, 2014 - ucy · 4 abstract the aim of this thesis is the pharmacokinetic study of biomarkers in...

ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΒΙΟΔΕΙΚΤΩΝ ΣΕ ΠΟΝΤΙΚΙΑ ΜΕ

ΧΡΗΣΗ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ

από την

Παναγιώτα Κλεάνθους

Υποβάλλεται στο Πανεπιστήμιο Κύπρου ως μερική συμπλήρωση των

απαιτήσεων για την απόκτηση Πτυχίου Ηλεκτρολόγου Μηχανικού

Τμήμα Ηλεκτρολόγων Μηχανικών και Μηχανικών Υπολογιστών

Μάιος, 2014

2

ΦΑΡΜΑΚΟΚΙΝΗΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΒΙΟΔΕΙΚΤΩΝ ΣΕ ΠΟΝΤΙΚΙΑ ΜΕ

ΧΡΗΣΗ ΦΘΟΡΙΣΜΟΥ

από την

Πανααγιώτα Κλεάνθους

Εξεταστική επιτροπή:

Κωνσταντίνος Πίτρης

Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα ΗΜΜΥ, Ακαδημαϊκός Σύμβουλος

Ιούλιος Γεωργίου

Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα ΗΜΜΥ, Μέλος Επιτροπής

Νικολέττα Νικολάου

Ειδικός Επιστήμονας, Τμήμα ΗΜΜΥ, Μέλος Επιτροπής

3

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η φαρμακοκινητική μελέτη

βιοδεικτών σε ποντίκια με χρήση φθορισμού. Κύριος στόχος της φαρμακοκινητικής

μελέτης αποτελεί ο καθορισμός της πορείας του φαρμάκου στο σώμα, από τη στιγμή

χορήγησής του στον οργανισμό μέχρι τη πλήρη απομάκρυνσή του. Η γνώση της

ακριβής συγκέντρωσης του φαρμάκου στους διάφορους ιστούς και όργανα του

οργανισμού κρίνεται σημαντική γιατί με αυτό το τρόπο επιτυγχάνονται τα επιθυμητά

θεραπευτικά επίπεδα. Επίσης μπορεί να γίνει έλεγχος εάν υπερβαίνονται τα όρια

τοξικότητας για τη συγκεκριμένη ουσία. Επομένως κρίνεται απαραίτητη η μελέτη της

φαρμακοκινητικής διαφόρων ουσιών για τη πλήρη κατανόηση της δράσης ενός

φαρμάκου και της αλληλεπίδρασης του με τους επικείμενους ιστούς ώστε να

προταθεί ο αποτελεσματικότερος τρόπος χρήσης του.

Κίνητρο αυτής της διπλωματικής εργασίας αποτέλεσε η ποσοτική αξιολόγηση της

φαρμακοκινητικής ενός νέου φθορίζον μορίου μέσα από τη χρήση εικόνων

φθορισμού. Το μόριο αποτελείτο από μια νέα γενιά εστεροποιημένων ισοπρενοειδών

με χαρακτηριστικά φθορισμού. Έγινε ενδοφλέβια χορήγηση του μορίου σε 5

ποντικούς άγριου τύπου, οι οποίοι θανατώθηκαν. Το παχύ έντερο του κάθε ποντικού

εκτομήθηκε και καταψύχθηκε. Στη συνέχεια κατεψυγμένες τομές του παχέος

εντέρου απεικονίστηκαν με μικροσκόπιο φθορισμού σε 8 διαφορετικές θέσεις, σε δύο

διαφορετικά μήκη κύματος (GFP και Cy3). Αποθηκεύτηκαν εικόνες για τα 15 και 30

λεπτά μετά τη χορήγηση του φαρμάκου καθώς επίσης και για τις 1, 3, 6 και 24 ώρες.

Κάποια τμήματα επίσης χρωματίστηκαν με χρώση H&E. Στη συνέχεια αναπτύχθηκε

ένας αλγόριθμος για να προσδιοριστεί ο συνολικός φθορισμός που υπήρχε στην κάθε

εικόνα αλλά και η χρονική πορεία της απορρόφησης του φθορισμού για το αρχικό

μόριο και το μεταβολίτη. Επιπλέον, η παρατήρηση ότι το μόριο φορτώνεται σε

ενδοκυτταρικά οργανίδια του παχέος εντέρου (πιθανόν στα μιτοχόνδρια) οδήγησε

στην ανάπτυξη ενός νέου αλγορίθμου για τη ποσοτικοποίηση και πάλι της χρονικής

πορείας της απορρόφησης του φθορισμού σε αυτά τα οργανίδια.

4

ABSTRACT

The aim of this thesis is the pharmacokinetic study of biomarkers in mice using

fluorescence. The main aim of Pharmacokinetic study is the determination of the

course of the drug in the body, from the time of administration of the agency until the

complete removal. It is important to know the exact concentration of the drug in

various tissues and organs of the body to achieve the desired therapeutic levels.

Another reason is the check if exceeded toxicity thresholds for the substance.

Therefore it is necessary to study the pharmacokinetics of various substances for the

full understanding of the action of a drug and its interaction with the forthcoming

tissues to suggest the most effective way to use.

The goal of this project was to quantitatively evaluate the pharmacokinetics of a novel

fluorescent theranostic agent from fluorescent microscopy images. The molecule

consisted of a new generation of esterified isoprenoids with fluorescent attributes. The

molecule was injected in wild-type mice which were then euthanized, in groups of 5

animals, at 15 min, 30 min, 1, 3, 6 or 24 hours post-injection. The colon of these mice

was resected and frozen to -80 oC. Frozen sections of the colon were subsequently

imaged with a fluorescent microscope at 8 different sites each at two different

wavelengths (GFP and Cy3). Additional sections were also stained with H&E and

stored digitally. An algorithm was developed to automatically determine the total

fluorescence of the image as well as separate the time course of fluorescence uptake

for the original molecule and its metabolite. In addition, it was observed that the

molecule was preferentially loaded into intracellular organelles in the colon (most

likely mitochondria). The time course and percentage of organelle uptake was also

quantified and using automated image processing algorithms.

5

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ.Κωνσταντίνο Πίτρη, που μου έδωσε την

δυνατότητα να ασχοληθώ με τη παρούσα διπλωματική εργασία. Η βοήθειά και η

καθοδήγησή του κατά τη διάρκεια αυτής της χρονιάς ήταν πολύτιμη για μένα.

Επίσης, θα ήθελα να εκφράσω ένα τεράστιο ευχαριστώ στη ξαδέλφη μου, Μαρία

Πρώτου, η οποία με βοήθησε στην επεξεργασία εικόνων στο PhotoShop. Ακόμη, ένα

μεγάλο ευχαριστώ στη καλύτερη μου φίλη, Όλγα Φιλίππου η οποία αν και μακριά,

μου πρόσφερε ηθική υποστήριξη. Πάνω απ’όλα, είμαι ευγνώμων στους γονείς μου,

Χριστάκη και Νίτσα Κλεάνθους για την αγάπη τους αλλά και την υποστήριξή τους

όλα αυτά τα χρόνια.

6

1 Εισαγωγή ........................................................................................................................... 8

1.1 Ο καρκίνος του παχέος εντέρου και η διάγνωσή του ................................................... 8

1.2 Αντικείμενο διπλωματικής .......................................................................................... 8

1.2.1 Συνεισφορά .......................................................................................................... 9

1.3 Οργάνωση Κειμένου ................................................................................................. 10

2 Θεωρητικό Υπόβαθρο ...................................................................................................... 11

2.1 Φαρμακοκινητική ...................................................................................................... 11

2.2 Φθορισμός ................................................................................................................ 13

2.3 Μικροσκοπία Φθορισμού .......................................................................................... 14

2.4 Ψηφιακή Επεξεργασία Εικόνας ................................................................................. 15

2.4.1 Δυαδικές Εικόνες (binary) .................................................................................. 16

2.4.2 Ασπρόμαυρες Εικόνες (grayscale) ...................................................................... 17

2.4.3 Έγρωμες Εικόνες (RGB)..................................................................................... 17

3 Πειραματική Διαδικασία/Μεθοδολογία ............................................................................ 19

4 Ανάλυση Εικόνας............................................................................................................. 23

4.1 Βασικές Λειτουργίες ................................................................................................. 23

4.1.1 Median Filtering ................................................................................................. 23

4.1.2 Black and White image ....................................................................................... 24

4.1.3 Μορφολογικοί Τελεστές ..................................................................................... 24

4.1.4 Histogram of image data ..................................................................................... 26

4.1.5 Colormap............................................................................................................ 26

4.1.6 Threshold ........................................................................................................... 27

4.1.7 T-test .................................................................................................................. 27

4.1.8 Photoshop ........................................................................................................... 28

4.2 Αναλυτική Διαδικασία .............................................................................................. 29

4.2.1 Διαδικασία εξαγωγής αποτελεσμάτων για ολικό φθορισμό βιοδείκτη και

μεταβολίτη. ................................................................................................................. 29

4.2.2 Διαδικασία εξαγωγής αποτελεσμάτων για τον αριθμό των pixel και τον ολικό φθορισμό ανά συσσώρευση. ........................................................................................ 31

5 Αποτελέσματα-Συμπεράσματα ......................................................................................... 36

5.1 ΟΛΙΚΟΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ ............................................................................................ 36

5.1.1 Επεξήγηση αποτελεσμάτων ................................................................................ 39

5.2 ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ ΣΤΙΣ ΣΥΣΣΩΡΕΥΣΕΙΣ ...................................................................... 42

5.3 PHOTOSHOP ........................................................................................................... 45

6 Επιλογος .......................................................................................................................... 49

6.1 Σύνοψη και Συμπεράσματα ....................................................................................... 49

6.2 Μελλοντικές προεκτάσεις.......................................................................................... 50

7

7 Βιβλιογραφία ................................................................................................................... 51

8 Παράρτημα ...................................................................................................................... 52

8.1 κώδικας 1ος

................................................................................................................ 52


................................................................................................................ 55

8.3 κώδικας 3ος .............................................................................................................. 57


................................................................................................................ 59

8

1 Εισαγωγή

1.1 Ο καρκίνος του παχέος εντέρου και η διάγνωσή του

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι ένας από τους συχνότερους καρκίνους σε

ολόκληρο τον κόσμο. Με τον όρο καρκίνος παχέος εντέρου εννοούμε το κακόηθες

νεόπλασμα το οποίο αναπτύσσεται στο παχύ έντερο ή στο ορθό. Εξειδικευμένες

εξετάσεις μπορούν να γίνουν έτσι ώστε να γίνει πλήρης διάγνωση του καρκίνου όπως

ενδοσκόπηση του παχέος εντέρου (κολονοσκόπηση, ορθοσκόπηση), βαριούχο

υποκλυσμό «διπλής αντιθέσεως», αξονική τομογραφία κοιλίας, μαγνητική

τομογραφία κοιλίας, «εικονική κολονοσκόπηση» και επιβεβαιώνεται με την

ιστολογική εξέταση δειγμάτων του όγκου που λαμβάνονται μέσω των ενδοσκοπίων.

1.2 Αντικείμενο διπλωματικής

Κίνητρο του παρόντος ερευνητικού προγράμματος ήταν η ανακάλυψη καινούργιων

διαγνωστικών που στόχο έχουν την ενδοσκόπηση με χρήση φθορισμού για τη

διάγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Σημαντικός στόχος της έρευνας ήταν

κατά πόσο μπορεί να γίνει η διάγνωση του καρκίνου στην περίπτωση που είναι ακόμη

σε πρώιμο στάδιο. Για την επίτευξη αυτού του στόχου κρίθηκε απαραίτητη η

φαρμακοκινητική μελέτη ενός νεόυ μορίου με χαρακτηριστικά φθορισμού.

Σημαντικοί παράγοντες που επηρεάζουν τις φαρμακοκινητικές μελέτες και πρέπει να

ληφθούν υπόψη και να αξιολογηθούν είναι η βιοσυμβατότητα των φαρμάκων, η

κινητικότητα της δραστικής ουσίας, η ικανότητα της να διαπερνά τους διάφορους

βιολογικούς ιστούς, ο χρόνος που παραμένει η ουσία ενεργή αλλά και ο αστάθμητος

παράγοντας “ασθενής”. Συνεπώς, κρίνεται απαραίτητη η μελέτη της

φαρμακοδυναμικής και φαρμακοκινητικής των διάφορων ουσιών για να κατανοηθεί η

δράση ενός φαρμάκου και η αλληλεπίδρασή του με επικείμενους ιστούς ώστε να

προταθεί ο αποτελεσματικότερος τρόπος χρήσης του. Το πρώτο βήμα για να

9

καθοριστεί ένας ρεαλιστικός μηχανισμός μεταφοράς μιας φαρμακευτικής ουσίας σε

έμβιο οργανισμό είναι ο καθορισμός της συγκέντρωσής της στους διάφορους ιστούς.

