universidade federal do paranÁ danilo leal rocha

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

DANILO LEAL ROCHA

IDENTIFICAÇÃO DO CIRCOVÍRUS SUÍNO TIPO 2 E DO PARVOVÍRUS SUÍNO EM

FETOS SUÍNOS NATIMORTOS E MUMIFICADOS PROVENIENTES DE GRANJAS

NO BRASIL

CURITIBA 2008

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DANILO LEAL ROCHA

IDENTIFICAÇÃO DO CIRCOVÍRUS SUÍNO TIPO 2 E DO PARVOVÍRUS SUÍNO EM

FETOS SUÍNOS NATIMORTOS E MUMIFICADOS PROVENIENTES DE GRANJAS

NO BRASIL

Dissertação apresentada ao Curso de Pós Graduação em Ciências Veterinárias, setor de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Paraná, como requisito parcial à obtenção do título de mestre em Patologia. Orientador: Prof. Dr. Geraldo Camilo

Alberton

CURITIBA 2008




i




ii

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela vida e por sempre iluminar a minha trajetória.

A minha família, em especial, meus pais, grandes mestres de minha vida. Aos

meus irmãos, Fabrício e Érika, meus sobrinhos, Gabriel e Alice e minha cunhada,

Petula, obrigado pelo amor e apoio. Obrigado a todos meus familiares que apesar da

distância, tenho certeza que torcem por minha felicidade.

A minha princesa, Fernanda, e a sua família que me acolheram com muito

carinho e amor.

A Daniella Sponchiado pela amizade e “trabalho de cupido”!

Ao amigo Cristiano pelo auxílio na tradução para o inglês.

Ao professor Dr. Geraldo Camilo Alberton pela credibilidade a minha pessoa,

apoio, compreensão, conhecimentos, orientações e amizade.

Aos professores Dr. João Scandolera e Dra Elizabeth Santin por integrarem o

comitê de orientação.

Ao professor Dr. José Lúcio dos Santos e Sra. Maria dos Santos pelo apoio,

desde aluno da UFV e também nesta nova conquista. Ao orgulho de fazer parte da

equipe Microvet.

A toda a equipe do Microvet, em especial, ao Prof. PhD Walter Guimarães,

Dra. Klédna Reis, Mayka Rabello, João, Cristiane, Simone, Alessandra pelo apoio

nos exames e orientações na dissertação.

A TOPIGS do Brasil pela oportunidade e o orgulho de trabalhar nesta equipe

por 5 anos.

A Universidade Federal do Paraná pela oportunidade.

A todos os amigos, professores, funcionários da Universidade Federal do

Paraná que me proporcionaram muita alegria nestes anos de convivência.

A todos muito obrigado!




iii

RESUMO

A suinocultura brasileira tem atingido resultados zootécnicos e econômicos de alta competitividade, sendo o Brasil, um importante país no cenário mundial na produção e comercialização de produtos suínos. Para isto, investimentos em qualidade genética do plantel, nutrição, programas de vacinação, instalações, qualificação de técnicos, entre outros, são fundamentais. Por outro lado, esta inserção no cenário globalizado também gera desafios sanitários presentes na suinocultura mundial. Entre estes, o circovírus suíno tipo 2 (PCV2) é um agente infeccioso que têm sido associado a diversas enfermidades com impacto na produção de suínos mundial. Entre estas enfermidades, a síndrome da refugagem multissistêmica e falhas reprodutivas foram reproduzidas de forma experimental e têm sido estudadas em diferentes países no mundo. No Brasil poucos estudos foram realizados sobre a participação do PCV2 relacionados à falhas reprodutivas, sendo a maioria dos estudos relacionada à síndrome da refugagem multissitêmica. Este fato pode ser um dos motivos pelo qual o PCV2 não tem sido considerado em granjas com falhas reprodutivas no Brasil. Nestas granjas, o parvovírus suíno (PVS), agente viral há muito tempo conhecido pelo potencial em causar falhas reprodutivas, tem sido investigado. O objetivo deste estudo foi investigar, por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR), a presença do PCV2 e do PVS em fetos suínos natimortos e mumificados provenientes de diferentes granjas no Brasil. Os fetos foram coletados entre junho de 2006 a junho de 2008 nas regiões sul, sudeste e centro-oeste, sendo estas enviadas ao laboratório para realização dos exames. Todas as amostras foram examinadas com controle negativo e positivo. Entre as 147 amostras investigadas, 83 (56,5%) foram positivas para pelo menos um destes agentes virais. O PCV2 foi detectado em 50,3% das amostras enquanto que co-infecção com o PCV2 e o PVS foi detectada em 6,2% das amostras investigadas. Estes resultados sugerem que o PCV2 deve ser incluído na lista de diagnóstico diferencial em granjas com falhas reprodutivas mesmo em unidades sem a manifestação clínica da síndrome da refugagem multissistêmica.

Palavras-chave: Suínos. Circovírus suíno tipo 2. Parvovírus suíno. Falhas reprodutivas. Reação em cadeia da polimerase.




iv

ABSTRACT

The Brazilian pig industry has achieved high competitiveness zootechnic and economic results, being Brazil, an important country swine production and trade of pig products. For that, investments in quality genetic breed, nutrition, vaccine programs, facilities, technician’s quality and others are essential. On the other hand, this insertion in the globalization scenery brings health challenges present at the world pig industry. Among these, the porcine circovirus type 2 (PCV2) is an infection agent that has been associated to several diseases with impact on the world pig industry. Among these diseases, the postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) and reproductive failure were experimentally reproduced and have been studied in several countries around the world. In Brazil, few studies were made about the relation between PCV2 and reproductive failure, being the majority of studies concentrated in PMWS. This fact could be one of the reasons why the PCV2 has not been associated with the reproductive failure on farms in Brazil. On those farms, the porcine parvovirus, a viral agent long known for its potential to cause reproductive failure, has been investigated. The objective of this present study was to investigate, through polymerase chain reaction (PCR), the presence of PCV2 and PPV in porcine stillbirths and mummies fetuses from different farms in Brazil. The fetuses were collected between June 2006 and June 2008 in the South, Southeastern and Midwestern regions. All the samples were examined with positive and negative control. Out of 147 samples, 83 (56,5%) were positive for at least one of the viral agents investigated. The PCV2 was detected in 50,3% of the samples while co-infection with PCV2 and PPV were detected in 6,2% of the investigated samples. These results suggest that PCV2 must be included in the differential diagnostic list in farms with reproductive failure even on farms without the clinical manifestation of postweaning multysistemic wasting syndrome.

Key-words: Swine. Porcine circovirus type 2. Porcine parvovirus. Reproductive

failure. Polimerase chain reaction.




v

LISTA DE TABELAS E FIGURA

TABELA 1 – OLIGONUCLEOTÍDEOS UTILIZADOS NAS AMPLIFICAÇÕES

DE PATÓGENOS VIRAIS E SUAS CARACTERÍSTICAS...................................

35

TABELA 2 – PRESENÇA DO CIRCOVÍRUS SUÍNO TIPO 2 (PCV2) E DO

PARVOVÍRUS SUÍNO (PVS) EM 147 AMOSTRAS DE FETOS

MUMIFICADOS E NATIMORTOS PROVENIENTES DE 39 GRANJAS DO

BRASIL ENTRE 06/2006 A 06/2008....................................................................

