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biología molecularbiología molecularaplicadaaplicada

emplea principios de la estructura y la emplea principios de la estructura y la función del DNA y de las proteínas para función del DNA y de las proteínas para

estudiar las bases de fenotipos producidos estudiar las bases de fenotipos producidos por genotipos bajo condiciones normales y por genotipos bajo condiciones normales y

patológicaspatológicas

mediante herramientas y técnicas que explotan mediante herramientas y técnicas que explotan la información contenida en las moleculas de la información contenida en las moleculas de

un organismo (sobre todo DNA)un organismo (sobre todo DNA)

La información química La información química contenida en un polimero contenida en un polimero

simple (ácido nucleíco) simple (ácido nucleíco) controla el desarrollo y controla el desarrollo y mantenimiento de un mantenimiento de un

organismo vivo complejoorganismo vivo complejo

4 bases:4 bases: Guanina (G), Adenina (A), Citosina (C), Timina (T)Guanina (G), Adenina (A), Citosina (C), Timina (T)

En un oligonucleótido de 10 nucleótidos puede haber 4En un oligonucleótido de 10 nucleótidos puede haber 41010 posiciones posiciones distintas de las cuatro bases (1.048.576)distintas de las cuatro bases (1.048.576)

En nucleo de una célula humana hay más de 10En nucleo de una célula humana hay más de 1099 nucleótidos, es nucleótidos, es decir más de 4decir más de 41000.000.0001000.000.000 de combinaciones de secuenciasde combinaciones de secuencias

Procesamiento de la información genética Procesamiento de la información genética en la célula (eucariotas)en la célula (eucariotas)

TRES DIMENSIONES EN UNA PROTEÍNATRES DIMENSIONES EN UNA PROTEÍNA

INTERACCIONES CON:INTERACCIONES CON:

Otros aminoácidos y con Otros aminoácidos y con elementos de estructura elementos de estructura secundaria en la misma secundaria en la misma subunidadsubunidad

Otras subunidadesOtras subunidades

Ligandos específicosLigandos específicos

Estructuras celularesEstructuras celulares

PerspectivaPerspectiva

El emparejamiento de las bases conduce a la El emparejamiento de las bases conduce a la doble hélice y a la hibridacióndoble hélice y a la hibridación

Heteroduplex DNAHeteroduplex DNA--RNA formado durante la síntesis de RNARNA formado durante la síntesis de RNA

Doble héliceDoble hélice EmparejamientoEmparejamiento

A A -- TT≈ 2°C≈ 2°C

C C -- GG≈ 4°C≈ 4°C

La cantidad de DNA en solución La cantidad de DNA en solución puede ser determinada mediante puede ser determinada mediante espectrofotometria ultravioleta.espectrofotometria ultravioleta.

Las bases del Las bases del DNA son menos DNA son menos accesibles a la accesibles a la luz ultravioleta luz ultravioleta en doble en doble cadena que en cadena que en cadena sencillacadena sencilla

La desnaturalización de la doble hélice de DNA es La desnaturalización de la doble hélice de DNA es un proceso cooperativoun proceso cooperativo

Tm es la temperatura a la que el 50% del DNA se Tm es la temperatura a la que el 50% del DNA se denaturalizadenaturaliza

La Tm de un duplex de un ácido nucleíco se La Tm de un duplex de un ácido nucleíco se modifica por tres factores principales:modifica por tres factores principales:

1.1. Composición de basesComposición de bases2.2. Longitud del duplexLongitud del duplex

3.3. Fuerza iónica de la soluciónFuerza iónica de la solución

Los desapareamientos en un heteroduplex producen una Los desapareamientos en un heteroduplex producen una disminución de 1ºC por cada 1% de secuencia desapareadadisminución de 1ºC por cada 1% de secuencia desapareada

Factores que afectan la desnaturalización y Factores que afectan la desnaturalización y renaturalización de la doble hélicerenaturalización de la doble hélice

Efecto Efecto sobre Tm

Efecto sobre Efecto sobre renaturalizaciónParametroParametro sobre Tm renaturalización