Είναι προφανές ότι τέτοιου είδους πειράματα είναι δύσκολο να πραγματοποιηθούν

απευθείας στον άνθρωπο. Στο στάδιο αυτό είναι αναπόφευκτή η χρήση

πειραματόζωων.

Στο παρόν ερευνητικό πρόγραμμα χρησιμοποιήθηκαν μικρά ποντίκια άγριου τύπου

στα οποία έγινε ενδοφλέβια χορήγηση του φαρμάκου και μετά ευθανασία.

Κατεψυγμένες τομές του παχέος εντέρου απεικονίστηκαν με μικροσκόπιο φθορισμού

σε διάφορες χρονικές στιγμές μετά τη χορήγηση του φαρμάκου. Ακολούθησε

επεξεργασία και ανάλυση των εικόνων φθορισμού σε περιβάλλον ‘ΜΑΤΛΑΒ’ για

εξαγωγή ποσοτικών μετρήσεων του φθορισμού με στόχο την ανάλυση αυτών που

αναφέρθηκαν προηγουμένως. Δηλαδή, της πορείας που ακολουθεί το φάρμακο από

τη στιγμή χορήγησής του στον οργανισμό μέχρι την απομάκρυνσή του και σε ποια

ενδοκυτταρικά οργανίδια του παχέος εντέρου αυτό συγκεντρώνεται. Όπως

αναφέρθηκε και πριν ο καθορισμός της πορείας της ουσίας στον οργανισμό αποτελεί

τον κύριο σκοπό των φαρμακοκινητικών μελετών ώστε να επιτευχθούν τα επιθυμητά

θεραπευτικά επίπεδα.

1.2.1 Συνεισφορά

Η συνεισφορά της διπλωματικής συνοψίζεται ως εξής:

1. Ενδοφλέβια χορήγηση φαρμάκου σε ποντίκια άγριου τύπου

2. Εκτομή και κατάψυξη παχέος εντέρου

3. Απεικόνιση τομών με μικροσκόπιο φθορισμού σε διάφορες χρονικές στιγμές

μετά τη χορήγηση του φαρμάκου.

4. Υλοποίηση τεσσάρων αλγορίθμων για εξαγωγή ποσοτικών μετρήσεων του

φθορισμού

5. Αξιολόγηση των αλγορίθμων και ανάλυση των αποτελεσμάτων

10

1.3 Οργάνωση Κειμένου

Στο κεφάλαιο 2 παρουσιάζεται το θεωρητικό υπόβαθρο της διπλωματικής εργασίας.

Ολόκληρη η πειραματική διαδικασία καθώς και η μεθοδολογία που ακολουθήθηκε

παρατίθενται στο κεφάλαιο 3. Το κεφάλαιο 4 συζητά τις βασικές λειτουργίες που

σχετίζονται με την ανάλυση εικόνας καθώς και την επεξήγηση των αλγορίθμων που

αναπτύχθηκαν. Στο κεφάλαιο 5 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα και τα

συμπεράσματα της διπλωματικής. Στο κεφάλαιο 6 γίνεται μια μικρή σύνοψη

ολόκληρης της διαδικασίας καθώς και τυχόν μελλοντικών προεκτάσεων. Στη

συνέχεια ακουλουθεί παράρτημα με τους τέσσερις αλγόριθμους που αναπτύχθηκαν.

Η εργασία αυτή κλείνει με το κεφάλαιο 8 όπου παρουσιάζεται η βιβλιογραφία.

11

2 Θεωρητικό Υπόβαθρο

Οι ιδιότητες της βιοκατανομής και της φαρμακοκινητικής παίζουν καθοριστικό ρόλο

στην αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια που χρειάζεται για τη θεραπεία με ένα

συγκεκριμένο φάρμακο.

2.1 Φαρμακοκινητική

Οι φαρμακοκινητικές μελέτες είναι πολύ σημαντικό μέρος της έρευνας στη

δημιουργία καινούργιων διαγνωστικών ή/και θεραπευτικών ουσιών και αυτό γιατί

μετά τη χορήγηση ενός φαρμάκου, είναι αναγκαίο να γνωρίζουμε τη συγκέντρωσή

του, στους διάφορους ιστούς και όργανα του οργανισμού, για να ελέγχεται αν

επιτυγχάνονται τα επιθυμητά θεραπευτικά επίπεδα ή ακόμα και αν υπερβαίνονται τα

όρια τοξικότητας για τη συγκεκριμένη ουσία. Κύριο αντικείμενο των

φαρμακοκινητικών μελετών είναι ο καθορισμός της πορείας που ακολουθούν τα

φάρμακα στο σώμα, από τη στιγμή της χορήγησης μέχρι την πλήρη απομάκρυνση

τους από τον οργανισμό. Βασικός στόχος κάθε φαρμακευτικής αγωγής είναι η

ασφαλής χρήση των χημικών ουσιών έτσι ώστε να ελαχιστοποιούνται οι

ανεπιθύμητες ενέργειες αλλά και να αντιμετωπίζονται αποτελεσματικά ασθένειες στο

συντομότερο δυνατό χρονικό διάστημα.

Ανάλογα με το δραστικό συστατικό και την χρήση του, θα πρέπει να μελετηθούν τα

ακόλουθα στοιχεία:

1. Απελευθέρωση του δραστικού συστατικού από την δοσολογική μορφή

2. Απορρόφηση

3. Κατανομή

4. Μεταβολισμός και χημική αποικοδόμηση.

5. Αποβολή του προϊόντος (απέκκριση)

12

Στην παρακάτω εικόνα φαίνεται η πορεία που ακολουθεί το δραστικό συστατικό από

την στιγμή που αυτό θα χορηγηθεί στον οργανισμό.

Εικόνα 1. Πορεία δραστικού συστατικού στον οργανισμό

Οι βασικοί μηχανισμοί που περιγράφουν τη φαρμακοκινητική μιας ουσίας

συνοδεύονται και από δευτερεύουσες ενέργειες όπως ανάμειξη της ουσίας με τα

δακρυϊκά υγρά και αραίωση λόγω της φυσιολογικής παραγωγής δακρύων, ιονισμό,

πρωτεϊνική αλληλεπίδραση κ.α. Οι παραπάνω μηχανισμοί αναδεικνύουν την

πολυπλοκότητα του συστήματος μεταφοράς φαρμακευτικών ουσιών στα διάφορα

όργανα.

Η μελέτη της φαρμακοκινητικής γίνεται σε ζώα, υπό σαφώς ελεγχόμενες και

καθορισμένες συνθήκες. Τα είδη των ζώων, η ηλικία και το φύλο ορίζονται από την

αρχή. Η μελέτη μπορεί να γίνει με την μέθοδο της δειγματοληψίας. Κατά την

διαδικασία της δειγματοληψίας θα πρέπει να επιλέγονται κατάλληλα βιολογικά υγρά

όπως είναι το πλάσμα, το αίμα, ο ορρός και τα ούρα. Επίσης θα πρέπει να επιλέγονται

κατάλληλοι βιολογικοί ιστοί. Το πλάσμα θεωρείται το καταλληλότερο βιολογικό

υγρό για τέτοιες μελέτες. Έτσι πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή στο χώρο

συλλογής του αίματος, στην διαδικασία δειγματοληψίας, στο υλικό που

χρησιμοποιείται για την δειγματοληψία, στα σωληνάρια, στο αντιπηκτικό υγρό και

στις συνθήκες φυγοκέντρησης για την απόκτηση του πλάσματος.

13

Η συγκέντρωση του δραστικού συστατικού θα πρέπει να προσδιοριστεί

χρησιμοποιώντας μια κατάλληλη και επικυρωμένη αναλυτική μέθοδο. Η εξειδίκευση,

η ακρίβεια, καθώς και η ακρίβεια της αναλυτικής μεθόδου θα πρέπει να περιγραφούν

πλήρως. Η χρήση μιας χημικής μεθόδου διαδικασίας είναι προτιμότερη, ωστόσο η

συγκέντρωση του δραστικού συστατικού μπορεί να γίνει και με φυσικές ή βιολογικές

μεθόδους. Μια από αυτές τις μεθόδους είναι η ποσοτικοποίηση με χρήση φθορισμού.

2.2 Φθορισμός

Ο φθορισμός είναι η διαδικασία κατά την οποία η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία

αφού απορροφηθεί από ένα μόριο επανεκπέμπεται σε μεγαλύτερο μήκος κύματος. Τα

μόρια του στοιχείου απορροφούν ενέργεια με την μορφή ηλεκτρομαγνητικής

ακτινοβολίας, φωτονίων και διεγείρονται. Δηλαδή ηλεκτρόνια φεύγουν από κάποια

εσωτερική τροχιά και μεταβαίνουν σε κάποια άλλη μακριά από τον πυρήνα. Όταν τα

ηλεκτρόνια επιστρέφουν στην κανονική τους κατάσταση αποβάλλουν ένα φωτόνιο

στην περιοχή του ορατού φωτός. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται αποδιέγερση. Κατά

τη διαδικασία αυτή, από την διεγερμένη κατάσταση πίσω στην κανονική χάνεται

δονητική ενέργεια. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα το φάσμα εκπομπής να μετατοπίζεται

σε μεγαλύτερα μήκη κύματος. Το μήκος κύματος μεταβάλλεται αντιστρόφως

ανάλογα με την ακτινοβολία ενέργειας. Επομένως, όταν η ηλεκτρομαγνητική

ακτινοβολία που απορροφάται είναι έντονη, ένα ηλεκτρόνιο μπορεί να απορροφήσει

δύο φωτόνια, άρα η εκπομπή ακτινοβολίας θα έχει μικρότερο μήκος κύματος από την

ακτινοβολία που απορροφάται.

Στην πιο κάτω εικόνα φαίνονται οι καμπύλες της εκπομπής απορρόφησης και του

φάσματος εκπομπής. Η καμπύλη φάσματος εκπομπής είναι μια κατοπτρική εικόνα

της καμπύλης της απορρόφησης με τη διαφορά ότι η πρώτη μετατοπίζεται σε

μεγαλύτερα μήκη κύματος.

14

Εικόνα 2. Καμπύλη εκπομπής απορρόφησης και φάσματος εκπομπής

2.3 Μικροσκοπία Φθορισμού Η μικροσκοπία φθορισμού είναι μια πολύ χρήσιμη μέθοδος μελέτης υλικών. Το

μικροσκόπιο φθορισμού επινοήθηκε στις αρχές του εικοστού αιώνα και είναι ένα

σημαντικό εργαλείο στην βιολογία και την επιστήμη των υλικών. Έχει ιδιότητες που

δεν είναι άμεσα διαθέσιμες σε άλλες τεχνικές οπτικής μικροσκοπίας. Το μικροσκόπιο

φθορισμού μπορεί να ανακαλύψει την παρουσία ενός και μόνο μορίου φθορισμού. Η

βασική λειτουργία ενός μικροσκοπίου φθορισμού είναι η ακτινοβολία του δείγματος

σε μία επιθυμητή και συγκεκριμένη ζώνη μήκους κύματος, και στη συνέχεια να

διαχωρίσει το ασθενέστερο εκπεμπόμενο φθορισμό από το φως της διέγερσης. Ένα

μικροσκόπιο φθορισμού αποτελείται από μια πηγή φωτός (light source), το φίλτρο

διέγερσης (excitation filter), τον διχροϊκό καθρέπτη (dichroic mirror) και το φίλτρο

εκπομπής (emission filter). Στην πλειοψηφία τα μικροσκόπια φθορισμού που

χρησιμοποιούνται ευρέως στον τομέα της βιολογίας είναι τα μικροσκόπια

επιφθορισμού. Ένα τέτοιο μικροσκόπιο φαίνεται στο πιο κάτω σχήμα.