35

FIGURA 1 – ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE DE PRODUTOS DA

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) PARA CIRCOVÍRUS SUÍNO

TIPO 2 (PCV2) E PARVOVÍRUS SUÍNO (PVS) DE FRAGMENTOS DE

CORAÇÃO E PULMÃO DE FETOS SUÍNOS NATIMORTOS E

MUMIFICADOS....................................................................................................

36




vi

RELAÇÃO DE SIGLAS

DNA – ácido desoxirribonucléico

IHC – Imunohistoquímica

ISH – in situ hibridização

ORF – open reading frame (região aberta de leitura)

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase

PCV2 – Circovírus suíno tipo 2 ou Porcine Circovirus type 2

PMWS – Postweaning multysistemic wasting syndrome

PVS – Parvovírus suíno

PPV – Porcine parvovirus

SRM – Síndrome da refugagem multissistêmica




vii

SUMÁRIO

1 REVISÃO DE LITERATURA – Associação do circovrírus suíno tipo 2 a

falhas reprodutivas............................................................................................

10

1.1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 11

1.2 ETIOLOGIA ................................................................................................... 12

1.3 EPIDEMIOLOGIA E TRANSMISSÃO ........................................................... 13

1.4 IMUNIDADE .................................................................................................. 14

1.5 FALHAS REPRODUTIVAS ........................................................................... 15

1.6 DIAGNÓSTICO ............................................................................................. 18

1.7 PREVENÇÃO ................................................................................................ 20

1.8 CONCLUSÃO ................................................................................................ 21

REFERÊNCIAS ................................................................................................... 23

2 ARTIGO CIENTÍFICO – Identificação do circovírus suíno tipo 2 e do parvovírus suíno em fetos suínos natirmortos e mumificados provenientes de granjas no Brasil....................................................................................................................

30

RESUMO ............................................................................................................. 31

ABSTRACT ......................................................................................................... 31

INTRODUÇÃO .................................................................................................... 32

MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 33

RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................ 35

CONCLUSÃO ...................................................................................................... 38

AGRADECIMENTOS .......................................................................................... 38

REFERÊNCIAS ..................................... ............................................................. 39




REVISÃO DE LITERATURA

A formatação desta revisão de literatura está de acordo com as Normas para Apresentação de

Documentos Científicos da Universidade Federal do Paraná




11

ASSOCIAÇÃO DO CIRCOVÍRUS SUÍNO TIPO 2 A FALHAS REPRODUTIVAS

1.1 INTRODUÇÃO

A suinocultura brasileira está entre as maiores e mais importantes no

mundo. Os resultados zootécnicos e custo de produção atingidos na atividade

conferem ao Brasil posição de destaque. O investimento em melhoramento genético,

nutrição, programas de vacinação, manejo, instalações, atualização técnica, entre

outros, são fundamentais. Por outro lado, esta globalização da atividade faz com que

o Brasil também enfrente desafios sanitários presentes na suinocultura mundial.

Entre estes desafios, a síndrome da refugagem multissitêmica (SRM) tem sido

descrita em vários países do mundo com grande impacto econômico na produção de

suínos (SEGALÉS et al., 2005). No Brasil esta enfermidade, usualmente

denominada circovirose, foi relatada pela primeira vez no ano de 2000 no estado de

Santa Catarina (ZANELLA, 2001).

O agente infeccioso associado a esta síndrome é o circovírus suíno tipo 2

(PCV2). Este vírus tem sido associado a diversas enfermidades em suínos, entre

estas a síndrome da refugagem multissistêmica (HARDING e CLARK, 1997), falhas

reprodutivas (WEST et al., 1999), a síndrome da dermatite e nefropatia suína

(ROSELL et al., 2000), o complexo de doenças respiratórias dos suínos (KIM et al.,

2003) e ao aumento na mortalidade pré-desmama (BRUNBORG et al., 2007).

Algumas destas foram reproduzidas de forma experimental, como a SRM

(BALASCH et al., 1999; ELLIS et al., 1999) e as falhas reprodutivas (SANCHEZ et

al., 2001; PENSAERT et al., 2004; SANCHEZ et al., 2004; PARK et al., 2005).

Estudos mais recentes têm demonstrado forte associação entre o PCV2 e as

falhas reprodutivas, como os abortos, retornos ao cio, mumificação e mortes

embrionárias e fetais (SANCHEZ et al., 2001; SANCHEZ et al., 2004; PARK et al.,

2005; MATEUSEN et al., 2007; LEFEBVRE et al., 2008).

A inclusão do PCV2 como agente potencial em falhas reprodutivas foi

iniciada após o isolamento deste agente em leitões natimortos de uma granja com

histórico de baixa eficiência reprodutiva (WEST et al., 1999). Desde então, novos

trabalhos nesta área tem sido publicados, entretanto, em números inferiores a SRM.

No Brasil, estudos consideraram o PCV2 como patógeno viral de pouca importância




12

em casos de fetos natimortos, mumificados e abortados (MORENO et al., 2007;

PESCADOR et al., 2007).

Esta revisão tem por objetivo apresentar estudos relacionados ao PCV2 com

foco na discussão da participação deste agente em falhas reprodutivas.

1.2 ETIOLOGIA

O circovirus suíno faz parte da família Circoviridae. Esta família está dividida

em dois gêneros: o gênero Circovírus, onde estão incluídos o circovírus suíno tipo 1

(PCV1), o circovirus suíno tipo 2 (PCV2), o vírus da doença do bico e das penas dos

psitacídeos e o circovírus das pombas, e o gênero Gyrovirus que inclui somente o

vírus da anemia dos frangos (TISCHER et al., 1982).

O PCV2 é um vírus pequeno (15-20nm), um dos menores genomas que

infectam vertebrados, icosaédrico, não-envelopado e contém fita circular simples de

ácido desoxirribonucléico (TISCHER et al., 1982). O genoma do PCV2 contêm três

genes principais, denominados ORFs (open reading frames ou regiões abertas de

leitura). A ORF1 codifica proteínas importantes para a replicação do DNA viral

enquanto a ORF2 codifica a proteína do capsídeo que é responsável pela indução

de anticorpos protetores (NAWAGITGUL et al., 2000). O terceiro gene, ORF3,

codifica proteínas não essenciais à replicação viral, entretanto, pode ser importante

na patogenia por induzir apoptose (LIU et al., 2005). Estudos também demonstraram

que amostras do PCV2 podem ser divididas em dois subgrupos ou genótipos,

PCV2a ou PCV2 grupo 2 e o PCV2b ou PCV2 grupo 1, sendo a principal diferença

observada na região da ORF2 (GRAU-ROMA et al., 2008).

Ambos os genótipos foram associados à SRM e a falhas reprodutivas

(HARDING et al., 2008; LEFEBVRE et al., 2008). Entretanto, alguns estudos

relataram a possibilidade de haver diferença na virulência entre os genótipos PCV2a

e PCV2b na manifestação da SRM (GRAU-ROMA et al., 2008; HARDING et al.,

2008). No Brasil foram detectadas as presenças de ambos os genótipos (JANICE et

al., 2008; REIS et al. 2008), sendo que, amostras de PCV2 brasileiras apresentaram

semelhança genética de 97,1% (CHIARELLI et al., 2007). Nos EUA, Europa e Ásia

também foram demonstradas ambos os genótipos (CHEUNG et al., 2007; HARDING

et al., 2008).

