chagas, SVS – MS e UEPA

Prof. Dr. Adriano Penha Furtado

Laboratório de Biologia Celular e Helmintologia, ICB-UFPA

Prof. Dra. Edilene Oliveira da Silva

Instituto de Ciências Biológicas ICB-UFPA

Prof. Dra. Jeannie Nascimento dos Santos (Suplente)

Laboratório de Biologia Celular e Helmintologia, ICB/UFPA

Belém, 20 de Setembro de 2017

2

Dedico este trabalho à minha família pelo apoio,

compreensão e por compartilhar todos os momentos de

minha vida, além de todos que me apoiaram direta ou

indiretamente durante minha jornada acadêmica e

profissional.

3

AGRADECIMENTOS

A Deus força iluminada e infinita por ter guiado nesta longa trajetória profissional,

colocando sempre em meu caminho pessoas que me ajudaram e ensinaram muito.

Ao meu orientador Dr. Ricardo Luiz Dantas Machado, minha imensa gratidão pela

confiança, acolhimento e pela oportunidade de aprendizado nas orientações referentes ao

andamento do projeto, sempre muito valioso para o desenvolvimento dessa tese, contribuindo

para o meu crescimento acadêmico e profissional.

À Dra. Margarete do Socorro Mendonça Gomes por sua amizade incondicional, pela

dedicada orientação e sabedoria nas abordagens dos problemas científicos e por me receber de

portas abertas todas as vezes que precisei, compartilhando sua sabedoria e me incentivando a

ver a grandiosidade do mundo científico.

A toda minha família por todo amor carinho, dedicação, zelo, apoio, consolo e atitudes

certas em horas incertas além de paciência e ajuda tão necessários em todo o decorrer de

minha jornada acadêmica e profissional.

A minha esposa e companheira, Petille Santos Souza pelo seu carinho, amor, ajuda,

incentivo, compreensão e tolerância nas horas e momentos difíceis de ausência.

Ao Laboratório Central de Saúde Pública do Amapá (LACEN-AP), pelo apoio

logístico, autorizando minhas atividades laborais e de pesquisa no Laboratório de Fronteira

(LAFRON) em Oiapoque, durante a fase de acompanhamentos clínico-laboratorial dos

pacientes inseridos na pesquisa.

Aos técnicos, microscopistas e notificantes de Endemias do Município de Oiapoque

pelo auxilio na coleta das amostras e apoio técnico.

Ao setor de controle de qualidade de endemias do Município de Oiapoque e do

Laboratório Central de Saúde Pública do Amapá, pela avaliação semi quantitativa das lâminas

de malária.

Aos biomédicos: Romulo Lima de Sousa do LAFRON e Silvestre Rodrigues do

Nascimento do Hospital Estadual de Oiapoque, que realizaram as análises hematológicas,

processaram e armazenaram todas as amostras sanguíneas.

As pessoas que me ofereceram moradia e me acolheram em Oiapoque, Belém e em

Fortaleza, nas muitas vezes em que precisei me ausentar de minha cidade para desenvolver as

atividades da tese: Anapaula Martins Mendes, Leila Margareth Carrera Menezes e Heli da

Silva Araújo Salles (in memoriam).

4

À Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitários-UFPA, pelo acolhimento humanizado e conhecimentos adquiridos. Aos

professores do Curso pela competência, generosidade intelectual e conhecimentos repassados

ao longo de minha jornada acadêmica.

À Dra. Maristela Gomes da Cunha, pela oportunidade de realizar os testes de ELISA

para a MSP-119 no laboratório de Microbiologia e imunologia do Instituto de Ciências

Biológicas da Universidade Federal do Pará (ICB-UFPA).

Aos profissionais do Instituto Evandro Chagas - IEC/SVS/MS pela forma cordial e

profissional que sempre fui tratado.

Aos profissionais da Seção de Parasitologia do Instituto Evandro Chagas, em especial

a Tamirys Pina Simão do Laboratório de Imunogenética em Malária, por ter me recebido para

as análises de citocinas, por sua prestimosa atenção durante a fase de execução das análises

laboratoriais e sua inestimável contribuição na análise estatística dos resultados.

À Maria Izabel de Jesus responsável pelo Laboratório de Biologia Humana da Seção

de Meio Ambiente/IEC, pela disponibilidade dos kits de citocinas e do laboratório para as

análises e Aline Collares Pinheiro de Sousa por toda hospitalidade, gentileza e prontidão em

colaborar com este trabalho, me acompanhando no citômetro e nas dosagens sérica do teor de

citocinas.

À Coordenação e professores do curso de enfermagem da universidade Federal do

Amapá (UNIFAP), na qual estou vinculado, pela liberação das minhas atividades laborais,

durante a fase final de redação da tese.

Ao grupo de pesquisadores que contribuíram na análise, interpretação e discussão dos

dados, para submissão e publicação de artigos em periódicos científicos nacionais e

internacionais.

Antecipadamente, aos membros da banca por aceitarem o convite para avaliar esta

tese.

Aos pacientes que colaboraram com o projeto e a todos que contribuíram direta ou

indiretamente para a realização desse trabalho, e que me é impossível relatar individualmente.

A cada um o meu muito obrigado!

5

SÚMARIO

LISTA DE FIGURAS.................................................................................. 7

LISTA DE ABREVIATURAS.................................................................... 8

RESUMO...................................................................................................... 10

ABSTRACT.................................................................................................. 11

1 INTRODUÇÃO........................................................................................... 12

1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS DA MALÁRIA............................................ 12

1.2 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DA MALÁRIA................................... 13

1.2.1 Epidemiologia da Malária no Município de Oiapoque............................ 20

1.3 PARASITOS GASTROINTESTINAIS NO BRASIL.................................. 26

1.4 COINFECÇÃO MALÁRIA E PARASITOS GASTROINTESTINAIS...... 29

1.5 IMUNOPATOGÊNESE DA COINFECÇÃO MALÁRIA E

ENTEROPARASITOSES.............................................................................

32

1.5.1 Resposta imune de anticorpos e citocinas.................................................. 38

1.6 JUSTIFICATIVA.......................................................................................... 42

1.7 HIPÓTESES.................................................................................................. 43

1.7.1 Hipótese Nula............................................................................................... 43

1.7.2 Hipótese Alternativa................................................................................... 43

1.8 OBJETIVOS................................................................................................. 44

1.8.1 Geral............................................................................................................. 44

1.8.2 Específicos.................................................................................................... 44

2 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................ 45

2.1 ÁREA DE ESTUDO E POPULAÇÃO........................................................ 45

2.1 CRITÉRIOS DE SELEÇÃO......................................................................... 46

2.1.1 Critérios de inclusão para paciente maláricos.......................................... 47

2.1.2 Critérios de exclusão................................................................................... 47

2.1.3 Critérios de inclusão para indivíduos não maláricos............................... 47

2.1.4 Critérios de exclusão................................................................................... 47

2.3 TAMANHO DA AMOSTRA........................................................................ 48

2.4 COLETA E EXAME DE SANGUE............................................................. 48

2.4.1 Coleta Sanguínea......................................................................................... 48

2.4.2 Diagnóstico de Malária................................................................................ 48

2.4.3 Detecção de Gametócitos............................................................................. 49

6

2.4.4 Concentração de Hemoglobina................................................................... 49

2.4.5 Controle de Qualidade do diagnóstico parasitológico.............................. 49

2.5 COLETA E EXAME DE AMOSTRAS FECAIS......................................... 49

2.6 DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE PLASMÓDIO................................... 50

2.7 AVALIAÇÃO DE ANTICORPOS IgG CONTRA A PVMSP-119.............. 50

2.8 NÍVEIS SÉRICOS DE CITOCINAS............................................................ 51

2.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA............................................................................ 52

2.10 CONSIDERAÇÃO ÉTICA........................................................................... 53

3 RESULTADOS............................................................................................ 54

3.1 MANUSCRITO 1.......................................................................................... 54

3.2 MANUSCRITO 2.......................................................................................... 67

4 CONCLUSÃO.............................................................................................. 92

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA........................................................... 93

APÊNDICE A - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.................. 110

APÊNDICE B – Formulário epidemiológico............................................... 112

APÊNDICE C - Resumos Aprovados em Congresso.................................. 113

APÊNDICE D - Manuscrito Extra............................................................... 126

ANEXO A - Parecer Consubstanciado do Comitê de Ética de Pesquisa...... 138

ANEXO B - Financiamento pelo Edital/CNPq/PPSUS – Amapá 2013....... 139

7

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Série histórica do número de casos na região Amazônica no período de

1970 a 2014......................................................................................................................

15

Figura 2 - Áreas de transmissão de malária no Brasil de acordo com Incidência

Parasitária Anual (IPA) no ano de 2015..........................................................................

16

Figura 3 - Casos de malária e Incidência Parasitária Anual (IPA) no ano de 2014....... 17

Figura 4 - Número de casos de malária notificados no Estado do Amapá e diferença

percentual entre os anos de 2003 a 2017..........................................................................

18

Figura 5 - numero de caso de malária no estado do Amapá, por categoria de local

provável de infecção e diferença percentual entre os anos de 2012 a 2016.....................

19

Figura 6 - Série histórica de casos totais e Incidência Parasitária Anual durante o

período de 2003 a 2014 no município de Oiapoque-Amapá...........................................

22

Figura 7 - Casos de malária por P. vivax segundo local provável de infecção e

importados dos garimpos clandestinos da Guiana Francesa para Oiapoque...................

22

Figura 8 - Serie histórica do número de casos de malária notificados no município de

Oiapoque e diferença percentual entre os anos de 2003 a 2016......................................

24

Figura 9 - Serie histórica do número de casos de malária por categoria de local

provável de infecção notificados no município de Oiapoque e diferença percentual

entre os anos de 2003 a 2016...........................................................................................

25

Figura 10 - Frequência da distribuição de geohelmintos no Brasil de 1995 a 2013. a)

A. lumbricoides; b) T. trichiura e c) Ancilostomídeos....................................................

28

Figura 11 - Mapa da América do Sul, mostrando a localização da Guiana Francesa e

Oiapoque no Estado do Amapá........................................................................................

45

8

LISTA DE ABREVIATURAS

AC Estado do Acre

ADCI Inibição celular dependente de anticorpos

AM Estado do Amazonas

AMA-1 Antígeno apical de Membrana-1

ANOVA Análise de variância

AP Estado do Amapá

BAIP Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários

CONSEP Conselho Superior de Ensino, pesquisa e extensão

DATASUS Departamento de Informática do Sistema Único de Saúde

DSEI Distrito Sanitário Especial Indígena

ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática

FC€RII Receptor para IgE de baixa afinidade

Grupo CE Controle endêmico (sem infecção para malária e parasitos intestinais)

Grupo CI Coinfectados (Infectados com malária vivax e parasitos intestinais)

Grupo E Enteroparasitas (Infectados com parasitos intestinais)

Grupo M Maláricos (infectados com malária vivax)

GM-CSF Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos e Macrófagos

HEMOPA Fundação Centro de Hemoterapia e Hematologia do Pará

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

IFN-γ Interferon gama

IgG Imunoglobulina G

IgG1 Imunoglobulina variantes isotípicas ou subclasses 1




IgA Imunoglobulina A

IgE Imunoglobulina E

IgM Imunoglobulina M

IL-2 Interleucina-2

IL-3 Interleucina-3

IL-4 Interleucina-4

IL-5 Interleucina-5

9

IL-6 Interleucina-6

IL-10 Interleucina-10

IPA Incidência Parasitária Anual

IR Índice de reatividade

LACEN/AP Laboratório Central de Saúde Pública Amapá

LAFRON Laboratório de Fronteira

MA Estado do Maranhão

MFI Media de Intensidade de Fluorescência

MS Ministério da Saúde

MSP-1 Proteína de superfície de merozoíto-1

MT Estado do Mato Grosso

NEM Número de episódios de malária anterior

NK Exterminadoras naturais

OD Densidade ótica

OPD Cromógeno Orto-fenilenodiamina

PA Estado do Pará

PBS Salina tamponada com fosfato

PCR Reação em cadeia da polimerase

PNM Programa Nacional de controle de malária

PUM Período da última malária (meses)

RO Estado do Rondônia

RO Estado do Roraima

SINAN Sistema de Informação de Agravos de Notificação

SIVEP Sistema Informatizado de Vigilância Epidemiológica

SVS Secretaria de Vigilância em Saúde

TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido

TGF-β Fator de transformação do crescimento beta

TH1 Subdivisões fenotípicas de linfócitos auxiliares 1

TH2 Subdivisões fenotípicas de linfócitos auxiliares 2

TNF-α Fator de necrose tumoral alpha

TO Estado do Tocantins

TR Tempo de residência no Oiapoque (ano)

UFPA Universidade Federal do Pará

10

RESUMO

A coinfecção malária-parasitoses intestinais são comuns nas regiões tropicais do planeta,

embora prevalentes, pouco se sabe sobre essa interação na epidemiologia e no impacto da

resposta imune. Este estudo avaliou a influência da coinfecção das enteroparasitoses na

malária causada pelo Plasmodium vivax em uma área fronteiriça entre Brasil e Guiana

Francesa. Levantamento transversal realizado em Oiapoque, município do Amapá, norte do

Brasil. O diagnóstico da malária foi realizado por meio da gota espessa, a dosagem de

hemoglobina por método automatizado, o exame coproparasitológico pelos métodos de

Hoffman-Pons-Janer e Faust. Avaliação de anticorpos IgG contra a PvMSP-119 foi realizada

por ELISA e a quantificação das citocinas Th1 (IFN-γ, TNF-α e IL-2) e Th2 (IL-4, IL-5 e IL-

10) por citometria de fluxo. Análise estatística foi utilizada para avaliar os parâmetros

investigados, sendo comparados os resultados a partir de quatro grupos distintos agrupados

em M os monoinfectados com malária vivax; CI os coinfectados malária vivax-

enteroparasitos; E os monoinfectados com enteroparasitos e CE controle endêmico (negativo

para ambas enfermidades). Foram incluídos 441 indivíduos agrupados de acordo com o seu

estado de infecção: [M 6,9% (30/441)], [CI 26,5% (117/441)], [E 32,4% (143/441)] e [CE

34,2% (151/441)]. O gênero masculino prevaleceu entre os grupos M (77% - 23/30) e CI

(60% - 70/117). Nos indivíduos investigados, 59% (261/441) foram infectados por algum tipo

de parasito intestinal. Entre estes, 45,2% (118/161) estava infectado somente por helmintos,

40,9% (107/261) somente protozoários, e 13,8% (36/261) tinham infecções associadas.

Dentre os helmintos detectados o Ascaris lumbricoides 19,9% (52/261) foi o mais prevalente,

seguido de Entamoeba histolytica como protozoários mais frequentes 5% (13/261). A

pesquisa evidenciou uma correlação entre o nível de hemoglobina e a presença das parasitoses

detectadas (coeficiente C = 0.2195 e p < 0.0001). Adicionalmente pelo teste qui-quadrado de

Tendência houve correlação entre a modalidade de enteroparasitos e o nível de Hemoglobina,

sendo apenas helminto (p < 0.0001), monoparasitado (p < 0.0001) e poliparasitado (p <

0.0031). Também foram calculadas utilizando um Tukey a partir e uma análise de variância,

ANOVA um critério, havendo diferença entre os níveis de hemoglobina nos diferentes grupos

estudados: CE/E, CE/CI, E/M e CI/M com (p < 0.01). A anemia foi expressa em percentuais,

considerado anêmico indivíduos com níveis de hemoglobina de ≤ 13 g/dL para homens e ≤ 12

g /dL para mulheres, utilizado o teste Kruskal-Wallis-Dunn entre os grupos, sendo [CI-CE (p

< 0.05)]. Foram observadas diferenças entre a parasitemia e de gametócitos entre os grupos M

e CI grupos (Wilcoxon-Mann-Whitney, p < 0.05). Com relação aos anticorpos contra PvMSP-

119 51,2% (226/441) da população foram respondedores, sobretudo para o grupo CI 81,1%

(95/117) apresentando perfil diferente quanto à reatividade. As análises dos níveis séricos de

citocinas da população revelou uma grande variação nas concentrações em todas as citocinas

de perfil inflamatório e anti-inflamatório, sendo as citocinas TNF-α e IL-10 aumentados para

os indivíduos do grupo coinfectado. A coinfecção não esteve associada com a redução de

malária (incidência, prevalência ou redução da parasitemia). Adicionalmente os resultados

apontam a coinfecção malária-enteroparasitoses um aspecto real no município do Oiapoque, e

avaliar a possibilidade de que populações infectadas por parasitoses intestinais possam

influenciar na dinâmica de transmissão, no cenário e desfecho da resposta imune na malária

de Plasmodium vivax, são fundamentais para estratégias diagnósticas e preventivas.

Palavras chaves: Malária, enteroparasitoses, coinfecção, citocinas, Amazônia brasileira.

11

SUMMARY

Malaria coinfection-intestinal parasites are common in tropical regions of the planet, although

prevalent, little is known about this interaction in epidemiology and the impact of immune

response. This study evaluated the influence of coinfection of enteroparasitoses on malaria

caused by Plasmodium vivax in a border area between Brazil and French Guiana. Transverse

survey carried out in Oiapoque, Amapá municipality, northern Brazil. The diagnosis of

malaria was made by means of a thick drop, hemoglobin concentration by automated method,

parasitological analyses of faeces by Hoffman-Pons-Janer and Faust methods. Moreover,

evaluation of IgG antibodies against PvMSP-119 was performed by ELISA and the

quantification of Th1 cytokines (IFN-γ, TNF-α and IL-2) and Th2 (IL-4, IL-5 and IL-10) by

flow cytometor. Statistical analysis was used to evaluate the parameters investigated,

comparing the results from four different groups grouped in M monoinfected with vivax

malaria; CI co-infected malaria vivax-enteroparasites; plus the enteroparasites monoinfected

infection and endemic control EC (negative for both diseases). A total of 441 individuals were

grouped according to their infection status: [M 6.9% (30/441)], [CI 26.5% (117/441)], [E

32.4% (143/441 )] and [EC 34.2% (151/441)]. The male gender prevailed among the M (77%

- 23/30) and CI (60% - 70/117) groups. In the investigated individuals, 59% (261/441) were

infected by some type of intestinal parasite. Among these, 45.2% (118/161) was infected only

by helminths, 40.9% (107/261) only protozoa, and 13.8% (36/261) had associated infections.

Among the helminths detected, Ascaris lumbricoides 19.9% (52/261) was the most prevalent,

followed by Entamoeba histolytica as most frequent protozoa 5% (13/261). The research

showed a correlation between the hemoglobin level and the presence of parasites detected

(coefficient C = 0.2195 and p <0.0001). In addition, the chi-square test showed a correlation

between enteroparasites and hemoglobin levels, being only helminth (p <0.0001),

monoparasite (p <0.0001), and polyparasite (p <0.0031). They were also calculated using a

Tukey from and an analysis of variance, ANOVA a criterion, with difference between

hemoglobin levels in the different groups studied: CE/E, CE/CI, E/M and CI/M with (p <0.01

). Anemia was expressed in percentages, considered an anemic individuals with hemoglobin

levels of ≤ 13 g/dL for men and ≤ 12 g/dL for women, using the Kruskal-Wallis-Dunn test

between the groups, being [CI-CE (p <0.05)]. Differences of parasitemia and gametocytes

between groups M and CI were observed (Wilcoxon-Mann-Whitney test, p <0.05). Regarding

the antibodies response against PvMSP-119, 51.2% (226/441) of the population were

responders, especially for the CI group 81.1% (95/117) presenting a different reactivity

profile. Serum cytokine evaluation in the population revealed a wide variation in

concentrations of all inflammatory and anti-inflammatory cytokines, where TNF-α and IL-10

being increased for individuals in the coinfected group. Coinfection was not associated with

the reduction of malaria (incidence, prevalence or reduction of parasitemia). In addition, the

results indicate that malaria-intestinal parasitosis coinfection is a real issue in the municipality

of Oiapoque, and evaluate the possibility that populations infected by intestinal parasites may

influence the transmission dynamics, scenario and outcome of the immune response in

Plasmodium vivax malaria, are fundamental for diagnostic and preventive strategies.

Key words: Malaria, enteroparasitoses, coinfection, cytokines, Brazilian Amazon.

12

1 INTRODUÇÃO

1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS DA MALÁRIA

A malária é uma infecção de manifestação principalmente aguda, caracterizada pela

tríade de calafrios, febre e sudorese excessiva, sendo uma das maiores causas de morbidade e

mortalidade em muitos países tropicais e subtropicais do mundo (Jain et al., 2010). Os

parasitos dessa nosologia são protozoários pertencentes ao gênero Plasmodium e atualmente,

cinco espécies reconhecidas infectam o homem, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax,

Plasmodium malariae, Plasmodium ovale e o Plasmodium knowlesi. Dentre esses, os dois

primeiros estão associados aos maiores índices de mortalidade/virulência e disseminação no

mundo (Andrade et al., 2010; Gonçalves et al., 2010; WHO, 2011), e a forma crônica em

humanos é mais observada pelos P. vivax, P. ovale e P. malariae.

Dos conhecidos parasitos da malária humana, somente o P. falciparum, P. vivax e o P.

malariae são detectados no Brasil (Oliveira-Ferreira et al., 2010). Nos últimos anos, o P.

vivax tem sido a espécie mais prevalente no país, responsável por aproximadamente 80% dos

casos, enquanto o P. falciparum é responsável por aproximadamente 20%, e o P. malariae

raramente detectado. Historicamente casos clínicos graves por P. vivax são raros (Andrade et

al., 2010), no entanto, estudos recentes reforçam a associação dessa espécie com

complicações clínicas e casos fatais, sendo este um motivo de preocupação para a saúde

pública (Alecrim et al.; 2006; Lacerda et al., 2008; Andrade et al., 2010).

A malária é uma doença de transmissão vetorial. O ciclo do Plasmodium é bastante

complexo, incluindo o homem como hospedeiro intermediário e as fêmeas do mosquito do

gênero Anopheles como hospedeiros definitivos. Observa-se que o mosquito anofelino

exercendo a hematofagia no hospedeiro intermediário infectado, ingere as formas sanguíneas

do parasito, porém, somente os gametócitos são capazes de evoluir no inseto, as demais

formas degeneram-se no estômago do inseto, o gametócito feminino amadurece e transforma-

se no macrogameta, o gametócito masculino, por um processo de exoflagelação, origina os

microgametas (quatro a oito) (Mueller et al., 2009).

O P. vivax possui algumas particularidades diferentes do P. falciparum sendo uma

delas persistir como hipnozoíto nos hepatócitos por meses ou anos antes de iniciar uma

infecção sanguínea, o que explica as recaídas tardias após a cura da infecção original. Até o

momento, os fatores inerentes ao hospedeiro e ao parasito que determinam o número e a

duração destas recaídas ainda não estão plenamente esclarecidos (Mueller et al., 2009).

Alguns autores acreditam que a picada de mosquitos não infectados leva a uma sinalização

13

para ativação dos hipnozoítos latentes, resultando em episódios de recaída (Huldén et al.,

2008) propondo que este seja um mecanismo de sobrevivência do parasito e conservação da

espécie (Wells et al., 2010).

1.2 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DA MALÁRIA

A malária é uma doença da antiguidade, foi reconhecida por Hipócrates e descrita

possivelmente em textos chineses antigos. Acompanhou a saga migratória do ser humano

pelas regiões do Mediterrâneo, Mesopotâmia Índia e Sudeste Asiático. Constituiu-se, assim,

como um dos principais obstáculos ao desenvolvimento de várias comunidades em diversos

países (Cesário & Cesário, 2006). Contudo, o homem passou a ser hospedeiro ocasional ao

ocupar os espaços onde antes existiam apenas os animais, alvos preferidos dos mosquitos

transmissores da malária. Adicionalmente o início da atividade agrícola e os processos

migracionais potencializaram a relação tênue entre o homem e a malária (Ferreira et al.,

2010).

No ano de 2012, 3,4 bilhões de pessoas no mundo estavam em áreas de risco de

malária, com uma estimativa de 207 milhões de casos e 627.000 mortes. Das mortes

estimadas, 90% ocorreram na África Subsaariana em crianças menores de 5 anos de idade

(77% dos casos). As taxas de mortalidade por malária caíram em todo o mundo cerca de 45%,

devido às medidas de controle empregadas contra a doença. Isso tem sido observado desde

2000, onde mais da metade dos países com transmissão contínua da malária registram

diminuições na incidência, internação e morte por malária (WHO, 2013).

Essa contínua diminuição na incidência da malária no mundo de 227 milhões, no ano

2000, para 198 milhões em 2013, reflete na redução de 100% na região Europeia, 76% na

região das Américas, e 34% na região Africana, ao longo dos anos. Na última década, houve

um progresso de controle e prevenção da malária sem precedentes na história da região

africana, as taxas de mortalidade, nesse período, ocasionada pela malária, foram reduzidas em

54%. Essa redução se deu pelo fato do significativo aumento de intervenções de controle do

vetor, na oferta de testes rápidos de diagnóstico e tratamento com terapias combinadas à base

de artemisinina (WHO, 2014).

Cerca de 60% dos casos de malária registrados na América do Sul são provenientes da

Amazônia Legal (Areválo-Herrera et al., 2012). No Brasil, a área endêmica compreende a

região da Amazônia Legal, que inclui os Estados do Acre, Amapá, Pará, Rondônia,

Amazonas, Tocantins, Mato Grosso, Maranhão e Roraima. Os casos registrados nessa região

14

respondem por 99% dos casos autóctones de malária, no país, e 80% dos casos registrados

fora da região Amazônica são importados dos estados pertencentes à esta área (Brasil, 2014;

Parise, 2014).

Em 2003, foi implantado o sistema Informatizado de Vigilância Epidemiológica em

malária (SIVEP-Malária) pelo Programa Nacional de controle de malária (PNCM) do

Ministério da Saúde (MS), permitindo monitorar e dar cobertura a toda a região malárica,

além de orientar os programas estaduais e municipais e gerar informações de forma a

estratificar as áreas de alto risco com maior facilidade. Mas, apesar de a ferramenta ter

melhorado os serviços de vigilância epidemiológica, não se tornou prática rotineira o uso de

mecanismos automatizados para detecção de epidemias, conforme sugestões internacionais

(Braz et al., 2013).

Em 2010, foram notificados 333.460 mil casos no Brasil, sendo a maioria na Região

Amazônica. Apesar do número de óbitos e internações ter sido reduzido, a questão da

transmissibilidade ainda preocupa. Apesar dos esforços do programa nacional e dos

programas estaduais, em quase uma década, não se obteve uma redução efetiva desse

indicador (Braz et al., 2014). A incidência da malária nas últimas quatro décadas sofreu

significativa variação (Figura 1). Até a década de 1990, o aumento foi devido à construção de

grandes rodovias na Região Norte, expansão de áreas de garimpos e projetos de colonização

(Hermes et al., 2013).

Após esse período, houve um período de relativa tendência à estabilização, com

bruscas quedas e elevações no número de casos. O último pico significativo se deu no ano de

2005, onde o aumento dos criadouros do mosquito vetor da malária foi o principal

responsável, em função da atividade de piscicultura desordenada com a construção de tanques

artificiais nas periferias de diversas cidades da Região (Brasil, 2013). No ano de 2014, os

números voltaram a se comparar com os registrados no final da década de 1970 (Brasil,

2015).

Na Região Amazônica, a incidência se alia aos fatores já largamente conhecidos como

sendo causa da disseminação da doença, tais como: ocupação do solo de forma inadequada,

fatores ambientais e biológicos e transformações oriundas do comportamento humano (Braz

et al., 2013). Segundo Braz et al (2014), para que haja um controle realmente eficiente, é

necessário que se conheçam previamente as variações sazonais, cíclicas e históricas da

doença, por localidade, descrevendo onde e quando ocorre, identificando precocemente as

mudanças não esperadas, ou seja, as epidemias e, de posse das informações, montar

estratégias viáveis a cada localidade específica.

15

Figura 1 - Série histórica do número de casos na região Amazônica no período de 1970 a

2014. (Fonte: Brasil, 2015).

Nos estudos de Braz et al (2013), foi observado que em 2010 foram registrados mais

de 300.000 mil casos de malária por ano no Brasil, sendo 99,6% na Região Amazônica.

Durante esse período, foram introduzidos diversos programas com o objetivo de controlar a

endemia e, mesmo com todos os esforços nas três esferas do governo, os casos continuam em

patamares elevados. Para Braz et al (2012), este alto índice de parasitas indicou a necessidade

de melhorar a vigilância da doença para apoiar medidas de controle e prevenir uma situação

epidêmica, com mais casos relatados do que o esperado. Além disso, uma das estratégias da

Organização Mundial da Saúde (OMS) para controle de doenças é fortalecer a capacidade

local para permitir e promover a avaliação regular da malária, visando intervenções adequadas

e oportunas.