Εικόνα 3. Μικροσκόπιο Φθορισμού

15

Το μήκος κύματος του φωτός διέγερσης, εστιάζεται στο δείγμα μέσω του

αντικειμενικού φακού. Ο φθορισμός που εκπέμπεται από το δείγμα είναι εστιασμένος

στον ανιχνευτή (detector), από τον ίδιο στόχο που χρησιμοποιήθηκε για την διέγερση.

Δεδομένου ότι το μεγαλύτερο μέρος του φωτός διέγερσης μεταδίδεται μέσω του

δείγματος , μόνο αντικατοπτρικό διεγερτικό φως φθάνει το στόχο μαζί με το

εκπεμπόμενο φως και με την μέθοδο επιφθορισμού δίνεται επομένως ένας λόγος

υψηλού σήματος προς θόρυβο . Ένα επιπρόσθετο φίλτρο φραγμού μεταξύ του στόχου

και του ανιχνευτή μπορεί να φιλτράρει το υπόλοιπο φως διέγερσης από το φως

φθορισμού .

2.4 Ψηφιακή Επεξεργασία Εικόνας

Η σύγχρονη επιστήμη χαρακτηρίζεται από τη συλλογή μεγάλων όγκων δεδομένων

από διάφορους αισθητήρες και διαφορετικές πηγές. Αυτά τα δεδομένα

αποθηκεύονται σε ψηφιακή μορφή και πρέπει να αναλυθούν. Μετα από μια

εκτεταμένη πειραματική εργασία, η ανάλυση αποτελεσμάτων κρίνεται σημαντική.

Επομένως η επεξεργασία εικόνας είναι η μέθοδος με την οποία μπορεί να αποδειχθεί

η εγκυρότητα των υποθέσεων που έχουν γίνει για ένα δεδομένο πρόβλημα

Μια εικόνα μπορεί να οριστεί ως μια δισδιάστατη συνάρτηση f(x, y). Μια ψηφιακή

εικόνα αποτελείται από ένα πεπερασμένο αριθμό στοιχείων τα οποία έχουν

συγκεκριμένη τοποθεσία και αξία. Τα στοιχεία αυτά είναι ευρέως γνωστά ως pixels.

Οι μηχανές απεικόνισης καλύπτουν σχεδόν όλο το ηλεκτρομαγνητικό φάσμα σε

αντίθεση με τους ανθρώπους οι οποίοι περιορίζονται μόνο στην ορατή του ζώνη.

Μπορούν ακόμα να δημιουργήσουν εικόνες από άλλες πηγές όπως για παράδειγμα ο

υπέρηχος και το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο.

Υπάρχουν τρεις τύποι επεξεργασίας εικόνων. Χαμηλό, μεσαίο και υψηλό επίπεδο

επεξεργασίας. Στο χαμηλό επίπεδο επεξεργασίας τόσο η είσοδος όσο και η έξοδος

είναι εικόνες. Περιλαμβάνει επεξεργασία εικόνας για μείωση θορύβου, αύξηση

αντίθεσης, όξυνσης, σκίασης, κλπ. Στο μεσαίο επίπεδο περιλαμβάνεται η κατάτμηση

της εικόνας, η μείωσή της σε κατάλληλη μορφή για μηχανογραφική επεξεργασία και

η ταξινόμηση των επιμέρους αντικειμένων. Χαρακτηρίζεται από το γεγονός ότι η

16

είσοδος είναι εικόνα ενώ η έξοδος είναι χαρακτηριστικά από τις εικόνες (άκρα,

περίγραμμα και ταυτότητα των επιμέρους αντικειμένων). Στο υψηλό επίπεδο υπάρχει

το γενικό σύνολο των αναγνωρισμένων αντικειμένων και στη συνέχεια εκτελούνται

γνωστικές λειτουργίες που συνδέονται με την ανθρώπινη όραση. Επομένως, η

επεξεργασία ψηφιακής εικόνας περιλαμβάνει διαδικασίες όπου είσοδοι και έξοδοι

είναι εικόνες αλλά και περιπτώσεις όπου εξάγονται κάποια χαρακτηριστικά της

εικόνας.

Τύποι Ψηφιακών Εικόνων

Το MATLAB υποστηρίζει τρεις βασικούς τύπους εικόνων:

Δυαδικές εικόνες (binary)

Ασπρόμαυρες εικόνες (grayscale)

Έγχρωμες εικόνες (RGB)

2.4.1 Δυαδικές Εικόνες (binary)

Σε μια δυαδική εικόνα κάθε pixel μπορεί να πάρει μια από τις δύο διακριτές τιμές (0

ή 1). Η τιμή 0 αντιστοιχεί στο μαύρο χρώμα ενώ το 1 στο λευκό. Επομένως μια

δυαδική εικόνα μπορεί να αποθηκεύτεί ως ένας δισδιάστατος πίνακας μηδενικών και

μονάδων. Μια δυαδική εικόνα ονομάζεται και μάσκα. Στην παρακάτω εικόνα

φαίνεται ένα παράδειγμα ενός pixel δυαδικής εικόνας όπου παίρνει τιμές 0 και 1.

Εικόνα 4. Δυαδική εικόνα

17

2.4.2 Ασπρόμαυρες Εικόνες (grayscale)

Μια ασπρόμαυρη εικόνα ή αλλιώς εικόνα έντασης φωτεινότητας είναι ένας πίνακας

δεδομένων του οποίου οι τιμές των στοιχειών αναπαριστούν την ένταση της

φωτεινότητας κάθε pixel. Το MΑΤΛΑΒ αποθηκεύει μια εικόνα έντασης σε ένα

δισδιάστατο πίνακα. Οι τιμές του πίνακα αναπαριστούν διάφορες εντάσεις

φωτεινότητας στο επίπεδο του γκρι. Η τιμή 0 αναπαριστά το μαύρο και η τιμή 255 το

λευκό. Ένα pixel έχει τιμή φωτεινότητας στο διάστημα [0,255]. Πιο κάτω

παρουσιάζεται ένα pixel μιας grayscale εικόνας κανονικοποιημένο στο διάστημα

[0,1].

Εικόνα 5. Ασπρόμαυρη (grayscale) εικόνα

2.4.3 Έγρωμες Εικόνες (RGB)

Μια έγχρωμη εικόνα αποθηκεύεται στο MATLAB ως ένας πίνακας δεδομένων

MxNx3, ο οποίος καθορίζει τρία χρώματα κάθε pixel (κόκκινο, πράσινο, μπλε). Κάθε

pixel έχει μία τιμή χρώματος , και το χρώμα περιγράφεται με βάση το ποσοστό που

περιέχει σε κόκκινο(Red), μπλε(Blue) και πράσινο (Green) . Κάθε ένα από αυτά τα

RGB στοιχεία μπορεί να πάρει τιμή 0-255 (2563 =16,777,216 διαφορετικά πιθανά

χρώματα στην εικόνα)

Ουσιαστικά μια εικόνα RGB δημιουργείται από την σύνθεση τριών grayscale

εικόνων. Κάθε μια από τις τρεις εικόνες αναπαριστά την ένταση της φωτεινότητας

των pixels για το κόκκινο, το πράσινο και το μπλε.

18

(0,0,0) μαύρο

(1,1,1) λευκό

(1,0,0) κόκκινο

Εικόνα 6 . Οι συνιστώσες χρώματος

Εικόνα 7. Έγχρωμη εικόνα

19

3 Πειραματική Διαδικασία/Μεθοδολογία

Για τη μελέτη της φαρμακοκινητικής των βιοδεικτών χρησιμοποιήθηκε πληθυσμός

29 ποντικιών χωρίς μεταλλάξεις (wild type) τα οποία χωρίστηκαν σε 6 ομάδες (5

ομάδες των 5 και μια των 4) και ακολουθήθηκε η πιο κάτω διαδικασία:

1. Στα ποντίκια χορηγήθηκε ενδοφλέβια ποσότητα του βιοδείκτη 50 mg ανά kg

βάρους.

2. Τα ζώα θανατώθηκαν σε συγκεκριμένο χρόνο από την χορήγηση του

βιοδείκτη: 15 λεπτά, 30 λεπτά, 1 ώρα, 3 ώρες, 6 ώρες, και 24 ώρες.

3. Το ήπαρ, παχύ έντερο, σπλήνα, πνεύμονες, και εγκέφαλος αφαιρέθηκαν και

αποθηκεύθηκαν αμέσως σε ξηρό πάγο (dry ice).

4. Τομές των διαφόρων οργάνων από γρήγορη ιστολογία (frozen sections)

μελετήθηκαν σε μικροσκόπιο φθορισμού και εικόνες φθορισμού

αποθηκεύθηκαν σε ασυμπίεστη μορφή (TIFF.) Έγινε απεικόνιση σε 2

διαφορετικά μήκη κύματος (GFP και Cy3 filter sets) από 5 διαφορετικές

περιοχές από κάθε όργανο του κάθε ζώου με φακό 4x. Στη περίπτωση του

παχεος εντέρου, που είναι και το αντικείμενο του παρόντος ερευνητικού

προγράμματος, έγινε επιπρόσθετη απεικόνιση με μεγέθυνση 10x.

5. Έγινε επίσης ιστοπαθολογική εξέταση με χρώση H&E για να διαπιστωθεί η

ακεραιότητα του ιστού.

Μετά την πιο πάνω διαδικασία ακολούθησε ανάλυση των εικόνων στον

υπολογιστή για εξαγωγή ποσοτικών αποτελεσμάτων. Για το σκοπό αυτό

δημιουργήθηκε ειδικό λογισμικό, σε περιβάλλον MATLAB, για αυτοματοποίηση

της διαδικασίας και εξαγωγή των αποτελεσμάτων όπως πιο κάτω:

20

1. Κατάτμηση της κάθε εικόνας σε περιοχή ιστού και άδεια περιοχή με

χρήση αλγορίθμων κατωφλίωσης.

2. Διαχωρισμός της εικόνας GFP σε κόκκινο(R) και πράσινο (G) μέρος. Το

μπλε (B) μέρος περιείχε μόνο θόρυβο.

3. Μέτρηση του ολικού φθορισμού και κανονικοποίηση με βάση τη πιο πάνω

μέτρηση σε ποσότητα φθορισμού ανά εικονοστοιχείο ιστού (fluorescence /

tissue pixel).

4. Δημιουργήθηκαν γραφικές παραστάσεις του φθορισμού ως προς τον

χρόνο.

5. Μια και ο βιοδείκτης σε σχέση με το μεταβολισμένο παράγωγο του έχουν

διαφορετικό φθορισμό (το παράγωγο είναι μετατοπισμένο σε μεγαλύτερα

μήκη κύματος) διαχωρίστηκαν οι γραφικές παραστάσεις σε φθορισμό

βιοδείκτη και φθορισμό μεταβολίτη με προσαρμογή καμπύλης και

αφαίρεση

Για το βιοδείκτη: Ολική GFP – R

Για το μεταβολίτη: GFP-G - GFP-R

Στην συνέχεια παίρνοντας τα αποτελέσματα από την πιο πάνω διαδικασία

διαπιστώθηκε ότι το φάρμακο μαζεύεται γύρω στα 15 λεπτά στο παχύ έντερο όπου

και ακολουθεί μια ανοδική πορεία μέχρι και τις τρεις ώρες. Μετά τις τρεις ώρες

αρχίζει η κάθοδος όπου μέχρι και τις έξι ώρες το φάρμακο απεκκρίνεται από τον

οργανισμό. Το φάρμακο μαζεύεται με την μορφή μικρών συσσωρεύσεων στα

διάφορα κυτταρικά οργανίδια του παχέος εντέρου του ποντικού. Έτσι ακολούθησε

μια άλλη διαδικασία σε περιβάλλον MATLAB και πάλι για να βρεθεί ο αριθμός των

pixel και ο ολικός φθορισμός που υπάρχουν σε αυτές τις συσσωρεύσεις .

21

1. Σαν πρώτο στάδιο έπρεπε να αποφασιστεί για κάθε μια από τις τρεις χρονικές

στιγμές που κρίθηκαν σημαντικές (15 λεπτά, 1 ώρα, 3 ώρες), ποια χρώματα

έπρεπε να προστεθούν και ποια να αφαιρεθούν από την κάθε εικόνα. Για να

επιτευχθεί το καλύτερο δυνατό αποτέλεσμα, ελέχθησαν ξεχωριστά οι εικόνες

των τριών χρονικών στιγμών.

2. Η κάθε εικόνα πολλαπλασιάστηκε με ένα διαφορετικό threshold για τις τρεις

διαφορετικές χρονικές στιγμές.