Poucas informações sobre características fisicoquímicas do PCV2 foram

relatadas na literatura. Segundo O’DEA et al. (2008), o PCV2 foi inativado em cultura




13

de células PK-15 durante exposição ao calor de 80ºC por 15 minutos. MARTIN et al

(2008) relataram redução significativa na titulação in vitro do PCV2 em sete dos

nove desinfetantes testados.

Alguns trabalhos têm demonstrado sinergismo entre PCV2 e outros agentes

virais no desenvolvimento da SRM ou no complexo de doenças respiratórias dos

suínos, dentre os quais se destacam o parvovirus suíno, o vírus da síndrome

reprodutiva e respiratória suína e o torque teno vírus (ELLIS et al., 1999;

KRAKOWKA et al., 2000; QUINTANA et al., 2001; KIM et al., 2003; KAICHUANG et

al., 2008; KRAKOWKA et al., 2008). Como o objetivo desta revisão é a apresentação

de estudos da associação do PCV2 a falhas reprodutivas esta sinergia com outros

agentes infecciosos na SRM não será explorada neste texto. Estudos demonstraram

que falhas reprodutivas associadas ao PCV2 podem ocorrer sem a participação de

outros agentes infecciosos (WEST et al., 1999; SANCHEZ et al., 2001; PARK et al.,

2005), entretanto, pode haver co-infecção (O’CONNOR et al., 2001).

1.3 EPIDEMIOLOGIA E TRANSMISSÃO

Estudos têm demonstrado a disseminação mundial do PCV2 na população de

suínos (BARBOSA et al., 2005; GARKAVENKO et al., 2005; SEGALÉS et al., 2005).

Entretanto, vale ressaltar que, o PCV2 tem sido comum a população de suínos antes

da doença se tornar evidente (MAGAR et al., 2000; ZANELLA et al., 2006).

Suínos domésticos e selvagens parecem ser os hospedeiros naturais,

enquanto que espécies não suídeos parecem não serem susceptíveis a infecção

pelo PCV2 (TISCHER et al., 1982; VICENTE et al., 2004). Entretanto, NAYAR et al

(1999) relataram a detecção de PCV2 em pulmão de bovinos e fetos abortados de

bovinos.

A transmissão do PCV2 pode ocorrer de forma horizontal ou vertical

(BALASCH et. al., 1999; ELLIS et al., 1999; PENSAERT et al., 2004; PARK et al.,

2005). A via oronasal tem sido utilizada em estudos de reprodução experimental da

SRM (BALASCH et al., 1999; ELLIS et al., 1999). O PCV2 tem sido detectado em

secreções nasais, saliva, fezes e soro de suínos, o que indica a disseminação

horizontal (KRAKOWKA et al., 2000; SEGALÉS et al., 2005). HA et al (2008)

demonstraram que a transmissão do PCV2 também pode ocorrer pelo leite da matriz

lactante. Entretanto, estudos têm demonstrado diferenças nas concentrações virais

em animais com ou sem a manifestação clínica da SRM. Neste sentido, SÉGALES




14

et al. (2005) demonstraram que a excreção viral foi significativamente maior em

animais com a manifestação clínica da SRM. Estudos sugeriram que concentrações

virais acima de 107 cópias de genoma/ml de soro são observadas em animais com a

manifestação clínica da SRM (BRUNBORG et al., 2004; OLVERA et al., 2004). Por

outro lado, animais sem a SRM também podem eliminar o PCV2 e servir como fonte

de infecção para outros animais (KRAKOWKA et al, 2005). É importante ressaltar

que procedimentos inadequados de manejo tais como: densidade de alojamento

elevada, baixa qualidade do ar, água e ração, mistura de lotes de origens diferentes

podem predispor a manifestação da SRM e conseqüente, maior excreção do PCV2

(MADEC et al., 2000).

A transmissão vertical também foi demonstrada, sendo que, a infecção

transplacentária pode ocorrer em qualquer idade de gestação (PENSAERT et al.,

2004; PARK et al., 2005). Os embriões suínos com a zona pelúcida intacta podem

ser resistentes ao PCV2, entretanto, tornam-se mais susceptíveis com o avanço dos

estágios embrionários (MATEUSEN et al., 2004). BIELANSKI et al. (2004) relataram

que o PCV2 pode ser resistente aos procedimentos de lavagem de embriões

recomendados pela International Embryo Transfer Society. O PCV2 também foi

detectado no sêmen e oócitos de reprodutores soropositivos e clinicamente sadios

(LAROCHELLE et al., 2000, BIELANSKI et al., 2004; SCHMOLL et al., 2008). GAVA

et al (2008) demonstraram que o PCV2 pode ser transmitido pelo sêmen para

matrizes e respectivos fetos durante a gestação.

1.4 IMUNIDADE

O estudo da dinâmica dos anticorpos passivos e ativos, bem como da

imunidade celular, também é importante para compreender o potencial do PCV2 em

atravessar a barreira placentária e causar infecção em embriões e fetos. Os estudos

apresentados neste capítulo demonstram que pode haver diminuição no titulo de

anticorpos para o PCV2 em leitoas próximo à idade de reprodução, bem como,

haver viremia em leitoas e matrizes soropositivas sem sinais clínicos da SRM

(LAROCHELLE et al., 2003; CARASOVA et al., 2007; CALSAMIGLIA et al., 2007).

A imunidade passiva ao PCV2, transmitida via colostro aos leitões, declina

durante o período de lactação e de creche (LAROCHELLE et al., 2003; CARASOVA

et al., 2007). Desta forma, a SRM não é usualmente observada em leitões com

menos de quatro semanas de idade (SEGALÉS et al., 2005; CARASOVA et al.,




15

2007). A soroconversão ativa foi observada em leitões entre oito a 15 semanas de

idade (LAROCHELLE et al., 2003; CARAROVA et al., 2007). Em condições

experimentais, a soroconversão ativa ocorreu entre 11 a 21 dias após a infecção

(BALASCH et al., 1999; LAROCHELLE et al., 2000). CARASOVA et al (2007) num

estudo realizado em uma granja com a SRM demonstraram que o maior título de

anticorpos IgG específico ao PCV2 foi observado com 16 semanas de idade sendo

detectado redução acentuada com 25 semanas. De forma concomitante neste

estudo, foi demonstrada viremia em animais de recria, terminação e matrizes

soropositivos e sem sinais clínicos da SRM. Outros autores também demonstraram

viremia em animais de terminação e matrizes, mesmo com altos títulos de anticorpos

e sem sinais clínicos da SRM (LAROCHELLE et al., 2003; MCINTOSH et al., 2006;

CALSAMIGLIA et al., 2007). PITTMAN et al. (2008) diagnosticaram a SRM em

leitoas de reposição em granja com histórico de falhas reprodutivas associadas ao

PCV2.

A titulação de anticorpos anti-PCV2, bem como a detecção de PCV2 no

soro, é variável entre matrizes num mesmo rebanho (CALSAMIGLIA et al., 2007).

Este perfil sorológico e virêmico pode estar relacionado à taxa de mortalidade dos

leitões (CALSAMIGLIA et al., 2007), entretanto, não foram encontrados dados na

literatura relacionando titulação de anticorpos anti-PCV2 e riscos de infecção

transplacentária.