Também é necessário avaliar rotineiramente se essas ações estão contribuindo para

reduzir a incidência da doença. Segundo o ministério da saúde, desde 2000 houve uma

redução de mais de 50% no número de casos de malária no país. Em novembro de 2015, o

governo lançou o Plano de Eliminação da Malária no Brasil para ajudar o país a cumprir a

meta dos Objetivos de Desenvolvimento Sustentável, da Organização das Nações Unidas, de

reduzir em 90% o número de casos da doença até 2030. Em 2014, o Brasil registrou 143.250

casos de malária, o menor número desde 1989 (Penido, 2016). Apesar dos poucos casos

autóctones na região Extra-Amazônica, a doença não pode ser negligenciada diante do risco

de reintrodução, agravado pelo fluxo migratório em áreas suscetíveis, bem como pela

16

possibilidade de aumento da letalidade devido ao diagnóstico tardio e manejo clínico

inadequado.

Embora o principal vetor (Anopheles darlingi) esteja presente em cerca de 80% do

país, atualmente, a incidência de malária no Brasil é quase exclusivamente (99,5% dos casos)

restrita à Região da Amazônia Legal. Nesta área, uma combinação de condições

socioeconômicas e ambientais favorece a proliferação do mosquito e, consequentemente, a

exposição de grandes contingentes populacionais de residentes ou visitantes ao risco

(Oliveira- Ferreira et al., 2010).

Nesse contexto, o risco da ocorrência anual de casos em determinado espaço

geográfico é estimado pela Incidência Parasitária Anual (IPA), que é expressa pelo número de

exames positivos de malária a cada mil habitantes (Figura 2). A IPA pode ser classificada

como de baixo risco (IPA<10); médio risco (IPA: 10-49) e alto risco (IPA>50). O Estado do

Amapá apresentou IPA variável entre os municípios distribuídos em baixo, médio e alto risco

de transmissão.

Figura 2 - Áreas de transmissão de malária no Brasil de acordo com Incidência Parasitária

Anual (IPA) no ano de 2015. (Fonte: SIVEP-MALÁRIA/SVS 2015. Acesso em 18/07/2017).

Esta heterogeneidade torna-se ainda mais evidente nos inquéritos realizados em

unidades espaciais como vilarejos e pequenas comunidades rurais. Pode ser explicados por

diversos fatores como a presença de criadouros do anofelino e a distância entre eles e os

domicílios humanos, assim como as características dos domicílios, a densidade demográfica e

17

o uso de medidas de proteção contra o mosquito e contra o parasito (Silva et al., 2008; Silva-

Nunes et al., 2010).

Na Amazônia brasileira, bem como em diversas áreas endêmicas do mundo, a

distribuição da malária apresenta grande heterogeneidade. Adicionalmente a esse contexto, no

início da década de 1990, a Amazônia Legal compreendida pelos Estados do Amapá (AP),

Acre (AC), Amazonas (AM), Maranhão (MA), Mato Grosso (MT), Pará (PA), Rondônia

(RO), Roraima (RO) e Tocantins (TO) registra elevada incidência de malária (Oliveira- Filho

& Martinelli, 2009). De acordo com o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), a

Amazônia Legal possui cerca de 26.9 milhões de habitantes (13,4% da população brasileira) e

59,75% do território nacional (IBGE, 2014). O Estado do Amapá apresentou como numero de

casos notificados de malária de 12.830 e IPA de 17,1 no ano de 2014 (Figura 3).

Figura 3 – Casos de malária e Incidência Parasitária Anual (IPA) no ano de 2014. (Fonte:

SIVEP-MALÁRIA/SVS/MS 2017. Acesso em 18/07/2017).

Na Amazônia Brasileira, a incidência da malária está associada às interações entre a

forma de uso da terra, o comportamento humano, os elementos físicos e biológicos do meio

natural e as transformações causadas pela intervenção humana (Confalonieri, 2005), como

exemplo, colonização agrícola, pecuária, extrativismo vegetal e mineral, além da construção

de estradas e de usinas hidrelétricas (Barbieri, 2005). No contexto brasileiro, deve ser

fortemente destacada os fatores socioeconômicos que modulam o autocuidado, a exposição

aos fatores de risco, a identificação da doença como problema de saúde pública, as condições

para a adoção de meios de prevenção e a adesão ao tratamento (Braz et al., 2013).

Adicionalmente, os determinantes políticos interagem nessa complexa rede de causalidade,

18

com especial destaque para os diferenciais de gestão em saúde pública nos três níveis de

governo ao longo do tempo.

No Estado do Amapá, a malária tem acometido grande parte da população ao longo

dos anos. Dentre os principais motivos está a sua condição de área endêmica, devido às

características ambientais propícias ao hábitat e proliferação do vetor, bem como a circulação

dos protozoários do gênero Plasmodium. Fazendo a análise de uma série histórica do número

de casos de malária notificados no Estado, é possível observar uma redução ao longo dos anos

(Figura 4).

Figura 4 - Número de casos de malária notificados no Estado do Amapá e diferença

percentual entre os anos de 2003 a 2017 (Fonte: SIVEP-malária/DATASUS/MS, 2017). Os

dados de 2017 são dados preliminares até Junho, sujeito a alteração.

Na malária, a dinâmica do número de casos se dá em razão do comportamento

humano, como ocupação do solo através dos assentamentos e construção de roças, de estradas

de rodagem ou de hidroelétricas, além de frentes de trabalho na mineração, que fazem com

que aumentem esses valores (Gomes et al., 2015). Da mesma forma, há mobilidade desses

números com relação aos serviços oferecidos pelos programas de controle, ou seja, se há

investimento com equipe de saúde, educação e intervenção com diagnóstico e tratamento em

tempo hábil, esses valores são reduzidos (Cardoso, 2014; Gomes et al., 2016). A redução ou

aumento no número de casos de malária está diretamente relacionado à rede de notificação e

diagnóstico deste agravo nos municípios, bem como à realização de ações de controle

vetorial.

19

De acordo com Cardoso (2014) a malária no Estado do Amapá segue o eixo da

Rodovia que liga a capital ao município de Oiapoque e que os municípios que não possuem

garimpo sofrem influências dos demais, tendo como exemplos o município de Oiapoque

(Influência dos Garimpos da Guiana Francesa); Calçoene (Possui a maior área garimpeira do

Estado do Amapá – Garimpo do Lourenço); Pedra Branca e Serra do Navio (Possuem grandes

mineradoras); Porto Grande (Garimpo do Vila Nova); Ferreira Gomes (Garimpo do Capivara,

cujo Influencia em Tartarugalzinho) Laranjal e Mazagão são terras de assentamento e ficam

próximos de garimpos. Entretanto, se os programas de controle estiveram articulados

adequadamente para cada área, a tendência deveria ser a de controle da endemia. Nos estudos

de Cardoso & Goldemberg (2007) a migração faz com que essas taxas aumentem,

dificultando assim o controle da endemia.

Adicionalmente a esse contexto, no Estado do Amapá foi realizado um comparativo

entre os anos de 2012 a 2016, por categoria de local provável de infecção, demonstrando que

a área indígena foi a que mais sofreu aumento dos casos de malária (299%) no ano de 2015,

fato relacionado à dificuldade na realização das medidas de controle vetorial e detecção ativa

que o Distrito Sanitário Especial Indígena (DSEI Amapá e Norte do Pará) vem enfrentando.

As áreas urbanas, indígenas de garimpo também sofreram aumento (Figura 5).

Figura 5 - numero de caso de malária no estado do Amapá, por categoria de local provável de

infecção e diferença percentual entre os anos de 2012 a 2016. (Fonte: SIVEP-

malária/DATASUS/MS, 2017).

20

Com relação à malária em áreas urbanas, especificamente na capital, Macapá, a

malária é periurbana, onde se encontram áreas de ressaca, fragmentos de florestas e

assentamentos desordenados (invasões). Num estudo realizado nos anos de 2007 e 2008, na

comunidade de Lagoa dos Índios, a abundância dos vetores se associou com o padrão sazonal

das chuvas. Deste modo, considerou-se que a transmissão de malária se mantém durante todo

o ano na cidade de Macapá (Galardo et al., 2013). Embora a malária se mantenha como

padrão de permanência entre os municípios do estado do Amapá é necessário um

monitoramento continuo dessa enfermidade, visando atingir cada vez mais o que é

preconizado pelo Ministério da Saúde: Diagnóstico precoce e Tratamento imediato e

adequado na quebra da cadeia de transmissão da doença.

Com relação às áreas indígenas, pouco se sabe sobre a ecologia dos vetores da malária

e suas relações com as populações indígenas. Os estudos demostram o vetor Anopheles

darlingi exibir comportamento predominantemente exofílico (Coimbra Jr et al., 2005). A

presença diária e nos mais variados horários de indígenas às margens de cursos d’água no

entorno das aldeias, inclusive nos momentos de pico da atividade anofélica, expõe os

indivíduos de ambos os sexos e de todas as idades ao risco de infecção, possivelmente

elevando esses percentuais a cada ano.

Para as áreas de garimpo, o desenvolvimento do ciclo malarígeno depende não apenas

das características naturais do meio ambiente, como também da presença do homem no

manuseio e forma de uso da terra influenciando os níveis de ocorrência de malária (Silva-

Nunes et al., 2008). Para compreender como a heterogeneidade da ocupação se relaciona com

a incidência da malária, é preciso abordar não apenas a dimensão biológica da doença, mas

também como esse processo ocorre no espaço regional, influenciando as características

populacionais e ambientais (Barbieri & Sawyer, 2007). Dentre as características importantes,

para áreas garimpeiras, na transmissão da malária é a quantidade de locais propícios à

reprodução dos vetores, como: cavas abandonadas que acumulam águas de chuva, grande

aglomerado de pessoas em um espaço pequeno e uma grande migração interna facilita a

entrada e saída de pessoas infectadas ou não, e a constante renovação de população de

suscetíveis.

1.2.1 Epidemiologia da Malária no Município de Oiapoque

O município de Oiapoque, pertencente ao Estado do Amapá, região Amazônica,

extremo norte do Brasil, fronteira ocidental da região amazônica. Faz fronteira ao norte com a

Guiana Francesa, ao sul com os municípios de Calçoene, Serra do Navio e Pedra Branca do

21

Amapari, ao leste é banhado pelo Oceano Atlântico. A área geográfica de Oiapoque é de

22.625 km2, possui população de 20.426 habitantes segundo IBGE (2010), além de uma

população flutuante (fluxo migratório de curto prazo) que não entra nas estatísticas oficiais

em virtude da intensa mobilidade de pessoas entre as cidades gêmeas de Oiapoque no Amapá

e Saint-Georges na Guiana Francesa com objetivo de trabalhar em cidades da Guiana

Francesa ou nos garimpos clandestinos, fator de aumento da vulnerabilidade à malária no

município de Oiapoque.

O clima é equatorial, com uma umidade relativa média de 82%. A precipitação anual

varia entre 2.700 e 3.300 mm. A temperatura média é de 27ºC, variando entre 26 e 33°C.

Temperaturas mais altas coincidem com os meses mais secos do ano de setembro a novembro.

O município também possui características que contribuem para as ocorrências dos casos de

malária, condições ambientais favoráveis ao Anopheles vetor da malária inclusive com áreas

indígenas isoladas e com presença de transmissão da doença (Galardo et al., 2013; Gomes et

al., 2016).

As áreas fronteiriças entre os países são muitas vezes caracterizadas por intensos

fluxos populacionais transfronteiriços (Peite et al., 2008). A cidade de Oiapoque encontra-se

na fronteira entre a Guiana Francesa e o Estado brasileiro do Amapá, onde há um fluxo

populacional intenso e continuo com o município francês de Saint Georges. Na Guiana

Francesa, a malária é endêmica e distribuída ao longo dos rios Maroni e Oiapoque, enquanto a

área costeira que faz fronteira com o Oceano Atlântico quase não possui transmissão da

malária (Nacher et al., 2013).

O contínuo fluxo migratório na fronteira Brasil - Guiana Francesa tem como ponto de

convergência o município de Oiapoque, que apresenta um índice de parasitemia anual

considerado como área de médio risco para transmissão de malária (SIVEP-

malária/DATASUS/MS, 2017). De fato, o Ministério da Saúde observou uma redução no

número de casos de malária ao longo dos anos na maioria dos municípios amazônicos em que

ocorre a transmissão, mas o mesmo não ocorreu nas áreas que se localizam na faixa de

fronteira (Gomes et al., 2016).

Esta falha no controle é uma preocupação para as autoridades de saúde e vários fatores

têm sido atribuídos, sendo necessária pesquisas mais aprofundadas para entender os

determinantes dessa malária a fim de estabelecer as melhores medidas de controle possíveis.

Segundo Andrade (2005), ao estudar a expansão da malária e sua vinculação com o processo

migratório no período de 1990 - 2003 observou que a situação da malária importada pela

fronteira, no período analisado, influenciou na manutenção e propagação da doença, visto

22

que, não somente manteve o IPA de alto risco de transmissão, como também contribuiu com

o aumento nos casos de infecção. De 2003 a 2014 foram notificados 53.958 casos de malária,

com IPA durante o período de 250,2/1000 habitantes (Figura 6).

Figura 6 - Série histórica de casos totais e Incidência Parasitária Anual durante o período de

2003 a 2014 no município de Oiapoque-Amapá (SIVEP-malária/DATASUS/MS, 2017).

Acompanhando a redução que ocorreu no país, o IPA em 2014 chegou a 39,5/1000

habitantes. Entre os casos notificados 27.301 (50,6%) foram autóctones e 26.657 (50,1%),

foram importados. Em relação aos casos autóctones, 8.470 (31%) foram na área urbana e

21.212 (69%) na área rural. Plasmodium vivax (61,4%) foi a espécie parasitaria predominante

seguido do P. falciparum (35,4%). A IPA média nas áreas indígenas foi de 254,6/1000

habitantes (SIVEP-malária, 2017). A Guiana Francesa contribuiu com 98,1% de casos

importados, sendo vários garimpos clandestinos relatados como local provável de infecção,

com o maior percentual oriundo do garimpo do Sikini com 21,9% dos casos (Figura 7).

Figura 7 - Casos de malária por P. vivax segundo local provável de infecção e importados dos

garimpos clandestinos da Guiana Francesa para Oiapoque (Fonte: Adaptada de Gomes et al.,

2015).

23

Em se tratando do fluxo migratório, essa fronteira internacional vem implicando

trânsito intenso, principalmente feito por brasileiros em direção aos garimpos clandestinos ou

aos trabalhos em cidades da Guiana Francesa, onde, muitos dos residentes em Oiapoque

possuem familiares envolvidos na extração de ouro ou outro tipo de atividade nos garimpos.

Entretanto, como essa população não é registrada por ocasião dos recenseamentos feitos no

município, não aparece nos censos populacionais (Cardoso, 2014; Gomes et al., 2015; Gomes

et al., 2016).

Essa relação entre homem e meio ambiente perdura ao longo dos anos e estabelece

uma articulação necessária de subsistência que envolve diversos fatores sociais e econômicos

que registram a presença de garimpeiros clandestinos nesta região e que vivem em condições

de vida e de trabalho de extrema precariedade. Esse grupo se desloca constantemente nos dois

sentidos e, especialmente, vem à procura de tratamento para repetidas infecções por malária.

Esse é o fenômeno conhecido como “malária importada”. No entanto, um hábito comum entre

os garimpeiros de ingerir medicamentos sem o devido acompanhamento e orientação médica,

acaba se refletindo nas resistências aos antimaláricos indicados pelo Ministério da Saúde do

Brasil (Gomes et al., 2015; Gomes et al., 2016).

As áreas de fronteira internacional são regiões que merecem atenção especial em

relação à saúde. Os limites internacionais criam empecilhos técnicos, políticos e operacionais

no controle das endemias, com explicita dificuldades em fornecer atenção integral à saúde aos

cidadãos fronteiriços que vivem e circulam entre a cidades gêmeas (Silva-Nunes et al., 2008;

Silva et al., 2010; Gomes et al., 2016). A vigilância e o controle da malária na fronteira

compreendem um grande desafio, pois a mobilidade transfronteiriça faz parte do cotidiano da

população e dificulta o controle dessa enfermidade.

O processo saúde-doença, geralmente, transcende as fronteiras e pode afetar ambos os

lados, podendo propagar-se, até mesmo, para regiões remotas dos limites dos países, no

entanto, a informação e direitos não atravessam o limite internacional, mas os agentes e

vetores produtores de doenças circulam livremente por essas áreas (Levino & Carvalho,

2011). Nesse contexto, as precárias condições de vida de grande parte das populações

fronteiriças, a ocupação desordenada do espaço, as intervenções politicas mal planejadas e os

diversos fluxos migratórios contribuem para o aumento da receptividade aos vetores e da

vulnerabilidade da população nessas áreas.

No Município de Oiapoque, a malária tem acometido grande parte da população ao

longo dos anos. Fazendo a análise de uma série histórica do número de casos de malária

notificados no município, é possível observar uma redução ao longo dos anos (Figura 8). No

24

ano de 2003, Oiapoque apresentou um cenário de 3.877 casos, nos anos posteriores, houve

aumento e diminuição, fechando o ano de 2016 com 897 notificações positivas. Essa redução

no número de casos de malária ao longo dos anos está diretamente relacionado à rede de

notificação e diagnóstico deste agravo no município, bem como à realização de ações de

controle vetorial.

Figura 8 - Serie histórica do número de casos de malária notificados no município de

Oiapoque e diferença percentual entre os anos de 2003 a 2016. (Fonte: SIVEP-

malária/DATASUS/MS, 2017).

Adicionalmente, no Município de Oiapoque foi realizado um comparativo entre os

anos de 2003 a 2016, por categoria de local provável de infecção, demonstrando que a área

indígena foi a que mais sofreu aumento dos casos de malária (59%) no ano de 2016 (Figura

9), fato relacionado à dificuldade na realização das medidas de controle vetorial e detecção

ativa dos casos, por serem locais de difícil acesso. Estatísticas vitais e essenciais para

monitorar o perfil de saúde/doença e planejar ações de saúde e educação, não são disponíveis

para a ampla maioria dos grupos. Neste sentido, Coimbra jr. & Santos (2000) chamam

atenção para as implicações do que denominam uma danosa invisibilidade demográfica e

epidemiológica.

25

Figura 9 - Serie histórica do número de casos de malária por categoria de local provável de

infecção notificados no município de Oiapoque e diferença percentual entre os anos de 2003 a

2016 (Fonte: SIVEP-malária/DATASUS/MS, 2017).

O perfil epidemiológico dos povos indígenas no Brasil é muito pouco conhecido, o

que decorre da exiguidade de investigações, da ausência de censos e de outros inquéritos

regulares e da precariedade dos sistemas de registro de informações sobre morbidade,

mortalidade, cobertura vacinal, dentre outros fatores (Coimbra Jr. & Santos, 2000). A

relevância da malária no perfil epidemiológico da população indígena é inquestionável

(Ianelli, 2000). Grupos vivendo em certas áreas da Amazônia em especial aquelas sob a

influência de fluxos migratórios, atividades de mineração e garimpos ou de implantação de

projetos de desenvolvimento, são particularmente vulneráveis (Gomes et al., 2016).

Adicionalmente a esse contexto, nas áreas urbanas e rurais tem sido observada uma elevada

taxa de morbidade da malária geralmente proveniente de outras localidades (Figura 9).

A maioria dos casos de malária importados do município de Oiapoque é proveniente

da Guiana Francesa. Por conta da fronteira, muitos brasileiros se deslocam para lá para

desempenhar atividades garimpeiras e voltam contaminados com malária, além dos que lá

residem e mantém intenso fluxo de entrada e saída no referido município, contribuindo para a

transmissão de novos casos (Gomes et al., 2016). Áreas fronteiriças e de garimpo representam

26

um desafio para o controle da malária, por apresentarem intenso fluxo migratório, e um

ambiente favorável para a manutenção e disseminação da doença na região.

1.3 PARASITOS GASTROINTESTINAIS NO BRASIL

Os parasitos gastrointestinais são cosmopolitas e comuns em muitas partes do mundo,

sendo responsáveis pela morbidade e mortalidade de grande parte da população,

especialmente em países de baixo status socioeconômico. É considerada um sério problema

de saúde pública nos países subdesenvolvidos e em desenvolvimento (Mahmud et al., 2013).

São mais prevalentes em ambientes quentes e úmidos, sobretudo de populações que ocupam

ambientes em condições sanitárias inapropriadas e que, ocasionalmente, concentram-se em

grupos de grande mobilidade e pluralidade com complexo e dinâmico quadro de saúde

relacionado a processos sociais, econômicos e ambientais (Oliveira et al., 2015).

Embora a prevalência de infecções gastrointestinais seja maior nos países em

desenvolvimento, essas doenças são frequentes nos países industrializados, provavelmente em

associação com a globalização através abastecimento alimentar e com a imigração e/ou

adoção de regiões endêmicas para viagens (Calderaro et al., 2014). Estima-se que infecções

intestinais causadas por helmintos e protozoários afetem mais de 2 bilhões de pessoas no

mundo, e estão entre os muitos problemas de saúde nos países em desenvolvimento,

principalmente, em locais com crescimento rápido e desordenado da população, sem as

adequadas estruturas de abastecimento de água potável e saneamento básico (Lodo et al.,

2010; Siqueira et al., 2011; Vieira & Benetton, 2013).

Embora populações inteiras estejam em risco geograficamente, as crianças são

observadas com a maior carga de infecção. Esta desproporção tem bases comportamentais,

biológicas e ambientais, na qual as crianças tendem a ser mais ativas no ambiente infectado e

raramente empregam bons comportamentos sanitários (Harhay et al., 2010). Adicionalmente a

prevalência das doenças parasitárias pode variar de acordo com a região, havendo influência

na infraestrutura física, no clima e cultura da localidade, estando esses fatores associados à

quantidade e ao tipo das parasitoses que infectam os indivíduos (Semedo et al., 2014). O

Brasil possui índices variáveis de parasitoses intestinais em diferentes municípios e regiões,

resultante das condições climáticas, sociais, econômicas e sanitárias das localidades, assim

como, condições do solo, água e alimentos dessas regiões (Hailegebriel, 2017).

Os parasitos encontrados no trato gastrointestinal humano podem ser categorizados em

dois grupos, helmintos e protozoários. Os helmintos transmitidos pelo solo (Ascaris

27

lumbricoides, Ancilostomíase e Trichuris trichiura) são os mais prevalentes, no Brasil entre

os protozoários, Giardia intestinalis e o complexo Entamoeba histolytica/díspar protozoários

patogênicos, sendo os comensais, Endolimax nana e Entamoeba coli não menos importantes

nos estudos de prevalência (Kubiak et al., 2017). Esses comensais indicam a ingestão de água

ou alimentos contaminados com resíduos fecais e que, portanto, estão sob risco de

contaminação de amebas patogênicas reforçando a importância do diagnóstico e descrição

destes comensais, a fim de se programar medidas preventivas para evitar infecção pela

Giardia intestinalis e E. histolytica (Belloto et al., 2011).

A frequência de giardíase sofre variações quanto à distribuição mundial, ficando a taxa

de incidência entre 11% e 30% (Mbuh et al., 2010). Globalmente, estima-se que existem 280

milhões de casos de infecção por G. intestinalis por ano em todo o mundo, mas

principalmente na Ásia, África e América Latina, a giardíase sintomática envolve cerca de

200 milhões de pessoas e, a cada ano, cerca de 500 mil novos casos sintomáticos são

detectados. Na União Europeia em 2012, foram documentados 16 368 (5,43 por 100 000

habitantes) de casos confirmados de giardíase (Kubiak et al., 2017). Nos Estados Unidos da

América, G. lamblia é considerado o parasito intestinal mais comumente encontrado no

homem representando a principal causa de diarreia causada por protozoário intestinal. Sabe-se

que a frequência de infecção por giardíase e do complexo Entamoeba histolytica/díspar varia

de acordo com a população e a região estudada e que é maior em países em desenvolvimento

(Huang & White, 2006).

Considerando os esforços para uma melhor compreensão da epidemiologia de

parasitos intestinais, relativamente poucos estudos equivalentes são feitos em protozoários

intestinais. Isso é surpreendente, porque a amebíase intestinal causada pelo protozoário

Entamoeba histolytica é a terceira maior doença parasitária responsável pela morte no mundo

após a malária e esquistossomose (Ouattara et al., 2010). No Brasil, a ampla diversidade das

características socioeconômicas, climáticas e geográficas tem sido apontada como fator crítico

para o perfil dos agentes etiológicos na diarreia, modelando assim a frequência destes

diferentes enteropatógenos (Belloto et al., 2011). Adicionalmente para Sánchez-Arcila et al

(2014), a falta de conhecimento e cuidados com a saúde potencializa a manutenção desses

patógenos, acarretando numa grande frequência de enteroparasitas patogênicos.

Ademais, o Brasil, principalmente a região Amazônica, as geohelmintíases apresentam

uma prevalência elevada e os helmintos intestinais mais comuns que infectam os seres

humanos são o A. lumbricoides, T. trichiura e Ancilostomídeos (Araújo & Fernandez, 2005).

Estes são amplamente distribuídos em países tropicais, infectando mais de um bilhão de

28

pessoas (Figura 10). Essa distribuição helmíntica no hospedeiro humano pode abrigar poucos

ou muitos parasitos, e tem consequências clínicas para os hospedeiros, pois é principalmente a

intensidade da infecção que determina a gravidade da morbidade (Wammes et al., 2014). A

maioria dos nemátodos intestinais como A. lumbricoides e T. trichuris são adquiridos através

da ingestão de ovos infectantes do solo contaminado com fezes humanas infectadas, enquanto

as infecções por Ancilostomídeos ocorrem quando as larvas infectantes do solo penetram na

pele do individuo (Morenikeji et al., 2009).

As geohelmintíases humanas, geralmente negligenciadas, têm grande importância no

contexto universal, o A. lumbricoides é o nematódeo mais frequente a infectar o trato

intestinal humano, a maioria das infecções envolve pequeno número de parasitos adultos e é

assintomática. A manifestação dos sintomas da ascaridíase depende do número de parasitos

adultos albergados pelo indivíduo. Infecções maciças podem resultar em bloqueio mecânico

do intestino delgado, principalmente em crianças (Melo et al., 2004). Os T. trichiura

colonizam o ceco (intestino grosso), sua penetração nos tecidos provoca inflamações e

pequenas hemorragias de modo que, quando presente em um grande número, podem causar

disenteria e até mesmo um prolapso retal (Hall et al., 2008). A ancilostomose raramente é

sintomática, até que seja estabelecida uma carga significativa de parasitas intestinais. A maior

preocupação da infecção é a espoliação de sangue, os ancilostomídeos consomem cerca de

0,25 mL de sangue por dia, podendo causar anemia e que pode estar associada a um retardo

físico e mental dos indivíduos afetados (Kucik et al., 2004).

Figura 10 - Frequência da distribuição de geohelmintos no Brasil de 1995 a 2013. a) A.

lumbricoides; b) T. trichiura e c) Ancilostomídeos (Adaptada de Charmmartin et al., 2014).

A infecção por helmintos influencia o estado nutricional, mas seu impacto sobre a

anemia não é clara. Na região amazônica, como em muitas outras partes do mundo, as áreas

endêmicas de malária coincidem com locais de alta prevalência de helmintíase intestinal

29

(Nacher, 2012). Essas características sugerem uma longa coadaptação evolutiva entre esses

parasitos e o homem. A chave para esta parceria é a interação imunológica entre helmintos e

seus hospedeiros mamíferos, polarizando as respostas imunes e modulando os processos

regulatórios, o que pode explicar a sua sobrevivência dentro de um hospedeiro a longo prazo

(Allen & Maizels, 2011). Além de representar uma tendência temporal de permanecia com

variabilidade e complexidade epidemiológica de cada parasito. Esta diferença destaca a

importância de estudos na busca de estimativa do risco de infecção por helmintos e outras

doenças tropicais negligenciadas.

Nesse contexto, a principal consequência da associação entre malária e das

geohelmintoses é a anemia. Por meio dos mecanismos de hemólise a malária se torna um

importante contribuinte para a ocorrência de anemia, enquanto que infecções com moderada ou

elevada intensidade causada pelo Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura e Ancilostomídeos,

são perniciosas, produzindo frequentemente anemia, e tendo como consequência à espoliação

sanguínea que quando não tratada e associada a desnutrição, se torna muitas vezes fatal

(Stephenson et al., 2000; Nacher, 2011; David et al., 2013). Estudos epidemiológicos que

avaliam concomitantemente as parasitoses intestinais, malária e a anemia de uma população

são importantes para o conhecimento da realidade local, contribuindo para que novas

estratégias de prevenção e controle sejam aplicadas com maior eficiência.

1.4 COINFECÇÃO MALÁRIA E PARASITOS GASTROINTESTINAIS

O múltiplo parasitismo é comum e as taxas de coinfecção dependem da distribuição

espacial das condições ambientais que permitem a transmissão dos parasitos, além das

interações imunológicas e de outros fatores, pelos parasitos, que possam alterar a

susceptibilidade ou o comportamento do hospedeiro (Knowles, 2011). Nesse contexto, o

maior obstáculo ao controle efetivo de parasitas intestinais em populações em risco é o

conhecimento inadequado da distribuição geográfica da infecção e as variáveis demográficas

que influenciam a sua prevalência (Brooker et al., 2006a). Apesar da elevada frequência e da

importância global para a saúde essas doenças são negligenciadas e poucos estudos retratam

sua prevalência a nível global, contribuindo para a compreensão geral da epidemiologia

desses patógenos na coinfecções.