3. Ακολούθως έγινε μετατροπή της πιο πάνω εικόνας σε δυαδική εικόνα.

4. Έγινε μέτρηση του φθορισμού στις συσσωρεύσεις και κανονικοποίηση με

βάση τη πιο πάνω μέτρηση σε ποσότητα φθορισμού στις κουκκίδες ανά

εικονοστοιχείο ιστού (fluorescence / tissue pixel).

5. Έγινε μέτρηση του αριθμού των pixel σε κάθε συσσώρευση

6. Δημιουργήθηκαν γραφικές παραστάσεις του αριθμού των pixels και του

ολικού φθορισμού στις συσσωρεύσεις.

Η σημαντική παρατήρηση ότι ο μεγαλύτερος αριθμός συσσωρεύσεων μαζεύεται στο

παχύ έντερο γύρω στις τρεις ώρες μετά την χορήγηση του φαρμάκου οδήγησε σε νέα

διαδικασία εύρεσης των κυτταρικών οργανιδίων στα οποία βρίσκεται μαζεμένος ο

ολικός φθορισμός. Για την επίτευξη αυτού του στόχου χρησιμοποιήθηκαν τομές από

την ιστοπαθολογική εξέταση που έγινε. Με την βοήθεια του μικροσκοπίου και

έχοντας τις εικόνες των πέντε διαφορετικών ποντικών στις 3 ώρες έγινε ταυτοποίηση

των εικόνων. Δηλαδή για τον κάθε ποντικό βρέθηκε μια τομή από την

ιστοπαθολογική εξέταση η οποία ταίριαζε σχεδόν απόλυτα στην αυθεντική εικόνα.

Το να ταιριάξει απόλυτα μια τομή με μια από τις εικόνες ήταν αρκετά δύσκολο για

τον λόγο ότι αρκετές από τις τομές που είχαμε στην διάθεσή μας καταστράφηκαν με

την πάροδο του χρόνου.

22

Στο τελικό στάδιο έγινε προσπάθεια να ταιριάξουν ακριβώς οι δύο εικόνες που

βρέθηκαν πιο πάνω για τον κάθε ποντικό μαζί με μια τρίτη εικόνα. Στην τρίτη εικόνα

απεικονίζονταν μόνο οι κουκκίδες χρωματισμένες άσπρες ενώ το υπόλοιπο φόντο

ήταν χρωματισμένο μαύρο. Με την βοήθεια του προγράμματος Photoshop έγινε

ταυτοποίηση των τριών εικόνων με το να μπει η μια εικόνα πάνω από την άλλη.

Στόχος ήταν να βρεθούν τα κυτταρικά οργανίδια στο παχύ έντερο του ποντικού, στο

οποίο μαζεύεται το φάρμακο.

23

4 Ανάλυση Εικόνας

Η ανάλυση κάθε εικόνας για τους πέντε διαφορετικούς ποντικούς στις οχτώ λήψεις

που πάρθηκαν αποτέλεσε το μεγαλύτερο αλλά και το πιο σημαντικό κομμάτι αυτού

του ερευνητικού προγράμματος. Μέσα από την ανάλυση που έγινε με την βοήθεια

του προγράμματος MATLAB αλλά και του Photoshop για το τελευταίο στάδιο του

πειράματος εξάχθηκαν σημαντικά αποτελέσματα όσον αφορά τον φθορισμό του

φαρμάκου στο παχύ έντερο του ποντικού. Δηλαδή απαντήθηκαν ερωτήματα τα οποία

είναι απαραίτητο να γνωρίζει κάποιος πριν τη χορήγηση ενός φαρμάκου σε ένα

ασθενή. Τέτοια πραδείγματα είναι μετά από πόσες ώρες χορήγησης του φαρμάκου

στον οργανισμό αρχίζει η δράση του και σε πόσες ώρες το φάρμακο αποβάλλεται από

τον οργανισμό.

4.1 Βασικές Λειτουργίες

Σε αυτό το στάδιο θα γίνει ανάλυση των βασικών λειτουργιών που

χρησιμοποιήθηκαν κατά την διαδικασία εξαγωγής των αποτελεσμάτων.

4.1.1 Median Filtering

Είναι συχνά επιθυμητό να εκτελείται μείωση του θορύβου σε μια εικόνα ή σήμα κατά

την επεξεργασία σήματος. Το ‘median filtering’ είναι μια γραμμική τεχνική

φιλτραρίσματος, που κυρίως χρησιμοποιείται για αφαίρεση θορύβου. Η μείωση του

θορύβου είναι σημαντική προϋπόθεση και αποτελεί ένα βήμα προ-επεξεργασίας ώστε

να βελτιωθούν τα αποτελέσματα της μετέπειτα επεξεργασίας. Για παράδειγμα είναι

σημαντικό να αφαιρεθεί ο θόρυβος από μια εικόνα ανίχνευση των ακμών της. Στην

επεξεργασία εικόνας αυτή η τεχνική είναι ευρέως διαδεδομένη για τον λόγο ότι

μειώνει το θόρυβο αλλά ταυτόχρονα διατηρεί τις ακμές της εικόνας.

24

4.1.2 Black and White image

Οι μαυρόασπρες εικόνες δεν είναι συνήθως εικόνες με έντονη αντίθεση μαύρου-

άσπρου. Γίνεται συνδυασμός των δύο αυτών χρωμάτων συνεχώς, παράγωντας μια

σειρά από αποχρώσεις του γκρι. Ουσιαστικά μια ασπρόμαυρη εικόνα αποτελεί ένα

πίνακα δεδομένων,του οποίου οι τιμές του αναπαριστούν την ένταση της

φωτεινότητας.

Εικόνα 8. Μετατροπή εικόνας σε ασπρόμαυρη

4.1.3 Μορφολογικοί Τελεστές

Μια άλλη μέθοδος για την επεξεργασία δυαδικών ή grayscale εικόνων είναι οι

μορφολογικοί τελεστές οι οποίοι χρησιμοποιούν τη γεωμετρία. Η αρχή λειτουργία

τους βασίζεται στη χρήση δομικών στοιχείων (structure element). Οι μορφολογικοί

τελεστές επεξεργάζονται μια εικόνα εφαρμόζοντας το δομικό στοιχείο σε αυτή. Τα

δομικά στοιχεία μπορεί να είναι αυθαίρετου μεγέθους και σχήματος. Ακολουθεί ένας

πίνακας με τα βασικά δομικά στοιχεία.

25

Πίνακας 1. Μορφολογικοί Τελεστές

Οι μορφολογικοί τελεστές παίρνουν σαν είσοδο μια εικόνα, εφαρμόζουν σε αυτή ένα

τελεστή και επιστρέφουν την επεξεργασμένη εικόνα σαν έξοδο. Η εικόνα εξόδου έχει

τις ίδιες διαστάσεις με την αρχική. Η τιμή των pixel στην εικόνα εξόδου βασίζεται

στην σχέση του pixel εισόδου και του γειτονικού του.

Βασικοί μορφολόγικοί τελεστές αποτελούν οι erosion, dilation, opening και closing.

Στην παρούσα πτυχιακή εργασία για τη ανάλυση των εικόνων σε περιβάλλον

MATLAB χρησιμοποιήθηκαν οι τελεστές opening και closing καθώς επίσης και το

δομικό στοιχείο ‘disk’. Επιπρόσθετα ανάλογα με την μορφή του σχήματος

καθορίζονται και οι διάφοροι παράμετροι. Για την συγκεκριμένη περίπτωση

καθορίστηκε και η ακτίνα του.

Open Image: Εκτελέι μορφολογικό άνοιγμα μιας δυαδικής ή grayscale εικόνας

με ένα δομικό στοιχείο. Το μορφολογικό άνοιγμα (opening) είναι ουσιαστικά

μια διάβρωση (erosion) που ακολουθείται από μια διαστολή (dilation),

χρησιμοποιώντας το ίδιο διαρθρωτικό στοιχείο και για τις δύο λειτουργίες.

Close Image: Πραγματοποιείται η αντίθετη λειτουργία από το άνοιγμα

εικόνας. Δηλαδή, εκτελεί μορφολογικό κλείσιμο της δυαδικής ή grayscale

εικόνας με το δομικό στοιχείο. Σε αυτή την περίπτωση όμως η λειτουργία του

‘closing’ εκτελεί διαστολή (dilation) που ακολουθείται από διάβρωση

(erosion) χρησιμοποιώντας και πάλι το ίδιο δομικό στοιχείο.

Επίπεδα Δομικά Στοιχεία

'arbitrary' 'pair'

'diamond' 'periodicline'

'disk' 'rectangle'

'line' ' square'

'octagon'

http://www.mathworks.com/help/images/ref/strel.html#bqkf9bn

http://www.mathworks.com/help/images/ref/strel.html#bqkf9c7

http://www.mathworks.com/help/images/ref/strel.html#bqkf9jz

http://www.mathworks.com/help/images/ref/strel.html#bqkf9kd

http://www.mathworks.com/help/images/ref/strel.html#bqkf9dn

http://www.mathworks.com/help/images/ref/strel.html#bqkf9dy

http://www.mathworks.com/help/images/ref/strel.html#bqkf9de

http://www.mathworks.com/help/images/ref/strel.html#bqkf9d3

http://www.mathworks.com/help/images/ref/strel.html#bqkf9da

26

4.1.4 Histogram of image data

Ιστόγραμμα εικόνας είναι ένα είδος ιστογράμματος που λειτουργεί ως μια γραφική

αναπαράσταση της κατανομής των επιπέδων αποχρώσεων σε μια ψηφιακή εικόνα. Η

εντολή ‘imhist’ χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί το ιστόγραμμα για την ένταση

της κάθε εικόνας.

4.1.5 Colormap

To ‘color mapping’ είναι μια συνάρτηση που μετασχηματίζει τα χρώματα μιας

εικόνας-πηγής στα χρώματα μιας άλλης εικόνας-στόχου. Ουσιαστικά είναι ένας

αλγόριθμος μετατροπής χρωμάτων. Μερικές φορές αποκαλείται και ως μεταφορά

χρωμάτων ή όταν εμπλέκονται εικόνες σε κλίμακα του γκρι, συνάρτηση μεταφοράς

φωτεινότητας. Υπηρετεί δύο κύριους σκοπούς, βαθμονόμηση των χρωμάτων και

προσαρμογή των χρωμάτων δύο εικόνων για οπτική συμβατότητα. Πιο κάτω

παρουσιάζεται ο χάρτης χρωμάτων.

Εικόνα 9. Χάρτης Χρωμάτων

27

Για το παρόν ερευνητικό πρόγραμμα χρησιμοποιήθηκε η εντολή colormap(gray) σε

περιβάλλον MATLAB. Ακολουθεί ένα παράδειγμα για την πλήρη κατανόηση της

εντολής αυτής. Αριστερά παρουσιάζεται η κανονική εικόνα ενώ στα δεξιά

απεικονίζεται η εικόνα σε γκρι χρώματα.

Εικόνα 10. Παράδειγμα εκτέλεσης εντολής ‘color map’

4.1.6 Threshold

Το ‘thresholding’ είναι η απλούστερη μέθοδος για τη κατάτμηση εικόνας. Μπορεί να

μετατρέψει μια ασπρόμαυρη εικόνα σε δυαδική εικόνα. Στο παρόν ερευνητικό

πρόγραμμα χρησιμοποιήθηκε η εντολή ‘graythresh’ η οποία υπολογίζει ένα

παγκόσμιο κατώφλι το οποίο μετατρέπει την εικόνα σε δυαδική. Η λειτουργία

‘graythresh’ χρησιμοποιεί τη μέθοδο Otsu. Αυτή η μέθοδος επιλέγει ένα κατώφλι για

να ελαχιστοποιήσει τη διακύμανση των μαύρων και των λευκών pixel.

4.1.7 T-test

Το t-test δύο δειγμάτων επιστρέφει μια απόφαση για κάποια δοκιμασία που έχει γίνει

μεταξύ των δύο δειγμάτων. Η απόφαση αφορά τη μηδενική υπόθεση ότι τα δεδομένα

σε δύο μεταβλητές x και y προέρχονται από ανεξάρτητα τυχαία δείγματα

ισοδύναμων μέσων και ισοδύναμων αλλά άγνωστων διακυμάνσεων. Η εναλλακτική

υπόθεση είναι ότι τα στοιχεία x και y προέρχονται από άνισα μέσα. Το αποτέλεσμα

είναι 1, εάν η δοκιμή απορρίπτει τη μηδενική υπόθεση σε επίπεδο σημαντικότητας

28

5%, και 0 διαφορετικά. Ο λόγος που έπρεπε να χρησιμοποιηθεί αυτή η διαδικασία

στο παρόν ερευνητικό πρόγραμμα είναι για να διαπιστωθεί η εγκυρότητα και η

αξιοπιστία των αποτελεσμάτων μας.