1.5 FALHAS REPRODUTIVAS

As falhas reprodutivas em suínos, tais como aborto, retorno ao cio, fetos

natimortos e mumificados, podem ser de origem infecciosa ou não. Estas falhas de

origem não infecciosa podem ser causadas, entre outras, por intoxicações e falhas

nos procedimentos de manejo (HOLLER, 1994). O tamanho da leitegada e a ordem

de parição da matriz também são exemplos de causas não infecciosas que podem

influenciar a sobrevivência fetal (SCHNEIDER et al., 2001). As falhas reprodutivas

de origem infecciosas podem ser sistêmicas ou localizadas no trato reprodutivo. As

causas infecciosas localizadas estão relacionadas, por exemplo, a infecções do trato

reprodutivo de matrizes que podem ter como causa procedimentos de manejo

inadequados. Entre as causas infecciosas sistêmicas alguns agentes virais e

bacterianos merecem destaque, como: parvovírus suíno (PVS), vírus da síndrome

reprodutiva e respiratória dos suínos, vírus da doença de Aujeszky, vírus da




16

influenza, vírus da peste suína clássica, Leptospira spp e Erysipelothrix

rhusiopathiae (HOLLER, 1994; KIM et al., 2004; MORENO et al., 2007). Estudos

recentes têm associado o PCV2 a estas falhas reprodutivas (WEST et al., 1999;

SANCHEZ et al., 2001; MATEUSEN et al, 2004; PARK et al., 2005; MATEUSEN et

al., 2007). LEFEBVRE et al. (2008) demonstraram que ambos os genótipos, PCV2a

e PCV2b, podem ser letais aos fetos.

O fato da ampla disseminação do PCV2 no mundo (SEGALÉS et al., 2005),

levantou a discussão se este agente seria importante em quadros clínicos de falhas

reprodutivas, uma vez que boa parte das matrizes são soropositivas (SANCHEZ et

al., 2001). Neste sentido, PENSAERT et al. (2004) demonstraram que o PCV2 pode

atravessar a barreira placentária e causar infecção em embriões ou fetos mesmo em

matrizes soropositivas. Neste estudo, os autores demonstraram que o PCV2 pode

causar viremia de forma livre no plasma ou associada à célula. Segundo estes

autores, os vírus que circulam livre pelo plasma são eficientemente controlados por

anticorpos maternos enquanto que na viremia de forma associada à célula, os vírus

podem atravessar a placenta sem o contato com anticorpos maternos. As chances

de infecção transplacentária aumentam com a maior concentração viral, duração da

viremia e virulência da amostra (PENSAERT et al., 2004). Vale ainda ressaltar as

informações apresentadas no capítulo anterior sobre detecção de viremia em

matrizes soropositivas e sem sinais clínicos da SRM (CARASOVA et al., 2007;

CALSAMIGLIA et al., 2007).

Alguns estudos reproduziram de forma experimental a transmissão vertical e

observaram aborto (SANCHEZ et al., 2004; PARK et al., 2005). Autores relataram

que o PCV2 pode atravessar a barreira placentária em qualquer idade de gestação

(KIM et al., 2004; PARK et al., 2005). MATEUSEN et al. (2007) relataram que o

PCV2 pode causar retorno ao cio, inclusive regular, quando infecções

transplacentárias ocorrerem em estágios iniciais de gestação. Entretanto, SANCHEZ

et al. (2001) não observaram interrupção da gestação após inoculação intra-fetal

com o PCV2. Segundo estes autores, estas diferenças observadas no curso da

gestação podem estar relacionadas, entre outras, a via de inoculação e a virulência

das amostras.

Estudos também demonstraram o potencial do PCV2 em causar morte fetal

(SANCHEZ et al., 2001; JOHNSON et al., 2002; MATEUSEN et al., 2004; SANCHEZ

et al., 2004; PARK et al., 2005). A mumificação ou natimortalidade fetal depende do




17

período gestacional nas quais os fetos foram expostos ao PCV2. Fetos infectados

antes de 75 dias de gestação apresentaram maiores chances de mumificação fetal

enquanto fetos infectados após esta idade se apresentaram natimortos ou fracos ao

nascimento (SANCHEZ et al., 2001). Estudos demonstraram que alguns fetos

infectados durante a gestação podem nascer vivos e indicam potencial destes em

carrear o vírus para a vida pós-natal (SANCHEZ et al., 2001; JONHSON et al., 2002;

SANCHEZ et al., 2004; PARK et al., 2005). Entretanto, o desenvolvimento da SRM

nestes leitões fracos ao nascimento não está determinado.

SANCHEZ et al. (2001) relataram congestão hepática, hemorragia e

hipertrofia cardíaca como as principais lesões macroscópicas em fetos inoculados

com o PCV2. LEFEBVRE et al. (2008) em estudo de inoculação experimental de

fetos relataram diferentes lesões macroscópicas de acordo com as doses

infectantes. As principais lesões histológicas em fetos infectados com o PCV2 foram

miocardites fibrosante e/ou necrosante (WEST et al., 1999; O’CONNOR et al., 2001;

BRUNBORG et al., 2007) e pneumonia discreta, caracterizada por infiltrado de

células mononucleares no espaço alveolar (PARK et al., 2005). Entretanto, no

estudo de PARK et al. (2005) apenas 30% dos fetos natimortos de matrizes

inoculadas com PCV2 apresentaram lesões histológicas discretas no pulmão. Desta

forma, conclui-se que o PCV2 pode causar morte fetal mesmo sem a observação de

lesões histológicas.

Segundo ALBANES (1998) exames histopatológicos em quadros de infecção

viral no tecido cardíaco podem apresentar baixa sensibilidade. Os vírus podem

causar insuficiência do miocárdio por dois mecanismos, efeito citotóxico direto ou de

forma indireta como conseqüência de resposta imunológica. A gravidade da lesão

cardíaca depende, entre outros, da localização e extensão. A lesão focal é bem

tolerada, porém se o processo inflamatório ocorrer nas proximidades do tecido de

condução, poderemos encontrar graves conseqüências. O autor ainda ressalta que

a persistência de material genético viral tem sido demonstrada, por meio de técnicas

como PCR ou hibridização in situ, na ausência de processo inflamatório e tem sido

associada à evolução desfavorável da insuficiência miocárdica.

Poucos estudos foram encontrados na literatura sobre a freqüência de

detecção do PCV2 em fetos suínos, sendo que, resultados bastante variáveis foram

observados. MALDONADO et al. (2005) não relataram participação efetiva do PCV2

como patógeno fetal, mesmo na Espanha onde a SRM é amplamentente




18

disseminada. Entretanto, ZIZLAVSKY et al. (2008) relataram o PCV2 como principal

agente infeccioso detectado nos 232 fetos investigados entre os anos de 2005 a

2007 na República Checa. Neste estudo, a freqüência do PCV2 variou entre 21,7%

a 54,1%. KIM et al (2004) em estudo realizado na Coréia do Sul observaram

freqüência do PCV2 em 13,1% de 350 fetos mumificados, natimortos e provenientes

de aborto. No Brasil, MORENO et al. (2007) realizaram estudo por meio de PCR

com 1727 fetos mumificados, natimortos e abortados, sendo todas as amostras

negativas para o PCV2. Neste estudo, os agentes mais detectados foram o

parvovírus suíno (17%) seguido pela Leptospira spp (13%) enquanto que

PESCADOR et al. (2007) relataram 5,7% das amostras positivas ao PCV2 do total

de 121 fetos investigados. Desta forma, há necessidade de outros estudos para

avaliar a freqüência de detecção do PCV2 em fetos suínos, bem como do impacto

deste agente no desempenho reprodutivo do plantel.