ComposiciónComposición

LongitudLongitud

Fuerza iónicaFuerza iónica

% error% error

ConcentraciónConcentración

DenaturalizantesDenaturalizantes

Temperatura

↑ ↑ TmTm ↑ ↑ % GC% GC

↑ ↑ TmTm ↑ ↑ longitudlongitud

↑ ↑ TmTm ↑ ↑ % Na% Na

↓ ↓ TmTm ↑ ↑ % error% error

Sin efectoSin efecto

↓ ↓ urea, formamida

Sin efectoSin efecto

↑ ↑ vel.vel. ↑ ↑ longitudlongitud

Optimo a 1,5 M NaOptimo a 1,5 M Na

↓ ↓ vel.vel. ↑ ↑ % error% error

↑ ↑ vel.vel. ↑ ↑ conc.conc.

Optimo a 50% form. Optimo a 50% form.

Optimo a 20ºC Optimo a 20ºC ↓↓ Tm

urea, formamida

Temperatura Tm

El apareamiento de El apareamiento de bases tiene lugar en la bases tiene lugar en la doble hélice del DNA doble hélice del DNA y tambien en las y tambien en las interacciones intra e interacciones intra e interinter--moleculares del moleculares del RNA y del DNA de RNA y del DNA de cadena sencillacadena sencilla

Las hebras sencillas de Las hebras sencillas de DNA desnaturalizaddo DNA desnaturalizaddo pueden ser pueden ser renaturalizadas y renaturalizadas y adoptar formas de adoptar formas de doble hebradoble hebra

La hibridación sobre un La hibridación sobre un DNA inmovilizado (en DNA inmovilizado (en filtro) permite saber si filtro) permite saber si una solución de DNA o una solución de DNA o RNA desnaturalizado RNA desnaturalizado contiene secuencias contiene secuencias complementarias de las complementarias de las cadenas inmovilizadascadenas inmovilizadas

El DNA y el RNA pueden ser separados del El DNA y el RNA pueden ser separados del resto de componentes celulares por métodos resto de componentes celulares por métodos físicofísico--químicosquímicos

La electroforesis La electroforesis horizontal en geles de horizontal en geles de agarosa permite agarosa permite separar las moleculas separar las moleculas de DNA por su tamaño de DNA por su tamaño (0,2 (0,2 -- 10 kb).10 kb).

La electroforesis vertical La electroforesis vertical en geles de en geles de poliacrilamida permite poliacrilamida permite separar las moleculas separar las moleculas de DNA con diferencias de DNA con diferencias en una sola baseen una sola base

La transferencia (blot) e La transferencia (blot) e hibridación usando la hibridación usando la tecnica de Southern tecnica de Southern permite identificar permite identificar secuencias específicas secuencias específicas de DNAde DNA

Cortar y PegarCortar y Pegar

Los enzimas de restricción son endonucleasas que Los enzimas de restricción son endonucleasas que reconocen y cortan secuencias específicas en la doble reconocen y cortan secuencias específicas en la doble hélice de DNA.hélice de DNA.

ER y sus metilasas protegen ER y sus metilasas protegen en bacterias a infecciones en bacterias a infecciones por fagos.por fagos.

Las ER de Tipo II son Las ER de Tipo II son homodimeros que se unen a homodimeros que se unen a secuencias específicas de secuencias específicas de DNA y rompen enlaces DNA y rompen enlaces fosfodiesterfosfodiester

Se requieren estirpes de Se requieren estirpes de bacterias modificadas para bacterias modificadas para realizar DNA recombinanterealizar DNA recombinante

Enzimas de RestricciónEnzimas de Restricción

Enzimas de Restricción de Tipo IEnzimas de Restricción de Tipo IEnzimas complejasEnzimas complejas: Cada enzima tiene 3 funciones : Cada enzima tiene 3 funciones simultaneas: Reconocimiento, Endonucleasa y Metilasasimultaneas: Reconocimiento, Endonucleasa y Metilasa

CofactoresCofactores: ATP, Mg: ATP, Mg2+2+ y Sy S--AdenosilmetioninaAdenosilmetionina