4.1.8 Photoshop

Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, το photoshop ήταν το πρόγραμμα που

χρηιμοποιήθηκε στο τελικό στάδιο του παρόντος ερευνητικού προγράμματος για την

ταυτοποίηση των ιστοπαθολογικών τομών του ποντικού με τις εικόνες φθορισμού

αλλά και με τις καινούργιες εικόνες με τον ολικό φθορισμό στις συσσωρεύσεις. Το

photoshop αποτέλεσε ένα σημαντικό εργαλείο το οποίο βοήθησε στο να ταιριάξουν

όσο το δυνατόν καλύτερα οι τρεις εικόνες, τοποθετώντας τη μια πάνω από την άλλη.

29

4.2 Αναλυτική Διαδικασία

Ακολουθεί η αναλυτική περιγραφή της διαδικασίας που ακολουθήθηκε στο

περιβάλλον matalab ώστε να παραχθούν τα αποτελέσματα. Η περιγραφή βασίζεται σε

παραδείγματα εικόνων από την διαδικασία εξαγωγής των αποτελεσμάτων μέσω του

προγράμματος MATLAB. Ολόκληρος ο κώδικας βρίσκεται σε παράρτημα στο τέλος

αυτής της διπλωματικής εργασίας.

4.2.1 Διαδικασία εξαγωγής αποτελεσμάτων για ολικό φθορισμό βιοδείκτη και

μεταβολίτη.

1ο βήμα Στην αρχή του κώδικα δημιουργείται ένα νέο αρχείο στην excel, μέσα στο

οποίο θα εγγραφούν όλα τα απαραίτητα στοιχεία που χρειάζονται για τη δημιουργία

γραφικών παραστάσεων.

4 fid=fopen('res.csv','w');

5 fprintf(fid,'Organ; Time Point; Mouse Number; Site;

GFP_Total_G;GFP_Total_R;Cy3_Total;Tissue_Pixels\r');

2ο βήμα Στη συνέχεια αφού φορτωθεί η εικόνα και ανοίξει, κατασκευάζονται τα

ιστογράμματα της εικόνας τόσο σε GFP φίλτρο όσο και σε Cy3.

[NG,XG]=imhist(imG(:,:,2),256);

[NC,XC]=imhist(imC(:,:,2),256);

3ο βήμα Ακολούθως γίνεται επεξεργασία στην εικόνα για εξαγωγή όσο το δυνατό

καλύτερων αποτελεσμάτων. Αρχικά εκτελείται φιλτράρισμα για τη μείωση του

θορύβου.

imG2=(medfilt2(double(imG(:,:,2)),[10 10]));

4ο βήμα Μετά γίνεται μετατροπή της εικόνας σε black-and-white και τέλος

μορφολογικό κλείσιμο της μαυρόασπρης εικόνας με τη χρήση του δομικού στοιχείου

‘disk’.

30

se = strel('disk',5);

L=(mean2(imG2)-ff*std2(imG2));

BW=im2bw(imG2,L);

imT=imclose(BW,se)

5ο βήμα Αφού γίνει η επεξεργασία της εικόνας, πρέπει να υπολογιστεί ο ολικός

φθορισμός και τα pixel του ιστού. Σε αυτό το στάδιο υπολογίζεται ο ολικός

φθορισμός σε GFP και Cy3 φίλτρο για τα δύο χρώματα της εικόνας Green και Red

(το μπλε είναι θόρυβος) ξεχωριστά εφ’όσον αυτά είναι χρήσιμα για την δημιουργία

παραστάσεων του βιοδείκτη και μεταβολίτη ως προς το χρόνο.

Tissue_Pixels=sum(sum(imT));

GFP_Total_G = sum(sum(imG(:,:,2)));

GFP_Total_R = sum(sum(imG(:,:,1)));

GFP_PerTissue_G = GFP_Total_G/sum(sum(double(imT)));

GFP_PerTissue_R = GFP_Total_R/sum(sum(double(imT)));

Cy3_Total = sum(sum(imC(:,:,2)));

Cy3_PerTissue = Cy3_Total/sum(sum(double(imT)));

6ο βήμα Στο τελικό στάδιο εμφανίζονται τα αποτελέσματα στην οθόνη. Πάνω

αριστερά εμφανίζεται η εικόνα σε GFP και σε Cy3 φίλτρο, αφού έχουν υποστεί το

φιλτράρισμα για μείωση του θορύβου και κανονικοποίηση. Δίπλα εμφανίζονται τα

ιστογράμματα της εικόνας για τα δύο φίλτρα. Κάτω αριστερά παρουσιάζονται οι

εικόνες ολικού φθορισμού και η μαυρόασπρη εικόνα. Τέλος, εμφανίζονται και οι

υπολογισμού του ολικού φθορισμού σε GFP και Cy3 φίλτο καθώς και τα pixels

ιστού, τα οποία υπολογίστηκαν προηγουμένως. Ακολουθεί ένα παράδειγμα από το

αποτέλεσμα που εμφανίζεται στην οθόνη.

31

Εικόνα 11. Τελικό αποτέλεσμα πρώτου ποντικού, 15 λεπτά μετά τη χορήγηση φαρμάκου.

4.2.2 Διαδικασία εξαγωγής αποτελεσμάτων για τον αριθμό των pixel και τον

ολικό φθορισμό ανά συσσώρευση.

Σε αυτό το στάδιο, κύριος στόχος ήταν να βρεθεί ο ολικός φθορισμός που υπάρχει

στις συσσωρεύσεις. Εφ’ όσον το φάρμακο αρχίζει να μαζεύεται στο παχύ έντερο

γύρω στα 30 λεπτά μετά τη χορήγησή του και παραμένει εκεί μέχρι και τις τρεις

ώρες, αυτό το χρονικό διάστημα κρίθηκε το σημαντικότερο για την εύρεση του

φθορισμού. Επομένως για κάθε χρονική στιγμή ξεχωριστά, έπρεπε να γίνει ανάλυση

σε περιβάλλον MATLAB για να βρεθεί ο αριθμός των pixel και του φθορισμού στις

συσσωρεύσεις για την κάθε στιγμή (30 λεπτά, 1 ώρα, 3 ώρες). Οι τρεις κώδικες ήταν

σχεδόν ίδιοι, με μόνη διαφορά το βήμα στο οποίο έπρεπε να αποφασιστεί πόσο θα

είναι το ‘graythresh’ με το οποίο θα πολλαπλασιαστεί η εικόνα για τη κάθε χρονική

στιγμή. Τα παραδείγματα που θα ακολουθήσουν για τη πλήρη κατανόηση του κώδικα

θα είναι από τις 3 ώρες μετά τη χορήγηση του φαρμάκου.

32

1ο βήμα Σε αυτό το βήμα έπρεπε να αποφασιστεί ποια χρώματα θα προστεθούν και

ποια θα αφαιρεθούν από τις εικόνες των 3 ωρών.

newIm=1*double(imG(:,:,1))+0.5*double(imG(:,:,3))-

0.5*double(imG(:,:,2));

2ο βήμα Στη συνέχεια η εικόνα πολλαπλασιάζεται με ένα κατώφλι. Για τις τρεις ώρες

το κατώφλι αυτό αποφασίστηκε να είναι 1.38.

c=1.38*graythresh(newIm);

3ο βήμα Ακολούθως έγινε μετατροπή της εικόνας σε μαυρόασπρη στη κλιμακα του

γκρι.

c=1.38*graythresh(newIm);

4ο βήμα Με τη χρήση ενός δομικού στοιχείου, του disk, έγινε μορφολογικό άνοιγμα

και κλέισιμο της εικόνας.

st=strel('disk',1);

BW=imopen(BW,st);

BW=imclose(BW,st);

Τα τέσσερα πρώτα βήματα έγιναν για να διαμορφωθεί η εικόνα φθορισμού με τετοιο

τρόπο ώστε να φαίνονται πιο έντονα οι μικρές περιοχές-συσσωρεύσεις όπου

μαζεύεται το φάρμακο. Το αποτέλεσμα που λαμβάνεται από τα βήματα αυτά

παρουσιάζεται πιο κάτω.

Αριστερά φαίνεται η κανονική εικόνα φθορισμού του ποντικού 5 στην 4η λήψη.

Δεξιά παρουσιάζεται η εικόνα μετά την επεξεργασία που έχει υποστεί. Όπως έχει

αναφερθεί σκοπός της όλης επεξεργασίας είναι η απομόνωση των μικρών αυτών

περιοχών όπου έχει μαζευτεί το φάρμακο, οι οποίες στην πρώτη εικόνα είναι

33

χρωματισμένες κίτρινες ενώ στην επεξεργασμένη έχουν χρωματιστεί άσπρες για να

φαίνονται πιο καθαρά.

Εικόνα 12. Εικόνα ολικού φθορισμού και εικόνα φθορισμού στις συσσωρεύσεις.

5ο βήμα Στη συνέχεια εκτελείται ‘median filtering’ στην αρχική εικόνα φθορισμού,

για μείωση του θορύβου όπως αναφέρθηκε προηγουμένως.


6ο βήμα Στο βήμα αυτό γίνεται μετατροπή της εικόνας σε μαυρόασπρη εικόνα και

εκτελείται μορφολογικό κλείσιμο της εικόνας.


L=(mean2(imG2)-0.3*std2(imG2));

BW2=im2bw(imG2,L);

BW2=double(imclose(BW2,se));

Με την εκτέλεση των τριών τελευταίων βημάτων, εμφανίζεται η αρχική εικόνα

φθορισμού μαυρόασπρη στην κλίμακα του γκρι και με το θόρυβο να έχει μειωθεί στο

ελάχιστο εφ΄όσον είχε προηγηθεί το φιλτράρισμα. Το παράδειγμα που ακολουθεί

είναι από τον ίδιο ποντικό του προηγούμενου παραδείγματος.

34

Αριστερά απεικονίζεται η κανονική εικόνα φθορισμού του συγκεκριμένου ποντικού.

Δεξιά είναι η εικόνα που έχει υποστεί επεξεργασία.

Εικόνα 13. Εικόνα ολικού φθορισμού και εικόνα ολικού φθορισμού διαμορφωμένη σε

μαυρόασπρη εικόνα.

7ο βήμα Ακολούθως γίνεται πολλαπλασιαμός της αρχικής μάσκας (black&white) που

δημιουργήθηκε, δηλαδή του ολικού φθορισμού στις συσσωρεύσεις, μαζί με τη

μάσκα (black&white) που δημιουργήθηκε στο τέλος, δηλαδή του ολικού φθορισμού.

BW=double(BW.*BW2);

Το αποτέλεσμα απο τον πολλαπλασιασμό των δύο μασκών είναι μια καινούργια

μαυρόασπρη μάσκα στην οποία παρουσιάζονται ξεκάθαρα οι μικρές περιοχές-

συσσωρεύσεις στις οποίες μαζέυεται όλο το φάρμακο.

Η τελική μάσκα παρουσιάζεται στην παρακάτω εικόνα.

35

Εικόνα 14. Τελική μάσκα του φθορισμού στις συσσωρεύσεις

8ο βήμα Στο τελευταίο βήμα αυτού του κώδικα υπολογίζονται, ο αριθμός των pixel,

το GFP_Total_G και το GFP_Total_R που υπάρχουν στις συσσωρεύσεις. Τα

αποτελέσματα αποθηκεύονται σε ένα νεό αρχείο της excel το οποίο δημιουργείται

στην αρχή του κώδικα. Χρησιμοποιώντας αυτά τα νούμερα, κατασκευάστηκαν οι δύο

γραφικές παραστάσεις που αναφέρθηκαν στο κεφάλαιο της μεθοδολογίας της

παρούσας διπλωματικής εργασίας.