1.6 DIAGNÓSTICO

O diagnóstico de falhas reprodutivas é complexo, uma vez que, estas falhas

podem ser de origem infecciosa ou não (HOLLER, 1994). No processo de

diagnóstico, devem-se revisar todos os procedimentos de manejo e ambiência

relacionados aos setores de reprodução da granja, entretanto, não é o objetivo desta

revisão.

Entre as causas infecciosas alguns agentes virais e bacterianos merecem

destaque, como, circovirus suíno tipo 2, parvovírus suíno, vírus da Doença de

Aujeszky, vírus da Peste Suína Clássica, vírus da Síndrome Reprodutiva e

Respiratória Suína, Leptospira spp e Erysipelothrix rhusiopathiae (HOLLER, 1994;

PENSAERT et al., 2004; KIM et al., 2004; MORENO et al., 2007; ZIZLAVSKY et al.,

2008). Dentre os agentes infecciosos que fazem parte do diagnóstico diferencial o

Brasil é considerado livre do vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória dos

Suínos. Estudos recentes não encontraram soroconversão nas amostras

investigadas (RISTOW et al., 2007; SILVA et al., 2007).

Como o objetivo desta revisão é a associação do PCV2 a falhas

reprodutivas, as informações neste capítulo sobre diagnóstico serão relacionadas a

este vírus.

Para confirmação do diagnóstico do PCV2 associado à falha reprodutiva é

necessário, entre outros, a identificação do PCV2 em órgãos fetais. Neste sentido,




19

algumas técnicas, tais como o isolamento viral, PCR, hibridização in situ e/ou imuno-

histoquímica, foram discutidas na literatura consultada (JONHSON et al, 2002;

PARK et al., 2005). O isolamento viral a partir de fetos pode apresentar baixa

sensibilidade (PARK et al., 2005) enquanto que bons resultados foram relatados por

técnicas tais como reação em cadeia da polimerase (PCR), hibridização in situ e/ou

imuno-histoquímica (JONHSON et al., 2002; PARK et al., 2005). A identificação do

PCV2 nos fetos natimortos, mumificados e abortados podem sugerir que este vírus

seja o causador da morte fetal, entretanto, técnicas que permitam a quantificação

viral no tecido, como o PCR em tempo real, pode ser importante nesta confirmação,

uma vez que as titulações detectadas podem ser comparadas às titulações virais

utilizadas nos estudos de infecções experimentais com danos aos fetos (SANCHEZ

et al., 2003; PARK et al., 2005; LEFEVBVRE et al., 2008).

O exame histopatológico pode ser realizado em tecidos de fetos abortados e

natimortos (PARK et al., 2005), desde que não apresentem estágio avançado de

autólise. Entretanto, as lesões histopatológicas descritas (WEST et al, 1999;

O’CONNOR et al., 2001) não são patognomônicas do PCV2, sendo necessária à

utilização de outras técnicas para confirmação. Vale ainda ressaltar que, conforme

discutido no capítulo anterior, o PCV2 pode induzir à morte fetal sem causar lesões

histológicas (PARK et al., 2005).

SANCHEZ et al. (2001) descrevem a técnica de imunoperoxidase para

detecção de anticorpos em soro de fetos expostos ao PCV2 no terço final de

gestação.

Não há um consenso na literatura sobre o órgão ou órgãos de eleição para

detecção do PCV2 em fetos (SANCHEZ et al., 2001; SANCHEZ et al., 2003; PARK

et al., 2005; BRUNBORG et al., 2007; LEFEBVRE et al., 2008). Estudos

demonstraram o coração de fetos como o órgão de maior título viral independente

do período gestacional (SANCHEZ et al., 2001; SANCHEZ et al., 2003; LEFEBVRE

et al., 2008). Outros autores destacaram a miocardite como a principal lesão

histopatológica em fetos (WEST et al, 1999; O’CONNOR et al., 2001; BRUNBORG

et al., 2007). Entretanto, PARK et al. (2005), sugerem tonsilas, baço e linfonodos de

fetos, como órgãos de maiores concentrações do PCV2. Segundo SANCHEZ et al.

(2003) o tropismo do PCV2 modifica de cardiomiócitos, hepatócitos e macrófagos na

fase pré-natal para macrófagos na vida pós-natal. Desta forma, a seleção dos




20

órgãos de fetos em estudos de detecção da freqüência do PCV2 pode gerar

diferenças nos resultados.

Outro ponto importante no processo de diagnóstico de agentes infecciosos

associados à falhas reprodutivas é o número de amostras ou fetos enviados ao

laboratório. É interessante enviar o maior número de fetos abortados, natimortos e

mumificados por leitegada e de diferentes leitegadas. A disseminação do PCV2 no

ambiente uterino pode ser lenta e nem todos os fetos de uma leitegada podem estar

infectados (SANCHEZ et al., 2001; PARK et al., 2005). Fetos inferiores a 16

centímetros, antes da fase de imunocompetência, tendem a apresentar maior título

viral (SANCHEZ et al., 2001). Por outro lado, estudos comprovam a presença de

DNA do PCV2 associado a anticorpos durante a fase de imunocompetência

(SANCHEZ et. al., 2001). Portanto, limitar o tamanho do feto para envio ao

laboratório com fins de diagnóstico pode ser um erro.

1.7 PREVENÇÃO Apesar de estudos apresentados nesta revisão terem demonstrado o

potencial do PCV2 em causar falha reprodutiva, não foram encontradas na literatura

discussões sobre medidas preventivas. Estas medidas preventivas para o PCV2

(MADEC et al., 2000), bem como as vacinas disponíveis no mercado, têm como

objetivo principal o controle da SRM.

Diferentes tipos de vacina têm sido descritos de forma experimental, como a

vacina de DNA, vacinas de subunidades da ORF1 e ORF2 do PCV2 (BLANCHARD

et al., 2003) e vacinas recombinantes (FENAUX et al., 2004; JU et al., 2005). Até o

momento, quatro empresas (Merial, Fort Dodge, Shering-Plough/Intervet e

Behringer) comercializam vacinas para PCV2. Entretanto, estes programas de

vacinação têm por objetivo principal o controle da SRM. QUNXING et al (2008)

apresentaram um estudo com o objetivo de desenvolver uma vacina conjugada para

o circovírus suíno tipo 2 e o parvovírus suíno. Vale ressaltar que a vacinação para

parvovirose no plantel reprodutivo é amplamente usada no Brasil, bem como as

vacinações para Leptospirose e Erisipelose.

Entre as medidas preventivas, MADEC et al. (2000) elaboraram um protocolo

com 20 pontos de procedimentos de manejo para auxiliar no controle da SRM.

Estudos não demonstraram relação entre a SRM e falhas reprodutivas associadas

ao PCV2, entretanto, uma maior excreção viral em animais com a manifestação




21

clínica da doença (SEGALÉS et al., 2005) podem aumentar a disseminação do

PCV2 no ambiente. Vale ressaltar que algumas granjas adotam a transferência de

fêmeas jovens, futuras reprodutoras, ao setor de gestação, fase onde pode haver

manifestação clínica da SRM. PITTMAN et al. (2008) diagnosticaram a SRM em

leitoas de reposição em uma granja onde foi realizado o diagnóstico de falhas

reprodutivas associadas ao PCV2.