Dessa forma, protozoários do gênero Plasmodium agente etiológico da malária, e

muitas espécies de parasitos intestinais (protozoários e helmintos) compartilham da mesma

área de distribuição geográfica, podendo assim ambos os tipos de parasitos coinfectar uma

30

mesma população de hospedeiros, principalmente nas áreas que apresentam características

geográficas, climáticas e socioeconômicas peculiares que favoreçam a sua existência e

manutenção (Brasil, 2005). Essa coinfecção de um mesmo hospedeiro pode influenciar de

maneira positiva (facilitação) ou negativa (competição) através de diferentes mecanismos

como competição por recursos e interações mediadas por via imune, potencializando ou

inibindo a malária no hospedeiro (Knowles, 2011). Desta forma, tem-se centrado sobre as

interações da coinfecção entre a malária e as helmintíases intestinais, e diversos estudos com

dados preliminares sugerem um decréscimo na gravidade da malária, entre os coinfectados

com helmintos intestinais (Degarege et al., 2012). Esse contexto fortalece as pesquisas de

coinfecção malária-parasitoses intestinais focadas na coinfecção malária-helmintos, não se

tendo amplo conhecimento a respeito das coinfecções de malária-protozoários intestinais.

Quando se trata dessas coinfecções o Ascaris lumbricoides é o helminto mais

investigado e resultados contraditórios tem sido detectado. Estudos revelaram que a

coinfecção com o A. lumbricoides foi associada com uma diminuição da malária (incidência,

prevalência ou redução da parasitemia) (Brutus et al., 2006; Boel et al., 2010). Para a malária

cerebral ou insuficiência renal, dois estudos identificaram o A. lumbricoides como o único

helminto associado à proteção contra a malária grave em adultos (Bejon et al., 2008).

Ademais, um trabalho observou um aumento da malária grave em crianças infectadas por este

nematelminto no continente africano (Le Hesran et al., 2004).

As infecções por Ancilostomídeos parecem também estar associado a casos de malária

por P. falciparum na África, essa alta prevalência de ambas as infecções entre os indivíduos é

extremamente comum nesta localidade (Brooker et al., 2006b). Os ancilóstomos são o

segundo nematoide gastrointestinal relatado em interações com malária (Nacher et al., 2000).

De fato, diversos estudos demonstram aumento da frequência de malária na coinfecção com

estes enteroparasitos (Boel et al., 2010; Pullan et al., 2011; Degarege et al., 2012), e aumento

da gravidade da anemia devido aos distintos mecanismos através dos quais cada parasita

causa anemia (Brooker et al., 2006b), enquanto que, apenas um estudo não encontrou

nenhuma associação entre a presença de Ancilostomídeos e a infecção malárica (Shapiro et

al., 2005).

A maioria dos estudos envolve o Plasmodium falciparum, no entanto, o efeito protetor

da malária pelo Plasmodium vivax foi também observado em três estudos - dois fora do Brasil

(Murray et al., 1978; Boel et al., 2010) e um no Brasil, onde Melo et al (2010) evidenciaram

que as helmintíases intestinais estão associadas com a proteção para a redução dos níveis de

hemoglobina, durante os episódios de malária por P. vivax, em uma população infantil da

31

cidade de Manaus no Estado do Amazonas. Adicionalmente, há evidências crescentes de que

a coinfecção com múltiplos parasitas pode prejudicar a resposta imune do hospedeiro a

parasitas isolados e pode aumentar a suscetibilidade à doença clínica de maneira que

atualmente não são claramente compreendidas (Druilhe et al., 2005; Mwangi et al., 2006).

Outro ponto interessante sobre as coinfecções entre o plasmódio e helmintos é o

aumento de gametócitos circulantes, aumento de duração da infecção e o aumento da

atratividade do hospedeiro para o vetor (Le Hesran et al., 2004; Nacher, 2012). Tem sido

descrito na literatura que o processo de gametogênese pode ser influenciado pelo estresse

parasitário e múltiplos fatores ambientais (Ono et al., 1993; Dyer & Day, 2000), dentre eles as

baixas concentrações de hemoglobina estão associadas com a circulação de gametócitos na

corrente sanguínea (Price et al., 1999). De fato, em 2001, estudo de coorte realizado na

Tailândia mostra um aumento de duas vezes a quantidade de gametócitos do Plasmodium

falciparum circulantes vinculados ao decréscimo dos níveis de hemoglobina em pacientes

infectados por helmintos (Nacher et al., 2001).

Embora a coinfecção entre o plasmódio e os helmintos seja prevalente em países

tropicais, o efeito de suas interações permanece obscuro (Roussilhom et al., 2010). Alguns

estudos relataram que indivíduos infectados por helmintos são suscetíveis à infecção pelo

plasmódio (Midzi et al., 2011; Ojurongbe et al., 2011), ocasionando o aumento de

gametócitos circulantes (Nacher et al., 2011), e redução dos níveis de hemoglobina (Boel et

al., 2010), bem como suprimindo manifestações clínicas agudas (Murray et al., 1978) e ainda,

aumentando o risco de malária (Spiegel et al., 2003; Nacher, 2011; Nacher 2012). Sabe-se

ainda que o aumento da incidência e da prevalência da malária pode interferir no

desenvolvimento de infecções mistas pelo P.vivax e o P. falciparum e que, a diversidade de

parasitos pode ser maior em pacientes infectados por helmintos (Nacher et al., 2001;

Chaorattanakawee et al., 2003).

Segundo Sánchez-Arcila et al (2014), as diferenças nos resultados obtidos nos

diferentes estudos, podem depender da espécie de parasitos intestinais e da idade de uma

população. Enquanto que a maioria dos estudos de coinfecção retratam a prevalência de

helmintos em crianças, na população do Estado de Rondônia foram encontrados uma

prevalência de protozoários e os participantes do estudo eram adultos (Sánchez-Arcila et al.,

2015). Além disso, o aumento da diversidade genética dos oocistos nos mosquitos

alimentados com sangue de pacientes coinfectados, teoricamente, poderia levar a uma maior

diversidade genética dos parasitos da malária que circulam na população.

32

As implicações evolutivas da coinfecção também podem estender-se à reprodução de

helmintos, que tem interesse de proteger seu hospedeiro para sobreviver e se reproduzir

(Nacher et al., 2000). Estas associações entre helmintíases e malária são bem documentadas

em regiões endêmicas da África e Ásia, principalmente com a malária causada por P.

falciparum. No Brasil, a infecção pelo P. vivax é predominante e, a má-nutrição e a forma

grave são pouco frequentes quando comparado com o continente africano. No entanto, em

áreas endêmicas brasileiras de malária vivax apenas um estudo de associação foi realizado em

uma população infantil da Amazônia oriental brasileira (Melo et al., 2010).

A erradicação da malária vem sendo discutida e a disseminação da resistência aos

antimaláricos é um grande problema para o seu efetivo controle. Portanto, avaliar a

possibilidade de que populações infectadas por parasitas intestinais possam influenciar na

dinâmica de transmissão dos parasitos da malária, bem como na compreensão da doença e sua

progressão, assim como fatores que influenciam o resultado clínico da infecção, são

fundamentais para estratégias diagnósticas e preventivas. A investigação proposta poderá

confirmar os achados já existentes no Brasil e avaliar o efeito da intensidade das

enteroparasitoses no curso da infecção pelo P. vivax.

1.5 IMUNOPATOGÊNESE DA COINFECÇÃO MALÁRIA E ENTEROPARASITOSES

O processo de aquisição de imunidade na malária é, ainda hoje, pouco compreendido,

sendo que inúmeros fatores o influenciam, como: a complexidade do ciclo biológico dos

plasmódios, sua extensa diversidade antigênica, o perfil de transmissão da área endêmica, a

maturidade do sistema imunológico relacionado à idade, status imunológico do indivíduo e/ou

os mecanismos inatos de resistência que o diferem (Langhorne et al., 2008). A resposta imune

contra malária envolve mecanismos inatos e adaptativos, com a participação de vários tipos

de células e anticorpos que podem levar a eliminação do agente ou a imunopatologia (Medina

et al., 2011).

Assim como o P falciparum, o P vivax também induz uma resposta imune específica

no hospedeiro por dois mecanismos: 1 - humorais (TH2) por meio de anticorpos que

fornecem proteção pelo bloqueio da invasão de merozoítos em novas hemácias, reduzindo a

citoaderência e melhoram a atividade fagocítica de macrófagos e monócitos. 2- celulares

(TH1) pelos linfócitos T que ativam os linfócitos B para produção de anticorpos e pela

liberação de citocinas que ativam macrófagos, natural killer (NK), células dendríticas e

neutrófilos para combater a infecção (Wipasa et al., 2011; Medina et al., 2011).

33

A invasão dos eritrócitos pelos plasmódios é um processo fundamental para o

estabelecimento da infecção malárica, constituindo assim um dos principais alvos para a

resposta imune protetora. Diversos trabalhos têm demonstrado que a imunidade direcionada

ao estágio eritrocítico pode contribuir para a redução/eliminação dos parasitos assim como

para o desenvolvimento das manifestações clínicas da doença (Polley et al., 2006; Osier et al.,

2008). As citocinas são moléculas protéicas secretadas por inúmeras células e pelo sistema

imune, com função sinalizadora para o sistema imune. Na malária vivax as citocinas são

liberadas depois da ruptura do eritrócito, com a consequente liberação de merozoitos no ciclo

eritrocítico (Medina et al., 2011).

O equilíbrio entre as citocinas pró e antiinflamatórias se faz necessário para garantir o

controle das alterações imunopatológicas, além de determinar os níveis de anemia, carga

parasitária, grau de pirexia, gravidade clínica, evolução da doença e até mesmo a morte

(Gonçalves et al., 2010; Jain et al., 2010). No entanto, pequenos níveis destas citocinas não

são suficientes para inibir o crescimento do parasito (Sohail et al., 2008). Apesar das

descrições clínicas da doença causada por P. vivax padrões referentes à resposta imunológica

e padrão de citocinas são escassos, e não completamente esclarecidos (Andrade et al., 2010;

Gonçalves et al., 2010; Medina et al., 2011). Vários estudos descrevem o papel do TNF-α,

IFN-γ, IL-10 e IL-4 para a infecção por P. falciparum e sua relação na patogênese da malária

(Vafa et al., 2007; Jain et al., 2010).

Adicionalmente a essa discussão, a superprodução e persistência desses mediadores

podem levar a imunopatologia, com gravidade da doença e até a morte (Sohail et al., 2008).

Os helmintos são conhecidos como reguladores de linfócitos T, levando a produção de

citocinas regulatórias da resposta Th1 (Maizels & Yazdanbakhsh, 2003). Estes nematoides

também modulam as funções das células dendríticas, consequentemente alterando a resposta

imune para os antígenos maláricos (Hartgers & Yazdanbakhs, 2006). Ademais, os ligantes

expressos pelos helmintos estimulam os receptores Toll-like, regulando negativamente a

capacidade de resposta imune durante a infecção concomitante (Boutlis et al., 2006; Wammes

et al., 2010). Sabe-se também que os helmintos provocam anemias e isso aumenta a

atratividade dos hospedeiros ao vetor, podendo tornar a pele mais refratária à picada dos

anofelinos (Hagel et al., 1993), deixando os hospedeiros menos atentos e incapazes de

responder ao ataque, facilitando a passagem do esporozoíto e aumentando a chance da

infecção sanguínea.

Uma das hipóteses específicas para a associação de helmintos com a proteção da

malária grave é que estes parasitos intestinais levam ao aumento do complexo IgE que ativa o

34

receptor para IgE de baixa afinidade (FC€RII) e assim libera IL10 (citocina antinflamatória),

que ativa a óxido nítrico sintetase, que por sua vez leva a liberação de óxido nítrico e reduz o

sequestramento de hemácias parasitadas (Nacher, 2002). Outra hipótese é que a proteção pode

ser induzida por transferência passiva de IgG de indivíduos imunes para malária para

pacientes infectados com o plasmódio (Roussilhon et al., 2010). Altas cargas parasitárias de

helmintos estão associadas com o não balanceamento Th2/Th1 (Pearce et al., 1991) e,

portanto, pode ser responsável por um direcionamento de resposta imune Th2 mediado por

helmintos contra antígenos maláricos.

Os helmintos reduzem os níveis de anticorpos citofílicos (IgG1 e IgG3), enquanto que

aumentam os não citofílicos (IgG2, IgG4 e IgM), mecanismo conhecido como inibição celular

dependente de anticorpos (ADCI) (Druilhe et al., 2005). A proteína de superfície do

merozoíto (MSP) é identificada como o principal alvo de anticorpos mediado por ADCI

(Oeuvray et al., 1994). A proteína de superfície de merozoíto-1 (MSP-1) é uma glicoproteína

de 195 kDa expressa em todas as espécies de malária estudadas, considerada de grande

potencial vacinal (Holder et al., 1992). Tem sido demonstrado que em P. falciparum a MSP-1

é sintetizada como um grande polipeptídio precursor, que é então processada

proteoliticamente em fragmentos menores durante o final do desenvolvimento do esquizonte

(Holder, 1988).

Diversos estudos demonstraram a elevada antigenicidade de diferentes regiões do

MSP-1 do P. vivax no Brasil (Soares et al., 1997; Soares et al., 1999; Nogueira et al., 2006;

Barbedo et al., 2007) e em outros países (Dent et al., 2009; Pitabut et al., 2007; Zeyrek et al.,

2008). A especificidade de anticorpos, ocorre em particular com a região C-terminal (42 kD e

19 subfragmentos-kD), bloqueando a invasão do parasito in vitro (Chappel & Holder, 1993;

Uthaipibull et al., 2001), e indução de imunidade protetora em modelos de animais (Arévalo-

Herrera et al., 1992; Egan et al., 2000).

Estudos de coinfecção malária-helminto estão direcionados para os mecanismos de

interação entre os parasitos por via resposta imunológica mediada, isto em virtude dos

conhecidos efeitos imunomoduladores causados pelos helmintos (Knowles, 2011). Isso se

caracteriza por altos níveis de citocinas como IL-4, IL-5 e IL-13, eosinofilia, altas

concentrações no soro de IgE (Maizels & Yazdanbakhsh, 2003; Smits et al., 2010) e de

anticorpos não-citofílicos IgG2, IgG4 e IgM (Druilhe et al., 2005). Apesar desta forte resposta

Th2, helmintos adultos frequentemente sobrevivem por anos em hospedeiros

imunocompetentes, possivelmente através da indução de mecanismos imunorregulatórios

(Hartgers & Yazdanbakhsh et al., 2006; Knowles, 2011).

35

Estes mecanismos incluem a indução de células T regulatórias e modulação de células

do sistema imune inato, como macrófagos e células dendríticas, o que resulta em ambiente

anti-inflamatório caracterizado por níveis aumentados de IL-10 e TGF-β (Hartgers &

Yazdanbakhsh, 2006). Esta rede regulatória no hospedeiro pode ser caracterizada como

hiporresponsividade imunológica, a qual protege a eliminação dos helmintos, mas ao mesmo

tempo protege o hospedeiro contra a patologia em virtude de uma possível inflamação

excessiva (Maizels & Yazdanbakhsh, 2003; Taylor et al., 2005). Esta hiporresponsividade não

é direcionada somente contra antígenos dos helmintos, mas parece se estender para antígenos

de terceiros.

Dessa forma, a resposta imune fortemente regulatória desencadeada pela infecção

helmíntica poderia prejudicar a resposta imune Th1 eficaz contra a infecção por plasmódio, o

que tornaria o hospedeiro mais suscetível a desenvolver altos níveis de parasitemia e sintomas

de malária. Por outro lado, esta resposta regulatória também poderia ter um efeito benéfico ao

hospedeiro por diminuir os efeitos nocivos de uma possível reação inflamatória exagerada

causada por citocinas do perfil Th1, assim ajudando a controlar a imunopatologia resultante

da infecção por plasmódio, neste caso poderia diminuir a probabilidade de desenvolver

quadros de malária grave (Knowles, 2011).

Além da influência do perfil regulatório das infecções helmínticas na malária, o forte

perfil Th2 pode se contrapor ao Th1, pela clássica dicotomia Th1xTh2, podendo também

induzir maior produção de anticorpos não citofílicos como IgG4 no lugar dos anticorpos

citofílicos, prejudicando a resposta eficiente na diminuição da carga parasitária. Entretanto o

real papel desempenhado por helmintos no curso da malária ainda não está esclarecido.

Estudos tem investigado as interações existentes entre o plasmódio e helmintos durante uma

coinfecção e demonstrado resultados conflitantes. É sugerido que ocorra tanto a presença de

sinergismo quanto de antagonismo nas infecções simultâneas por nematódeos e protozoários

(Cox, 2001; Knowles, 2011).

Assim, algumas pesquisas realizadas com modelos animais indicaram a existência de

efeito facilitador de Schistosoma sp. sobre a infecção por Plasmodium sp., enquanto outras

sugeriram um efeito supressor. Alguns estudos epidemiológicos reportaram um efeito protetor

da infecção helmíntica sobre a densidade parasitária na infecção por P. falciparum ou sobre as

manifestações clínicas da doença, enquanto outros demonstraram um risco aumentado de

infecção por Plasmodium sp. ou malária naqueles indivíduos coinfectados com helmintos.

Estes resultados contraditórios podem ser atribuídos as diferentes espécies de helmintos e

fenótipos estudados (clínico ou parasitológico) e as diferentes populações expostas a níveis

36

distintos de transmissão das infecções (Le Hesran et al., 2004; Lyke et al., 2005; Knowles,

2011).

Diversos estudos demonstram mudanças na resposta de anticorpos aos antígenos

plasmodiais em indivíduos coinfectados com helmintos. A resposta imune contra protozoários

intestinais não é tão destacadamente imunorregulatória como a resposta induzida por

helmintos, entretanto infecções crônicas por protozoários foram sugeridas como

possivelmente associadas ao perfil de resposta imune reguladora do tipo 1 (Díaz & Allen,

2007; Courtin et al., 2011). Por exemplo, a resposta imune contra Giardia duodenale, um dos

protozoários intestinais mais prevalentes, envolve tanto a resposta celular quanto a humoral.

Estudos relatam que os anticorpos contra giárdia atuam ativando a via clássica do sistema

complemento que leva à lise do parasito, limitando a invasão dos tecidos pelos trofozoítas de

giárdia (Faubert, 2000; Boef et al., 2012).

Entretanto a defesa mais substancial está na imunidade de mucosa e ação de

anticorpos IgA. A produção de IL-6 por linfócitos T estava aumentada nos indivíduos com G.

duodenale comparado aos que não abrigavam esse protozoário. Também ocorreu aumento nos

níveis de IL-10 produzido por células da imunidade inata nos indivíduos infectados com altas

cargas de G. duodenale, tornando possível a ideia de que altas cargas deste protozoário

intestinal induzam resposta reguladora inata, ambas as estimulações para secreção das duas

citocinas foram realizadas com antígenos não pertencentes à giárdia. Dessa forma é razoável

pensar que existem influencias em outras infecções no mesmo hospedeiro (Boef et al., 2012).

Os enteroparasitos podem causar aos seus portadores danos como obstrução intestinal

(A. lumbricoides), desnutrição (A. lumbricoides e T. trichiura), quadros de diarreia (G.

duodenale e E. histolytica) e anemia (Ancilostomídeos). Embora a anemia seja mais evidente

por infecções com Ancilostomídeos, esta alteração hematológica também foi associada com

infecção de moderada a alta intensidade de T. trichiura (Knowles, 2011). O impacto das

infecções por A. lumbricoides sobre a anemia ainda não está esclarecido. Como a anemia é

uma característica hematológica também fortemente associada à malária, diversos trabalhos

avaliaram o impacto da coinfecção malária-helminto sobre a anemia nos indivíduos

portadores dos dois tipos de parasitos, e alguns destes trabalhos encontraram resultados

contrastantes (Abanyie et al., 2013).

Em um trabalho realizado em crianças nigerianas, a frequência de anemia nas crianças

coinfectadas com P. falciparum e A. lumbricoides não foi diferente da frequência de

indivíduos anêmicos portadores somente de P. falciparum, indicando que neste caso a malária

é a principal causa de anemia. No Zimbábue, a prevalência de anemia no grupo de crianças

37

coinfectadas com P. falciparum e helmintos foram maiores que no grupo de crianças com

somente uma infecção (Midzi et al., 2010; Boef et al., 2012). Estudo realizado no estado do

Amazonas demonstrou que a concentração de hemoglobina durante a infecção malárica

encontrava-se aumentada nas crianças, que além da malária por P. vivax também estavam

infectadas com helmintos intestinais quando comparado às crianças que estavam somente com

P. vivax, sugerindo que a infecção helmíntica concomitante estava protegendo as crianças de

desenvolver anemia (Melo el al., 2010).

As respostas imunorreguladora e Th2 induzidas pelas infecções helmínticas podem

atenuar o perfil Th1 da malária, levando a diminuição da gravidade da anemia malárica,

através da secreção de citocinas como IL-10 e TGF-β. A eosinofilia, número de eosinófilos

maior que 450 células/mm3, é uma alteração hematológica bastante comum nas infecções

helmínticas. Geralmente as infecções por protozoários como Plasmodium spp. G. lambia e E.

histolytica não causam eosinofilia. Os eosinófilos são estimulados por citocinas específicas

como fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), IL-3 e IL-5.

Linfócitos T ativados por infecções parasitárias produzem IL-5, estímulo predominante para

eosinofilia que assim como IL-4 levam ao aumento de produção de IgE para a resolução da

infecção helmíntica (Leder & Weller, 2000; Mueller et al., 2013).

Mesmo que a eosinofilia não seja uma característica marcante na malária, um estudo

demonstrou que indivíduos com infecções assintomáticas por P. falciparum apresentavam

aumento na frequência de eosinófilos e que durante a fase aguda da malária o número de

eosinófilos diminuía, mas ocorria elevação nos níveis plasmáticos de proteína eosinofílica

catiônica e proteína eosinofílica, marcadores de função de eosinófilos. Dessa forma, o menor

número de eosinófilos durante a fase aguda da malária seria devido ao sequestro destas

células nos tecidos e não em virtude de menor produção de eosinófilos na medula óssea

(Roussilhon et al., 2010).

Assim, é possível que os eosinófilos ou seus grânulos possam participar na resposta

contra a malária. Assim, nas coinfecções de malária com parasitoses intestinais as alterações

nos números de eosinófilos poderiam ter alguma implicação na resposta imune direcionada

contra ambos os parasitos (Lacerda et al., 2012). Estes resultados podem ser atribuídos as

diferentes espécies de helmintos e fenótipos estudados e as diferentes populações expostas a

transmissão das infecções.

38

1.5.1 Resposta imune de anticorpos e citocinas

O estudo das respostas de anticorpos aos antígenos de Plasmodium é um processo

chave para a descoberta e desenvolvimento de vacinas contra a malária. Entretanto, a

dificuldade prática de uma vacinação contra a malária é, devido à necessidade de cultura dos

parasitos, em larga escala e livres de contaminação com componentes celulares do hospedeiro

e pela complexidade do ciclo de vida do Plasmodium, que resulta em uma resposta

imunológica específica para cada forma evolutiva, e pelo fato do parasito ter desenvolvido

diversas estratégias de escape à resposta imune do hospedeiro (Good et al., 2005). Além de

apresentar um custo relativamente alto, as preparações antigênicas são de difícil

reprodutibilidade e consequentemente, o desenvolvimento de uma vacina antimalárica

necessita de modernas técnicas para a produção de antígenos (Hill, 2011).

O desenvolvimento de vacinas contra a malária, sobretudo na busca de imunógenos

efetivos e de baixo custo, representa um desafio científico significante no controle dessa

infecção (Good et al., 2005). Nos últimos anos um progresso tem sido obtido na identificação

e caracterização molecular e imunológica de proteínas de vários estágios do P. falciparum

candidatas a uma vacina. No caso do P. vivax, apesar de sua alta prevalência em várias partes

do mundo, inclusive no Brasil, a busca de vacinas é pouco explorada e o número de genes

clonados que codificam essas proteínas antigênicas ainda é pequeno quando comparado ao P.

falciparum (Galinski; Barnwell, 1996).

Uma das razões principais é a falta de um sistema in vitro para o cultivo contínuo do

P. vivax, já estabelecido para o P. falciparum e as dificuldades de manutenção do parasito em

cultura se devem ao fato de que o P. vivax invade preferencialmente ou quase que

exclusivamente reticulócitos os quais normalmente correspondem a apenas 1% da população

total de eritrócitos no homem (Mons et al., 1988; Barnwell et al., 1989). Consequentemente, a

obtenção de reticulócitos em quantidades suficientes para manter um cultivo contínuo no

laboratório não é uma tarefa fácil.

Por essa razão, inexiste ainda uma vacina eficaz utilizada no combate à malária,

principalmente no que tange a espécie de P. vivax. É sabido que uma vacina contra esta

espécie é de suma importância, levando em consideração que as infecções por P. vivax são as

mais prevalentes em áreas endêmicas. Além disso, estima-se que as formas latentes

responsáveis pelas reinfecções (hipnozoíticas) contribuem com aproximadamente 80% de

todas as infecções do estádio sanguíneo por P. vivax. Como não há diagnóstico para as formas

latentes, os hipnozoítas são importantes fontes de reintrodução do P. vivax (White, 2011).

39

As vacinas pensadas para combater a malária são classificadas de acordo com a fase

em que elas atuam para suprimir o parasito. Uma vacina pré-eritrócitica reduziria a incidência

de infecções primárias, além de evitar o estabelecimento das formas latentes, reduzindo as

reinfecções que contribuem para a transmissão continuada. A vacina do estádio sanguíneo

bloquearia o crescimento do parasito e preveniria a doença e a morte do hospedeiro. Uma

vacina de bloqueio da transmissão impediria a infecção do mosquito vetor, dessa forma, iria

acelerar a erradicação da doença (Nilsson et al., 2015). Essas estratégias focam,

principalmente, a determinação de antígenos-alvo, essenciais para o desenvolvimento e

sobrevivência do parasito.

Diversos antígenos de estágios assexuados sanguíneos têm despertado interesse como

alvos potenciais de uma possível vacina protetora. Dentre esses antígenos, temos a proteína de

superfície de merozoítas (MSP-119) é uma glicoproteína polimórfica expressa sobre a

superfície do merozoíto de P. vivax (Good et al., 2005; Holder, 2009) e a proteína de antígeno

de membrana apical (AMA-1) proteína imunogênica integrante da membrana que é expressa

na superfície apical dos merozoítos e esporozoítos, e possuem importância durante a invasão

nos eritrócitos e hepatócitos (Hodder et al., 2001, Silvie et al., 2004). Ambas as proteínas tem

se destacado como um dos principais objetos de diferentes estudos em malária vivax (Herrera

et al., 2007). A resposta imune contra os estágios assexuados sanguíneos está associada com a

resposta mediada por anticorpos.

Estudos de transferência de soro de indivíduos imunes, quando transferidos para

indivíduos não imunes, protegem contra as formas eritrocíticas do parasito, demonstrando que

aqueles indivíduos que receberam o soro apresentaram proteção contra a malária clínica ou

diminuição na gravidade e carga parasitária da doença. Estas evidências sugerem que o

estágio eritrocítico é o principal alvo para a imunidade naturalmente adquirida (Doolan et al.,

2009). Estudos como esses demonstraram que os anticorpos desempenham um papel

importante na aquisição de imunidade contra a malária clínica.

Nesse contexto, Sánchez-Arcila et al (2015) avaliando a resposta imune de anticorpos

de P. vivax por AMA-1 e MSP-119 numa população de Rondônia no Brasil, evidenciam que

embora a malária seja mais frequente em indivíduos infectados com parasitos intestinais,

parâmetros hematológicos e de parasitemia não diferiram entre os indivíduos infectados com

parasitos intestinais, maláricos e coinfectados. Parece que a alteração hematológica observada

tanto na malária quanto nos grupos coinfectados deve-se ao efeito da malária, em vez de

parasitas intestinais ou coinfecção.

40

Apesar de haver mudanças em IgG total dirigidas a PvAMA-1 e PvMSP-119 no grupo

de parasitos intestinais, uma diminuição da IgG e nas respostas citofïlicos associados à

coinfecções não foi observado. Estas respostas talvez relacionem com outros fatores, como

propriedades de antígenos, número e tempo de exposição, idade e determinantes genéticos do

hospedeiro. Novos estudos devem ser realizados para determinar o efeito de protozoários

intestinais na resposta imune à diferentes antígenos da malária (Sánchez-Arcila et al., 2015).

Adicionalmente, é importante destacar que a presença da resposta de anticorpos para P. vivax

AMA-1 e MSP-119 proteínas de todos os grupos indicaram que os participantes haviam sido

expostos à infecção da malária e as respostas da subclasse de IgG foram em grande parte de

acordo com pré-resultados posteriormente publicados (Supali et al., 2010; Turner et al.,

2008).