Tissue_Pixels=sum(sum(BW));

GFP_Total_G = sum(sum(double(imG(:,:,2)).*BW));

GFP_Total_R = sum(sum(double(imG(:,:,1)).*BW));

36

5 Αποτελέσματα-Συμπεράσματα

5.1 ΟΛΙΚΟΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ

Ο ολικός φθορισμός δείχνει την δικόρυφη φύση της κινητικής, δηλαδή την ύπαρξη

δύο κορυφών στις γραφικές παραστάσεις του ολικού φθορισμού. Το μόριο του

βιοδείκτη υπάρχει από την αρχή. Ο μεταβολισμένος βιοδείκτης εμφανίζεται λίγο πιο

μετά, στην δεύτερη κορυφή όπως φαίνεται από την πιο κάτω γραφική. Αυτό

συμβαίνει γιατί μετά το μεταβολισμό στον οργανισμό, το φάρμακο διασπάται και

φθορίζει διαφορετικά. Οι δύο κορυφές, βιοδείκτη και μεταβολίτη, εμφανίζονται τόσο

στην γραφική παράσταση με φίλτρο GFP όσο και με Cy3 φίλτρο. Ωστόσο στο παρόν

ερευνητικό πρόγραμμα η ανάλυση που ακολουθεί βασίζεται εξ'ολοκλήρου στο

φίλτρο GFP. Στην γραφική παράσταση παρουσιάζεται ο ολικός φθορισμός σε

συνάρτηση με τον χρόνο.

Γραφική Παράσταση 1. Φθορισμος συναρτήσει χρόνου.

0

50

100

150

200

250

300

350

15min 30min 1hr 3hr 6hr 24hr

Total Fluorescence (GFP)

37

Με την χρήση δύο απλών διαδικασιών μπορούν τα δύο πιο πάνω φάσματα να

αποσυνδεθούν. Εφαρμογή της πρώτης μεθόδου στην γραφική παράσταση του ολικού

φθορισμού με GFP φίλτρο θα δώσει δύο νέες παραστάσεις του βιοδείκτη και του

μεταβολίτη ως προς τον χρόνο. Το ίδιο συμβαίνει και με την εφαρμογή της δεύτερης

μεθόδου στην γραφική παράσταση του φθορισμού με φίλτρο Cy3. Στην συνέχεια

ακολουθεί περιγραφή της δημιουργίας των γραφικών παραστάσεων βιοδείκτη και

μεταβολίτη ως προς το χρόνο χρησιμοποιώντας το GFP φίλτρο.

Περιγραφή Διαδικασίας

Σε αυτή τη μέθοδο γίνεται η εξής υπόθεση: Tο μόριο αποτελείται αποκλειστικά από

το κόκκινο κανάλι, επομένως το φάσμα του μορίου παρουσιάζεται μόνο με την

κανονικοποίηση που έγινε στο κόκκινο κανάλι. Δηλαδή, οι τιμές που πάρθηκαν από

τον αλγόριθμο για το κόκκινο κανάλι διαιρέθηκαν με τον αριθμό των pixels και με

αυτό το τρόπο έγινε η κανονικοποίηση. Για να γίνει η ακόλουθη γραφική παράσταση,

για την κάθε χρονική στιγμή υπολογίστηκε τόσο ο μέσος όρος, όσο και η τυπική

απόκλιση η οποία φαίνεται στη γραφική παράσταση που ακολουθεί. Τα στοιχεία και

οι γραφικές παραστάσεις που ακολουθούν προέρχονται μόνο από το φθορισμό με τη

βοήθεια του φίλτρου GFP.

Γραφική Παράσταση 2. Φθορισμός βιοδείκτη συναρτήσει χρόνου με GFP φίλτρο.

0

20

40

60

80

100

120

140

160


Molecule Fluorescence (GFP-R)

38

Ο μέσος όρος του ολικού φθορισμού από τα πρώτα 15 λεπτά μέχρι και τις τρεις ώρες

κυμαίνεται περίπου στο 120 με 140. Ενώ από τις 6 ώρες και μετά ο αριθμός αυτός

μειώνεται δραματικά και φτάνει περίπου στο 45.

Το φάσμα του μεταβολίτη μπορεί να ανακτηθεί με αφαίρεση του κόκκινου καναλιού

από το πράσινο κανάλι. Το μπλε κανάλι ήταν μόνο θόρυβος. Για τη δημιουργία της

γραφικής παράστασης που ακολουθεί, έγινε αφαίρεση της κανονικοποιημένης τιμής

του κόκκινου καναλιού από την κανονικοποιημένη τιμή του πράσινου. Υπολογίστηκε

ο μέσος όρος και η τυπική απόκλιση και το αποτέλεσμα φαίνεται πιο κάτω.

Γραφική Παράσταση 3. Φθορισμός μεταβολίτη συναρτήσει χρόνου με GFP φίλτρο.

Ο μέσος όρος για τα 15 λεπτά μέχρι και τη μια ώρα είναι περίπου 110, ενώ στις 3

ώρες φτάνει στο μέγιστο, 117 με μέγιστη και ελάχιστη τιμή 131.3924 και 103.314

αντίστοιχα. Στη συνέχεια και πάλι ο αριθμός αυτος μειώνεται και φτάνει περίπου στο

93.

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140


Metabolite Fluorescence (GFP-G - GFP-R)

39

5.1.1 Επεξήγηση αποτελεσμάτων

Παρατηρώντας την πρώτη γραφική παράσταση, βιοδείκτη ώς προς τον χρόνο, αυτό

που αξίζει να σημειωθεί είναι ότι η συγκέντρωση του βιοδείκτη στο παχύ έντερο του

ποντικού είναι περισσότερη κατά την διάρκεια των τριών ωρών. Το φάρμακο αρχίζει

να μαζεύεται στο παχύ έντερο ήδη από τα πρώτα 15 λεπτά της ενδοφλέβιας

χορήγησής του στον ποντικό. Η συγκέντρωσή του αρχίζει να αυξάνεται σταδιακά και

στις τρεις ώρες φτάνει στο μέγιστο σημείο της. Στην συνέχεια ξεκινάει η καθοδική

πορεία του φαρμάκου για να απεκκριθεί από το παχύ έντερο του ποντικού. Μετά την

χορήγηση του φαρμάκου είναι σημαντικό να γνωρίζει κάποιος την συγκέντρωσή του

στους διάφορους ιστούς και όργανα του οργανισμού, καθώς επίσης και την διάρκεια

που παραμένει σε αυτό. Αυτό γίνεται για να επιτευχθούν όσο το δυνατό τα καλύτερα

και επιθυμητά αποτελέσματα όσον αφορά τα θεραπευτικά επίπεδα αλλά και για να

γίνεται έλεγχος αν υπερβαίνονται τα όρια τοξικότητας της συγκεκριμένης ουσίας

στον οργανισμό. Συνεπώς το γεγονός ότι ο βιοδείκτης έχει την δυνατότητα να

παραμείνει στο παχύ έντερο του ποντικού μέχρι και τρεις ώρες είναι πολύ θετικό για

το λόγο ότι υπάρχει αρκετός χρόνος ώστε να χορηγηθεί η θεραπεία στον ασθενη.

Ακόμη αξίζει να σημειωθεί ότι στο παχύ έντερο δεν υπάρχει σχεδόν καθόλου

μεταβολίτης. Σύμφωνα με προηγούμενη μελέτη βιοδεικτών στο ήπαρ, έχει εξαχθεί το

συμπέρασμα ότι ο μεταβολισμός συμβαίνει σε αυτό το όργανο του ποντικού.

Επομένως πολύ λίγος μεταβολισμένος βιοδείκτης περνά στο παχύ έντερο. Έτσι

εξηγείται και η ελάχιστη κορυφή στην αρχική γραφική παράσταση.

Ακολούθως παρουσιάζονται κάποιες εικόνες φθορισμού σε GFP και Cy3 φίλτρο στα

30 λεπτά χορήγησης του φαρμκάκου, στις τρεις ώρες όπου το φάρμακο είναι στο

μέγιστο και στις 6 ώρες που αρχίζει η απέκκριση από τον οργανισμό. Όλες οι πιο

κάτω εικόνες προέρχονται από τον ποντικό 4 στην 8η λήψη. Τέλος παρουσιάζονται

εικόνες από την ιστολογική τομή του παχέος εντέρου με χρήση H&E.

40

Εικόνα 15. Φθορισμός σε φίλτρο GFP και Cy3 από το παχύ έντερο του ποντικού 30 λεπτά

μετά την χορήγηση του φαρμάκου, 10x

Εικόνα 16. Φθορισμός σε φίλτρο GFP και Cy3 από το παχύ έντερο του ποντικού 3 ώρες μετά

την χορήγηση του φαρμάκου, 10x

41

Εικόνα 17. Φθορισμός GFP και Cy3 από το παχύ έντερο 6 ώρες μετά την χορήγηση του

φαρμάκου, 10x

Εικόνα 18. Ιστολογική τομή παχέος εντέρου με χρώση H&E 4x (κάτω) και 10x (πάνω) στις 6

ώρες χορήγησης του φαρμάκου

42

5.2 ΦΘΟΡΙΣΜΟΣ ΣΤΙΣ ΣΥΣΣΩΡΕΥΣΕΙΣ

Σε αυτό το στάδιο κρίνεται απαραίτητη η επεξήγηση του όρου ‘συσσωρεύσεις’. Με

την εξαγωγή αποτελεσμάτων μέσω του προγράμματος MATLAB και παρατηρώντας

προσεχτικά την κάθε εικόνα από το παχύ έντερο του ποντικού, διαπιστώθηκε το

γεγονός ότι κατά την διάρκεια των τριάντα λεπτών μέχρι και τις τρεις ώρες ο

φθορισμός σε κάποια κυτταρικά οργανίδια του ποντικού ήταν πιο έντονος από ότι σε

άλλα. Με βάση κάποια πειράματα τα οποία έγιναν στο εργαστήριο σε διάφορα

κύτταρα, ο βιοδείκτης φάνηκε να πηγαίνει προς τα μιτοχόνδρια. Έτσι με βάση αυτό, η

υπόθεση ότι πιθανόν τα κυτταρικά οργανίδια του ποντικού να είναι τα μιτοχόνδρια

έγινε εντονότερη. Εφ΄όσον όμως αυτό δεν μπορούσε να ειπωθεί με απόλυτη σιγουριά,

χρησιμποποιήθηκε ο όρος ‘συσσωρεύσεις’ για τα συγκεκριμένα οργανίδια του παχέος

εντέρου του ποντικού.

Παίρνοντας και αναλύοντας τα αποτελέσματα από την δεύτερη διαδικασία που

ακολουθήθηκε σε περιβάλλον MATLAB, κατέληξα στο συμπέρασμα πως ο αριθμός

των pixel που υπάρχει σε κάθε συσσώρευση είναι ανάλογος με τη διάρκεια

παραμονής του φαρμάκου στον οργανισμό. Δηλαδή όσο αυξανόταν αυτός ο χρόνος,

αυξανόταν και ο αριθμός των pixel στις συσσωρεύσεις. Ο αριθμός των pixel στα

πρώτα 30 λεπτά της χορήγησης του βιοδείκτη στον οργανισμό είναι πολύ μικρός σε

σχέση με τις 3 ώρες διάρκειας του φαρμάκου στον οργανισμό του ποντικού. Στην

γραφική που παρουσιάζεται πιο κάτω φαίνεται ο μέσος όρος του αριθμού των pixels

για τις τρεις χρονικές στιγμές, καθώς επίσης η ψηλότερη και χαμηλότερη τιμή που

προκύπτει από την τυπική απόκλιση.