Outra medida preventiva poderia ser a exclusão do uso de sêmen infectado

com PCV2. GAVA et al (2008) demonstraram que o PCV2 pode ser transmitido pelo

sêmen para matrizes e respectivos fetos. Entretanto, aplicações de técnicas

laboratoriais para detecção do PCV2 nas rotinas de muitas das centrais de

inseminação artificial no Brasil seriam de difícil execução. Técnicas como PCR, por

exemplo, demandam equipamentos e equipe qualificada. O sêmen suíno é utilizado

na forma fresca, não é realizado o congelamento, desta forma, o envio de amostras

de sêmen para laboratórios capacitados também teria limitações. REICKS e

LEUWERKE (2008) não relataram diferença na detecção de PCV2 no sêmen de

reprodutores vacinados e não vacinados. Entretanto, houve redução significativa na

quantidade de vírus detectada no soro de reprodutores vacinados. Há necessidade

de estudos para definir se a vacinação de reprodutores pode reduzir a eliminação de

PCV2 pelo sêmen. Vale ressaltar que SCHMOLL et al. (2008) relataram à detecção

de PCV2 em sêmen de machos soronegativos.

1.8 CONCLUSÃO

Estudos demonstram o potencial do PCV2 em provocar falhas reprodutivas

tais como retorno ao cio regular ou irregular, aborto, fetos natimortos e mumificados.

Algumas granjas de suínos chegam a adotar uma dose extra da vacina para

parvovirose em programas de vacinação de leitoas de reposição ou trocam de

fornecedor desta vacina onde há histórico de falhas reprodutivas. Entretanto, a

participação do PCV2 nestes quadros clínicos as vezes não é considerada no

diagnóstico diferencial.

No Brasil, a manifestação clínica da SRM em diferentes intensidades é

amplamente disseminada. Entretanto, algumas granjas com histórico de falhas

reprodutivas não consideram o PCV2 na lista de diagnóstico diferencial. Vale

ressaltar que não foram encontrados estudos sobre a relação entre granjas com a

SRM e falhas reprodutivas relacionadas ao PCV2.




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Desta forma, há necessidade de mais estudos sobre a freqüência do PCV2

em fetos suínos no Brasil, bem como, definir a participação deste agente viral nos

transtornos reprodutivos em granjas.




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30

ARTIGO CIENTÍFICO

Este artigo está de acordo com as normas da revista Ciência Animal




31

IDENTIFICAÇÃO DO CIRCOVÍRUS SUÍNO TIPO 2 E DO PARVOVÍRUS SUÍNO

EM FETOS SUÍNOS NATIMORTOS E MUMIFICADOS PROVENIENTES DE

GRANJAS NO BRASIL

IDENTIFICATION OF PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 AND PORCINE

PARVOVIRUS IN PORCINE STILLBIRHTS AND MUMMIES FETUSES FROM

FARMS IN BRAZIL

DANILO LEAL ROCHA,1 JOSÉ LÚCIO DOS SANTOS,2 GERALDO CAMILO

ALBERTON3

1. Mestrando do Setor de Ciências Agrárias/UFPR, médico veterinário do laboratório Microvet

2. Professor Adjunto da Universidade Federal de Viçosa, médico veterinário responsável técnico pelo

laboratório Microvet

3. Professor Adjunto do Departamento de Medicina Veterinária da Universidade Federal do Paraná

RESUMO – Foi investigada a presença de seqüências genômicas do circovírus suíno tipo 2

(PCV2) e do parvovírus suíno (PVS) em 147 amostras de fetos suínos natimortos e

mumificados. Estas amostras, provenientes de 39 granjas localizadas em oito estados

brasileiros, foram coletadas entre os anos de 2006 a 2008. Foram utilizados fragmentos de

coração e pulmão para extração do DNA total e posterior amplificação de fragmentos

correspondentes aos patógenos virais pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR).

Entre as 147 amostras, 74 (50,3%) foram positivas ao PCV2 enquanto nove amostras (6,2%)

apresentaram co-infecção com o PCV2 e o PVS. Nenhuma amostra foi positiva apenas para

PVS. Entre as 39 granjas estudadas, 21 (53,8%) apresentaram fetos positivos ao PCV2

enquanto que co-infecção com o PCV2 e o PVS foi detectada em três (7,7%). Estes resultados

indicam que o PCV2 pode ser um importante agente infeccioso causador de morte

embrionária e fetal em suínos no Brasil, e deve ser incluído na lista de diagnóstico diferencial.

PALAVRAS-CHAVE: suíno, circovírus suíno tipo 2 (PCV2), parvovírus suíno (PPV), falhas

reprodutivas, reação em cadeia da polimerase (PCR).

ABSTRACT

This study investigated the presence of genome sequence of the porcine circovirus type 2

(PCV2) and porcine parvovirus (PPV) in 147 porcine stillbirths and mummies fetuses

samples. These samples, originated from 39 farms located in eight Brazilian provinces, were

collected between 2006 and 2008. Heart and lung fragments were used for extraction of total




32

DNA and latter amplification of correspondent fragments of the virus pathogens through

polymerase chain reaction (PCR) technique. Out of 147 samples, 74 (50,3%) were positive for

PCV2 while nine samples (6,2%) were positive for PCV2 and PPV. None of the samples were

positive just for PPV. Out of 39 investigated farms, 21 (53,8%) had fetuses positive for PCV2

while co-infection with PCV2 and PPV were detected in 3 farms (7,7%). These results

indicate that PCV2 could be an important infection agent in cases of porcine stillbirths and

mummies fetuses in Brazil and must be included at differential diagnostic list.

KEY-WORDS: swine, porcine circovirus type 2 (PCV2), porcine parvovirus (PPV),

reproductive failure, polymerase chain reaction (PCR).

INTRODUÇÃO

As falhas reprodutivas em suínos, tais como retorno ao cio, aborto, mortes

embrionárias e fetais comprometem a meta de produção de leitões nascidos vivos e/ou

desmamados de uma granja. Desta forma, estas falhas reprodutivas podem causar prejuízos

econômicos na produção de suínos.

As causas de falhas reprodutivas em suínos podem ser de origem infecciosa ou não-

infecciosa (HOLLER, 1994). Entre as causas não infecciosas, vários procedimentos de

manejo podem influenciar o desempenho reprodutivo do plantel, enquanto que as infecciosas

podem ser causadas, em especial, por agentes bacterianos e virais (ALMOND, 2006). Entre os

agentes infecciosos mais freqüentes detectados em fetos suínos natimortos, mumificados e

abortados podem-se destacar o parvovírus suíno (KIM et al., 2004; MORENO et al., 2007), o

vírus da síndrome reprodutiva e respiratória dos suínos (MALDONADO et al., 2005) e a

Leptospira spp (MORENO et al., 2007). Estudos recentes têm associado o circovírus suíno

tipo 2 (PCV2) a falhas reprodutivas com efeitos diretos sobre o embrião ou o feto (WEST et

al., 1999; SANCHEZ et al., 2001; JOHNSON et al., 2002; MATEUSEN et al., 2004; PARK

et al., 2005; MATEUSEN et al., 2007; LEFEBVRE et al., 2008). Dentre estes agentes

infecciosos citados, é importante destacar que o Brasil é considerado livre do vírus da

síndrome reprodutiva e respiratória dos suínos (PRRS), sendo que estudos recentes não

relataram soroconversão nas amostras investigadas (RISTOW et al., 2007; SILVA et al.,

2007).