3 Subunidades3 Subunidades: Reconocimiento, Actv. Endonucleasa y Actv. : Reconocimiento, Actv. Endonucleasa y Actv. Metilasa se localizan en diferentes subunidades del Metilasa se localizan en diferentes subunidades del complejocomplejo

Sitio de reconocimientoSitio de reconocimiento: 15 pares de bases: 15 pares de bases

Sitio de metilación o roturaSitio de metilación o rotura: a aprox. 1000 pb del 5’ de la : a aprox. 1000 pb del 5’ de la secuencia TCA en sitio de reconocimientosecuencia TCA en sitio de reconocimiento5’ A5’ AAACNNNNNNGTGC 3’CNNNNNNGTGC 3’3’ TTGnnnnnnC3’ TTGnnnnnnCAACG 3’

5’ TG5’ TGAANNNNNNTGCT 3’NNNNNNTGCT 3’3’ ACTnnnnnn3’ ACTnnnnnnAACGA 3’CG 3’ CGA 3’

Eco KEco K Eco BEco B

Enzimas de Restricción de Tipo IIEnzimas de Restricción de Tipo II

Reconocen TETRAReconocen TETRA--, PENTA, PENTA--, o HEXANUCLEOTIDOS, o HEXANUCLEOTIDOS

Secuencias poseen un eje de simetria rotacional:Secuencias poseen un eje de simetria rotacional:PALINDROMO:PALINDROMO:

5’ GAATTC 3’5’ GAATTC 3’3’ CTTAAG 5’3’ CTTAAG 5’Eco RIEco RI

Enzimas de Restricción de Tipo II reconocen Enzimas de Restricción de Tipo II reconocen palindromos y producen 3 tipos de cortespalindromos y producen 3 tipos de cortes

Enzimas de Restricción de Tipo IIIEnzimas de Restricción de Tipo III

Enzimas complejasEnzimas complejas: Cada enzima tiene 3 funciones : Cada enzima tiene 3 funciones simultaneas: Reconocimiento, Endonucleasa y Metilasasimultaneas: Reconocimiento, Endonucleasa y Metilasa

CofactoresCofactores: ATP, Mg: ATP, Mg2+2+ y Sy S--AdenosilmetioninaAdenosilmetionina

2 subunidades2 subunidades: Actividad endonucleasa en una subunidad y : Actividad endonucleasa en una subunidad y Reconocimiento + Metilación en otra subunidad diferenteReconocimiento + Metilación en otra subunidad diferente

Sitio de reconocimientoSitio de reconocimiento: no palindromo: no palindromo

Sitio de roturaSitio de rotura: separado del reconocimiento y diferente en : separado del reconocimiento y diferente en cada hebracada hebra

5’ CAT5’ CATGGAACGCCGCAGAAGAGAAG//TTAAC AC 3’TTAAC AC 3’3’ GTA3’ GTACTGCGCTGCGTCTTC AATTGTCTTC AATTG//TG 3’TG 3’ Hga IHga I

Mapas de RestricciónMapas de Restricción

COHESIVIDADCOHESIVIDAD

Capacidad de complementariedad entre extremos digeridos Capacidad de complementariedad entre extremos digeridos por enzimas de restricciónpor enzimas de restricción

El orden y simetría de los sitios de corte de las ER tipo II El orden y simetría de los sitios de corte de las ER tipo II tiene las siguientes consecuencias:tiene las siguientes consecuencias:

a) La generación de extremos protuberantes con a) La generación de extremos protuberantes con terminación de cadena sencilla que son complementarios terminación de cadena sencilla que son complementarios en configuración antiparalela pero identicos en paraleloen configuración antiparalela pero identicos en paralelo

5’5’GG AATTCAATTCNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG AATTC AATTC 3’3’3’3’CTTAACTTAA GGnnnnnnnnnnnnnnnnnnCTTAACTTAA G G 5’5’