Essas interações imunológicas entre helmintos e parasitos da malária não são claras e

há pouco consenso entre essa coinfecção. Entretanto, durante a infecção da malária, as

citocinas são referidas como sendo importantes marcadores moleculares mediadas por células

de resposta imune e conhecido por serem críticos na regulação de doenças (Sánchez-Arcila et

al., 2014). Essas infecções helmínticas tem um profundo efeito sobre o sistema imunológico,

e que podem inibir a capacidade do hospedeiro para montar uma resposta imune do tipo Th1.

Com efeito, a infecção com Ascaris sp. induz respostas antiinflamatórias Th2 associada pelos

níveis elevados de interleucina IL-10. Portanto, espera-se que a influência da infecção

helmíntica no sistema imunitário poderia estender-se a resposta imunitária contra o paludismo

devido ao efeito antiinflamatório de citocinas induzidas por helmintos e, assim,

possivelmente, afetar o curso da infecção de malária (Geiger et al., 2002; Figueiredo et al.,

2010).

Adicionalmente a maioria dos estudos enfatiza que o P. vivax induz uma maior

produção de citocinas em relação a P. falciparum mesmo com biomassa parasitária

semelhante (Anstey et al., 2009). Os estudos reportam a importância do padrão de citocinas e

de suas interações na resposta imune do hospedeiro durante infecção por P. vivax (Sortica et

al, 2012). O aumento da parasitemia, bem como a resposta imunológica durante o percurso da

doença são fatores que determinam sua gravidade (Sortida et al., 2012). Os níveis elevados de

citocinas do tipo Th1 e Th2 como IFN-γ e IL-4, respectivamente, têm sido associados à

gravidade da doença, no entanto existem muitas dúvidas sobre o papel imunológico destas

citocinas na patogênese da doença (Tangteerawatana et al., 2007).

Na infecção por P. vivax, estudos vêm evidenciando o papel protetor da citocina IL-4

como regulador negativo dos efeitos pró-inflamatórios ocasionada por P. vivax. Apesar de

41

possuir baixos níveis sistêmicos, IL-4 parece ser um mediador central com várias interações

significativas em indivíduos assintomáticos (Cabantous et al., 2009; Mendonça et al., 2013).

Por outro lado, citocinas antiinflamatórias como TGF-β e IL-10 nas fases iniciais da infecção

correlacionam-se a elevadas parasitemias, porém em fases tardias da infecção parecem

prevenir sintomas mais graves (Walther et al., 2009). Durante a infecção, as citocinas

desempenham um papel divergente, controlando o crescimento do parasito e exacerbando a

patologia (Kabyemela et al., 2013). Os efeitos antagônicos são atribuídos ao tempo de

expessão e ao equilíbrio das citocinas anti e pró-inflamatórias (Dodoo et al., 2002). No

entanto, esses mecanismos imunopatológicos da malária ainda não foram totalmente

elucidados, constituindo-se um campo amplo para novos estudos.

Com isso, à capacidade de alguns parasitos intestinais, principalmente helmintos

induzir respostas antiinflamatórias do hospedeiro para seu próprio benefício, fortalece a

hipótese de que pode haver um contrapeso entre citocinas pró-inflamatórias, associadas à

malária, e citocinas anti-inflamatórias, associadas a helmintos ou protozoários parasitos

intestinais. Embora as respostas de citocina tenham sido extensivamente descritas na infecção

pelo P. falciparum, poucos estudos analisaram a concentração de citocinas sistêmica em

coinfecção de parasitos intestinais e malária por P. vivax (Maizels et al., 2004).

No Brasil, a transmissão da malária concentra-se na Região Amazônica, sendo que o

P. vivax tem sido a espécie mais prevalente, responsável por aproximadamente 84% dos casos

nesta região (Gomes et al., 2016; Dotrário et al., 2016). A manutenção do número de casos,

juntamente com o rápido desenvolvimento do P. vivax nos mosquitos vetores (Olliaro et al.,

2016) e o controle dificultado por métodos tradicionais em regiões endêmicas, tem mostrado a

importância da identificação de técnicas efetivas e economicamente viáveis, que possam

interromper a transmissão da malária em regiões endêmicas (Mueller et al., 2015).

Indivíduos que estão frequentemente expostos ao parasito, tem a capacidade de

desenvolver respostas imunes específicas, protegendo-os de evoluir a uma infecção malárica

grave. Além disso, o soro desses indivíduos pode impossibilitar a fertilização dos gametas,

impedindo o desenvolvimento parasitário e, consequentemente, bloqueando a transmissão

desse parasito de pacientes infectados para os mosquitos (Greenwod et al., 2008) viabilizando

uma vacina de bloqueio de transmissão (Arévalo-Herrera et al., 2010, 2011, 2015). Em

síntese, estas vacinas são negligenciadas por não previrem a infecção em indivíduos

vacinados ou moderarem o curso da doença, sendo um empreendimento financeiro pouco

atraente para as empresas de vacinas nos países desenvolvidos.

42

1.6 JUSTIFICATIVA

As regiões tropicais são conhecidas pela endemicidade da coinfecção da malária-

parasitos intestinais. Embora prevalentes, pouco se sabe sobre esta interação e como as

infecções simultâneas afeta a epidemiologia e/ou patogénese de cada morbidade. Em

Oiapoque, município do Estado do Amapá, norte do Brasil, fronteira ocidental da Amazônia

com a Guiana Francesa, apresenta ao longo dos anos índice parasitário anual elevado, e um

conjunto de atributos naturais que reflete a influência imposta pela conjugação dos domínios

guianense e amazônico brasileiro, classificando-o como município ou área de risco

permanente e constante para transmissão da malária e parasitos intestinais.

Essa coinfecção humana por múltiplas espécies de parasitos são reais e relativamente

frequentes na natureza e diversos estudos epidemiológicos indicam que essa interação

representa um desafio para compreender a ecologia dos parasitos e criar estratégias

antiparasitárias fundamentais e essenciais na compreensão dos mecanismos que regem as

respostas imunes em benefícios a saúde humana. Adicionalmente, informações contraditórias

sobre a consequência benéfica ou não, alertam sobre os possíveis efeitos das coinfecções no

desenvolvimento de uma vacina contra a malária. Entretanto, os dados são controversos e

conflitantes, alguns mostrando uma maior susceptibilidade, outros mostram menor

susceptibilidade ou ainda, nenhuma influência na evolução clinica da malária.

Tendo em vista que os trabalhos que abordam as coinfecções entre plasmódio e

parasitoses intestinais são raros, e que estes são principalmente voltados para P. falciparum, é

importante o desenvolvimento de estudos direcionados para P. vivax, já que esta espécie é a

principal responsável pelos casos de malária no Brasil. Considerando que nas áreas endêmicas

de malária a população também esteja exposta é que a coinfecção de malária com parasitos

intestinais (helmintos e protozoários) possa causar alterações no balanço entre a resposta

imune e a evolução clínica do hospedeiro infectado, torna os estudos de coinfecção entre os

dois parasitos de grande importância no planejamento de ações antimaláricas em áreas

endêmicas de P. vivax.

Adicionalmente ao contexto das interações fronteiriças do Brasil com a Guiana

Francesa, a migração humana é uma realidade entre as diferentes regiões, onde as

intensidades de transmissão e os antecedentes genéticos humanos são bem distintos,

contribuindo para a transmissão de novos casos de malária, que teoricamente em pacientes

coinfectados poderia levar a uma maior diversidade genética dos parasitos que circulam na

população, constituindo um sério agravante para a saúde pública. Associado a estes aspectos

43

sociais, está o alastramento de casos, surgimento da resistência às drogas pelo P. vivax nos

últimos anos, complicações clínicas associadas com casos fatais, bem como, resultados não

promissores no desenvolvimento de vacinas, gerando um grande problema para o seu efetivo

controle, incapaz de erradicar a doença sem o auxílio de medidas inovadoras.

Além disso, as pesquisas precisam levar em consideração a influência do

poliparasitismo na imunogenicidade de antígenos candidatos a vacinas. A descrição de

determinantes de proteção ou gravidade são fundamentais para guiar futuros estudos no

manejo e controle epidemiológico da malária. A elucidação do padrão geográfico do

complexo P. vivax é importante para as avaliações de diversidade, caracterizando e

identificando ferramentas de predição do diagnóstico, além de possíveis alvos terapêuticos

que codificam antígenos candidatos a vacinas, assim como, na formulação e estruturação de

medidas de vigilância que visem o controle da malária.

Por essas razões, julga-se pertinente estudar o perfil epidemiológico, imunológico e

molecular dos povos de uma área amazônica e fronteiriça entre Brasil e Guiana Francesa, o

que decorre da exiguidade de investigações, da ausência de inquéritos e censos, bem como da

precariedade de informações sobre morbidade e mortalidade. Portanto, avaliar a possibilidade

de que populações infectadas por enteroparasitos possam influenciar na dinâmica de

transmissão dos parasitos do P. vivax, bem como na compreensão da doença e sua progressão,

e nos fatores que influenciam o resultado clínico da infecção, são fundamentais para

estratégias diagnósticas e preventivas aumentando a capacidade de controle da malária e

contribuindo para a eliminação da doença.

1.7 HIPÓTESES

1.7.1 Hipótese Nula

A coinfecção de enteroparasitos não influencia nos níveis de hemoglobina, no número de

gametócitos circulantes na corrente sanguínea e na resposta imune na malária causada pelo

Plasmodium vivax em pacientes de uma área endêmica da Amazônia.

1.7.2 Hipótese Alternativa

A coinfecção de enteroparasitos influencia na infecção pelo Plasmodium vivax em

pacientes de uma área endêmica da Amazônia.

44

Variável

independente

Coinfecção

pelos

Enteroparasitas

Variáveis

dependentes

Infecção pelo Plasmodium vivax

Quantidade de gametócitos circulantes

Concentração de hemoglobina

Níveis de anticorpos

Perfil de citocinas

1.8 OBJETIVOS

1.8.1 Geral

- Avaliar a influência da coinfecção de parasitos intestinais na malária causada pelo

Plasmodium vivax em pacientes do município de Oiapoque no Estado do Amapá, área

endêmica da Amazônia brasileira.

1.8.2 Específicos

- Caracterizar por gênero e idade da população os enteroparasitos (helmintos e protozoários)

detectados;

- Identificar a prevalência dos enteroparasitos da população estudada;

- Correlacionar a frequência dos enteroparasitos com os níveis de hemoglobina da população

de estudo;

- Determinar a distribuição e prevalência de indivíduos com diagnóstico de malária vivax e

parasitos intestinais entre os grupos e subgrupos de estudo;

- Correlacionar dados epidemiológicos e hematológicos na coinfecção malária-parasitos

intestinais;

- Avaliar os níveis de anticorpos IgG MSP-119 e as possíveis alterações associadas as

coinfecções malária-parasitos intestinais;

- Verificar o perfil de citocinas Th1 (IFN-γ, TNF-α e IL-2) e Th2 (IL-4, IL-5 e IL-10) e as

possíveis alterações associadas as coinfecções malária-parasitos intestinais;

45

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1 ÁREA DE ESTUDO E POPULAÇÃO

Estudo transversal foi realizado, no município de Oiapoque, pertencente ao Estado do

Amapá, norte do Brasil, fronteira ocidental da região amazônica. Possui IPA de alto risco para

transmissão de malária, fica localizado na parte mais setentrional do Estado do Amapá. Faz

fronteira ao norte com a Guiana Francesa, ao sul com os municípios de Calçoene, Serra do

Navio e Pedra Branca do Amapari, ao leste é banhado pelo Oceano Atlântico e a oeste limita-

se com o município de Laranjal do Jari. Está situado a 590 km da capital, Macapá, ligando-se

por via terrestre através da BR 156, onde a presença de trechos estreitos e perigosos,

principalmente no período das chuvas, quando diversos locais tornam-se intrafegáveis em

razão dos atoleiros (Gea, 2013). Possui uma população de 20.509 habitantes localizado a uma

latitude norte de 03° 50’ 35” e longitude oeste 51° 50’ 06”segundo IBGE (2010) (Figura 11).

Figura 11 - Mapa da América do Sul, mostrando a localização da Guiana Francesa e

Oiapoque no Estado do Amapá (Fonte: Adaptada de Gomes et al., 2016).

De acordo com Palhares & Guerra (2016), o município de Oiapoque apresenta um

conjunto de atributos naturais que reflete a influência imposta pela conjugação dos domínios

guianense e amazônico. A cobertura vegetal corresponde fisionomicamente a dois padrões de

46

vegetação distintos: o domínio das formações florestadas e o domínio das formações

campestres. É cortado por vários cursos d’água e com uma base geológica e geomorfológica

que apresenta características peculiares, como morros graníticos, quedas d’água, pedreiras,

entre outras. A área geográfica de Oiapoque é de 22.625 km2. O clima é equatorial, com

umidade relativa média de 82%. A precipitação anual varia entre 2.700 e 3.300 mm. A

temperatura média é de 27 ºC, variando entre 26 e 33 °C. Temperaturas mais altas coincidem

com os meses mais secos do ano de setembro a novembro (ANA, 2015).

É composto por uma sede municipal, Oiapoque, e quatro distritos: Clevelândia do

Norte (área de destacamento militar do exército); Vila Velha (área de propriedades agro-

extrativas); Vila Brasil (serve de apoio aos garimpos infiltrados nas Guiana Francesa);

Taperebá (área de apoio aos pescadores da costa marítima). Outras localidades na área

geográfica municipal: Ponte do Cassiporé (intercessão da BR-156); Rio Cassiporé, ponto de

apoio para o tráfego rodoviário da BR-156 e fluvial, tanto para agricultores da região como

para os povoados indígenas da região (Gea, 2013).

Na cidade de Oiapoque circulam moradores, visitantes, comerciantes, garimpeiros,

militares e índios. Em decorrência da fronteira com o município de Saint George (Guiana

francesa), apresenta um fluxo populacional intenso, com movimento frequente de catraias que

transportam passageiros de um lado para outro, franceses e brasileiros, numa relação que

envolve comércio, turismo, vida social e compras, mas, que também favorece a disseminação

de doenças transmissíveis (Andrade, 2005).

A economia local gira em torno do comércio de produtos brasileiros vendidos aos

Guianenses, do cultivo da mandioca, extrativismo, venda de produtos hortifrutigranjeiros

comercializados no mercado local. Não se pode deixar de mencionar a atividade do garimpo

que serve para dinamizar a economia local (comércio, hotéis, bares etc.). Também existe a

pesca e a caça de subsistência de diversas espécies nativas encontradas nos rios e florestas da

região (Silva, 2013). A exploração sexual também é fortemente encontrada no local.

2.2 CRITÉRIOS DE SELEÇÃO

Os indivíduos incluídos neste estudo foram triados em quatro postos de diagnóstico de

malária, localizado nos bairros Paraíso, Planalto, Nova Esperança e Infraero. Foram incluídos

neste estudo os pacientes maláricos (Plasmodium vivax) e não maláricos que preencheram os

critérios de seleção da pesquisa. Todos os casos positivos (malária e enteroparasitas) foram

devidamente tratados e acompanhados pela equipe técnica composta de dois agentes

notificantes, dois microscopistas, um agente de endemia, um enfermeiro, um biomédico e um

47

médico, na unidade mista de saúde do Oiapoque e no Laboratório de Fronteira, priorizando

sempre o bem estar do paciente. Para tal, foi utilizada a ficha de inclusão e acompanhamento

do projeto.

2.2.1 Critérios de inclusão para paciente maláricos

- Termo de consentimento assinado para maiores de 18 anos

- Termo de Assentimento assinado para menores de 18 anos

- Consentimento pós-informado dos pais/responsáveis pelas crianças e adolescentes (se

menores de 18 anos)

- Impressão digital para aqueles não alfabetizados

- Gota espessa positiva para P. vivax, independente da quantificação da parasitemia

- Idade: crianças maiores de 7 anos, adolescentes e adultos

- Primoinfecção ou história anterior de malária há mais de trinta dias

- Ser nativo da área de estudo

2.2.2 Critérios de exclusão

- Falta de consentimento/autorização para participação na pesquisa

- Gravidez referida

- Uso de tratamento antimalárico nos 30 dias anteriores

- Pacientes com doenças degenerativas, tuberculose e leishmanioses

- Crianças menores de 7 anos.

2.2.3 Critérios de inclusão para indivíduos não maláricos

- Termo de consentimento assinado para maiores de 18 anos

- Consentimento pós-informado dos pais/responsáveis pelas crianças e adolescentes (se

menores de 18 anos)

- Impressão digital para aqueles não alfabetizados

- Gota espessa negativa e sem sinais clínicos de malária

- Idade: crianças maiores de 7 anos, adolescentes e adultos

- Ser nativo da área de estudo.

2.2.4 Critérios de exclusão

- Falta de consentimento/autorização para participação na pesquisa;

48

- Gravidez referida;

- Crianças (maiores de 7 anos), adolescentes e adultos com malária por P. vivax, P.

falciparum, P. malariae ou malária mista (P. falciparum e P. vivax);

2.3 TAMANHO DA AMOSTRA

Os dados epidemiológicos, tais como idade, sexo e número de episódios de malária

anteriores foram obtidos durante uma entrevista realizada e também a partir dos prontuários

médicos. Considerando um tamanho finito de 20.509 indivíduos, com o erro tolerável de

amostragem de 5% (ε) = 0,05, associado ao intervalo de confiança de 95%, onde, tendo-se um

α = 0,05 e utilizando-se o valor maximizado para a Incidência de 0,25 seria necessário incluir

no mínimo 377 indivíduos na pesquisa, sendo incluídos 441 indivíduos que foram

comparados os resultados a partir de quatro grupos: 1) pacientes com coinfecções por

parasitas intestinais e malária; 2) pacientes com malária e resultado negativo para parasitas

intestinais, 3) pacientes sem malária e positivo para parasitas intestinais e 4) pacientes

negativos para as duas parasitoses.

2.4 COLETA E EXAME DE SANGUE

2.4.1 Coleta Sanguínea

Amostras de sangue foram colhidas por punção venosa para identificar os níveis de

hemoglobina (com anticoagulante) e para o preparo da gota espessa em lâmina (sem

anticoagulante). Após a coleta, a lâmina foi mantida em temperatura ambiente para secagem

da gota de sangue, sendo posteriormente corada e analisada por microscópia ótica de aumento

de 100X (Nikon, Japão), possibilitando quantificar a intensidade do parasitismo, mediante a

determinação da parasitemia por volume (µL) de sangue.

2.4.2 Diagnóstico de Malária

As lâminas foram preparadas como recomendado pela técnica de Walker (azul de

metileno e Giemsa) (Herrera et al., 2014) e avaliada pelo microscopista local do posto de

diagnóstico de malária do município. A contagem direta de parasitos, foi realizada pela

estimativa da parasitemia a partir da avaliação semiquantitativa, que registra o intervalo de

parasitemia por µl de sangue, com 200 campos e o número de parasitos encontrados foram

multiplicados por 5 (Bueno et al., 2012).

49

2.4.3 Detecção de Gametócitos

Foi realizada por contagem direta na lâmina, pelo microscopista local do posto de

diagnóstico de malária do município. A contagem das formas sexuais (gametocitemia) das

lâminas de Gota espessa foi realizada por meio de uma revisão das lâminas positivas para

quantificação dos gametócitos em 100 leucócitos. A conversão para gametócitos/µL foi

realizada por cálculo utilizando como valor de referência 8000 leucócitos/mm3, sendo

realizado a contagem direta de gametócitos na lâmina (Nº de gametócitos X Nº de leucócitos

(8000)/100 = gametócitos por µL). Este procedimento é semelhante aos métodos diagnósticos

preconizados pelas diretrizes do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) do

Centers for Disease Control (CDC) e também similar às diretrizes da Organização Mundial de

Saúde (OMS).

2.4.4 Concentração de Hemoglobina

A concentração de hemoglobina foi medida no sangue venoso, utilizando equipamento

automatizado (Mindray-BC-3000plus) do Hospital de Oiapoque. A anemia média foi definida

através dos valores de referencias da hemoglobina, sendo os indivíduos considerados

anêmicos quando seus níveis de hemoglobina eram ≤ 13 g/dL de sangue em homens e ≤ 12 g

/dL de sangue em mulheres.

2.4.5 Controle de Qualidade do diagnóstico parasitológico de malária

Todas as lâminas positivas foram revisadas e encaminhadas ao setor de controle de

qualidade de endemias do Laboratório Central do Amapá (LACEN/AP). Esse controle da

qualidade foi realizado através da avaliação de três fatores: coloração da lâmina, confecção da

lâmina e concordância ou divergência dos resultados. Posteriormente são expedidos laudos

com os resultados das análises de volta aos laboratórios e aos coordenadores de endemias do

município.

2.5 COLETA E EXAME DE AMOSTRAS FECAIS

A todos os indivíduos foi solicitado a fornecer amostras fecais pela manhã, sendo

proporcionados dois recipientes de plástico. Um com solução conservante (formol a 10%) e

outro sem solução conservante, para os casos negativos três amostras fecais foram coletadas e

examinadas utilizando os métodos: a fresco/direto sem e com lugol, Hoffman-Pons-Janer e

flutuação por centrifugação em solução de sulfato de zinco. Para cada amostra de fezes, duas

50

lâminas foram examinadas para a detecção dos parasitos por dois investigadores com

experiência na identificação, utilizando microscopia óptica (Nikon, Japão) com ampliações de

100X e 400X. As análises foram realizadas em Laboratório privado do município do

Oiapoque/AP.

2.6 DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE PLASMÓDIO

Estas análises foram realizadas no Laboratório de Imunogenética de Malária no

Instituto Evandro Chagas/SVS/MS no Pará. O DNA foi extraído do sangue total utilizando o

kit Easy-DNATM (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) and the QIAamp® DNA Blood Kit

(Qiagen, Inc., Chatsworth, CA). A confirmação do diagnóstico parasitológico foi realizada

pelo protocolo de PCR aninhado de acordo com o descrito previamente por Snounou et al.

(1993).

2.7 AVALIAÇÃO DE ANTICORPOS IgG CONTRA A PVMSP-119

A avaliação de anticorpos IgG total contra a MSP-119 foi realizada no Laboratório de

Microbiologia e Imunologia na Universidade Federal do Pará, seguindo o protocolo de Cunha

et al (2001). A proteína recombinante (His6-MSP-119) da MSP-1 do P. vivax (cepa Belém)

expressa em Escherichia coli. Os 96 poços das placas de ELISA (Costar, Corning Inc., NY,

EUA) foram sensibilizados com 50 μL da proteína His-MSP-119 (4 μg/mL) diluída em

tampão carbonato 0,05 M pH 9,0 (Na2CO3 15 mM, NaHCO3 34,9 mM), por 16 horas a

temperatura ambiente.

Posteriormente, as placas foram lavadas com PBS (phosphate buffered saline) Tween

0,05% e bloqueadas com 200 μL de PBS leite 5% (Molico, Nestlé®). Após 2 horas a 37°C, as

placas foram lavadas com PBS Tween 0,05% e 50 μL do plasma, diluído 1:100 em PBS leite

5%, foram adicionados em cada poço, em duplicata, e as placas foram incubadas por 16 horas

a temperatura ambiente. Após nova lavagem das placas com PBS Tween 0,05%, foram

adicionados, em cada poço, 50 μL de conjugado anti-IgG humano ligado a peroxidase

(DAKO polyclonal rabbit, Glostrup, Dinamarca), diluído 1:10.000 em PBS leite 5%, e as

placas foram incubadas por 2 horas em temperatura ambiente.

Em seguida, após nova lavagem com PBS Tween 0,05%, as placas foram reveladas

com a adição de 100 μL de OPD (orto-fenilenodiamina) (1 mg/mL) diluído em tampão

fosfato-citrato (NaH2PO4 0,2 M, C6H8O7 0,2 M, pH 5,0) contendo 0,03% de peróxido de

51

hidrogênio. Essa reação foi mantida no escuro e interrompida após 10 minutos pela adição de

25 uL de H2SO4 4 N em cada poço. A densidade ótica (OD) foi quantificada em leitora de

ELISA (EL800 Bio Tek, Winooski, EUA) em um comprimento de onda de 490 nm.

Para definição das amostras negativas ou positivas, foi calculado o índice de

reatividade (IR), determinado pela divisão do valor da OD da amostra pelo ponto de corte

(Corte: PvMSP-119 = 0.165). Amostras com IR ≥ 1 foram consideradas positivas, enquanto

que amostras com IR < 1 foram consideradas negativas. O ponto de corte foi estabelecido pela

média das ODs de 56 amostras de plasma de indivíduos sem histórico de malária, da

Fundação Centro de Hemoterapia e Hematologia do Pará (HEMOPA) residentes em Belém -

Pará, acrescida de três desvios padrões.

2.8 NÍVEIS SÉRICOS DE CITOCINAS

O Kit CBA (BD) (cytometric beads array) foi usado nesse estudo para a quantificação

das citocinas IL-2, INFγ e TNF (Th1) e IL-4, IL-5, IL-10 (Th2) em uma mesma amostra. Seis

populações de beads com distintas intensidades de fluorescência são conjugadas com um

anticorpo de captura específico para cada citocina, misturadas para formar o CBA e lidas no

citômetro de Fluxo do tipo FACSCanto II (Becton Dickinson, San José, CA, EUA),

previamente calibrado com “setup beads,” incubadas com Isotiocianato de fluoresceína

(FITC) ou Ficoeritrina (PE), de acordo com as recomendações do fabricante.

Uma curva padrão foi realizada para cada citocina e analisadas pelo FACSDiva

Software (Becton Dickinson, San Jose,CA, EUA). As populações de beads foram visualizadas

de acordo com as suas respectivas intensidades de fluorescência: da menos brilhante para a

mais brilhante. No CBA, as beads de captura das citocinas foram misturadas com o anticorpo

de detecção conjugado com o fluorocromo PE, e depois incubadas com as amostras para

formar o ensaio "em sanduíche". Os tubos para aquisição foram preparados com: 50 µL de

amostra, 50 µL da mistura de beads e 50 µL do reagente de detecção Th1/Th2 PE (Human

Th1/Th2 PE Detection Reagent/1 vial, 4mL). O mesmo procedimento foi realizado para a

obtenção da curva-padrão. Os tubos foram homogenizados e incubados por três horas, em

temperatura ambiente, no escuro.

Os resultados foram gerados em gráficos e tabelas utilizando-se o software FCAP

Array 3. (Becton Dickinson, San Jose,CA, EUA). Para cada citocina foram quantificados os

valores brutos de Media de Intensidade de Fluorescência (MFI). Os valores foram expressos

em pg/mL para cada citocina em comparação com a curva padrão, foram considerados 300

52

eventos para cada citocinas. Estas análises foram realizadas no Laboratório de Imunogenética

de Malária no Instituto Evandro Chagas/SVS/MS no Pará.

2.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados dos dados epidemiológicos obtidos a partir do questionário, de cada

voluntário foram armazenados no banco de dados do programa Epi-Info 3.5.1 (CDC, Atlanta,

GA, EUA). Os valores de cada grupo (Malária, coinfectados, enteroparasitas e controle

endêmico) assim como os subgrupos (Helmintos, protozoários e associação de helmintos-

protozoários) foram expressos em percentuais. A idade, tempo de residência no Oiapoque

(ano) (TR), número de episódios de malária anterior (NEM), período da última malária

(meses) (PUM), níveis de hemoglobina (g/dL), parasitemia (parasites/𝜇L) e gametócitos

foram expressos em Mediana (1º e 3º Quartil) utilizando o software estatístico BioEstat 5.3.

As diferenças entre os grupos quanto a idade, TR, NEM, PUM e hemoglobina foram

calculadas utilizando um Tukey a partir e uma análise de variância, ANOVA um critério. Para

calcular o grau de anemia foi utilizado o teste Kruskal-Wallis-Dunn.

Os testes estatísticos utilizados foram escolhidos considerando-se o tipo e tamanho de

cada variável e o número de grupos avaliados, sendo as diferenças de parasitemia e de

gametocitos entre os grupos: malária e coinfectado calculadas usando o teste Wilcoxon-

Mann-Whitney. Para o índice de reatividade (IR) PvMSP119 entre os grupos estudados, foram

realizadas múltiplas correlações através do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido

de pós-teste de Dunn. Os dados foram expressos no formato Boxplot (valor mínimo ao valor

máximo, P25%-P75% e mediana), As diferenças significativas foram estimadas pela mediana

dos valores em cada grupo, sendo consideradas significativas aquelas onde p ≤ 0,05.

Para analise da expressão das citocinas, o nível de significância foi obtido pela

comparação entre as concentrações de citocinas dos grupos estudados, utilizando o programa

Graph-Pad Prism versão 6.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Para à analise da

existência de correlação entre os grupos estudados, foi realizado pelo teste não paramétrico de

Kruskal-Wallis seguido de pós-teste de Dunn´s. Os dados foram expressos no formato

Boxplot (valor mínimo ao valor máximo, P25%-P75% e mediana). As diferenças

significativas foram estimadas pela mediana dos valores em cada grupo, sendo considerados

significativos àqueles onde P≤ 0,05.