O circovírus suíno tipo 2 (PCV2), membro da família Circoviridae, é amplamente

disseminado na população de suínos (SEGALÉS et al., 2005) e tem sido associado a outras

enfermidades, tais como a síndrome da refugagem multissistêmica ou circovirose (ELLIS et

al., 1999), a síndrome da dermatite e nefropatia (ROSELL et al., 2000), ao complexo de




33

doenças respiratórias dos suínos (KIM et al., 2003), ao aumento da mortalidade de leitões

antes do desmame (BRUNBORG et al., 2007) e a imunossupressão (KAICHUANG et al.,

2008).

Devido a esta variedade de enfermidades relacionadas ao PCV2, muitos estudos têm

sido realizados em todo o mundo. No Brasil, o número de estudos relacionados ao PCV2 é

crescente desde o primeiro relato da síndrome da refugagem multissistêmica (ZANELLA,

2001). Entretanto, poucos estudos relacionados ao PCV2 e falhas reprodutivas foram

realizados, sendo que, nestes estudos o PCV2 foi considerado como agente infeccioso de

pouca importância no Brasil (MORENO et al., 2007; PESCADOR et al., 2007). Por outro

lado, em outros países, estudos têm relatado aumento nas taxas de aborto, retorno ao cio e

fetos natimortos e mumificados relacionados ao PCV2 (WEST et al., 1999; BRUNBORG et

al., 2007), sendo que, ZIZLAVSKY et al. (2008) relataram o PCV2 como o principal agente

infeccioso detectado em fetos suínos na República Checa.

O objetivo deste estudo foi investigar, por meio da técnica de PCR, a presença do

DNA do circovírus suíno tipo 2 (PCV2) e do parvovírus suíno (PVS) em fetos suínos

natimortos e mumificados.

MATERIAL E MÉTODOS

Para a investigação da presença de fragmentos de DNA do PCV2 e do PVS foram

utilizadas 147 amostras de fetos suínos natimortos e mumificados, provenientes de 39 granjas,

coletados entre junho de 2006 a junho de 2008. As amostras foram provenientes de granjas

localizadas em importantes regiões produtoras de suínos no Brasil: Minas Gerais (14), Paraná

(12), Santa Catarina (6), Rio Grande do Sul (2), Goiás (2), Bahia (1), Rio de Janeiro (1) e

Espírito Santo (1). Estas granjas possuíam plantel de 150 a 3000 matrizes com ciclo de

produção completo ou unidades produtoras de leitões. Estas granjas utilizavam vacinação do

plantel reprodutivo para o PVS e não utilizavam vacina para o PCV2.

Os fetos foram armazenados em sacos plásticos identificados, congelados em freezer a

-20oC e posteriormente enviados em caixa isotérmica ao laboratório Microvet, localizado em

Viçosa-MG. O período de transporte até o laboratório variou entre 24 a 48 horas. No

laboratório os fetos foram necropsiados com material estéril para retirada de fragmentos de

coração e pulmão.

A extração do DNA total foi realizada pelo método padrão fenol-clorofórmio, sugerido

por DAVIS et al. (1994) com modificações. Fragmentos de coração e de pulmão de cada feto

foram macerados com posterior adição de 3 a 5 mL de tampão fosfato (Na2HPO4 0,04 M;




34

KH2PO4 0,01 M, pH=7,4) para homogeinização. Foi realizada transferência de 1,5 ml da

suspensão para tubos Eppendorfs e centrifugados a 10000 x g por 10 minutos. O sobrenadante

foi descartado e o sedimento ressuspenso em 1,0 ml de tampão fosfato com a adição de 125 μl

de SDS (dodecil sulfato de sódio) a 10%, misturado por inversão e incubado em banho-maria

a 65oC por 30 minutos. Após esta fase, foram adicionados 350 μl de acetato de potássio 8M,

misturado por inversões repetidas e incubado em gelo por 60 minutos. O precipitado foi

centrifugado a 10.000 x g por 15 minutos a 12ºC. O sobrenadante foi transferido para outro

tubo Eppendorf e foi adicionado um volume de fenol/clorofórmio (1:1). Após homogeneizar

por inversões repetidas e separar as fases por centrifugação por 15 minutos a 10000 x g, a fase

aquosa foi coletada e foi adicionado um volume de clorofórmio (Merck), misturado por

inversões repetidas e as fases separadas por centrifugação por 15 minutos a 10000 x g. O

sobrenadante foi coletado e adicionado dois volumes de etanol para precipitar DNA total.

Centrifugação por 10 minutos a 15000 x g foi realizada para obtenção do sedimento, que foi

lavado com 150 μl de etanol 70%. O etanol foi descartado e o sedimento seco em temperatura

ambiente por 30 minutos. O sedimento foi ressuspenso em 30 μl tampão TE (Tris-HCl 10

mM, EDTA 1 mM). Após determinação da concentração por absorvância 260 nm usando

espectofotômetro Ultrospec 1100 pro (Amersham Biosciences), o DNA total foi diluído para

uma concentração de 50 ng/µL e estocado a -80º C até o uso. Aplicação de uma alíquota do

DNA total em gel de agarose 0,8% foi realizada para verificar integridade do DNA total.

A amplificação de fragmentos de DNA específicos de PCV2 e PVS foi realizada

seguindo metodologia recomendada por KIM et al. (2003). Os oligonucleotídeos utilizados

nas amplificações estão indicados na tabela 1. Amplificações foram realizadas em 50 µl de

mistura de reação contendo 50 ng de DNA total, 20 mM de Tris-HCl, 50 mM de KCl, 1,25

mM de MgCl2, 0,2 mM de cada desoxinucleotídeo trifosfatado (dNTP), 1µM de cada

oligonucleotídeo e 2,5 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen). O programa de amplificação

em termociclador Mastercycler gradient (Eppendorf) consistiu de 30 ciclos com 1 passo de

94º C por 1 min., 55ºC por 1 min., 72ºC por 3 min. e finalizada com um passo de extensão de

72º C por 4 min. Produtos de amplificação foram aplicados em gel de agarose 1,5% em

presença de brometo de etídeo e submetidos a eletroforese a 60 V e fotografados com luz

ultravioleta. Os testes foram realizados com controle positivo e negativo para validação.




35

TABELA 1. Oligonucleotídeos utilizados nas amplificações de fragmentos do DNA do

circovírus suíno tipo 2 (PCV2) e do parvovírus suíno (PVS) e suas características Vírus Oligonucleotídeos e seqüência (5' para 3') Posição do

Nucleotídeo

Tamanho do

Produto

Referência

PCV2 D CGGATATTGTAGTCCTGGTCG

R ACTGTCAAGGCTACCACAGTCA

1095-1115

1570-1549

481 pb Ellis et al., 1999

PVS D CCAGCAGCTAACACAAGAAAAGGTTATCAC

R GTCCATGTTGGTAATCCATTGTAAATC

3708-3730

3907-3933

226 pb Arnauld et al., 1998

D – direto R – reverso

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Entre os 147 fetos natimortos e mumificados investigados foi detectado a presença

de pelo menos um agente viral em 83 (56,5%) amostras enquanto que 64 (43,5%) amostras

foram negativas aos agentes infecciosos investigados. O PCV2 foi detectado em 74 amostras

(50,3%) enquanto nove amostras (6,2%) apresentaram co-infecção com o PCV2 e o PVS.