43

Γραφική Παράσταση 4. Αριθμός pixel σε κάθε συσσώρευση

Από τα αποτελέσματα του αρχέιου της excel, ο μέσος όρος του αριθμού των pixels

για τα πρώτα 30 λεπτά χορήγησης του φαρμάκου στις συσσωρεύσεις ανήλθε στα

1604.575 pixels. Η τυπική απόκλιση ήταν 1488.862 pixels, επομένως η μέγιστη τιμή

φτάνει στα 3093.437 και η ελάχιστη 115.713 pixels. Στη συνέχεια παρατηρείται μια

αύξηση του αριθμού αυτού για τη μία ώρα όπου το φάρμακο ήταν χορηγημένο στον

οργανισμό του ποντικού. Συγκεκριμένα, ο μέσος όρος ήταν 2381.95 pixels. Η τυπική

απόκλιση ήταν 1443.923 και έτσι η μέγιστη τιμή φτάνει στα 3825.873 και η ελάχιστη

στα 938.027 pixels. Τέλος για τις τρεις ώρες, ο μέσος όρος ήταν 4930.1 pixels και η

τυπική απόκλιση 2801.34. Αυτό δίνει μέγιστη και ελάχιστη τιμή 7731.44 και 2128.76

pixels αντίστοιχα, αριθμούς πολύ μεγαλύτερους σε σχέση με τις δύο προηγούμενες

χρονικές στιγμές.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

30min 1hr 3hr

High

Low

Mean

44

Στη συνέχεια, έγινε γραφική παράσταση του ολικού φθορισμού που υπάρχει στις

συσσωρεύσεις σε σχέση με το χρόνο. Όπως θα περίμενε κάποιος και πάλι ο ολικός

φθορισμός σε κάθε συσσώρευση αυξάνεται αναλογικά με την διάρκεια παραμονής

του φαρμάκου στον οργανισμό του ποντικού. Για την δημιουργία της παράστασης

αυτής, έγινε η υπόθεση ότι αποτελείται αποκλειστικά από το κόκκινο κανάλι,

επομένως οι τιμές για το κόκκινο κανάλι κανονικοποιήθηκαν, υπολογίστηκε ο μέσος

όρος και τέλος η τυπική απόκλιση.

Γραφική Παράσταση 5. Ολικός φθορισμός στις συσσωρεύσεις

Από τα αποτέλεσματα που λήφθηκαν στα 30 λεπτά ο ολικός φθορισμός στις

συσσωρεύσεις ήταν 414924.725, στη μια ώρα χορήγησης του φαρμάκου 554574.25

και στις τρεις ώρες 1289130. Οι τυπικές αποκλίσεις ήταν 411152.2, 380926.3 και

787018.6 αντίστοιχα για τις τρεις χρονικές στιγμές.

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

30min 1hr 3hr

High

Low

Mean

Total Fluoresence

45

5.3 PHOTOSHOP

Σε αυτό το στάδιο παρουσιάζεται μια από τις πέντε εικόνες που επεξεργάστηκαν στο

πρόγραμμα PhotoShop και στην οποία απεικονίζεται το καλύτερο δυνατό

αποτέλεσμα. Όπως έχει αναφερθεί αρκετές φορές το να ταιριάξουν απόλυτα οι

εικόνες ολικού φθορισμού και φθορισμού στις συσσωρεύσεις με την εικόνα της

ιστολογίας αποτέλεσε μια εξαιρετικά δύσκολη διαδικασία εφ΄όσον οι περισσότερες

εικόνες της τομής του παχέος εντέρου από την ιστολογική εξέταση είχαν

καταστραφεί με το πέρας των χρόνων. Από τα αποτελέσματα των πέντε εικόνων

έκρινα σημαντική την εικόνα από τον ποντικό 1 αφού για αυτή την εικόνα η

ιστολογική τομή ταίριαζε καλύτερα στην εικόνα φθορισμού, επομένως και στην

εικόνα με το φθορισμό στις συσσωρεύσεις.

Αρχικά παρουσιάζεται η εικόνα από την ιστολογική τομή του ποντικού 1 που

επιλέχθηκε στο εργαστήριο. Στο εργαστήριο υπήρχαν περίπου 6 τομές ιστολογίας για

κάθε ένα από τους πέντε ποντικούς στις τρεις ώρες. Η επιλογή της συγκεκριμένης

εικόνας έγινε με μόνο κριτήριο το γεγονός ότι ήταν η μόνη που δεν είχε καταστραφεί

και θα μπορούσε να γίνει προσπάθεια εντοπισμού της αντίστοιχης εικόνας

φθορισμού. Στη συνέχεια ακολουθεί η εικόνα φθορισμού του ποντικού 1 και

συγκεκριμένα η εικόνα προέρχεται από την πρώτη λήψη. Η εικόνα αυτή κρίθηκε η

καταλληλότερη γιατί ήταν η μόνη που έμοιαζε αρκετά με την τομή της ιστολογίας.

46

Εικόνα 19. Εικόνα ιστολογίας

Εικόνα 20. Εικόνα Φθορισμού

47

Στη συνέχεια φαίνεται το αποτέλεσμα από την προσπάθεια που έγινε στο Photshop να

ταυτιστούν οι δύο εικόνες μεταξύ τους όσο το δυνατό καλύτερα. Ουσιαστικά

αποτελείται από τις δύο προηγούμενες εικόνες τοποθετημένες τη μια πάνω στην

άλλη. Απο κάτω βρίσκεται η εικόνα φθορισμου από τον ποντικό 1 και από πάνω

βρίσκεται η εικόνα της ιστολογικής εξέτασης. Αυτό που αξίζει να σημειωθεί και

μπορεί εύκολα να παρατηρηθεί είναι ότι σε αρκετά σημεία οι δύο εικόνες δεν

μπόρεσαν να ταιριάξουν απόλυτα. Παρ’όλα αυτά, η εικόνα που φαίνεται πιο κάτω

αποτελεί το καλύτερο δυνατό αποτέλεσμα.

Εικόνα 21. Αποτέλεσμα photoshop- επικάλυψη των δύο εικόνων

Τέλος, στην εικόνα που ακολουθεί έχει προστεθεί ακόμα μια εικόνα πάνω από τις δύο

προηγούμενες. Η εικόνα του ολικού φθορισμού στις συσσωρεύσεις του ποντικού 1

στην συγκεκριμένη λήψη, έπρεπε να τοποθετηθεί πάνω από τις άλλες δύο για να γίνει

μια προσπάθεια εύρεσης των κυτταρικών οργανιδίων στα οποία βρίσκεται

συγκεντρωμένο το φάρμακο. Με πράσινο χρώμα είναι χρωματισμένες οι περιοχές

όπου η συγκέντρωση του φαρμάκου είναι η περισσότερη.

48

Εικόνα 22. Τελική εικόνα

49

6 Επιλογος

Σε αυτό το κεφάλαιο θα παρουσιαστεί μια μικρή σύνοψη των αποτελεσμάτων και των

συμπερσασμάτων τα οποία έχουν εξαχθεί.

Στη συνέχεια αναφέρονται κάποιες μελλοντικές προεκτάσεις της διπλωματικής

εργασίας.

6.1 Σύνοψη και Συμπεράσματα

Αυτό που αξίζει να σημειωθεί είναι ότι η συγκέντρωση του βιοδείκτη στο παχύ

έντερο του ποντικού είναι περισσότερη κατά την διάρκεια των τριών ωρών. Το

φάρμακο αρχίζει να μαζεύεται στο παχύ έντερο ήδη από τα πρώτα 15 λεπτά της

ενδοφλέβιας χορήγησής του στον ποντικό και αυξάνεται σταδιακά μέχρι τις τρεις

ώρες όπου η συγκέντρωση του φαρμάκου φτάνει στο μέγιστο της. Στην συνέχεια

αρχίζει η απέκκριση του φαρμάκου. Ο βιοδείκτης παραμένει στο παχύ έντερο του

ποντικού μέχρι και τρεις ώρες από τη στιγμή χορήγησης του φαρμάκου επομένως

υπάρχει αρκετός χρόνος ώστε να χορηγηθεί η θεραπεία στον ασθενή. Επίσης

παρατηρώντας τη γραφική παράσταση του μεταβολίτη οδηγήθηκα στο συμπέρασμα

ότι στο παχύ έντερο δεν υπάρχει καθόλου μεταβολίτης.

Κατά την διάρκεια των τριάντα λεπτών μέχρι και τις τρεις ώρες ο φθορισμός σε

κάποια κυτταρικά οργανίδια του ποντικού ήταν πιο έντονος από ότι σε άλλα. Λόγω

κάποιων πειραμάτων που έγιναν στο εργαστήριο, έγινε η υπόθεση ότι αυτά τα

κυτταρικά οργανίδια μπορεί να ήταν τα μιτοχόνδρια. Αλλά αυτό δεν μπορούσε να

ειπωθεί με ακρίβεια. Επίσης παρατηρήθηκε ότι όσο αυξανόταν η διάρκεια παραμονής

του φαρμάκου στον οργανισμό, αυξανόταν και ο αριθμός των pixel στα κυτταρικά

οργανίδια-συσσωρεύσεις, αλλά και ο ολικός φθορισμός που υπήρχαν σε αυτά.

Τέλος, έγινε μια προσπάθεια στο πρόγραμμα PhotoShop να ταριάξουν μεταξύ τους

τρεις εικόνες, ώστε να γίνει πιο κατανοητό το κυτταρικό οργανίδιο του ποντικού στο

50

οποίο μαζεύεται το φάρμακο. Δυστυχώς, δεν ήταν εφικτή η πλήρης κατανόηση του

κυτταρικού οργανιδίου λόγω του ότι οι περισσότερες εικόνες της τομής του παχέος

εντέρου από την ιστολογική εξέταση είχαν καταστραφεί με το πέρας των χρόνων.

6.2 Μελλοντικές προεκτάσεις

Μετά τη διαδικασία της ενδοφλέβιας χορήγησης του φαρμάκου και της ευθανασίας,

έγινε εκτομή σε όλα τα όργανα των ποντικών. Ήδη η επεξεργασία και ανάλυση του

συκωτιού έχει γίνει στο παρελθόν. Σε αυτό το ερευνητικό πρόγραμμα αναλύθηκε το

παχύ έντερο του ποντικού, επομένως σε μεταγενέστερο στάδιο μπορεί να γίνει

ανάλυση όλων των υπόλοιπων οργάνων. Επίσης σημαντική προέκταση αποτελεί το

γεγονός ότι τα αποτελέσματα που έχουν εξαχθεί μπορούν να χρησιμοποιηθούν ώστε

να σχεδιαστεί μια αποτελεσματική θεραπεία για τον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Αποτελεί σημαντικό γεγονός το ότι έχουν βρεθεί οι ώρες που το φάρμακο μαζεύεται

στο όργανο, η διάρκεια που παραμένει και πότε αρχίζει η απέκκριση του για την

εύρεση της σωστής θεραπείας.

51

7 Βιβλιογραφία

Ξένη

[1] Rafael C. Gonzalez , Richard E. Woods, Steven L. Eddins - Digital Image

Processing Using MATLAB, 2nd edition.

[2] Kenneth R. Spring, National Institutes of Health, Fluorescence Microscopy

Διαδικτυακοί Τόποι

Kenneth R. Spring, Michael W. Davidson, Introduction to Fluorescence Microscopy,

(http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fluorescenceintro.html, τελευταία

πρόσβαση στις 29/04/2014)

Brian Herman and Victoria E. Centonze Frohlich, Joseph R. Lakowicz, Douglas B.

Murphy , Kenneth R. Spring, Michael W. Davidson, Basic Concepts in Fluorescence,

(http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/fluorescenceintro.ht

ml, τελευταία πρόσβαση στις 29/04/2014)

Ελληνική Εταιρεία Ογκολογίας Πεπτικού, Καρκίνος Παχέος Εντέρου,

(http://www.digestiveoncology.org.gr/index.php?option=com_content&view=categor

y&layout=blog&id=33&Itemid=34&lang=el, τελευταία ενημέρωση στις 29/04/2014 )

http://www.amazon.com/Rafael-C.-Gonzalez/e/B001ITWUOG/ref=ntt_athr_dp_pel_1

http://www.amazon.com/s/ref=ntt_athr_dp_sr_2?_encoding=UTF8&field-author=Richard%20E.%20Woods&ie=UTF8&search-alias=books&sort=relevancerank

http://www.amazon.com/Steven-L.-Eddins/e/B004FUYU34/ref=ntt_athr_dp_pel_3

http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fluorescenceintro.html

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/fluorescenceintro.html

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/fluorescenceintro.html

http://www.digestiveoncology.org.gr/index.php?option=com_content&view=category&layout=blog&id=33&Itemid=34&lang=el

http://www.digestiveoncology.org.gr/index.php?option=com_content&view=category&layout=blog&id=33&Itemid=34&lang=el

52

8 Παράρτημα

Στο παράρτημα αυτό παρουσιάζονται οι δύο κώδικες που έγιναν για την εξαγωγή των

αποτελεσμάτων. Αρχικά δίνεται ο πρώτος κώδικας που ανατύχθηκε για την εύρεση

του ολικού φθορισμού στις εικόνες. Στη συνέχεια παρουσιάζονται οι τρεις κώδικες

(30 λεπτά, 1 ώρα και 3 ώρες ) που χρησιμοποιήθηκαν για να βρεθεί ο αριθμός των

pixel και ο ολικός φθορισμός που υπάρχει στις συσσωρεύσεις.