COHESIVIDAD (2)COHESIVIDAD (2)

b) Los extremos de una molécula de DNA generados por b) Los extremos de una molécula de DNA generados por un ER puede tener complementariedad con otra molécula un ER puede tener complementariedad con otra molécula con el mismo extremo:con el mismo extremo:

MseI: MseI: TT//TAATAAAseI: AseI: ATAT//TAATAATT

BamHI: BamHI: GG//GATCGATCCCBgl II: Bgl II: AA//GATCGATCTTBcl I: Bcl I: TT//GATCGATCAASau 3AI: Sau 3AI: //GATCGATC


c) Recombinantes producto de dos ER con extremos c) Recombinantes producto de dos ER con extremos compatibles pueden perder secuencia original:compatibles pueden perder secuencia original:

BamHI: BamHI: GG//GATCGATCCCBgl II: Bgl II: AA//GATCGATCTT

Producen:Producen: GGATCTGGATCTAGATCCAGATCC

Y en consecuencia adquirir una nueva diana:Y en consecuencia adquirir una nueva diana:Mbo I o Sau3AI Mbo I o Sau3AI ((//GATCGATC))


d) Endonucleasas con sitios múltiples de reconocimiento d) Endonucleasas con sitios múltiples de reconocimiento que producen extremos heterogéneos:que producen extremos heterogéneos:

//CCCCAAGGGG//CCCCTTGGGG Eco RIIEco RII

GTGT//AGAGACACGTGT//ATATAC AC GTGT//CGCGAC AC GTGT//CTCTAC AC Acc IAcc I

CC//CCCGCGAAGGCC//CCCGCGGGG G CC//TTCGCGAAG G CC//TTCGCGGGG G Ava IAva I


e) Isosquizomería: Endonucleasas con identico sitio de e) Isosquizomería: Endonucleasas con identico sitio de reconocimientoreconocimiento

Hind III Hind III yy Hsu I: Hsu I: AA//AGCTTAGCTT

Pero que pueden tener diferente punto de corte:Pero que pueden tener diferente punto de corte:Sma ISma I CCCCCC//GGGGGGXma IXma I CC//CCGGGCCGGG

DNA ligasaDNA ligasa

Cataliza la formación de enlaces fosfodiester en moleculas de DNA de doble cadena entre extremos próximos cohesivos 3’-hidroxilo y 5’-fosfato

USO EN TECNOLOGÍARECOMBINANTE:- de E.coli (NAD como cofactor)- de fago T4 (ATP como energía)

DNA ligasa: DNA ligasa: condiciones de ligacióncondiciones de ligación

Una reacción de ligación rquiere de 3 ingredientes (además de agua):

1. Dos o mas fragmentos de DNA con extremos compatibles.

2. Un tampon conteniendo ATP. El tampon se prepara concentrado (10x) y tras la dilución proporciona una concentración de 0.25 a 1 mM.

3. T4 DNA ligase. Una reacción tipica para insertar un fragmento en un plamiso puede necesitar entre 0.01 (protuberantes solapantes) a 1 (romos) unidades de ligasa

La temperatura optima de incubación es de 16 ºC y cuando se desea una eficiencia alta se requiere esta temperatura. Sin embargo la ligasa es activa en un amplio rango de temperaturas y para reaccciones rutinarias se efectuan entre 4ºC y temperatura ambiente, dependiendo de de los tipos de secuencias a ligar


DEPENDENCIA DE LA TEMPERATURADEPENDENCIA DE LA TEMPERATURA

In vivo, la temperatura de la ligación óptima es de In vivo, la temperatura de la ligación óptima es de aproximadamente 37 ºC, aunque a esta temperatura el aproximadamente 37 ºC, aunque a esta temperatura el emparejamiento de bases es inestableemparejamiento de bases es inestable

En el laboratorio se ha de determinar una temperatura de En el laboratorio se ha de determinar una temperatura de compromiso entre la óptima y aquella que garantiza el compromiso entre la óptima y aquella que garantiza el emparejameinto de las bases: dependencia en el contenido emparejameinto de las bases: dependencia en el contenido en G+Cen G+C