Nenhuma amostra foi positiva apenas ao PVS. Entre as 39 granjas estudadas, 21 (53,8%)

apresentaram fetos positivos ao PCV2 enquanto que co-infecção com o PCV2 e o PVS foi

detectada em três (7,7%) granjas (tabela 2).

TABELA 2. Presença do circovírus suíno tipo 2 (PCV2) e do parvovírus suíno (PVS) em 147

amostras de fetos suínos natimortos e mumificados provenientes de 39 granjas do Brasil entre

06/2006 a 06/2008.

Amostras Granjas Agente viral

Total Positivas Porcentagem de positivas

Total Positivas Porcentagem de positivas

PCV2 147 74 50,3 39 21 53,8 PVS 147 0 0,0 39 0 0,0 PCV2 e PVS 147 9 6,2 39 3 7,7 Pelo menos um agente viral

147 83 56,5 39 24 61,5




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FIGURA 1. Eletroforese em gel de agarose de produtos da reação em cadeia da polimerase

(PCR) para circovírus suíno tipo 2 (PCV2) e parvovírus suíno (PVS) de fragmentos de

coração e pulmão de fetos suínos natimortos e mumificados.

Amostras 1,2,3,8 = PCR duplex negativo para PCV2 e PVS; Amostra 4 = PCR duplex positivo para

PCV2 e PVS; Amostras 5,6,7,10 = PCR duplex positivo para PCV2; Amostra 9 = PCR duplex controle

positivo para PCV2 e PVS; Amostra 11 = PCR duplex controle negativo para PCV2 e PVS; Amostra 12

= marcador molecular 1Kb plus DNA ladder (Invitrogen).

A freqüência de detecção do PCV2 em fetos natimortos, mumificados e abortados nos

estudos realizados no Brasil e no exterior variou consideravelmente. Os resultados do presente

estudo são semelhantes ao realizado por ZIZLAVSKY et al. (2008). Neste estudo realizado na

República Checa o PCV2 foi considerado o principal agente infeccioso detectado em fetos

suínos entre os anos de 2005 a 2007, com freqüência de detecção variando de 21,7% a 54,1%.

KIM et al. (2004) em estudo realizado na Coréia do Sul relataram freqüência do PCV2 em

13,1% dos 350 fetos mumificados, natimortos e provenientes de aborto. Entretanto, outros

estudos obtiveram menor freqüência de detecção do PCV2 em amostras de fetos suínos

(MALDONADO et al., 2005; MORENO et al., 2007; PESCADOR et al., 2007). No Brasil,

MORENO et al. (2007) não observaram amostras positivas ao PCV2 dentre os 1727 fetos

analisados, enquanto que PESCADOR et al. (2007) relataram apenas 5,7% das amostras

positivas ao PCV2 do total de 121 fetos investigados. MALDONADO et al. (2005) relataram

que o PCV2 provavelmente não seja um patógeno importante relacionado a abortos, mesmo

na Espanha onde a síndrome da refugagem multissistêmica é amplamente disseminada.

Alguns fatores podem influenciar os resultados dos estudos de freqüência do PCV2

em fetos natimortos, mumificados e abortados. Entre estes, pode-se citar: a técnica utilizada

para detecção dos agentes (KIM et al., 2004; PARK et al., 2005), a seleção dos fetos para o

diagnóstico (PARK et al., 2005), o órgão fetal selecionado para detecção do agente viral

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12




37

(SANCHEZ et al., 2003; KIM et al., 2004; PARK et al., 2005), a idade gestacional

(SANCHEZ et al., 2001) e programas de vacinação para PCV2.

No presente estudo foi utilizado fragmento de coração e pulmão de fetos natimortos e

mumificados de diferentes tamanhos. A concentração do PCV2 e do PVS nos tecidos fetais

varia de acordo com a idade gestacional, bem como, entre órgãos de um mesmo feto, sendo o

coração e o pulmão os órgãos fetais de maior concentração para o PCV2 e o PVS,

respectivamente (SANCHEZ et al., 2001; SANCHEZ et al., 2003; MENGELING et al., 2006;

LEFEVBVRE et al., 2008). Vale ressaltar que PARK et al. (2005) demonstraram que o PCV2

pode causar aborto, entretanto, alguns fetos pode não apresentar lesões histopatológicas bem

como não ser detectado a presença do DNA do PCV2.

Os resultados de detecção do PCV2 neste estudo demonstraram que a transmissão

vertical pode ser uma importante via de infecção. Estudos demonstraram que fetos expostos

ao PCV2 durante a gestação podem nascer vivos e carrear o vírus, entretanto, a manifestação

clínica da síndrome da refugagem multissistêmica nestes leitões não foi determinada

(SANCHEZ et al., 2004). Por outro lado, esta possibilidade não deve ser descartada, uma vez

que em situações experimentais estes leitões podem não ser expostos aos mesmos desafios de

um sistema de produção de suínos. O PCV2 pode ser veiculado por sêmen e oócitos de

reprodutores soropositivos e sem sinais clínicos da síndrome da refugagem multissistêmica

(LAROCHELLE et al., 2000; BIELANSKI et al., 2004; SCHMOLL et al., 2008). GAVA et al

(2008) relataram que o PCV2 pode ser transmitido via sêmen aos fetos durante a gestação.

A detecção do PCV2 nos fetos natimortos e mumificados observada no presente

estudo pode indicar que este vírus seja o causador da morte fetal, entretanto, a metodologia

empregada não permite esta afirmação. Estudos com inoculação experimental, demonstraram

que o PCV2 tem potencial em causar morte embrionária e fetal, podendo haver interrupção da

gestação (SANCHEZ et al., 2001; SANCHEZ et al., 2003; MATEUSEN et al., 2004;

PENSAERT et al., 2004; PARK et al., 2005; MATEUSEN et al., 2007; LEFEVBVRE et al.,

2008; PITTMAN et al., 2008). Técnicas que possibilitem a quantificação viral nos tecidos

fetais, como o PCR em Tempo Real, podem auxiliar na confirmação do PCV2 como

responsável pela morte fetal, uma vez que, as titulações detectadas podem ser comparadas às

titulações virais utilizadas em infecções experimentais com danos ao feto (SANCHEZ et al.,

2003; PARK et al., 2005; LEFEVBVRE et al., 2008). Vale ressaltar que no Brasil, o

parvovírus tem sido o agente infeccioso mais relacionado com transtornos reprodutivos




38

(MORENO et al., 2007), e, no presente estudo, o mesmo foi identificado em apenas nove

(6,2%) das amostras e, mesmo assim, sempre associado com o PCV2.

CONCLUSÃO

O PCV2 foi detectado em 56,5% dos fetos natimortos e mumificados e deve ser

considerado no diagnóstico diferencial de granjas com histórico de falhas reprodutivas.

AGRADECIMENTOS

À equipe do laboratório Microvet pelo apoio para a execução deste estudo.




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