clear; close all; clc;

DirName='C:\Matlab';

Verbose=1;

Organ={'Colon'};

Mag={'10x'};

TimePoints={'15m'; '30m'; '1hr'; '3hr'; '6hr'; '24hr' };

M=[1 5;1 5;1 5;1 5;1 5;1 4];

S=[8;8;8;8;8;8];

if Verbose

fid=fopen('res.csv','w');

fprintf(fid,'Organ;Time Point;Mouse

Number;Site;GFP_Total_G;GFP_Total_R;Cy3_Total;Tissue_Pixels\r');

end;

if Verbose

hf=figure;

ss=get( 0, 'ScreenSize' );

set(hf,'Position',[100 ss(4)-550 1000 450]);

end;

load corectimage;

for o=1:length(Organ)

fprintf('%s',Organ{o});

for t=1:length(TimePoints)

fprintf('\n%s - ',TimePoints{t});

for m=1:length(Mag)

fprintf('%s \n',Mag{m});

for p=M(t,1):M(t)

fprintf('\n %d - ',p);

for q=1:S(t)

fprintf('%d ',q);

if strcmp(Organ,'Colon')

53

FileNameG=sprintf('%s\\%s\\%s\\%s\\M%d-E1-I800-G-

%d.tif',DirName,Organ{o},TimePoints{t}, Mag{m}, p, q);

imG=imread(FileNameG,'TIFF');

FileNameC=sprintf('%s\\%s\\%s\\%s\\M%d-E1-I800-C-


imC=imread(FileNameC,'TIFF');

else

FileNameG=sprintf('%s\\%s\\%s\\M%d-E1-I800-G-


imG=imread(FileNameG,'TIFF');

FileNameC=sprintf('%s\\%s\\%s\\M%d-E1-I800-C-


imC=imread(FileNameC,'TIFF');

end;

% Correct the image intensity (only for Mag=4x)

if strcmp(Mag,'4x')

imG=double(imG);

imC=double(imC);

load(sprintf('%s\\corectimage.mat',DirName));

imG(:,:,1)=imG(:,:,1).*imXG;

imG(:,:,2)=imG(:,:,2).*imXG;

imG(:,:,3)=imG(:,:,3).*imXG;

imC(:,:,1)=imC(:,:,1).*imXC;

imC(:,:,2)=imC(:,:,2).*imXC;

imC(:,:,3)=imC(:,:,3).*imXC;

imG=uint8(imG);

imC=uint8(imC);

end;

if Verbose

disp('Creating Histograms ...');

[NG,XG]=imhist(imG(:,:,2),256);

[NC,XC]=imhist(imC(:,:,2),256);

end;

if Verbose disp('Normalizing and Filtering ...'); end;

imG1(:,:,1)=medfilt2((imG(:,:,1)-min(min(min(imG(:,:,1)))))*3,[5 5]);



imC1=imC;

imC1(:,:,2)=medfilt2((imC(:,:,2)-min(min(min(imC(:,:,2)))))*8,[5 5]);

if Verbose

disp('Correcting and Thresholding ...');

end;

imG2=(medfilt2(double(imG(:,:,2)).*imXG,[10 10]));

ff=0.9;

% Dont have to correct for 10x

if strcmp(Mag{o},'10x')


ff=0.3;

end;

imG2=imG2-min(min(imG2));

imG2=imG2./max(max(imG2));


L=(mean2(imG2)-ff*std2(imG2));

BW=im2bw(imG2,L);

54

imT=imclose(BW,se);

if Verbose

disp('Calulating and displaying ...');

end;

Tissue_Pixels=sum(sum(imT));

GFP_Total_G = sum(sum(imG(:,:,2)));

GFP_Total_R = sum(sum(imG(:,:,1)));

GFP_PerTissue_G = GFP_Total_G/sum(sum(double(imT)));

GFP_PerTissue_R = GFP_Total_R/sum(sum(double(imT)));

Cy3_Total = sum(sum(imC(:,:,2)));

Cy3_PerTissue = Cy3_Total/sum(sum(double(imT)));

if Verbose

subplot(2,2,1);

imshow([imG imC]);

title('GFP and Cy3 Normalized Fluorescence Images');

subplot(2,2,2);

plot(XG,NG,'r');

hold on;

plot(XC,NC,'g');

hold off;

axis tight;

title('Histograms of GFP (green) and Cy3 (Red) images');

subplot(2,2,3);

imagesc([imG2 imT]);colormap(gray);

title('Total Fluorescence and Total Tissue Mask');

ha6 = subplot(2,2,4);

cla(ha6);

text(0,1,strcat('GFP File: ',FileNameG));

text(0,0.85,strcat('Cy3 File: ',FileNameC));

text(0,0.65,sprintf('Total GFP Fluorescence: %d (G) %d

(R)',GFP_Total_G, GFP_Total_R))

text(0,0.50,sprintf('Total Cy3 Fluorescence: %d',Cy3_Total))

text(0,0.30,sprintf('Tissue Pixels: %d',Tissue_Pixels))

text(0,0.15,sprintf('Normalized GFP Fluorescence: %0.5f (G) %0.5f

(R)',GFP_PerTissue_G, GFP_PerTissue_R))

text(0,0,sprintf('Normalized Cy3 Fluorescence:

%0.5f',Cy3_PerTissue))

axis off

fprintf(fid,'%s;%s;%d;%d;%d;%d;%d;%d\r',Organ{o},TimePoints{t},p,q,GF

P_Total_G,GFP_Total_R,Cy3_Total,Tissue_Pixels);

if ((p==M(t))&&(q==S(t)))

pause;

end;

end;

end;

end;

end;

end;

end;

if(~Verbose)

fclose(fid);

end;

55


clc; clear; close all;


DoPlot=1; DoSave=1;

Organ={'Colon'}; Mag={'10x'}; TimePoints={'30m'}; M=[1 5]; S=[8];

if DoSave fid=fopen('result_miins.csv','w'); fprintf(fid,'Organ;Time Point;Magnitude;Mouse

Number;Site;GFP_Total_G;GFP_Total_R;Tissue_Pixels\r'); end;

load corectimage;

for o=1:length(Organ) fprintf('%s',Organ{o}); for t=1:length(TimePoints) fprintf('\n%s - ',TimePoints{t}); for m=1:length(Mag) fprintf('%s \n',Mag{m}); for p=M(t,1):M(t,2) fprintf('\n %d - ',p); for q=1:S(t) fprintf('%d ',q);

% Create filename and open the images if strcmp(Organ,'Colon') FileNameG=sprintf('%s\\%s\\%s\\%s\\M%d-E1-I800-G-

%d.tif',DirName,Organ{o},TimePoints{t}, Mag{m}, p, q); imG=imread(FileNameG,'TIFF');

else FileNameG=sprintf('%s\\%s\\%s\\%s\\M%d-E1-I800-G-

%d.tif',DirName,Organ{o},TimePoints{t}, Mag{m}, p, q); imG=imread(FileNameG,'TIFF'); end;

% Correct the image intensity (only for Mag=4x) if strcmp(Mag,'4x') imG=double(imG); load(sprintf('%s\\corectimage.mat',DirName)); imG(:,:,1)=imG(:,:,1).*imXG; imG(:,:,2)=imG(:,:,2).*imXG; imG(:,:,3)=imG(:,:,3).*imXG; imG=uint8(imG);

56

end;


0.5*double(imG(:,:,2)); imagesc(newIm); newIm=newIm-min(min(newIm)); newIm=newIm/max(max(newIm)); c=1.45*graythresh(newIm); BW=im2bw(newIm,c); st=strel('disk',1); BW=imopen(BW,st); BW=imclose(BW,st);

imG2=(medfilt2(double(imG(:,:,2)),[10 10])); imG2=imG2-min(min(imG2)); imG2=imG2./max(max(imG2)); se = strel('disk',5); L=(mean2(imG2)-0.3*std2(imG2)); BW2=im2bw(imG2,L); BW2=double(imclose(BW2,se));

BW=double(BW.*BW2); ovIm=imG; ovIm(:,:,1)=255*uint8(BW);


GFP_Total_G = sum(sum(double(imG(:,:,2)).*BW)); GFP_Total_R = sum(sum(double(imG(:,:,1)).*BW));

if DoPlot subplot(2,2,1); image(imG); subplot(2,2,2); imagesc(BW2);

colormap(gray) subplot(2,2,3); imagesc(BW); colormap(gray); subplot(2,2,4);

image(ovIm); pause(2); end;

if DoSave

fprintf(fid,'%s;%s;%s;%d;%d;%d;%d;%d\r',Organ{o},TimePoints{t},Mag{m}

,p,q,GFP_Total_G,GFP_Total_R,Tissue_Pixels);

end; end; end; end; end; end;

if(DoSave) fclose(fid); end;

57




DoPlot=1; DoSave=1;

Organ={'Colon'}; Mag={'10x'}; TimePoints={'1hr'}; M=[1 5;]; S=[8];

if DoSave fid=fopen('result_hr.csv','w'); fprintf(fid,'Organ;Time Point;Magnitude;Mouse


load corectimage;






% Correct the image intensity (only for Mag=4x) if strcmp(Mag,'4x') imG=double(imG); load(sprintf('%s\\corectimage.mat',DirName)); imG(:,:,1)=imG(:,:,1).*imXG; imG(:,:,2)=imG(:,:,2).*imXG;

58

imG(:,:,3)=imG(:,:,3).*imXG; imG=uint8(imG); end;


0.5*double(imG(:,:,2)); newIm=newIm-min(min(newIm)); newIm=newIm/max(max(newIm)); c=1.4*graythresh(newIm); BW=im2bw(newIm,c); st=strel('disk',1); BW=imopen(BW,st); BW=imclose(BW,st);

imG2=(medfilt2(double(imG(:,:,2)),[10 10])); imG2=imG2-min(min(imG2)); imG2=imG2./max(max(imG2)); se = strel('disk',5); L=(mean2(imG2)-0.3*std2(imG2)); BW2=im2bw(imG2,L); BW2=double(imclose(BW2,se));




if DoPlot subplot(2,2,1); image(imG); subplot(2,2,2); imagesc(BW2);

colormap(gray) subplot(2,2,3); imagesc(BW); colormap(gray); subplot(2,2,4);

image(ovIm); pause(2); end;

if DoSave



end; end; end; end; end; end;

if(DoSave) fclose(fid); end;

59




DoPlot=1; DoSave=1;

Organ={'Colon'}; Mag={'10x'}; TimePoints={'3hr'}; M=[1 5]; S=[8];

M=[5 5]; S=[4];

if DoSave fid=fopen('result_threehr.csv','w'); fprintf(fid,'Organ;Time Point;Magnitude;Mouse


load corectimage;






60

% Correct the image intensity (only for Mag=4x) if strcmp(Mag,'4x') imG=double(imG); load(sprintf('%s\\corectimage.mat',DirName)); imG(:,:,1)=imG(:,:,1).*imXG; imG(:,:,2)=imG(:,:,2).*imXG; imG(:,:,3)=imG(:,:,3).*imXG; imG=uint8(imG); end;


0.5*double(imG(:,:,2)); newIm=newIm-min(min(newIm)); newIm=newIm/max(max(newIm)); c=1.38*graythresh(newIm); BW=im2bw(newIm,c); st=strel('disk',1); BW=imopen(BW,st); BW=imclose(BW,st); im=BW;

imG2=(medfilt2(double(imG(:,:,2)),[10 10])); imG2=imG2-min(min(imG2)); imG2=imG2./max(max(imG2)); se = strel('disk',5); L=(mean2(imG2)-0.3*std2(imG2)); BW2=im2bw(imG2,L); %imagesc(imG2); %imagesc(BW2); end;

BW2=double(imclose(BW2,se));




if DoPlot %subplot(2,2,1); image(imG); subplot(2,2,2);imagesc(im);

colormap(gray); % imagesc(BW2); colormap(gray); %subplot(2,2,3); imagesc(BW); colormap(gray);% subplot(2,2,4);

image(ovIm); imwrite(BW,'koukkides3.jpg'); %subplot(2,2,2); %image(ovIm); pause(4); end;

if DoSave



61

end;

end;

end;

end;

%end;

if(DoSave)

fclose(fid);

end;

end;

, 2014 - ucy · 4 abstract the aim of this thesis is the pharmacokinetic study of biomarkers in...

Documents