53

2.10 CONSIDERAÇÃO ÉTICA

O estudo foi realizado com autorização do Comitê de Ética em Pesquisa da

Universidade Federal do Amapá (CEP /UNIFAP, protocolo 187404137/2013). Os candidatos

ao estudo foram incluídos, após receberem esclarecimento e manifestarem por escrito a sua

concordância em participar da pesquisa. Indivíduos positivos para malária vivax e parasitos

intestinais foram subsequentemente tratados por quimioterápicos recomendados pelo

Ministério da Saúde. Os participantes positivos para parasitos intestinais foram encaminhados

a equipe médica do hospital de Oiapoque para orientações e tratamento.

54

3 RESULTADOS

3.1 MANUSCRITO 1

Título: High Frequency of Enteroparasitoses in the Municipality of Oiapoque, Amapá

State, Brazil, on the Border With French Guiana

Autores: Rubens Alex de Oliveira Menezes, Margarete do Socorro Mendonça Gomes,

Anapaula Martins Mendes, Silvestre Rodrigues do Nascimento, Alvaro Augusto Ribeiro

DÀlmeida Couto, Mathieu Nacher, Martin Johannes Enk, Ricardo Luiz Dantas

Machado

Proposta do artigo: Respondendo aos objetivos específicos 1 a 3, este trabalho avaliou a

frequência de enteroparasitos numa população do município de Oiapoque no Estado do

Amapá e correlacionou com o nível de hemoglobina de cada indivíduo, tendo como propósito

produzir informações que possam subsidiar o planejamento, avaliação e intervenções voltadas

para a prevenção e controle das referidas infecções.

Resumo dos resultados: Nos indivíduos investigados, 58.6% (261/446) foram infectados por

algum tipo de parasito intestinal. Entre estes, 45,2% (118/161) estava infectado somente por

helmintos, 40,9% (107/261) com protozoários, e 13,8% (36/261) tinham infecções associadas.

Dentre os helmintos detectados o Ascaris lumbricoides 19,9% (52/261) foi o mais prevalente,

seguido de Entamoeba histolytica como protozoários mais frequentes 5% (13/261). A

pesquisa evidenciou uma correlação inversamente proporcional significativa entre o nível de

hemoglobina e a presença das parasitoses detectadas (coeficiente de contingência C=0.2195 e

p < 0.0001). O índice de enteroparasitoses é um reflexo claro da falta de saneamento da região

estudada, indicando um estado epidemiológico preocupante.

Status: Submetido – Revista Pan-Amazônica de Saúde (ISSN 2176-6223)

55

E-Mail de Submissão

56

High Frequency of Enteroparasitoses in the Municipality of Oiapoque, Amapá State,

Brazil, on the Border With French Guiana

Rubens Alex de Oliveira Menezes

Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários,

Universidade Federal do Pará, Belém, Pará, Brasil, Departamento de Ciências biológicas e da

Saúde da Universidade Federal do Amapá, Macapá, Amapá, Brasil - email:

[email protected]

Margarete do Socorro Mendonça Gomes

Laboratório Central do Amapá, Macapá, Amapá, Brasil - email:

[email protected]

Anapaula Martins Mendes

Universidade Federal do Amapá/Campus Binacional-Oiapoque, Oiapoque, Amapá, Brasil -

email: [email protected]

Silvestre Rodrigues do Nascimento

Hospital Estadual do Oiapoque, Oiapoque, Amapá, Brasil - email: silvestre-

[email protected]

Alvaro Augusto Ribeiro DÀlmeida Couto

Laboratório Central do Amapá, Macapá, Amapá, Brasil - email: [email protected]

Mathieu Nacher

Université des Antilles et de la Guyane, Caiena, Guiana Francesa - email:

[email protected]

Martin Johannes Enk

Instituto Evandro Chagas, Secretaria de Vigilância Sanitária, Ministério da Saúde,

Ananindeua, Pará, Brasil - email: [email protected]

Ricardo Luiz Dantas Machado

Instituto Evandro Chagas, Secretaria de Vigilância Sanitária, Ministério da Saúde,

Ananindeua, Pará, Brasil, Universidade Federal Fluminense, Niterói, Rio de Janeiro, Brasil -

email: [email protected]

Corresponding author

Rubens Alex de Oliveira Menezes

Deptº Ciências Biológicas e da Saúde/Universidade Federal do Amapá. Rodovia Juscelino

Kubitscheck, Jardim Equatorial, 68903-419, Macapá, Amapá, Brasil.

Phone: 55 96 4009-2932; Mobile: 55 96 99151-5567

E-mail: [email protected]

57

ABSTRACT

Background: Enteroparasites represent a considerable proportion of infectious parasitic

diseases worldwide. This study evaluated the frequency of enteroparasites and the correlation

of enteroparasites with hemoglobin levels. Methods: A cross-sectional study was performed

in the municipality of Oiapoque in the state of Amapá in northern Brazil, which is located at

the western border of the Amazon region. Fecal samples collected over a one-year period

(2014/2015) were analyzed using direct methods and spontaneous sedimentation. Results:

The study included 446 individuals ranging in age from 7 to 61 years. Among the investigated

individuals, 58.6% (261/446) were infected with some type of enteroparasitas. Of these

infected individuals, 45.2% (118/161) were infected only by helminths, 40.9% (107/261)

were infected with protozoa, and 13.8% (36/261) had combined infections. Ascaris

lumbricoides (19.9%, 52/261) was the most commonly detected helminth, followed by

Entamoeba coli and Endolimax nana were the most frequent protozoans (17.2%, 45/261). The

study showed an inversely proportional correlation between the hemoglobin level and the

presence of detected parasitoses. Conclusions: In Oiapoque, enteroparasitic diseases are the

cause of anemia in the population. The high frequency of enteroparasites is a clear reflection

of the lack of sanitation in the studied region, indicating an epidemiological state of concern.

Keywords: Amazon Region, Enteroparasitoses, Hemoglobin, Oiapoque, Western Frontier

INTRODUCTION

Intestinal parasites represent a considerable segment of infectious parasitic diseases

worldwide, although the prevalence may vary depending on the characteristics of each

region1. Most enteroparasitoses are transmitted by the oral route via the ingestion of water or

food infected with parasitic structures. A high number of these parasitoses is associated with

places with poor sanitary hygiene and a lack of treated water and sewage, which facilitate the

dissemination of eggs, cysts and larvae2. Additionally, the lack of public policies aimed at

promoting changes in cultural habits and improving the socioeconomic conditions of the

population favor the establishment of this disease class3. Intestinal infections caused by

protozoa and helminths are estimated to afflict 3.5 billion people worldwide and cause

illnesses in approximately 450 million people, with risks of serious public health problems in

several countries, especially underdeveloped countries4.

In Latin American countries such as Brazil, 55.3% of the population is estimated to be

infected with enteroparasites5. Additionally, 10.9 million people in the country are infected

with soil-transmitted helminths (geohelminths), with the highest risk of transmission

occurring in the northern region of Brazil6. However, because no public policy requires

notification of enteroparasitoses, data are restricted to some scientific publications and cannot

truly address the prevalence and incidence of these infections in the different regions of this

country7. This lack of epidemiological data is more evident in the northern region of Brazil.

Because epidemiological studies addressing the occurrence of intestinal parasites in

populations in the State of Amapá are scarce, the responsible authorities cannot design and

implement effective control measures. Notably, the border areas between countries contain

international political boundaries and are often characterized by an intense population flow,

which creates a unique environment with effects on the incidence of diseases and the

availability of healthcare services8. This scenario is closely related to the local social

determinants of health.

58

In addition to the unique symptomatology of these parasites, infections also affect

nutritional status, growth and cognitive function. Moreover, environmental and

socioeconomic factors and hygiene habits considerably affect morbidity and mortality9.

Anemia is a relevant problem for individuals living in areas with limited resources and a

significant burden of enteroparasitoses10

. Although helminth infections affect nutritional

status, their impact on anemia is unclear11

. Some studies have indicated that moderate or high

intensity infections with the hookworm Ancylostoma cause anemia in men. Cases of Trichuris

trichiura enteroparasitoses are also associated with this clinical condition12

. This study

evaluated the frequency of enteroparasites in a population in the municipality of Oiapoque in

the state of Amapá, Brazil, and correlated infection with the hemoglobin level of each

individual to produce information in support of the planning and evaluation of interventions

aimed at the prevention and control of these infections.

MATERIALS AND METHODS

A cross-sectional study was performed from November 2014 to November 2015 in the

municipality of Oiapoque in the State of Amapá, which is located in the western border of the

Brazilian Amazon region. This municipality is located in the northernmost part of the state

and borders French Guiana to the north and the Atlantic Ocean to the east. In 2010, this region

had a population of 20,509 inhabitants according to the Brazilian Institute of Geography and

Statistics13

. After receiving a detailed explanation of the project and signing the informed consent

form, a questionnaire with socioepidemiological data was filled out, and two fecal samples

were collected in labeled containers without and with preservatives. The collected samples

were analyzed in the Laboratory of Clinical Analysis of the Municipal Hospital of Oiapoque.

The methods used for enteroparasite detection were direct examination and spontaneous

sedimentation. The results were presented as descriptive and inferential statistics in tables to indicate

the respective frequencies corresponding to the detected enteroparasites. The contingency

coefficient and Chi-square (χ2) tests were used to assess the combined proportions and to

evaluate the significance of the greatest contribution among age groups, genders and parasitic

species to the hemoglobin level. P-values equal to or lower than 5% (p < 0.05) were

considered significant. The study was approved by the Research Ethics Committee of the

Federal University of Amapá (protocol 187404137/2013). RESULTS

A total of 446 subjects were included in the study, as summarized in Table 1. The

participants were classified into the following age groups: 7 to 14 years old (5.9%, 26/446);

15 to 18 years old (27.8%, 124/446); 19 to 25 years (19.7%, 88/446) and ≥ 26 years old

(46.6%, 208/446). The highest parasitosis positivity rate was observed among individuals ≥

26 years of age (31.31%, 140/446), followed by individuals aged 15 to 18 years (13%,

58/446), 19-25 years (9.41%, 42/446) and 7 to 14 years (4.71%, 21/446). The majority of the

individuals included in the study were male (54.48%, 243/446). The Chi-square test (χ2)

revealed a significant (p = 0.0082) association between gender and the presence of intestinal

parasites.

59

Table 1. Characterization of helminths and protozoa detected in the study population in

Oiapoque (n = 446), Amapá state, Brazil, according to gender and age (years).

Oiapoque

Protozoa

(n = 107)

Helminths

(n = 118)

Both

(n = 36)

Negative

(n = 185) p-value

Gender (%)

Male 56 (23.0) 46 (19.0) 26 (11.0) 115 (47.0) 0.0082*

Female 51 (25.1) 72 (35.5) 10 (5.0) 70 (34.4)

Age group (%)

7-14** 8 (30.8) 10 (38.5) 3 (11.5) 5 (19.2) 0.0302*

15-18 20 (16.1) 34 (27.4) 4 (3.2) 66 (53.2) 0.0026*

19-25 20 (22.7) 16 (18.2) 6 (6.8) 46 (52.3) 0.0298*

≥26** 59 (28.4) 58 (27.9) 23 (11.0) 68 (32.7) 0.0006*

Source: Study data collection instrument.

*Chi-square test with significant results (p-value < 0.05).

**Meta-analysis test: Several combined proportions with statistical significance of a higher

contribution between the 7 to 14 year old (p = <0.0001) and ≥ 26 year old (p = <0.0001) age

groups. All age groups contributed to the presence of intestinal parasites. The non-parametric

Chi-square test (χ2) revealed a significant association between the 7 to 14 year old (p =

0.0302), 15 to 18 year old (p = 0.0026), 19 to 25 year old (p = 0.0298) and ≥ 26 year old age

groups (p = 0.0006). A meta-analysis test (several combined proportions) was performed to

assess the significance of the factor that had the greatest contribution among the age groups.

The results were significant between the 7 to 14 year old (p = <0.0001) and ≥ 26 year old (p =

<0.0001) age groups.

Among the individuals investigated, 58.6% (261/446) were infected with some type of

intestinal parasite. Of these, 45.2% (118/161) were infected only by helminths, 40.9%

(107/261) were infected with protozoa, and only 13.8% (36/261) of these individuals had

combined infections with these intestinal parasites. Ascaris lumbricoides (19.9%, 52/261) was

the most detected helminth, followed by Ancilostomídeos (7.7%, 20/261), Strongyloides

stercoralis (3.8%, 10/261) and Trichuris trichiura (2.3%, 6/261). Entamoeba coli and

Endolimax nana were the most frequent protozoans (17.2%, 45/261). Giardia intestinalis and

Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar were detected in 3.1% (8/261) and 5% (13/261) of

individuals, respectively (Table 2). Table 2. Frequency of intestinal parasites in the studied population of Oiapoque (n = 446),

Amapá state, Brazil, from 2014 to 2015.

Oiapoque - Intestinal parasites (n) (%)

Protozoa 107 41

Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar 13 5.0

Entamoeba coli + Endolimax nana 45 17.2

Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar + Entamoeba coli 11 4.2

Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar + Endolimax nana 1 0.4

Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar + Endolimax nana +

Entamoeba coli

12

4.6

Entamoeba coli 8 3.1

Entamoeba coli + Giardia intestinalis 3 1.1

Giardia intestinalis + Endolimax nana + Entamoeba coli 5 1.9

Giardia intestinalis 8 3.1

Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar + Endolimax nana +

Entamoeba coli + Giardia intestinalis

1 0.4

60

Helminths 118 45.2

Ascaris lumbricoides 52 19.9

Ancilostomídeos 20 7.7

Strongyloides stercoralis 10 3.8

Trichuris trichiura 6 2.3

Ascaris lumbricoides + Trichuris trichiura 25 9.6

Ancilostomídeos + Trichuris trichiura 2 0.8

Hymenolepis nana 2 0.8

A. lumbricoides + Trichuris trichiura + Ancilostomídeos 1 0.4

Protozoa + helminths 36 13.8

Entamoeba coli + Ascaris lumbricoides 4 1.5

Entamoeba coli + Ascaris lumbricoides + Trichuris. trichiura +

Ancilostomídeos

1 0.4

Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar + Ascaris lumbricoides 2 0.8

Entamoeba coli + Endolimax nana + Ascaris lumbricoides 11 4.2

Giardia intestinalis + Ascaris lumbricoides 5 1.9

Entamoeba coli + Endolimax nana + Trichuris trichiura 5 1.9

Entamoeba coli + Endolimax nana + Strongyloides stercoralis 1 0.4

Entamoeba coli + Endolimax nana + Ancilostomídeos 1 0.4

Giardia intestinalis + Trichuris trichiura 2 0.8

Giardia intestinalis + Ancilostomídeos 1 0.4

Entamoeba coli + Ascaris lumbricoides + Trichuris trichiura 1 0.4

Entamoeba coli + Endolimax nana + Ascaris lumbricoides + Trichuris

trichiura

2

0.8

Positive 261 58.6

Negative 185 41.4

Source: Study data collection instrument. The hemoglobin level in the study population ranged from 7.7 to 18.2 g/dL (mean =

13.2 ± 1.5). Among the individuals positive for intestinal parasitoses, the hemoglobin level

ranged from 7.7 to 18.2 g/dL (mean = 12.8 ± 1.5). Table 3 shows a significant correlation

between hemoglobin level and the presence of detected parasitoses (contingency coefficient

(C) test = 0.2195 and p < 0.0001). Analysis of the hemoglobin levels in the parasitized and

non-parasitized groups revealed a significant correlation for helminths (p = <0.0001),

monoparasitism (p = <0.0001) and polyparasitism (p = 0.0031). Table 3. Correlation between intestinal parasite group, parasitism modality and hemoglobin level in a

population from Oiapoque, Amapá state, Brazil, from 2014 to 2015.

Detected parasites* Hemoglobin levels (g/dL) P-value

< 10.0 10.0-13.0 > 13.0

Protozoan (n = 107) 1 45 61 0.0598**

Helminth (n=118) 5 81 32 < 0.0001**

Protozoa and helminth association (n =

36)

1 15 20 0.1073**

Monoparasitized (n = 119) 2 81 36 < 0.0001**

Polyparasitized (n = 142) 5 61 76 0.0031**

Non-parasitized (n = 185) 2 56 127 --

Source: Study data collection instrument.

*There is a strong association between the hemoglobin level and the detected parasitoses:

(Contingency Coefficient C = 0.2195 and p < 0.0001).

**Chi-square test of trend

61

DISCUSSION

Due to the great diversity in socioeconomic and geographical characteristics among

Brazilian municipalities, enteroparasitic infections are endemic in various areas of the country

and thus constitute a basic and relevant public health problem14

. Currently, the prevalence of

intestinal parasites in the municipality of Oiapoque, which is an area bordering French

Guiana, is underestimated due to the lack of records in the municipality, which prevents the

development of specific and well-targeted control measures for this population. These issues

indicate the relevance and importance of discussing the behavior of these diseases in the

municipality and the health care of border populations and highlight their particularities and

geographical aspects related to the main constraints and determinants of health in border

areas. Variations in the frequencies of diseases between men and women may result from

physiological, intrinsic or behavioral differences and distributions based on influences of the

population structure15

. This study found an infestation of enteroparasites with a predominance

among males (Table 1), which might be related to work activities that have contact with the

soil, such as illegal gold mining and agriculture (the predominant activities in the region),

given the large percentage of geohelminths detected. The data presented here indicate that individuals from all age groups are affected by

intestinal parasitoses. Additionally, a greater contribution was observed for the 7 to 14 year

old and ≥ 26 year old age groups (meta-analysis: several combined proportions p = 0.0001)

(Table 1). Factors such as differences in hygiene habits and the resistance of individuals to

seeking health centers due to cultural and social issues may influence this process16

. In this study, a predominance of polyparasitized individuals was observed (54.4%,

142/261) (Table 3). This finding may be associated with the high frequency with which the

host comes into contact with the medium contaminated with different species or may be

related to the degree of host immunocompetence2. The frequent finding of polyparasitism is

due to similarities in life cycles given the elimination of large numbers of eggs and/or cysts

and their resistance in the environment, which act as an important focus for the maintenance

and transmission of these pathogens14

. Therefore, in this locality, intervention and control

measures for these parasites in soil and water are necessary to break this chain of

transmission. The prevalence of enteroparasites was 58.6% (261/446) in the study population (Table

2). Studies in other regions of Brazil with geographic and socioeconomic characteristics

different from the municipality of Oiapoque indicate variation in positivity between 7.4% in

the state of Santa Catarina in the southern region of Brazil17

. to 42.9% in the interior of the

state of Bahia in northeast Brazil18

. Although the prevalence is usually lower in urban

populations in the country, where there is usually a better quality of sanitation and hygienic

sanitary conditions, the results are still worrying. In the municipality of Oiapoque, the

precarious socioeconomic and sanitary conditions favor the transmission of enteroparasitoses.

The location of this area on the border with French Guiana, where the migratory flow related

to illegal mining is intense, is also a factor that may influence the results. Our study showed that Ascaris lumbricoides (19.9%, 52/261) was the most detected

helminth, but other geohelminths were detected at low frequencies, including Ancilostomídeos

(7.7%, 20/261), Strongyloides stercoralis (3.8, 10/261) and Trichuris trichiura (2.3%, 6/261).

Regarding the protozoa, Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar (5%, 13/261) was observed

in the investigated individuals, but combined infections with non-pathogenic amoebas, such

as Entamoeba coli and Endolimax nana, were the most frequent (17.2% 45/261).

Additionally, Giardia intestinalis (3.1%, 8/261) was detected at a reduced frequency (Table

62

2). Several factors may explain these findings. First, the helminths detected can be transmitted

by waterborne routes, such as A. lumbricoides and Trichuris trichiura. Thus, consumption of

raw food and contaminated water may be a common practice among this population. Additionally, geohelminths known to actively penetrate skin (Strongyloides stercoralis

and Ancilostomídeos) were detected, which suggests that habits such as walking barefoot or

handling soil without hand protection (i.e., agriculture and illegal mining, the predominant

activities in the region) may be important factors in the transmission of these parasites in the

population. Second, the absence of a population treatment policy and the lack of treatment

plans for parasitized individuals (after therapeutic treatment) may stimulate the maintenance

of the transmission chain. Finally, the lack of soil and water research and decontamination for

these parasitoses complements the characteristics of maintenance of these helminths in the

municipality. Among the different ameba species, E. histolytica/Entamoeba dispar is the only

species considered invasive, especially in tropical regions and communities living in

inadequate sanitary conditions19

. Although many individuals are contaminated by commensal

amoebae, most infections are asymptomatic20,21

. The results show low numbers of this

parasite, which indicates that the parasite may not be endemic in the region. However, the

detection of commensal amoebae as evidenced by helminth infections indicates that the

population ingests water or food contaminated with fecal waste and therefore is at high risk of

contamination by this pathogenic amoeba. We must emphasize the importance of the diagnosis and description of these

commensals for the planning of preventive measures and avoidance of infection due to oro-

fecal contamination with pathogenic amoebas22,23

. Another important protozoan pathogen

infection found was giardiasis. The decrease in the rate of giardiasis usually increases with the

age group because successive contact with the parasite increases host immunity19,24

. This

parasite is often found in collective environments because transmission occurs where direct

person-person contact is habitual. However, in the municipality of Oiapoque, the analysis of

the samples revealed a low frequency of giardiasis, which may be related to host factors, such

as immune defense mechanisms, and the biological characteristics of the parasite, whose

elimination is intermittent. At least three alternate examinations are required for each patient

to obtain an accurate evaluation of this parasite. Another important factor in the drastic reduction of helminthoses and protozooses is

adequate drug treatments in conjunction with the establishment of health education programs,

personal hygiene, early treatment of symptomatic and asymptomatic infected individuals,

food storage care, water treatment and footwear use; these measures are key for health

promotion and disease prevention25

. When some form of intestinal parasite is identified, the

awareness of the infected individual/population is of great importance in addition to specific

drug treatment for the avoidance of reinfection26

. The infected individual is treated with

polyvalent antiparasitic agents. At least two therapeutic schemes should be performed, and the

soil should be treated to break the chain of transmission. Another important finding was the association between anemia and intestinal

parasitoses, which represented a serious public health problem. The presence of some

parasites usually determines the onset of anemia, and clinical manifestations are usually

proportional to the parasitic load of the individual. The study showed an inversely

proportional association between hemoglobin level and detected parasitoses (Contingency

Coefficient C = 0.2195 and p < 0.0001) (Table 3). However, the development of anemia in

parasitized individuals is multifactorial, and factors such as nutritional status, parasite species

and load, duration of infection, body iron store, iron intake and bioavailability and

63

physiological iron requirements are complicating factors of this clinical picture27,28

. No

significant differences in these factors were found between groups in this study. Among the

geohelminthiases detected in this study, ancylostomiasis had a marked relationship with

anemia. Despite this close relationship, our results did not support this finding, probably due

to the low circulation of this parasite or its non-endemic profile in the region. Thus, new

studies are necessary to determine the prevalence of this helminthiasis in the municipality. There is a gap in the literature regarding the risk of anemia development in individuals

infected with multiple helminth species but at low numbers. This low-intensity polyparasitism

may be related to the increased possibility of anemia. A recent study demonstrated that

polyparasitic infections were associated with a 5 to 8-fold increased risk of developing

anemia27

. Polyparasitism is a common condition in humans; however, little is known about

the interaction between parasites and their impact on the host's immune system and other

diseases28

. Investigations of the Th1/Th2 response patterns are of great relevance for

understanding host defense against infectious/parasitic diseases. The implications of

concomitant infections in humans have been evaluated mainly in relation to the effects of

intestinal helminth infections on Plasmodium falciparum malaria in non-Brazilian endemic

areas with conflicting results. In Brazil, studies with patients from the state of Rondônia

coinfected with P. vivax and intestinal parasites did not find a direct relationship with

anemia29,30

. Although coinfection with Plasmodium and helminths is prevalent in tropical

countries, the effect of their interactions remains unclear. Some studies have reported that

helminth-infected individuals are susceptible to infection by Plasmodium, causing an increase

in circulating gametocytes, reduced hemoglobin levels and suppression of acute clinical

manifestations and thus an increased risk of malaria11, 12

. An increased incidence and

prevalence of malaria can affect the development of mixed P. vivax and P. falciparum

infections. Additionally, parasite diversity may be higher in helminth-infected patients

31. Malaria

is an endemic disease in the municipality of Oiapoque, and almost half of the cases are from

French Guiana. This association may be relevant for the establishment of the anemic status in

this population. The municipality of Oiapoque is in an area bordering French Guiana, and

several diseases in addition to malaria, such as AIDS, tuberculosis and leishmaniasis, are

important public health problems in the region. New studies need to be carried out to clarify

the influence of intestinal parasitoses on coinfected individuals to understand the transmission

dynamics of these diseases. These studies will produce information that can support the

planning and evaluation of interventions aimed at the prevention and control of these

infections.

CONCLUSIONS

The frequency of intestinal parasitoses is high in the municipality of Oiapoque, and an

effective model of primary healthcare adapted to the region has been suggested to combat

these adverse conditions and to promote the implementation and success of public policies

supporting the universalization of access to education and sanitation and health services.

Many challenges will be faced given the peculiarities of the region. Improvement of the care

model emphasizing preventive health education and community participation conducted by

local health authorities and municipal managers aims at better health care for the population

living in the state of Amapá. Acknowledgments: We acknowledge and thank all those who accepted to participate in the

present study, as well as to the professionals of the Hospital of the municipality of Oiapoque,

64

in which the activities were developed in particular to the employees: Flaviano Feitosa and

Leudilene Marques for assistance in sample collection and technical support. Funding: This work was supported by the Research Program for the Unified Health System

(PPSUS): Shared Health Management with the Foundation for Research Support of the State

of Amapá [001/2013 EPF 00007631]. Competing interests: None declared. Ethical approval: Approved by the Research Ethics Committee of the Federal University of

Amapá (protocol 187404137/2013).

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67

3.2 MANUSCRITO 2

Enteroparasite and vivax malaria co-infection on the Brazil-French Guiana border:

Epidemiological, haematological and immunological aspects

Autores: Rubens Alex de Oliveira Menezes, Margarete do Socorro Mendonça Gomes,

Anapaula Martins Mendes, Álvaro Augusto Ribeiro D’Almeida Couto, Mathieu Nacher,

Tamirys Pina Simão, Aline Collares Pinheiro de Sousa, Andrea Regina de Souza

Baptista, Maria Izabel de Jesus, Martin Johannes Enk, Maristela Gomes da Cunha,

Ricardo Luiz Dantas Machado

Proposta do artigo: Respondendo aos objetivos específicos 4 a 7, este artigo avaliou a

influência da coinfecção das enteroparasitoses na malária causada pelo Plasmodium vivax em

uma área fronteiriça entre Brasil e Guiana Francesa da Amazônia brasileira. Este é o primeiro

estudo que oferece um perfil imune da interação parasita-hospedeiro na malária vivax em

Oiapoque-Amapá. Tais resultados poderão contribuir para o conhecimento sobre a patogênese

dessas coinfecções e no delineamento de estratégias antiparasitárias.

Resumo dos resultados: Foram incluídos no estudo 441 indivíduos agrupados de acordo com

o seu estado de infecção: [Maláricos (M) 6,9% (30/441)], [Coinfectados (CI) 26,5%

(117/441)], [Enteroparasitas (E) 32,4% (143/441)] e [Controle endêmico (CE) 34,2%

(151/441)]. O gênero masculino prevaleceu entre os grupos (M) 77% (23/30) e (CI) 60%

(70/117). Houve diferença entre os níveis de hemoglobina nos diferentes grupos estudados:

[CE e E (p < 0.01)], [CE e CI (p < 0.01)], [E e M (p < 0.01)] e [CI e M (p < 0.01)]. A anemia

foi expressa em percentuais entre indivíduos [CI e CE (p < 0.05)]. Foi observado diferenças

na parasitemia entre os grupos [CI e M (p < 0.05)]. Com relação aos anticorpos contra

PvMSP-119 foram detectados em 51,2% (226/441) da população. As analíses dos níveis de

citocinas revelaram uma grande variação nas concentrações, com pistas imunológicas na

alteração da resposta imune expressa pelas citocinas TNF-α e IL-10 aumentados para os

indivíduos do grupo coinfectado. Os resultados apontam a coinfecção Malária e

Enteroparasitoses um aspecto real no município do Oiapoque. Adicionalmente, a coinfecção

não esteve associada com a redução de malária (incidência, prevalência ou redução da

parasitemia).

Status: Submetido – PLOS Neglected Tropical Diseases (ISSN: 1935-2735)

68

E-Mail de Submissão

69

Enteroparasite and vivax malaria co-infection on the Brazil-French Guiana border:

Epidemiological, haematological and immunological aspects

Short title: Enteroparasite and vivax malaria co-infection on the Amazon border

Rubens Alex de Oliveira Menezes1,2*

, Margarete do Socorro Mendonça Gomes3, Anapaula

Martins Mendes4, Álvaro Augusto Ribeiro D’ Almeida Couto

3, Mathieu Nacher

5, Tamirys

Pina Simão6,7

, Aline Collares Pinheiro de Sousa7, Andrea Regina de Souza Baptista

8, Maria

Izabel de Jesus7, Martin Johannes Enk

7, Maristela Gomes da Cunha

1, Ricardo Luiz Dantas

Machado1,7,8

1Postgraduate Program in the Biology of Infectious and Parasitic Agents, Federal University

of Pará (UFP), Belém, Pará State, Brazil

2 Federal University of Amapá (UNIFAP), Macapa, Amapá State, Brazil

3 Amapá State Secretary of Health (SESA)/Amapá Central Laboratory, Amapá state, Brazil

4 UNIFAP/Oiapoque Binational Campus, Oiapoque, Amapá State, Brazil

5 Université des Antilles et de la Guyane Caiena, French Guiana

6 Postgraduate Program in Neuroscience and Cell Biology, UFP, Belém, Pará State, Brazil

7 Evandro Chagas Institute/Brazilian Secretariat of Health Surveillance (SVS)/Brazilian

Ministry of Health (MS), Ananindeua, Pará State, Brazil

8 Fluminense Federal University, Niterói, Rio de Janeiro State, Brazil

* Corresponding author

E-mail: [email protected] (RAOM)

70

Abstract

Malaria-enteroparasitic co-infections are known for their endemicity. Although they are

prevalent, little is known about their epidemiology and effect on the immune response. This

study evaluated the effect of enteroparasite co-infections with malaria caused by Plasmodium

vivax in a border area between Brazil and French Guiana.

Methods: The cross sectional study took place in Oiapoque, a municipality of Amapá, on the

Amazon border. Malaria was diagnosed using thick blood smears, haemoglobin dosage by an

automated method and coproparasitology by the Lutz e Faust methods. The anti-PvMSP-119

IgG antibodies in the plasma were evaluated using ELISA and Th1 (IFN-γ, TNF-α and IL-2),

and Th2 (IL-4, IL-5 and IL-10) cytokine counts were performed by flow cytometry. The

participants were grouped into those that were monoinfected with vivax malaria (M), vivax

malaria-enteroparasite co-infected (CI), monoinfected with enteroparasite (E) and endemic

controls (EC), who were negative for both diseases.

Main findings: 441 individuals were included and grouped according to their infection status:

[M 6.9% (30/441)], [Cl 26.5% (117/441)], [E 32.4% (143/441)] and [EC 34.2% (151/441)].

Males prevailed among the (M) 77% (23/30) and (CI) 60% (70/117) groups. There was a

difference in haemoglobin levels among the different groups under study for [EC-E], [EC-Cl],

[E-M] and [Cl-M], with (p < 0.01). Anaemia was expressed as a percentage between

individuals [CI-EC (p < 0.05)]. In terms of parasitaemia, there were differences for the groups

[CI-M (p < 0.05)]. Anti-PvMSP-119 antibodies were detected in 51.2% (226/441) of the

population. The cytokine level analysis revealed a large variation in the TNF-α and IL-10

concentrations, being high for individuals in the co-infected group.

Conclusion: Co-infection was not associated with malaria reduction (the incidence,

prevalence or reduction of parasitaemia). Studies of this nature that offer immunological clues

about immune response changes are essential for diagnostic and preventive strategies.

Keywords: malaria, enteroparasites, co-infection, cytokines, Brazilian Amazon.

71

Author summary

Tropical regions are known for the endemicity of malaria-enteroparasite co-infections.

Although they are prevalent, little is known about these interactions and how simultaneous

infection affects the epidemiology and/or pathogenesis of each morbidity. Oiapoque, a

municipality in the state of Amapá, northern Brazil, on the western border of the Amazon,

was chosen to determine the epidemiology and effect of these co-infections. To understand

the development of anti-parasitic strategies, it is fundamental to uncover the mechanisms that

govern these immune responses. The authors demonstrate the differences between the

antibody profiles reported in the study and draw attention to the importance of performing

immunoepidemiological studies in different malaria-endemic areas, where the transmission

intensities and human genetic backgrounds are very distinct. Establishing P. vivax's complex

geographical pattern is important, both for diversity evaluations that help select candidate

antigens for vaccines and for formulating and structuring surveillance measures to control

malaria. The results show that malaria-enteroparasite co-infection is a reality in the

municipality of Oiapoque. This study evaluates the possibility that populations infected with

intestinal parasites can affect malarial transmission dynamics, which is essential knowledge

for diagnostic and preventive strategies.

72

Introduction

In Brazil, over 99% of reported malaria cases occur in the Amazon region [1,2]. The

cases recorded outside the Amazon region are imported from the Amazon states or from other

countries. There are rare indigenous accounts that have been restricted to the Atlantic Forest

in the south-eastern part of the country [3]. Socioeconomic and environmental conditions

favour disease transmission and vector survival [4]. In recent years, Plasmodium vivax has

been the most prevalent species in the country, accounting for approximately 80% of

episodes, while Plasmodium falciparum is responsible for approximately 20%, and

Plasmodium malariae is rarely detected. Historically, severe clinical P. vivax cases have been

rarely reported [5]. However, recent studies emphasize the association of this species with

clinical complications and fatal cases, which is a cause for public health concern [5-7].

Currently, it is estimated that more than a third of the world's tropical and sub-tropical

population is infected with one or more enteroparasites [8]. Human infections with these

organisms remain prevalent in countries where the malaria parasite is also endemic [9,10],

and they are one of the most important public health issues in the world [11,12]. Malaria and

intestinal parasite co-infections are widespread, and both have similar geographical

distributions and overlap in developing countries [9,13].

Although Plasmodium and helminth co-infections are prevalent in tropical countries,

the effect of their interactions remains unclear [14]. Some studies report that individuals who

are infected with helminths are susceptible to Plasmodium infection [15,16], resulting in an

increase in circulating gametocytes [17], a reduction in haemoglobin levels [18], the

suppression of acute clinical manifestations [19] and an increased risk of malaria transmission

[17,20,21]. It is known that increased incidence and prevalence of malaria can affect the

development of P. vivax and P. falciparum-mixed infections and that parasite diversity may

be greater in patients who are infected with helminths [22,23]. The evolutionary implications

of co-infection may also extend to the reproduction of helminths, which are interested in

protecting their hosts to survive and reproduce [24].

These associations between helminthiases and malaria are well documented in

malaria-endemic regions of Africa and Asia, especially where malaria is caused by P.

falciparum. However, the protective effect against malaria from P. vivax has also been

observed in two studies outside Brazil [18,19]. In the Brazilian Amazon region, intestinal

helminthiases were associated with protection against reduced haemoglobin levels during P.

vivax malaria episodes in a population of children in the city of Manaus, Amazonas State [25].

In addition, in the municipality of Porto Velho in the State of Rondônia, co-infection with

enteroparasites did not affect the immune response pattern to vivax malaria [26,27], but

differences were observed between the haemoglobin levels of malaria patients and individuals

who were not infected by enteroparasites [26].

The municipality of Oiapoque is in the French Guiana border region, and it has a close

relationship with local social health determinants. It also has an intense population flow. The

objective of this study was to evaluate the effect of enteroparasite co-infection on malaria

caused by Plasmodium vivax in this region of the Brazilian Amazon.

Methods

Study area

A cross-sectional study was conducted in the municipality of Oiapoque, Amapá State,

in northern Brazil, on the western border of the Amazon region. It has an Annual Parasite

Index that designates it as at high risk of malaria transmission, and it is located in the northern

part of the state of Amapá. Due to the border with the municipality of Saint Georges de

l’Oyapock in French Guiana, there is an intense population flow related to trade, mining,

tourism and social life, which also facilitates the spread of communicable diseases.

Inclusion criteria

73

Participants were required to meet the following inclusion criteria: (1) signed consent

form, (2) being native to the study area, (3) being over seven years of age, (4) consenting to

blood collection and (5) providing a faecal sample.

Sample

A total of 441 participants formed the study population, with the sample collection

taking place over one year between the months of November 2014 and November 2015. Data

collection was performed by passive detection in the municipality's Basic Health Units,

following phenotypic diagnoses using thick blood smears and prior to treatment. For the

uninfected group, samples were also collected in the same municipality so that the

participating individuals were from a similar background exposure conditions. After a

parasitological evaluation, the subjects were divided into the following four groups: 1)

patients with an intestinal parasite and malaria co-infection (n = 117); 2) patients with malaria

who were negative for intestinal parasites (n = 30); 3) patients without malaria who were

positive for enteroparasites (n = 143); and 4) patients who were negative for both (n = 151).

Epidemiological data such as the age, gender and number of previous episodes of malaria

were obtained during interviews and from medical records.

Ethical considerations

This study was authorised by the Federal University of Amapá (UNIFAP) Research

Ethics Committee (CEP, protocol 187404137/2013). The study candidates were included after

they received a briefing and expressed their consent to participate in writing. Donors who

were positive for malaria and enteroparasites were subsequently treated with

chemotherapeutic agents as recommended by the Ministry of Health. Participants who were

positive for enteroparasites were referred to the hospital's medical team for advice and

treatment.

Collection and laboratory analysis

Blood collection

Blood samples were collected by venipuncture. Ten millilitres of venous blood was

collected from each patient. Four millilitres was dispensed into a tube containing EDTA

(ethylenediamine tetraacetic acid) (Beckton & Dickson, USA) to perform haematological

analysis and to prepare thick blood smear slides, and 6 mL was dispensed into a tube (Becton

& Dickson, USA) with no anticoagulant for immunological analysis. After this collection,

each slide was maintained at room temperature to dry the blood drop. The slides were

subsequently stained and analyzed using light microscopy (Nikon, Japan) according to the

protocol described by the World Health Organization.

Malaria diagnosis

The slides were prepared by following the Walker technique (methylene blue and

Giemsa) [28] and evaluated by a local microscopist from the municipality’s malaria

diagnostic station. Direct parasite counting was performed by estimating the parasitaemia

using a semi-quantitative evaluation, which recorded the parasitaemia interval per µL of

blood from 200 fields. The number of counted parasites was multiplied by 5 [29]. These

results were subsequently confirmed in the Amapá Border Laboratory (LAFRON/AP) and by

the endemic quality control section of the Amapa Central Laboratory (LACEN/AP).

For the sexual form count (gametocytaemia), the thick blood slides were reviewed for

gametocyte quantification in 100 leukocytes. The conversion to gametocytes/μL was

performed by calculation using a reference value of 8000 leukocytes/mm3, and the

gametocytes were counted directly on the slide (Nº gametocytes X Nº of leukocytes

74

(8000)/100 = gametocytes per µL). This procedure is similar to the diagnostic methods

recommended by the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) guidelines of the

United States Centers for Disease Control (CDC) and the World Health Organization (WHO)

guidelines. The count was subsequently confirmed in LAFRON/AP and sent to LACEN/AP's

endemic quality control section.

Haemoglobin dosage

The haemoglobin concentration was measured in venous blood using the Oiapoque

Hospital's automated equipment (Mindray-BC-3000plus). Anemia was defined with

haemoglobin reference values. The evaluated haematological parameters were the total

number of erythrocytes (RBC; reference range: males 4.5 - 6.5 x 106/µL, females 3.9 - 5.6 x

106/µL) and the haemoglobin (Hb; males ≥ 13 g/dL, females ≥ 12 g/dL). Individuals were

considered anaemic when their haemoglobin levels were ≤ 13 g/dL of blood for males and ≤

12 g/dL of blood for females.

Evaluation of anti-PvMSP-119 IgG antibodies

The evaluation of the total anti-MSP-119 IgG antibodies was performed at the Federal

University of Pará (UFP) according to Wedge et al.'s (2001) protocol. The recombinant

protein (His6-MSP-119) of the MSP-1 from P. vivax (Belém strain) was expressed in

Escherichia coli. The 96 wells of the Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) plates

(Costar, Corning Inc. NY, USA) were sensitized with 50 μL of His-MSP-119 protein (4

μg/mL) diluted in 0.05 M of pH 9.0 carbonate buffer (15 mM Na2CO3, 34.9 mM NaHCO3)

for 16 hours at room temperature. The plates were subsequently washed with phosphate-

buffered saline (PBS) containing 0.05% Tween and blocked with 200 μL of 5% PBS-milk

(Molico, NESTLÉ®). After 2 hours at 37°C, the plates were washed with 0.05% Tween PBS,

and 50 μL of plasma diluted 1:100 in 5% PBS-milk was added to each well in duplicate. The

plates were then incubated for 16 hours at room temperature. After the further washing of the

plates with 0.05% Tween PBS, 50 μL of human peroxidase-linked anti-IgG (DAKO

polyclonal rabbit, Glostrup, Denmark) diluted 1:10,000 in 5% PBS-milk was added to each

well, and the plates were incubated for 2 hours at room temperature. Then, after further

washing with 0.05% Tween PBS, the plates were developed by adding 100 μL of OPD (ortho-

phenylenediamine) (1 mg/mL) diluted in phosphate-citrate buffer (0.2 M NaH2PO4, 0.2 M

C6H8O7, pH 5.0) containing 0.03% hydrogen peroxide. This reaction was maintained in the

dark and stopped after 10 minutes by adding 25 μL of 4 N H2SO4 to each well. The optical

density (OD) was measured using an ELISA reader (EL800 Bio Tek, Winooski, USA) at a

wavelength of 490 nm. The reactivity index (RI) was calculated to define the negative or

positive samples, determined by dividing each sample's OD value by the cut-off point (Cut-

off: PvMSP-119 = 0.165). Samples with an RI ≥ 1 were considered positive, while samples

with an RI < 1 were considered negative. The cut-off point was established by taking the

mean ODs of 56 plasma samples obtained from the Pará Haemotherapy and Haematology

Foundation Centre (HEMOPA) from individuals residing in Belém, Pará State, with no

history of malaria plus three standard deviations.

Cytokine dosage

A CBA (cytometric bead array) Kit (BD) was used in this study to quantify cytokines

IL-2, INFγ and TNF (Th1) and IL-4, IL-5, and IL-10 (Th2) in the same sample. Six bead

populations with distinct fluorescence intensities were conjugated with a capture antibody

specific for each cytokine. They were mixed to form the CBA and read on a FACSCanto II-

type flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) that was previously calibrated with

"setup beads", incubated with fluorescein isothiocyanate (FITC) or phycoerythrin (PE)

75

according to the manufacturer's recommendations. A standard curve was performed for each

cytokine and analyzed using FACSDiva software (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

The bead populations were displayed according to their respective fluorescence intensities,

from dimmer to brighter. In the CBA, the cytokine capture beads were mixed with detection

antibody conjugated with PE fluorochrome and then incubated with the test samples to form a

"sandwich" test. The acquisition tubes were prepared with 50 μL of sample, 50 μL of bead

mix and 50 μL of Th1/Th2 PE detection reagent (Human Th1/Th2 PE Detection Reagent/1

vial, 4 mL). The same procedure was performed to obtain the standard curve. The tubes were

homogenized and incubated for three hours at room temperature in the dark. The results were

presented on graphs and in tables using FCAP Array 3 software (Becton Dickinson, San Jose,

CA, USA). Raw MFI (media fluorescence intensity) values were quantified for each cytokine.

The values were expressed in pg/mL for each cytokine in comparison to the standard curve.

Three hundred events were considered for each cytokine.

Collection and examination of faecal samples

Two faecal samples were collected from each individual, each in a separate container.

One contained a preservative solution (10% formaldehyde), and one was kept without

preservative solution. For the negative cases, three faecal samples were collected and

examined using the fresh/direct approach with and without Lugol solution and the Hoffman-

Pons-Janer and Faust methods. For each faecal sample, two slides were examined using light

microscopy (Nikon, Japan) at magnifications of 100X and 400X for parasite detection by two

researchers who were experienced in these identifications. The analyses were performed in a

private laboratory in the municipality of Oiapoque.

Statistical analysis

Each volunteer's epidemiological data results, which were obtained from the

questionnaire, was stored in an Epi-Info 3.5.1 database (CDC, Atlanta, GA, USA). The values

for each group (malaria, co-infected, enteroparasite and endemic control), as well as the

subgroups (helminths, protozoa and helminth-protozoa association), were expressed as a

percentage. The age, residence time in Oiapoque (years) (RT), number of previous malaria

episodes (NPE), period since last malaria (months) (PLM), haemoglobin levels (g/dL),

parasitaemia (parasites/L) and gametocytes were expressed as medians (1st and 3rd Quartile)

using BioEstat 5.3 statistical software. The differences between groups with regard to age,

RT, NPE, PLM and haemoglobin were calculated using Tukey's test based on a one-way

analysis of variance (ANOVA). The Kruskal-Wallis-Dunn test was used to calculate the

degree of anaemia.

The statistical tests used here were chosen by considering the size and type of each

variable and number of evaluated groups. The differences in the parasitaemia and the

gametocytes between the malaria and co-infected groups were calculated using the Wilcoxon-

Mann-Whitney test. For the PvMSP119 reactivity index (RI) among the studied groups,

multiple correlations were performed using the non-parametric Kruskal-Wallis test, followed

by Dunn's post-test. The data were expressed in box plot format (minimum to maximum

values, P25%-P75% and median). Significant differences were estimated using the median

values for each group; those with p ≤ 0.05 were considered significant.

For the cytokine expression analysis, the significance level was obtained by

comparing the cytokine concentrations of the studied groups using the GraphPad Prism

program, version 6.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). An analysis to uncover the

correlation between the groups was performed using the non-parametric Kruskal-Wallis test

followed by Dunn's post-test. The data were expressed in box plot format (minimum to

76

maximum values, P25%-P75% and median). Significant differences were estimated using the

median values for each group, and those with p ≤ 0.05 were considered significant.

Results

Prevalence of malaria and enteroparasites

Table 1 summarizes the individual results according to their infection status. In

summary, 6.9% (30/441) of the individuals were infected with malaria alone (M); 26.5%

(117/441) of the individuals were co-infected with malaria and enteroparasites (CI); 32.4%

(143/441) of the individuals were infected with enteroparasites only (E); and 34.2% (151/441)

of the individuals had a negative diagnosis for malaria and enteroparasites/endemic control

(EC). The (CI) and (E) groups consisted of subjects who were positive for intestinal parasitic

infection, with helminths only (H), protozoa only (P) or an association of helminths and

protozoa (P+H).

Table 1. Distribution and Number of Individuals among Groups and Subgroups

According to the Malaria and Intestinal Parasite Diagnosis Groups Subgroups Description n %

Malaria (M) Individuals infected with Plasmodium

vivax only

30 6.9

Co-infected (CI) Helminths (H) Individuals co-infected with

Plasmodium and helminths only (H)

54 12.2

Protozoa (P) Individuals co-infected with

Plasmodium and protozoa (P) only

39 8.9

Helminths + Protozoa (H+P) Individuals co-infected with

Plasmodium and helminths +

protozoa (P+H)

24 5.4

Total (CI) 117 26.5

Enteroparasite (E) Helminths (H) Individuals infected with helminths

only (H)

63 14.2

Protozoa (P) Individuals infected with protozoa

only (P)

68 15.4

Helminths + Protozoa (H+P) Individuals infected with helminths

and protozoa (P+H) only

12 2.8

Total (E) 143 32.4

Endemic Control (EC) Individuals negative for malaria and

intestinal parasite diagnosis

151 34.2

Total 441 100

Groups: malaria (M), co-infected (CI), enteroparasite (E) and endemic control (EC).

Subgroups CI and E: helminths (H), protozoa (P) and association of helminths and protozoa

(H+P).

Characteristics of the studied groups

Table 2 summarizes the characteristics of the studied groups. Males represented the

majority of individuals who were infected with malaria in both the M group, 77% (23/30),

and CI group, 60% (70/117). When using a one-way ANOVA with Tukey's test, it could be

observed that the mean age of the CI (p < 0.01) and E (p < 0.05) groups differed from that of

the (EC) group. However, this trend did not occur between the other groups.

77

Table 2. Epidemiological and Haematological Data for the Studied Groups

Malaria-Positive

N=147

Malaria-Negative

N=294

Malaria (M)a

N=30

Co-infected (CI)b

N=117

Enteroparasites (E)c

N=143

Endemic control (EC)d

N=151

Category n (%)

Male 23 (77) 70 (60) 56 (39) 88 (58)

Female 7 (23) 47 (40) 87 (61) 63 (42)

Age 29 (12–55) 29 (7–66)d* 25 (8–74)d* 19 (10–60)

RT 29 (12–79)d* 26 (7–66)d* 25 (8–65)d* 19 (10–60)

NPE 4 (2–10) 5 (0–17) 4 (0–17) 4 (1–16)

PLM 9 (5–14) 8 (0–15)c*d* 9 (0–17) 9 (4–18)

Haemoglobin (g/dL) 13.8 (11.7–17)b*c* 13.2 (7.7–18.2)d* 12.4 (9.4–16.7)d* 13.7 (9.4–16.7)

Anaemia (%) 10% (3/30) 30.8% (36/117)d* 43.3% (62/143) 10.6% (16/151)

Parasitaemia (par./𝜇L) 2750 (60–16.000)b* 1000 (25–30.000) (--) (--)

Gametocytes 250 (0–6000) 70 (0–6000) (--) (--)

n (%): number of samples (percentage) in each category

Values expressed as medians (25–75%): age, residence time (years) in Oiapoque (RT),

number of previous malaria episodes (NPE), period (months) since last malaria (PLM),

haemoglobin levels (g/dL), parasitaemia (parasites/L) and gametocytes.

The differences between the groups with regard to their age, RT, NPE, PLM and haemoglobin

were calculated using Tukey's test and based on a one-way ANOVA.

Individuals with haemoglobin levels ≤ 13 g/dL for men and ≤ 12 g/dL for women were

considered to have anaemia, according to the Kruskal-Wallis-Dunn test.

Differences in parasitaemia and gametocytes between the malaria and co-infected groups

were calculated using the Wilcoxon Mann-Whitney test. aDifference between indicated group and the malaria group

bDifference between the indicated group and the co-infected group

cDifferences between the indicated group and the enteroparasite group

dDifferences between the indicated group and the endemic control

Statistical differences in epidemiological parameters were expressed as * p < 0.05.

We also observed differences in the mean residence time (RT) for groups E, CI and M

(p < 0.05) when compared to the EC group. Regarding the number of previous malaria

episodes (NPE), there were no differences between groups (p = 0.0716). When analyzing the

period since last malaria (PLM) variable, we observed differences between the CI and EC

groups (p < 0.01) and between the E and CI groups (p < 0.01).

Analyses of some haematological data showed that the mean haemoglobin levels

differed between the groups EC and E (p < 0.01), EC and CI (p < 0.01), E and M (p < 0.01)

and M and CI (p < 0.01). However, there was no significant difference when comparing

groups EC and M and E and CI. Anaemia was expressed as a percentage, and the Kruskal-

Wallis-Dunntest found a difference between the CI and EC individuals (p-value= 0.0224).

With regard to parasitaemia (count of Plasmodium vivax parasites), there were differences

between the CI and M groups (p = 0.0152), as calculated by the Wilcoxon-Mann-Whitney

test. However, when using the same test to quantify the Plasmodium vivax gametocytes, no

statistically significant differences were observed between the CI and M groups (p = 0.0819).

78

Anti-PvMSP119 IgG responses to Plasmodium vivax

The percentage of individuals in the investigated population that possessed naturally

acquired anti-PvMSP-119 IgG-1 antibodies is shown in Fig 1. Responders represented 51.2%

(226/441) of individuals (Fig 1a). The presence of anti-PvMSP-119 IgG antibodies among the

groups showed a higher prevalence of 81.1% (95/117) in the CI group. The lowest prevalence

was in the EC group, with 33.1% (50/151) (Fig 1b). To support the data (Fig 1c), each

individual's data were shown as a point and expressed in box plot format. Significant

differences were observed, as estimated by the median values for each group (a nonparametric

Kruskal-Wallis test followed by Dunn’s post-test). These values were considered significant,

where p < 0.05.

Fig 1. (a) Frequency-specific antibody response to PvMSP-119, as determined by ELISA. The

subjects were grouped into responders and non-responders to the recombinant protein. (b)

Prevalence of anti-PvMSP-19 IgG antibodies in the studied groups. (c) PvMSP-119 reactivity

index (RI) between the studied groups as expressed in box plot format, with individual data

shown as points. Multiple correlations were made using the nonparametric Kruskal-Wallis

test followed by Dunn’s post hoc test (minimum to maximum values, P25%–P75% and

median); significant differences were estimated using the median values for each group, and

those with p < 0.05 were considered significant. ** p < 0.05, *** p = 0.001 and **** p <

0.001.

79

Fig. 2 shows the seroprevalence in terms of the frequency of anti-MSP119-specific IgG

antibodies as distributed across the four study groups as well as the reactivity index, which

specified and subdivided the CI and E groups. Fig 2a shows that the helminths were most

prevalent in the CI group, with 85.1% (46/54). The highest values in group E were found in

the protozoa and helminth association subgroup, with 58.3% (7/12). Fig 2b expresses the

PvMSP-119 reactivity index (RI) among the studied groups structured as in Fig 2a. The data

are expressed in box plot format (minimum to maximum values, P25%-P75% and median),

with each individual's data shown as a point. Significant differences were observed in each

group’s median values, and those with p < 0.05 were considered significant. ** p < 0.05, ***

p = 0.001 and **** p < 0.001.

80

Fig 2. (a) Prevalence of recombinant PvMSP-119 antigens in the studied groups, according to

the intestinal parasitic infection. The (enteroparasite) and (co-infected) groups have subgroups

of individuals that were infected with helminths, protozoa and protozoa and helminths

together. (b) The PvMSP119 reactivity index (RI) between the endemic control, malaria,

enteroparasite (helminths, protozoa and protozoa+helminths) and co-infected (helminths,

protozoa and protozoa+helminths) groups. Multiple correlations were made using the

nonparametric Kruskal-Wallis test followed by Dunn's post hoc test. Data are expressed in

box plot format (minimum to maximum values, P25%–P75% and median), with all individual

data shown as points. Significant differences were estimated using the median values for each

group, and those with p < 0.05 are considered significant. * p = 0.05, ** p < 0.05, *** p =

0.001 and **** p < 0.001.

Circulating cytokine profile in the population's plasma

A total of 130 of the 441 individuals analysed at the start of the study were evaluated

to verify the circulating cytokine profile in the population's plasma, from groups M (n = 30),

CI (n = 50), E (n = 50) and EC (n = 100). The TNF-α concentration was higher in the CI

group than in the other groups. The median values differed for the CI-E, M-CI and CI-EC

groups (p = 0.001) (Fig 3a).

Fig 3. Serum levels of TNF-α (a), IFN-γ (b), IL-2 (c), IL-4 (d), IL-5 (e) and IL-10 (f)

cytokines in pg/mL among the following groups: endemic control, malaria, enteroparasite and

co-infected groups. Multiple correlations were made using the non-parametric Kruskal-Wallis

test followed by the Dunn's post hoc test. Data are expressed in box plot format (minimum to

81

maximum values, P25%–P75% and median). Significant differences were estimated using the

median values for each group, with p < 0.05 being considered significant. * p = 0.05, ** p <

0.05 and *** p = 0.001.

Additionally, the IFN-γ levels were higher in group M than in the other groups.

Comparisons of the M-EC (p = 0.001), M-E (p < 0.05), E-CI (p < 0.05) and EC-CI (p =

0.001) groups were statistically significant (Fig 3b). Increased IL-2 concentration values were

observed in the EC group. Statistically significant differences were observed for the EC-CI (p

= 0.001), EC-M (p = 0.001), M-CI (p = 0.001), M-E (p < 0.05) and CI-E (p = 0.001) groups

(Fig 3c).

The IL-4 concentration was higher in the CI group, and there was a statistically

significant difference for CI-E (p = 0.05). Comparisons between the remaining groups were

not statistically significant (Fig 3d). IL-5 showed high concentrations in the CI group, and

comparisons of the CI-E (p = 0.05), CI-M (p = 0.001) and EC-CI (p = 0.001) groups were

significant (Fig 3e). With respect to the IL-10 cytokine profile, we can observe increased

concentrations for groups CI and M. There were statistically significant differences for groups

CI-E, CI-EC, M-E and M-EC (p = 0.001) (Fig 3f).

Discussion

Microorganism co-infections are largely unexplored, and their effects can be either

favourable or harmful to the human host. Some studies have explored the effects of helminth

co-infections on the dynamics of P. falciparum malaria transmission and its correlation with

anaemia [26,27]. In Brazil, recent studies have described the haematological and

immunological profiles of vivax malaria and intestinal parasite co-infections [25-27] in two

areas of Brazil's western Amazon. We are the first to study the effect of intestinal parasites on

biological aspects of malaria in individuals who were naturally infected with P. vivax in a

malaria-endemic area located on the Brazilian border with French Guiana.

The parasitological findings of this study show a higher prevalence of individuals who

were infected only with E (32.4%), followed by the CI group (26.5%). Group M had the

lowest prevalence (6.9%). The CI and M groups were predominant in the male population,

emphasizing their geographical peculiarities and aspects related to the primary constraints and

health determinants in the border region related to work activities, more specifically, the

illegal mining (gold mining) and agricultural activities prevalent in the region where contact

with the vector and soil is frequent.

The results show that individual haemoglobin levels differ between the CI and M

groups. Anaemia was more prevalent in the CI and E individuals, with significant differences

in the plasmodial parasite load between the CI and M groups. This haematological change

observed between the groups emphasizes that anaemia is multifactorial and is a frequent early

manifestation of malaria that contributes to disease severity, especially in the context of

concurrent infections [30-32]. This disease leads to the destruction or sequestration of

erythrocytes, abnormal erythropoiesis and blood loss arising from eventual coagulopathy [33-

35]. Additionally, cytokine polymorphisms have been associated with susceptibility to severe

malarial anaemia, disturbing erythropoiesis [36,37]. Studies have shown that a number of co-

infections increase susceptibility to anaemia because they exacerbate the inflammation caused

by malaria [38,39]. Helminth infections are associated with the increased likelihood of

development and the greater severity of anaemia in Plasmodium infection [39] as well as

genetic changes - haemoglobinopathies - and nutritional deficiencies [40].

The molecular mechanisms underlying malarial anaemia are largely unknown,

although it is accepted that the disease is complex and multifactorial and has characteristics in

82

common with acute malaria [40,41]. In this context, the results of this study indicate that the

effect of enteroparasitic infection on the prevalence and severity of anaemia caused by vivax

malaria still requires further investigation. These differences may be explained by the fact that

in a co-infection, there may be a negative interaction between parasites, characterized by a

protective effect on the individual and a suppressive effect on one of the pathogens or a

positive interaction in which an infection is facilitated by the presence of the other parasite

[41-43]. Thus, it is possible that P. vivax and intestinal parasite co-infection could modify the

immune response profile against certain specific Plasmodium antigens.

Seroepidemiological studies to investigate the type and magnitude of the vivax malaria

immune response in naturally exposed populations, in both Brazil [44-46] and around the

world [47-50], have provided important information about the potential candidacy of

immunogenic P. vivax antigens for use in creating an anti-malarial vaccine. The differences

between antibody profiles reported in the present study indicate the importance of performing

immunoepidemiological studies in different malaria-endemic areas, where transmission

intensities and human genetic backgrounds are very distinct [51].

Studies on antibody responses to Plasmodium antigens offer a key process in the

discovery and development of anti-malarial immunotherapy. Several studies have reported

high antibody responses to P. vivax antigens in individuals who have been exposed to malaria

infections [27,52]. In this study, anti-PvMSP-119 IgG antibodies were detected in 51.2%

(226/441) of the studied population, indicating the presence of an immunogenic protein, with

results similar to those of other studies in the Amazon region [27,52-55]. Higher prevalence

and specific antibody RIs were observed in the CI and M groups, reaching 81.1% (95/117)

and 76.7% (27/30), respectively. As demonstrated in other endemic areas in the Brazilian

Amazon, PvMSP-119 appears as an immunogenic molecule during naturally acquired malaria

infections [56-58].

Corroborating the findings in the Western Brazilian Amazon, the presence of

enteroparasites also did not affect antibody responses to this antigen [27]. The reduced

prevalence of IgG and RI in the group of individuals who were infected with intestinal

parasites alone appears to be a general characteristic of this association, as in Rondônia, the

prevalence of protozoa in vivax malaria-co-infected individuals was higher than that detected

in the Oiapoque municipality, where geohelminths were more prevalent.

These results support those of other studies [59,60] that have suggested, theoretically,

the possibility that malaria-helminth co-infection potentiates parasitic genetic diversity in

individuals who are exposed to both infections [21,59,60]. Understanding this transmission

dynamic and the evolutionary implications of populational P. vivax co-infection is very

important for predicting the emergence and distribution of different strains of the parasite,

which may differ in their virulence and drug resistance [61]. This finding is a major concern

in these neglected border areas, where the usual practice of inadequate self-treatment

contributes to an increased risk of developing resistance to antimalarial drugs.

Due to Oiapoque's local genetic diversity and the combined effects of the geographical

structure of the border between Brazil and French Guiana in a regional, national and

international context, there is a dispersion of Plasmodium vivax populations between the two

countries [62]. Establishing P. vivax's complex geographical pattern is important, both for

evaluating diversity when encoding candidate antigens for vaccines and when formulating and

structuring surveillance measures to control malaria.

In fact, helminths were the most prevalent enteroparasites in the CI (85.1%, 46/54)

and E (58.3%, 7/12) groups. The reduction in the antibody prevalence and reactivity index in

group E may be explained by the association (protozoa-helminths) and/or presence of

intestinal protozoa. However, in the CI group, the IgG prevalence and reactivity index were

not reduced and were similar to those in infected group M. These data confirm the non-

83

importance of protozoa in the immune process during co-infection with P. vivax, as

previously shown in another Brazilian Amazon region [27]. However, the diversity of

enteroparasites meant that groups could not be formed with sample sizes large enough for

researchers to be able to infer some sort of effect on co-infection.

The general trend in co-infection studies (helminths, malaria) is convergent and points

to the possibility of increasing incidence and prevalence of malaria [63,64] and a tendency to

reduce malaria symptoms [24,65]. This finding suggests that these patients might be less

likely to seek treatment, making them a potential source of transmission [21]. In poor tropical

areas, health determinants and constraints affect the population's health care and services

sought when the disease is at an advanced stage.

In malaria, protective immunity is gradually acquired through the natural exposure of

people living in areas where the disease is endemic, but this immunity is rapidly lost when

exposure ceases, indicating that malaria's immunological memory is short term and requires

constant exposure to the parasite [66,67]. Although infection by many enteroparasites was

observed, the research revealed a prevalence of helminths, and it is generally believed that

helminth infection may alter the host's natural immune response to Plasmodium due to the

anti-inflammatory effect of helminth-induced cytokines [26].

Understanding the Th1/Th2 response pattern is of great importance for understanding

the host's defense, and these antagonistic responses allow for the homeostasis of the immune

system, which is important for parasite containment [68]. In cases in which an inflammatory

pattern is prevalent, the disease tends to be more severe [5]. In this regard, the ability to

measure numerous molecules and visualise inflammatory changes in individuals who are co-

infected with malaria and enteroparasites is extremely important for advancing the

understanding of the immune response to pathogens [26,27]. In this context, despite the

importance of the PvMSP-119 immunogenic molecule being present in response to malaria,

other mediators, such as pro- and anti-inflammatory cytokines, also act in the elimination of

plasmodial infections.

The individual analysis of mean serum cytokine levels in the studied population

showed a broad variation in the serum concentrations of all the Th1 inflammatory profile

cytokines (IFN-γ, TNF-α and IL-2) in the studied groups. Initially, we found that the

expression of these cytokines exhibited a very similar profile between groups, with high

levels for M and CI individuals. This observation suggests that only malarial infection, and

not intestinal parasites, affected the increase in these levels. Elevated serum cytokine levels

during infection have been reported previously, both in uncomplicated and severe malaria

[69,70]. However, their participation in reducing the parasitic load remains controversial.

Some studies have shown the importance of the cytokine pattern and its interactions in

the vivax malaria immune response [68].Increased parasitaemia and immune responses during

the course of the disease are factors that determine its severity [71]. Inflammatory patterns are

rare, and few studies have evaluated the various cytokines present using the same method and

the same group of malaria-infected patients [72]. This observation can also be corroborated

when we observe the Th2 profile of anti-inflammatory cytokines (IL-4, IL-5 and IL-10), with

increased serum concentrations in co-infected individuals. In fact, the high levels of these

cytokines and their increased frequency among the groups infected with malaria (Cl and M)

are consistent with the hypothesis that these cytokines play an anti-inflammatory role by

inhibiting pro-inflammatory mechanisms after the initial stages of infection [73].

In the literature, IL-4 and IL-5 concentrations have been shown to confer protection

against extracellular pathogens, including helminths [74]. Some studies have shown

conflicting results, in which the concentrations of these cytokines depend on the host's

parasitaemia levels [75]. Additionally, several studies focusing on IL-10 have shown that this

cytokine plays an important role in the control of the antiparasitic response and tissue damage

84

caused by this response, demonstrating its importance in regulating the immune response

[76]. Furthermore, studies have shown that interactions between IL-6 and IL-10 cytokines are

correlated with the parasitic load [77]. This study presents several variations in the Th1

cytokine expression (IFN-γ, TNF-α and IL-2), with similar medians among the studied

groups, but with high and varying levels of each cytokine. The Th2 cytokine (IL-4, IL-5 and

IL-10) medians differed from each other in the studied groups, showing high levels for

individuals in the co-infected group.

Variations in the cytokine production and high Th1 (TNF-α) and Th2 (IL-4, IL-5 and

IL-10) profile levels in the co-infected group therefore suggest that cytokines exhibit marked

increases in their plasma concentrations when individuals are infected with P. vivax, with a

shifting pattern inchanges associated with malaria and intestinal parasite co-infection. They

seem to act in inflammatory processes in a nonspecific way, not exerting any effect on co-

infection. However, only the IL-10 cytokine levels were affected in cases of malaria and

intestinal parasite co-infection. Further wide-ranging studies are needed to evaluate the

intestinal parasite species present in malaria-endemic areas and their relationship to the

immune response of infected individuals.

These results may reflect the fact that the number of parasites in the bloodstream at a

particular time may not always show the maximum immunogenic potential capable of

inducing a host's immune response because some parasite antigens may be in immune system

tissue and not just in the blood [78]. The overall magnitude of production of pro- and anti-

inflammatory cytokines and the imbalance between them during co-infection have been

proposed as important determinants in controlling or exacerbating malaria [79]. However,

new immunological and molecular epidemiological studies are required to better understand

the protective immune response scenario and outcome in Plasmodium vivax malaria. These

studies will be essential in the development of vaccines and new immunotherapeutic targets.

The present study has some limitations, we acknowledge. First the cross sectional

design is prone to bias and confounding and does not allow to infer causality. Secondly, the

small sample size, notably in the malaria alone group, may not have been sufficient to detect

some differences with other groups. Morevover, this evaluation did not allow to look at the

respective effects of different nematode species which may have contrasting effects.

Likewise, the current results highlight the possibility that the enteroparasite and vivax malaria

co-infection on the Brazil-French Guiana border mark biological differences, until

unexplained, towards the differential immune response and haematological profile of the host-

parasite interaction in vivax malaria in Oiapoque, Amapá state. Aditionaly, provide additional

information about the influence that enteroparasite could have in a malaria vivax

development; essential for diagnostic and preventive strategies.

Conclusion

The malaria by P. vivax is endemic in the region studied and its coinfection with intestinal

parasitosis is present in the municipality. Fecal findings demonstrate a diverse enteroparasitic

prevalence among the groups, highlighting the particularities and geographic aspects related

to the determinants of health in the border area. Hemoglobin levels in individuals appear to be

strongly attributed to malaria infection, especially in the context of concurrent infections, with

patients co-infected with lower parasitemia but were more likely to be anemic than patients

with isolated malaria. The high prevalence of sexual stage antibodies between groups

increases the premise that most individuals are exposed to malaria, making it an important

factor for the maintenance of transmission in the locality. The profile of inflammatory and

anti-inflammatory cytokines, coinfection may influence the two parasitoses investigated. We

must emphasize the need for longitudinal studies of statistical power enough to better

characterize the nuances of this co-infection.

85

Acknowledgments

We would like to extend our appreciation and gratitude to all who agreed to participate in this

study as well as to the local malaria control team in the municipality of Oiapoque for their

assistance in sample collection and technical support. We also thank the Central Laboratory

(LACEN) of Amapá, the Microbiology and Immunology Laboratory of the Federal University

of Pará and the Malaria Immunogenetics Laboratory/Parasitology Section of the Evandro

Chagas Institute for their sample analysis, logistical support and general support.

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92

4 CONCLUSÃO

- Na população estudada, o parasitismo intestinal acomete indivíduos de ambos os sexos e

tem relação com a faixa etária, nível de escolaridade, aspectos financeiros e as atividades de

garimpagem;

- O Ascaris lumbricoides foi o helminto mais frequente e a Entamoeba histolytica/díspar foi o

protozoário patogênico mais predominante;

- Observa-se uma relação inversamente proporcional entre o nível de hemoglobina e as

parasitoses detectadas, bem como correlação significante na modalidade de parasitismo;

- Os achados coproparasitológicos demonstram uma prevalência diversa entre os grupos,

salientando as particularidades e aspectos geográficos relacionados aos condicionantes e

determinantes de saúde na área de fronteira;

- A malária vivax é endêmica na região estudada e a coinfecção com enteroparasitoses está

presente no município;

- Há predomínio da população masculina entre os indivíduos maláricos, coinfectados e dos

não infectados com malária e enteroparasitoses;

- Os níveis de hemoglobina dos indivíduos parece estar fortemente atribuída a infecção

malárica, principalmente no contexto de infecções simultâneas;

- Prevalência elevada de anticorpos contra PvMSP-119 potencializa a premissa de que a

maioria dos indivíduos são expostos a malária, configurando um importante fator de

manutenção da transmissão na localidade;

- Observa-se que o perfil de citocinas inflamatórias e anti-inflamatórias pode influenciar no

perfil da coinfecção entre as duas parasitoses investigadas.

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110

APÊNDICE A - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

(Obrigatório para Pesquisa Clínica em Seres Humanos – Resolução nº 466/2012 – CNS)

I – DADOS DE IDENTIFICAÇÃO

NOME (PACIENTE):_______________________________________________________

DOCUMENTO DE INDENTIDADE: __________________________________________

ENDEREÇO COMPLETO: __________________________________________________

BAIRRO: _____________________________ CEP: ______________________________

CIDADE: ___________________ ESTADO: _______________ FONE: ______________

II – DADOS SOBRE O ESTUDO

1.Título: Coinfecção do Plasmodium Vivax e enteroparasitos no Município do Oiapoque,

Estado do Amapá, Fronteira Brasil-Guiana Francesa

2. Equipe responsável: Rubens Alex de Oliveira Menezes, Margarete do Socorro Mendonça

Gomes, Ricardo Luiz Dantas Machado.

III. EXPLICAÇÕES SOBRE O PROJETO DE PESQUISA AO PACIENTE

1. A malária é uma doença muito frequente na Amazônia e causada por parasitos chamados

plasmódios;

2. A infecção de parasitas intestinais com o agente de malária pode ter o quadro de anemia

acentuado;

3. Visando esclarecer alguns desses aspectos, convidamos você a participar desta pesquisa.

Para conduzir os estudos, precisaremos realizar uma coleta do sangue da ponta dos dedos para

preparação de lâminas de Gota Espessa e Distensão Sanguínea para diagnóstico da doença.

Serão também coletadas amostras de sangue (10 mL) da veia do braço para realizar os estudos

genéticos e sorológicos e fezes para realização do exame parasitológico. As coletas de sangue

serão realizadas com materiais descartáveis e estéreis. Geralmente, não há dor no local da

coleta, mas pode ocorrer de intensidade limitada e por pouco tempo, em casos de coletas de

sangue da veia. Serão entregues frascos limpos para o exame de fezes;

4. Algumas complicações decorrentes da coleta de sangue podem ocorrer como manchas

roxas no local da coleta devido à retirada da agulha pelo profissional antes do garrote ou por

perfuração da veia; alergia ao álcool à 70% usado para limpeza local ou contaminações

devido à má limpeza feita ou uso de material não-descartável (estéril) contaminado;

5. É assegurado o diagnóstico e o tratamento de todos os pacientes com malária, independente

da participação neste estudo;

7. A participação neste estudo é voluntária e você poderá retirar o seu consentimento a

qualquer momento sem prejuízo do seu tratamento regular;

8. As informações obtidas serão analisadas em conjunto com outros pacientes/indivíduos, não

sendo divulgado a identificação de nenhum paciente/indivíduo;

9. Não há despesas pessoais para o participante em qualquer fase do estudo, incluindo exame

e consultas. Também não há compensação financeira relacionada à participação;

10. O material biológico obtido poderá ser utilizado para esta pesquisa será armazenado uma

alíquota no Laboratório de Malária da Seção de Parasitologia do Instituto Evandro Chagas

para a realização em outras pesquisas decorrentes deste estudo. Nova solicitação de utilização

dessas amostras será realizada junto ao Comitê de Ética;

111

11. Para obtenção de quaisquer informações e esclarecimentos, o paciente poderá entrar em

contato com os pesquisadores responsáveis no Instituto Evandro Chagas, situado na Rodovia

Br 316, s/ nº - Bairro: Levilândia, CEP: 67030 – 000. Telefone para contacto: (0XX91) 3214

2089. Poderá também contactar o Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Evandro Chagas,

situado no mesmo endereço citado anteriormente. Telefone para contacto: (0XX91) 3214-

2237, sob Coordenação do Dr. Ricardo Luiz Dantas Machado;

12. Todas as informações coletadas serão mantidas em sigilo.

IV. AFIRMAÇÕES DO PACIENTE OU DE SEU RESPONSÁVEL LEGAL

1. Fui esclarecido sobre os objetivos da pesquisa, os procedimentos, riscos, benefícios e

outros assuntos? SIM NÃO

2. Fui esclarecido sobre a liberdade de retirar o meu consentimento a qualquer momento, sem

que isso traga prejuízo quanto à continuidade do meu tratamento ou do menor do qual sou

responsável? SIM NÃO

3. Fui esclarecido de que não haverá remuneração financeira além do previsto para as

despesas do estudo? SIM NÃO

4. Fui esclarecido de que não haverá indenização além das previstas pela lei, em reparação a

dano imediato ou tardio, causado pela pesquisa em questão? SIM NÃO

5. Fui esclarecido de que a segurança da minha identidade ou do menor do qual sou

responsável será preservada, mantendo-se as informações em caráter confidencial?

SIM NÃO

V. CONSENTIMENTO PÓS-INFORMADO

Declaro que, após ter sido convenientemente esclarecido dos riscos e benefícios deste estudo,

conforme acima definido, autorizo a minha participação ou do menor do qual sou responsável,

na qualidade de paciente no Projeto de Pesquisa referido no inciso II.

Macapá, ........... de...................... de................

......................................................................... ...........................................................

Assinatura Paciente ou do Responsável Legal Assinatura e carimbo do Pesquisador

Documento em duas vias

Rubrica em todas as páginas do TCLE do participante da pesquisa e o pesquisador

responsável

112

APÊNDICE B – Formulário epidemiológico

Coinfecção do Plasmodium Vivax e enteroparasitos no Município do Oiapoque, Estado do

Amapá, Fronteira Brasil-Guiana Francesa

A Informação do Espécime

1. Número de ID do espécime:_____________ (por exemplo, CB 01) a ser codificado

conforme abaixo:

XX = primeira inicial do país e do centro de coleta, por exemplo CB para

Colômbia/Buenaventura

## = identificador exclusivo do espécime, por exemplo 01 para primeiro paciente recrutado

para a avaliação

2. Data de coleta do espécime: [____/____/_______] (DIA/MÊS/ANO)

B. Informações sobre o paciente

1. Número de ID do paciente:______________ (igual ao número de ID do espécime)

2. Sexo: Masculino Feminino

3. Idade: _____ [anos]

4. Residência: cidade ou distrito ______________________________

Estado (Província) e País __________________________

5. Temperatura corporal: ___________________________________________________

6. Histórico de viagens: “Você viajou para fora deste Estado (província)/distrito nas últimas

quatro semanas?” Sim Não

Se sim, para onde? (começar com a viagem mais recente)__________________________

Viagem 1: Cidade ou Povoação/Bairro ________________________Distrito ou Estado

(Província)_______________

C Resultados de investigação microscópica:

1. Investigação microscópica (realizada no campo):

Espécie: ______________________

Parasitemia: ______________________ (contagem de parasitos no campo)

Classificado como 1+/2+/3+/4+ ou % de parasitemia ou parasitos por

microlitro. 2. Investigação microscópica (realizada no laboratório):

Espécie: ______________________

Parasitemia: ______________________ (contagem precisa de parasitos)

Classificada como parasitos por microlitro de sangue

D Passado malárico

Exposição prévia à doença Sim Não

Primoinfecção Sim Não

Episódios prévios de malária Sim Não

Se sim Quantas vezes________________________

Assinatura do investigador principal _____________________________

Data: [___/___/______] (DIA/MÊS/ANO)

OBS: Este documento foi elaborado em duas vias, uma ficará guardada nos arquivos das

instituições responsáveis pela entrevista e coleta do paciente e sob a responsabilidade do

pesquisador e a outra será entregue aos participantes do estudo, sendo que todas as duas vias

estarão assinadas por quem de direito.

113

APÊNDICE C – Resumos aprovados em Congresso

114

Resumo Aprovado no Congresso de Medicina Tropical 2015

Código: 1645

Título: Perfil epidemiológico da coinfecção Plasmodium Vivax e Parasitoses Intestinais no

Município do Oiapoque, Estado do Amapá: Resultados Preliminares

Autores: Rubens Alex Oliveira de Menezes, Margarete do Socorro Mendonça Gomes,

Anapaula Martins Mendes, Jairo Lourenço da Silva Filho, Francicléa Lúcia Oliveira

Ferreira, Ederson Tavares Nascimento e Ricardo Luiz Dantas Machado*.

Instituição: Universidade Federal do Pará

Palavras-chave: Malária, parasitoses intestinais, coinfecção, município do Oiapoque,

Amazônia brasileira

Resumo: Introdução: Embora a coinfecção entre o plasmódio e os parasitos intestinais seja

prevalente em países tropicais, o efeito de suas interações permanece obscuro. Este estudo

tem como objetivo avaliar o perfil da coinfecção com parasitos intestinais com pacientes com

infecção por Plasmodium vivax em uma área endêmica da Amazônia brasileira. Metodologia:

Estudo transversal foi realizado, no município de Oiapoque, pertencente ao Estado do Amapá,

norte do Brasil, fronteira ocidental da região amazônica. O diagnóstico de malária e a

contagem de gametócitos foram executados pela gosta espessa e esfregaço sanguíneo. A

dosagem de hemoglobina foi realizada por método automatizado. O exame parasitológico das

fezes foi realizado pelo método de Hoffman-Pons-Jones. O teste do Qui-quadrado e Exato de

Fisher foram usados para avaliar as diferenças entre as proporções e o teste de Student t para

avaliar as diferença entre as médias. Resultados: Nos três meses de coleta foram incluídos no

estudo 37 indivíduos que concordaram participar da pesquisa. O P. vivax foi detectado em

95,7% dos indivíduos. A parasitemia variou de 150 a 13.500 parasitos/mm3 (DP ± 3,57). Os

gametócitos foram detectados em 94,6% das lâminas investigadas. Os níveis de hemoglobina

variam de 10,4 a 15,7 g/dL (DP ± 2,65). Dos pacientes analisados 83,78% apresentaram-se

parasitados, com pelo menos um parasito intestinal patogênico. A Entamoeba coli foi o

protozoário mais frequente (32,14%), seguido da Entamoeba histolytica (14,28%) e a Giardia

lamblia (7,14%). Os helmintos detectados foram: Ascaris lumbricoides (46,42%), Thicuris

trichuris e Ancilostomídeos foram detectados em 3,57% das amostras avaliadas. Verificou-se

associação significativa entre enteroparasitoses e os níveis de hemoglobina. Não se observou

significância estatística na comparação entre presença de gametócitos e a presença de

parasitos. Conclusão: Os dados sugerem que existe uma associação entre estes dois grupos de

parasitos, ou poderia ser explicado pela presença de determinantes estruturais comuns para

ambas as doenças. Um programa de educação continuada envolvido com a prevenção e

tratamento das infecções parasitárias e malária é uma medida fundamental para sua

erradicação.

115

Certificado do Resumo no Evento Científico

117

Resumo 1 Aprovado no Congresso de Medicina Tropical 2016

Código: 7533

Titulo: Perfil dos níveis de hemoglobina e concentração de gametócitos na coinfecção

Plasmodium Vivax/Enteroparasitoses no Município do Oiapoque, Estado do Amapá

Autores: Rubens Alex de Oliveira Menezes1, Margarete do Socorro Mendonça Gomes

2,

Anapaula Martins Mendes3, Silvestre Rodrigues do Nascimento


Machado1,5

1Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários da

Universidade Federal do Pará; 2SESA/Laboratório Central do Amapá;

3Universidade

Federal do Amapá/Campus Binacional-Oiapoque; 4HEO - Hospital Estadual do Oiapoque,

Pela Secretaria Municipal de Saúde do Oiapoque-AP; 5Instituto Evandro Chagas/SVS/MS.

RESUMO

Introdução: Este estudo tem como objetivo avaliar parâmetros que influenciam a infecção por

Plasmodium vivax coinfectatos com parasitos intestinais em uma área endêmica da Amazônia

brasileira. Metodologia: Estudo transversal realizado no município de Oiapoque, Estado do

Amapá. O diagnóstico de malária e a contagem de gametócitos foram executados pela gosta

espessa e esfregaço sanguíneo. A dosagem de hemoglobina foi realizada por método

automatizado. O exame parasitológico das fezes foi realizado pelo método de Hoffman-

PonsJones. Análise estatística foi utilizada para avaliar os parâmetros investigados.

Resultados: Foram incluídos no estudo 446 indivíduos, o P. vivax foi detectado em 99,1% dos

indivíduos. A amostra foi dividida em quatro grupos: grupo I [Malária e Parasitose positivo

(n=118)], grupo II [Malária positivo e parasitose negativo (n=34)], grupo III [Malária

negativo e parasitose positivo (n=143)] e grupo IV [Malária e parasitose negativo (n=151)]. A

parasitemia variou de 25 a 30.000 parasitos/mm3 (DP ± 2,75). Os gametócitos foram

detectados em 88,5% das lâminas investigadas. Os níveis de hemoglobina variam de 7,7 a

18,2 g/dL (DP ± 0,5). Dos indivíduos incluídos no estudo, 118 (26,5%) foram coinfectados

com malaria e parasitos intestinais, esses indivíduos coinfectados, a prevalência de malária

por P. vivax foi de 117 (99,1%). Amebas comensais foram os protozoários mais frequentes

(84,7%) e o Ascaris lumbricoides foi o helminto mais detectado (88,4%). Não houve

significância estatística entre a concentração de gametócitos entre os grupos com malária

(coinfectados ou não) (p=0,1432).Não foi observado relação entre os grupos com malária

(coinfectados ou não) e a parasitemia (p = 0,06). . Houve diferença entre os níveis de

hemoglobina nos diferentes grupos estudados; entre o grupo I e o grupo II (p < 0,05), entre I e

IV (p<0,0001), entre II e III (p<0,005) e entre III e IV (p<0,0001). Conclusão: Na população

estudada, a coinfecção pode interferir nos níveis de hemoglobina da malária vivax.

Adicionalmente, a coinfecção não esteve associada com a redução de malária (incidência,

prevalência ou redução da parasitemia). A melhoria dos indicadores está nas ações de

educação em saúde e de mobilização da comunidade, além de uma maior cobertura da atenção

básica à saúde com relação aos casos suspeitos destes agravos.

Palavras-Chave: Malária, Plasmodium vivax, anemia, Oiapoque, Enteroparasitoses

118


119

Resumo 2 Aprovado no Congresso de Medicina Tropical 2016

Código: 7534

Titulo: Caracterização da coinfecção da Malária e Parasitoses Intestinais no Município

do Oiapoque, Estado do Amapá, Brasil

Autores: Rubens Alex de Oliveira Menezes1, Margarete do Socorro Mendonça Gomes

2,

Anapaula Martins Mendes3, Silvestre Rodrigues do Nascimento


Machado1,5


Universidade Federal do Pará; 2SESA/Laboratório Central do Amapá;

3Universidade

Federal do Amapá/Campus Binacional-Oiapoque; 4HEO - Hospital Estadual do Oiapoque,

Pela Secretaria Municipal de Saúde do Oiapoque-AP; 5Instituto Evandro Chagas/SVS/MS

RESUMO

Introdução: A coinfecção malária-parasitoses intestinais são comum nas regiões tropicais do

planeta. Embora essa coinfecção seja prevalente, o efeito de suas interações permanece

obscuro. Este estudo tem como objetivo avaliar o perfil da coinfecção de parasitos intestinais

com infecção por Plasmodium spp em uma área endêmica da Amazônia brasileira.

Metodologia: Estudo transversal foi realizado, no município de Oiapoque, pertencente ao

Estado do Amapá. O diagnóstico de malária e a contagem de gametócitos foram executados

pela gosta espessa e esfregaço sanguíneo. O exame parasitológico das fezes foi realizado pelo

método de Hoffman-Pons-Jones. Resultados: Em um ano de coleta foram incluídos no estudo

446 indivíduos, sendo 34 (7,6%) estavam infectados apenas com malária, 118 (26,5%) foram

co-infectados com malaria e parasitas intestinais, 143 (32%) foram infectados com parasitas

intestinais apenas, e 151 (33,9%) não foram infectadas com malária e parasitas intestinais. Em

indivíduos coinfectados, a prevalência de malária por P. vivax foi de 117 (99,1%) e P.

falciparum de 01 (0,9%). Ao analizarmos os casos apenas de malária, observamos 34 (7,6%),

sendo P. vivax 30 (85,8%), P. falciparum 3 (11,4%) e P. vivax + P. falciparum 01 (2,8%).

Dos 118 (26,5%) coinfectados com malaria e parasitos intestinais, observa-se 39 casos

(33,3%) de malaria-protozoários, sendo prevalente a associação de Entamoeba coli +

Endolimax nana (43,6%). Para os casos de malária-helmintos (46,6%), sendo Ascaris

lumbricoides mais predominante, com 47,2% dos casos. Os casos de tripla associação

(Malária/Protozoários/Helmintos foi verificado em (20,6%) das amostras, sendo mais

prevalente associação de E. coli + E. nana + A. lumbricoides (33,4%). Conclusão: Os

resultados apontam a coinfecção Malária e Enteroparasitoses um aspecto real no município do

Oiapoque. Avaliar a possibilidade de que populações infectadas por parasitoses intestinais

possam influenciar na dinâmica de transmissão da malária, são fundamentais para estratégias

diagnósticas e preventivas.

Palavras-Chave: Epidemiologia, Malária, Oiapoque, Plasmodium vivax

120


122

Resumo Aprovado na 6th International Conference on Plasmodium Vivax Research 2017

Coding: 13427

Título: Malaria-Intestinal Parasite Co-infections: Intensity of Plasmodium vivax

Transmission Associated with Specific IgG Responses (PvMSP119) in Individuals from

Brazilian Amazon Border Community

Autores: Rubens Alex de Oliveira Menezes1,2

, Tamirys Pina Simão3,7

, Margarete do

Socorro Mendonça Gomes4, Anapaula Martins Mendes

5, Alvaro Augusto Ribeiro D Àlmeida

Couto4, Mathieu Nacher

6, Martin Johannes Enk

7, Maristela Gomes da Cunha

1, Ricardo Luiz

Dantas Machado1,7

1Postgraduate Program in Biology of Infectious and Parasitic Agents of the Federal University

of Pará, Brazil; 2Federal University of Amapá, Brazil;

3Postgraduate Program in

Neurosciences and Cell Biology of the Federal University of Pará, Brazil; 4SESA/ Central

Laboratory of Amapá; 5Federal University of Amapá/Binacional Campus-Oiapoque;

6Université des Antilles et de la Guyane Caiena/Guiana Francesa e da University of the West

Indies; 7Evandro Chagas Institute/Health Ministry, Pará, Brazil.

Backgrounds: Polyparasitism is a common condition in humans, but its impact on the

immune system and clinical diseases is still poorly understood. There are few studies on the

prevalence and effect of malaria-intestinal parasite co-infections in the immune response of

this interaction. Materials and Methods: We characterized the malaria-intestinal parasite co-

infection associated with specific IgG responses (PvMSP119) by evaluating the reactivity and

intensity of Plasmodium vivax transmission in 446 individuals from a community of the

Brazilian Amazon, located in the State of Amapá, Oiapoque municipality, bordering French

Guiana, and the samples was collected from 2014 to 2015. The IgG antibodies specific for

(MSP-119) were detected in the plasma by means of the enzyme-linked immunosorbent assay

(ELISA) and the samples were divided into four groups: group I [Malaria and Parasitosis (n =

118)], group II [Malaria only (n = 34)], group III [Parasitosis only (n = 143)] and group IV

[Control (n = 151)]. Results: The reactivity index of the samples ranged from 0.0182 to

18.4364 ± 3.3584 with 53.8% (240/446) presenting His6-MSP119 specific IgG, being these

82.2% (97 / 118) belonging to group I, 76.4% (26/34) to group II, 40.5% (58/143) to group III

and 39% (59/151) to group IV. The frequency of antibodies observed was 57.5% (61/106) for

protozoa, 57.9% (69/119) for helminths, 69.4% (25/36) for protozoa and helminths and 45.9%

(85/185) without infection. Analyzing the frequency in the groups I and III we obtained for

group I: 76.9% (30/39) with protozoa infection, 87.5% (49/56) with helminths and 75%

(18/24) protozoa and helminths infections; for group III: 45.5% (31/68) with protozoa

infections, 31.7% (20/63) with helminths and 58.3% (7/12) with protozoa and helminths

infections. Conclusions: Our results confirm the high antigenicity of this protein, especially

for group I, presenting a different profile regarding reactivity and intensity of transmission.

These data add important information that may help in understanding the immunological

aspects involved in the pathogenesis of malaria vivax.

123


125

Resumo Aprovado no Congresso de Medicina Tropical 2017

Código: 15356

Título: Frequência de Enteroparasitoses no Município de Oiapoque, Amapá, Brasil,

Fronteira com a Guiana Francesa

Autores: Rubens A. O. Menezes1; Dayse C. G. Dias

2; Camila C. D. Melo

2; Margarete S. M.

Gomes3, Anapaula M. Mendes

4, Silvestre R. Nascimento

5, Alvaro A. R. D. Couto

3, Mathieu

Nacher6, Martin J. Enk

7, Ricardo L. D. Machado

1,7


Universidade Federal do Pará; 2Discente de Medicina da Faculdade da Amazônia (FAMAZ),

Belém, PA, Brasil.3SESA/Laboratório Central do Amapá;

4Universidade Federal do

Amapá/Campus Binacional-Oiapoque; 5HEO - Hospital Estadual do Oiapoque, Pela

Secretaria Municipal de Saúde do Oiapoque-AP; 6Université des Antilles et de la Guyane

Caiena/Guiana Francesa e da University of the West Indies; 7Instituto Evandro

Chagas/SVS/MS.

RESUMO

Introdução: As enteroparasitoses representam um segmento considerável de doenças

infeccioso-parasitárias ao redor do mundo. Este estudo avaliou a frequência de enteroparasitos

e correlacionou com o nível de hemoglobina. Métodos: Estudo transversal realizado, no

município de Oiapoque, pertencente ao Estado do Amapá, norte do Brasil, fronteira ocidental

da região amazônica, no período de um ano de coleta de amostras fecais 2014/2015 utilizando

os métodos a fresco, direto, Hoffmann e sedimentação por centrifugação. Resultados: Foram

incluídos no estudo 446 indivíduos, todas as faixas etárias contribuíram para a presença de

parasitos intestinais, sendo realizado o teste de Meta-analise: Varias proporções combinadas,

cujo resultado apresentou-se entre as faixas etárias de 7 a 14 anos (p= <0.0001) e de ≥ 26 anos

(p=<0.0001). Nos indivíduos investigados, 58.6% (261/446) foram infectados por algum tipo

de parasito intestinal. Entre estes, 45,2% (118/161) estava infectado somente por helmintos,

40,9% (107/261) com protozoários, e 13,8% (36/261) tinham infecções associadas. Dentre os

helmintos detectados o Ascaris lumbricoides 19,9% (52/261) foi o mais prevalente, seguido

da associação da Entamoeba coli e a Endolimax nana como protozoários mais frequentes

17,2% (45/261). A pesquisa evidenciou uma correlação inversamente proporcional

significativa entre o nível de hemoglobina e a presença das parasitoses detectadas (coeficiente

de contingência C=0.2195 e p < 0.0001). Conclusões: O índice de enteroparasitoses é um

reflexo claro da falta de saneamento da região estudada, indicando um estado epidemiológico

preocupante. Dessa forma, um modelo eficaz de atenção primária à saúde tem sido a sugestão

no combate a essas condições adversas.

Palavra Chave: Enteroparasitoses, Região Amazônica, Oiapoque, Hemoglobina.

126

APÊNDICE D – Manuscrito Extra

Evaluation of the Anti-Pvs48/45 Humoral Immune Response in Natural Plasmodium

vivax Infections in the Brazilian Amazon

Este artigo avaliou a resposta de anticorpos naturalmente adquirida em infecções por

Plasmodium vivax contra a proteína Pvs48/45 na Amazônia Brasileira. Tais resultados

poderão contribuir para o entendimento do potencial imunogênico desse antígeno e

desenvolvimento de uma vacina de bloqueio de transmissão eficiente. Este é o primeiro

estudo que oferece um perfil imune humoral à proteína Pvs48/45, em amostras de pacientes

maláricos da região Amazônica brasileira.

Resumo dos resultados: A pesquisa de anticorpos IgG anti-Pvs48/45 foi realizada por

ELISA no soro de 281 amostras de pacientes maláricos residentes na região amazônica

brasileira. O ponto de corte foi estabelecido utilizando soro de voluntários que nunca tiveram

contato com o plasmódio, estabelecendo a média da densidade óptica (DO) mais três desvios

padrão. Dos 281soros analisados, em 22,4% foram encontradas respostas de anticorpos

específicos anti-Pvs48/45 e os índices de parasitemia e a presença de gametócitos não

influenciaram o reconhecimento antigênico desta proteína. Dentre os cinco subfragmentos

analisados, a região recombinante C-Terminal + Central da Pvs48/45 foi a que apresentou

maior reconhecimento antigênico na amostra em estudo (32%), apesar de não ser

estatisticamente significativo. Essas características dão suporte ao potencial promissor desse

antígeno no desenvolvimento de uma nova estratégia de vacina.

127

Evaluation of the Anti-Pvs48/45 Humoral Immune Response in Natural Plasmodium

vivax Infections in the Brazilian Amazon

Tatiana M. S. Cisne Pessoa1; Myrela C. Santos de Jesus

1; Rubens Alex de Oliveira

Menezes2; Ricardo L. D. Machado

3; Myrian Arevalo-Herrera

4; Sócrates Herrera

4;

Luciane M. Storti-Melo1*

1Post-Graduate Program in Parasitic Biology, Federal University of Sergipe (Universidade

Federal de Sergipe - UFS), 49100-000, São Cristóvão, Sergipe, Brazil 2Post-Graduate Program in Biology of Infectious and Parasitic Agents, Federal University of

Pará (Universidade Federal do Pará – UFPA) 3Evandro Chagas Instituto/Health Surveillance Service/Ministry of Health (IEC), Belém,

Pará, Brazil 4Caucaseco Scientific Research Centre, Cali, Colombia

*Corresponding author: Universidade Federal do Sergipe, Departamento de Biologia,

Centro de Ciências Biológicas e da Saúde

Address: Av. Marechal Rondon, s/n, Rosa Elze, São Cristóvão, Sergipe, Brasil, Cep. 49100-

000, E-mail address:[email protected] (Storti-Melo, L. M.)

Abstract

Background Malaria continues to be responsible for major morbidity and mortality in many

tropical and subtropical countries. Individuals who are frequently exposed to the malaria

parasite in endemic areas develop specific immune responses, leading to a reduction in the

parasitic load and clinical manifestations. The sera of these individuals may make it

impossible for gametes to fertilize in mosquitoes, thereby blocking the transmission of this

parasite to the vector. The Pvs48/45 protein is found on the surface of the gametocytes and is

used as an antibody target, which represents a viable vaccination strategy to block

transmission. The aim of this study was to evaluate naturally acquired antibody responses

against the Pvs48/45 protein in Plasmodium vivax-infected patients.

Materials and methods Anti-Pvs48/45 IgG antibody screening was performed by ELISA using 281 serum

samples from malarial patients living in the Brazilian Amazon region. The cut-off point was

established using sera from volunteers who had never had contact with Plasmodium to

establish the mean optical density (OD) plus three standard deviations. Fischer's exact test

was applied to compare the parasitaemia indices and the presence of gametocytes with the

frequency of humoral immune responses and the antigenicity of the Pvs48/45 protein and its

subfragments. The level of significance was 95%.

Results

Anti-Pvs48/45-specific antibody responses were found in 22.4% of the 281 analysed

sera. The parasitaemia indices and the presence of gametocytes did not influence antigenic

recognition of this protein. Among the five analysed subfragments, the recombinant C-

terminal + central region of Pvs48/45 presented the highest antigenic recognition in the study

sample (32%), although the difference was not significant.

Conclusion Studies using an isolated region of the protein may facilitate understanding of the

immunogenic potential of this antigen. This study aims to contribute to the development of an

efficient transmission-blocking vaccine against the Pvs48/45 protein in future trials.

Keywords: Pvs48/45; vaccine; immune response; malaria.

128

Introduction

Plasmodium vivax and the vectors involved in the biological cycle of malaria have

several distinct characteristics that allow the transmission of this parasite in both temperate

climates and tropical areas [1, 2]. However, none of these characteristics are as specific as the

ability of this Plasmodium species to form hypnozoites, which reactivate periodically and can

cause multiple malaria episodes that account for up to 80% of clinical episodes [3]. In Brazil,

approximately 99% of malaria transmission is concentrated in the Amazon region. P. vivax is

the most prevalent species and is responsible for approximately 84% of the cases in this

region [4-6]. The maintenance of the number of malaria cases, the rapid development of P.

vivax in vector mosquitoes [7] and the difficulty in the control of transmission using

traditional methods in endemic regions have shown the importance of identifying effective

and economically viable methods to interrupt the transmission of malaria in endemic regions

[8].

Individuals who are frequently exposed to the parasite have the ability to develop

specific immune responses that protect them from developing a serious malarial infection [9,

10]. Moreover, the serum of these individuals may make fertilization of the gametes

impossible, thereby preventing parasite development and consequently blocking the

transmission of this parasite from the infected patients to mosquitoes [11]. This exposure to

endemicity facilitates the development of a transmission blocking vaccine [12]. Specific

antibodies against Plasmodium antigens expressed in gametocytes have been experimentally

demonstrated to block Plasmodium transmission from the vertebrate host to the vector

mosquito [13]. Although this blockade does not prevent the individual from acquiring the

disease, the vaccination strategy interrupts the transmission from infected individuals to

uninfected individuals [12, 14] and prevents the re-emergence of transmission in areas where

complete elimination has been achieved [8].

The Pvs48/45 protein is located on the surface of the P. vivax gametocyte and acts on

the fertilization of the parasite. Thus, the protein represents a potential target for transmission

blocking and anti-parasitic activity [15]. The synthesis of this protein was recently described,

and a preliminary evaluation of its immunological properties, including its antigenicity,

immunogenicity and transmission blocking activity, was performed using samples from

patients with malaria vivax from Colombia. However, this study suggested the need for a

broader evaluation in areas endemic for malaria to verify the effectiveness of this protein in

transmission blocking. The estimated responses of antibodies acquired against the Pvs48/45

protein in natural P. vivax infections in an endemic area in Brazil may provide results that add

to and clarify the role of these antibodies and the relevance of this antigen for vaccine

development.

This protein together with the post-fertilization antigens Pvs25 and Pvs28 has a highly

limited polymorphic sequence and low nucleotide diversity compared to the blood stage

antigens [16]. These characteristics support the promising potential of this antigen in the

development of a novel vaccine strategy. Here, we present for the first time the humoral

immune response to the Pvs48/45 protein in samples from malarial patients from the Brazilian

Amazon region.

Materials and methods

Study population

For this study, 281 samples collected from seven different cities in the Brazilian

Amazon region were included to extend the range of samples for the descriptive antigenicity

study. The samples were taken from Rio Branco/state of Acre (n=26, collected in 2003), Porto

Velho/state of Rondônia (n=26, collected in 2003), Belém (n=25, collected in 2003),

Goianésia do Pará (n=20, collected in 2012) and Itaituba (n=19, collected in 2016) in the state

of Pará and the municipalities of Macapá (n=16, collected in 2003) and Oiapoque (n=150,

129

collected in 2015) in the state of Amapá (Fig. 1). The samples used in this study were

collected from patients who were randomly selected from individuals who spontaneously

sought a public health centre with symptoms suggestive of malaria, had a positive thick-drop

smear test result and were confirmed to have vivax malaria by molecular diagnosis [17-19].

Figure 1: Cities in the Brazilian Amazon region where the collections were performed.

Source: Geomapas and IBGE.

Ethical aspects

This project was submitted to the Ethics Committee of the Federal University of

Sergipe (Universidade Federal de Sergipe) to request the re-use of the samples and was

approved under number opinion no. 1,774,182.

Laboratory analysis

The blood plasma samples were analysed at the Caucaseco Scientific Research Centre

in Cali, Colombia. The evaluation of naturally acquired antibodies against the Pvs48/45

protein and its five subfragments (N-terminal, C-terminal, central, N-terminal + central and

C-terminal + central) was performed using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

as described in Arévalo-Herrera et al. [15]. All samples were analysed in duplicate. Because

the protein purification procedure used the thioredoxin system, all samples were also

evaluated by ELISA for reactivity to thioredoxin in parallel with the protein and subfragment

analyses.

Samples that showed a humoral immune response against Pvs48/45 were titrated. The

titration was performed in serial dilutions of 1:200, 1:400, 1:800 and 1:1600.

130

Data analysis

The result for each sample was expressed using the reactivity index (RI). This index

was calculated by dividing the mean absorbance values of each sample by the cut-off value of

the negative controls used as a reference on each plate. The cut-off point was calculated by

summing the mean of the negative controls with three times the obtained standard deviation.

Thus, the positive samples were those with an RI ≥ 1.0, whereas the negative samples had an

RI < 1.0. Samples that showed a positive result for thioredoxin were considered false positive

because this protein was present in the organisms where the protein was expressed, including

E. coli, as described in Arévalo-Herrera [15].

Fisher's exact test was applied in the Bioestat 5.3 program with a 95% significance

level for comparison of the parasitaemia indices and the presence of gametocytes with the

frequency of humoral immune responses and verification of the antigenicity of the Pvs48/45

protein and its subfragments.

Results

Antigenicity of Pvs48/45 protein in the Brazilian Amazon

Of the samples analysed to evaluate the humoral immune response against the

Pvs48/45 protein, 63 (22.42%) samples showed a positive humoral immune response (Fig. 2),

and 20.28% of the samples reacted with thioredoxin in addition to Pvs48/45.

The results show that the antibody response profile against the Pvs48/45 antigen is

variable from one region to another. Samples from the city of Rio Branco showed a higher

percentage of positive immune responses (38.5%), whereas no samples from individuals from

Macapá presented antigenicity for the Pvs48/45 protein. Patients with vivax malaria from

Itaituba, Belém and Goianésia do Pará presented similar percentages of samples with positive

immune responses (15.8%, 12.5% and 10.0%, respectively).

Among the 63 samples positive for Pvs48/45, the maximum reactivity index (RI)

value obtained was 5.5, and the minimum value was 1.0 (estimated reactivity threshold). The

dispersion of the RI values (Fig. 3) shows that the values are distributed close to the reactivity

threshold between 1 and 2, with a median of 1.3 (mean=1.5; SD=0.605).

Only one sample presented an RI > 5, and three samples presented an RI ≥ 2. Because

the RI is a value that expresses how many times the optical density (OD) of the sample is

greater than the cut-off point, the majority of the samples presented little reactivity.

Samples showing a positive immune response were titrated. The maximum dilution at

which a positive immune response was still obtained was 1:1600.

Figure 2: Distribution of the humoral immune response frequency against Pvs48/45 by city.

131

Figure 3: Dispersion of the reactivity indices of the samples in which anti-Pvs48/45-specific

antibody responses were found.

Parasitaemia indices and presence of gametocytes

Only samples from the municipality of Oiapoque were used to evaluate the

relationship between the parasitaemia indices and the presence of gametocytes in response to

antibodies against Pvs48/45 because the gametocytes were measured in thick-drop

preparations.

The parasitaemia data revealed a mean of 3,056 parasites/mm3. Samples were

classified based on the presence or absence of gametocytes. Parasitaemia was evaluated

according to the Brazilian Ministry of Health recommendations outlined in the Manual of

Malaria Laboratory Diagnostics [20], which considered low parasitaemia values below 10,000

parasites/mm³.

A total of 28.7% of the samples presented with low parasitaemia and a positive

humoral immune response. A total of 22.2% of the samples that presented with high

parasitaemia had a positive antibody response (p=0.5099). However, this difference was not

significant (Table 1).

Table 1 Relationships between the humoral immune response and parasitaemia index

Positive

immune

response (%)

Negative

immune

response (%)

Total P-value**

High*

parasitaemia 2 (22.2%) 7 (77.8%) 9 (10.5%)

0.5099 Low parasitaemia 25 (28.7%) 62 (71.3%) 87 (90.6%)

Total 27 69 96

132

Presence of

gametocytes

21 (25.3%) 62 (74.7%) 83 (86.5%)

0.1128 Absence of

gametocytes

6 (46.2%) 7 (53.8%) 13 (13.5%)

Total 27 69 96 (100%)

* High parasitaemia: ≥ 10,000 parasites/mm³; low parasitaemia <10,000 parasites/mm³.

** Fisher's exact test.

A humoral immune response positive for Pvs48/45 was detected in 25.3% of the

samples with the presence of gametocytes. Conversely, 46.2% of the samples in which no

gametocytes were found had a positive immune response. This difference was not significant

(p=0.1128) (Table 1).

Reactivity of the samples to the Pvs48/45 subfragments

In addition to the whole protein, 5 subfragments were expressed corresponding to the

N-terminal, C-terminal, central, N-terminal + central and C-terminal + central regions. A

subgroup of the investigated sample (n=169) distributed among the seven endemic areas was

used to assess the prevalence of antibodies against these specific regions of the protein and

thus estimate possible epitope locations.

Table 2 shows that the recombinant C-terminal + central sub-fragment showed the

highest percentage of reactivity (32%; p=0.0565), although the difference was not significant.

The central region of the peptide presented the lowest reactivity, with 17% (p=0.1645) of the

samples.

Table 2 Percentage of samples processed by peptide

Peptide n Positive RI

n (%) P-value*

Pvs48/45 281 63 (22.4%)

N-terminal 169 40 (23.7%) 0.4465

C-terminal 169 35 (20.7%) 0.4128

Central 169 29 (17.2%) 0.1645

N-terminal + Central 169 45 (26.6%) 0.2478

C-terminal + Central 169 54 (32.0%) 0.0565

* Fisher's exact test

Discussion

Different vaccine strategies that protect the individual from acquiring and developing

malarial infections using different parasite antigens have been evaluated [21, 22]. However,

effective results have not been achieved. Despite not preventing individuals from developing

the disease [23], the transmission blocking strategy blocks infected individuals from

transmitting the disease post-vaccination [15].

In this study, serum samples from naturally exposed malaria patients from the

Brazilian Amazon were analysed. Of these samples, 22.42% (63/281) presented an immune

response to the Pvs48/45 antigen. Although the seroprevalence was low, confirmation of this

antigenicity shows the production of anti-Pvs48/45 antibodies by individuals after exposure to

natural P. vivax infection. The recognition of the recombinant Pvs48/45 protein by these

natural antibodies shows that at least one epitope is present in the tested recombinant protein.

133

However, the low prevalence may be due to the expression system, which is based on the

thioredoxin model. The high percentage of samples that reacted to thioredoxin in addition to

Pvs48/45 (20.28%) caused a considerable portion of the samples to be classified as false

positive, leading to this low seroprevalence. In turn, the variable endemicity level of these

regions should be considered [24] because the endemicity differs from the malarial

transmission profile in the Colombian regions [15]. Moreover, the malarial history of these

patients investigated in the Brazilian Amazon showed that 34% of the samples represented

primary infections, which compromised the response to the investigated protein. Finally, the

Brazilian population is quite mixed due to the influence of colonization by the Portuguese and

contains crosses involving, mainly, Europeans, Africans and Native Americans [25].

Therefore, ethnicity may influence the frequency of polymorphisms of molecules involved in

the immune response and consequently may compromise their efficiency [26].

The low titre obtained is further evidence of the low reactivity of Pvs48/45 in samples

from infected individuals from the Brazilian Amazon. In a study conducted in different

endemic areas in the Brazilian Amazon region with the PV200L fragment of P. vivax MSP-1,

patients from the city of Macapá showed the lowest frequency and antibody levels. This result

was similar to the results obtained in the present study because no sample from this area

showed an immune response against Pvs48/45. One explanation for this finding was that

Macapá presented a low annual parasitaemia index (6.0 in 2009), which could contribute to

the absence of an immune response [19].

Individuals living in endemic areas are continually exposed to Plasmodium. These

individuals are more likely to develop clinical immunity by maintaining direct contact with

the parasite, which protects them against the development of severe malaria. These

individuals do not develop sterile immunity because this type of immunity is not achieved

under natural conditions. In a natural infection, individuals may not present high gametocyte

titres. Although P. vivax gametocytes are found in most infections prior to the onset of clinical

manifestations [8], the proportion in relation to the asexual stages does not reach 10%.

Additionally, these gametocytes remain in circulation in the blood stream for up to 3 days [7].

This phenomenon is perhaps another explanation for the low percentage of responses to the

Pvs48/45 antigen used in this study. In this sense, we cannot rule out the possibility that the

antigen tested is poorly recognized by individuals who are naturally exposed to Plasmodium

in the Brazilian Amazon region. Nevertheless, the importance of these findings can be

reinforced by evaluating the effectiveness of the antibodies produced by these individuals

through immunogenicity and transmission blocking tests to determine whether this antigen

has the ability to block the Plasmodium life cycle.

The results show that the presence or absence of gametocytes is not related to the

development of an antibody response against Pvs48/45 (Table 3). Although the gametocytes

might not have been found in the thick-drop test because they were present in low

concentrations [7], these concentrations were sufficient to ensure the contact of the

individuals with these parasitic forms. These results reinforce the need for further investments

and studies with the Pvs48/45 antigen as a candidate for a transmission blocking vaccine

because antibodies can develop independently of the high presence of gametocytes in the

bloodstream. Individuals who experience more malarial episodes present lower parasitaemias

than individuals who report fewer malarial episodes [27]. In the present study, both

individuals with high and low parasitaemias had similar anti-Pvs 48/45 antibody response

profiles. These results may indicate that the Pvs48/45 protein is antigenic in naturally exposed

populations regardless of the low parasitaemia indices commonly seen in endemic areas. This

finding may be supported by the presence of gametocytes in the early stages of P. vivax

infection even in cases with low parasitaemias [7].

134

When analysing the antigenicity of the C-terminal recombinant peptide plus the

central portion, we found that this region had a higher percentage of antigenicity compared to

the antigenicity obtained with the complete antigen (22.42%), although the difference was not

significant (32%). Studies with the homologous Pfs48/45 protein of P. falciparum revealed

that the amino-terminal (N-terminal) and carboxy-terminal (C-terminal) fragments induced

antibody responses capable of blocking transmission [28]. A study with the Pfs48/45 protein

from P. falciparum made progress in identifying conformational epitopes capable of inducing

blocking antibodies. Two epitopes (I and II) located in the C-terminal region of this protein

were identified as highly efficient targets because they contained domains crucial for the

development of a transmission blocking vaccine [29]. Pvs48/45 and its homologue Pfs48/45

are included in the group of proteins with cysteine-rich domains. As shown previously, the

cysteine residues located in the central and C-terminal regions of Pfs48/45 are crucial for the

presentation of the epitopes that induce blocking antibodies, which is an essential feature for

the effectiveness of a transmission blocking vaccine [29]. Although the expression of these

proteins, which are part of the cysteine class, in their proper conformation has been extremely

complex, some studies have achieved the expression of a fragment of the protein with a

correct conformational structure that has facilitated recognition of the protein. The C-terminal

fragment of the Pfs48/45 protein was fused to four catalysts (DsbA, DsbC, FkpA and SurA)

for expression to synthesize a correctly folded protein and generate high antibody titres [28].

This approach may represent a strategy for further expression studies with Pvs48/45 or its C-

terminal subfragment for future experimental immunogenicity assays.

Conclusion

Finally, further efficacy studies must be conducted to determine whether the results

obtained to date are on the right track or whether a course correction is required. The

successful development of a vaccine against P. vivax may take time, but investments are

needed because this neglected malaria parasite is widespread in the Americas, and reports of

major clinical complications have begun to emerge.

List of abbreviations

Declarations

Ethics approval and consent to participate

Ethical approval for this study was granted from the Research Ethics Committee of the

Universidade Federal do Sergipe (Protocol no. 1.088.855/2015), and all participants gave

written informed consent for enrolment in the study.

Consent for publication

Not applicable.

Availability of data and material

The authors confirm that all data underlying the findings are fully available without

restriction.

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Funding

Work reported in this manuscript was funded in part by Fundação de Amparo à Pesquisa do

Estado de Sergipe (FAPESP) and in part by the Conselho Nacional para o Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq), Brasília, Brazil. Work in Colombia was jointly sponsored

by COLCIENCIAS, the Ministry of Social Protection and the National Institute of Allergy

and Infectious Diseases (NIAID grant #49486/TMRC).

Authors’ contributions

SH, RLDM and LMSM designed and initiated the study. TMSCP, MSCJ and RAOM

performed the laboratory analyses. TMSCP, RAOM, RLDM, SH and LMSM analysed and

135

interpreted the data. TMSCP, RAOM and LMSM wrote the manuscript. All authors read,

commented on and approved the final manuscript.

Acknowledgements

We thank all of the patients involved in this study.

Authors information

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Figure captions

Fig. 1 Cities in the Brazilian Amazon region where the collections were performed

Source: Geomapas and IBGE.

Fig. 2 Distribution of the humoral immune response frequency against Pvs48/45 by city

Fig. 3 Dispersion of the reactivity indices of the samples in which anti-Pvs48/45-specific

antibody responses were found

138

ANEXO A – Parecer Consubstanciado do Comitê de Ética de Pesquisa

139

ANEXO B – Financiamento pelo Edital/CNPq/PPSUS – Amapá 2013

universidade federal do parÁ instituto de … rubens alex de... · ipa incidência parasitária...

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