Extremo protuberante AATT: 5Extremo protuberante AATT: 5--6ºC6ºC

Para clonación de vectores: 5Para clonación de vectores: 5--15ºC15ºC


DEPENDENCIA DE LAS CONCENTRACIONESDEPENDENCIA DE LAS CONCENTRACIONES

A una fuerza iónica (concentración salina) constante la A una fuerza iónica (concentración salina) constante la preferencia entre reacción intra o intermolecular depende de:preferencia entre reacción intra o intermolecular depende de:

1.1. Longitud del fragmento de DNALongitud del fragmento de DNA2.2. Concentración de DNAConcentración de DNA

A concentracion constante:A concentracion constante: Cuanto menor sea el fragmento se Cuanto menor sea el fragmento se favorecen reacciones intramoleculares (circularización).favorecen reacciones intramoleculares (circularización).

A longitud constante:A longitud constante: Según disminuye la concentración de Según disminuye la concentración de DNA se incrementa la probabilidad de circularización.DNA se incrementa la probabilidad de circularización.

Las reacciones bimoleculares son las preferidas entre un Las reacciones bimoleculares son las preferidas entre un vector y DNA lineal.vector y DNA lineal.


Teória de la reacción de policondensación intramolecularTeória de la reacción de policondensación intramolecular

j j (en g/l)(en g/l) = 51.1 x M= 51.1 x Mrr--1/21/2

Permite calcular la concentración “j” de un fragmento de DNA Permite calcular la concentración “j” de un fragmento de DNA a la cual se igualan las velocidades iniciales de las reaccionesa la cual se igualan las velocidades iniciales de las reaccionesbibi-- y monomolecular de circularizacción.y monomolecular de circularizacción.

CIRCULARIZACIÓNCIRCULARIZACIÓNDNA < j

OLIGOMERIZACIÓNOLIGOMERIZACIÓNDNA > jDNA < j DNA > j


Las reacciones bimoleculares entre monomeros de diferente Las reacciones bimoleculares entre monomeros de diferente longitud funcionan mejor cuando los dos substratos de la longitud funcionan mejor cuando los dos substratos de la reacción estan en cantidades equimolecularesreacción estan en cantidades equimoleculares

La longitud del fragmento más corto va a determinar la La longitud del fragmento más corto va a determinar la concentración de extremos del vector que se necesita para concentración de extremos del vector que se necesita para competir con la circularización monomolecular del fragmento competir con la circularización monomolecular del fragmento menor de la siguiente forma:menor de la siguiente forma:

[inserto] = (Mr inserto / Mr vector) x [vector][inserto] = (Mr inserto / Mr vector) x [vector]


Tamaño inserto Tamaño inserto [vector] µg/ml[vector] µg/mlkbkb LambdaLambda pBR322pBR322

31x1031x1066 Da Da 2.6x102.6x1066 DaDa

0.50.5 97509750 81381311 34473447 28628622 12181218 10210233 663663 555544 430430 363655 308308 26261010 109109 991515 5959 552020 3838 3.23.23030 2121 1.81.8

Enzimas modificantes de extremosEnzimas modificantes de extremos

Transferasa TerminalTransferasa Terminal

Nucleasas: Dnasa y RnasaNucleasas: Dnasa y Rnasa

Fosfatasa alcalinaFosfatasa alcalina

Polinucleótido quinasaPolinucleótido quinasa


Transferasa Terminal (TT)Transferasa Terminal (TT)

Añade colas homopolimericasAñade colas homopolimericas

Substrato:Substrato: extremos 3’ extremos 3’ --OH con al menos 3 bases OH con al menos 3 bases protuberantesprotuberantes

Condiciones de reacción:Condiciones de reacción: diferente para añadir diferente para añadir dAdA / / dTdT (Co(Co2+2+) ) o o dC dC / / dCdC (Mn(Mn2+2+))

Longitud de la cola:Longitud de la cola: entre 10 y 30 bases y puede ser entre 10 y 30 bases y puede ser monitorizada (electroforesis o marcaje)monitorizada (electroforesis o marcaje)


Transferasa Terminal (TT)Transferasa Terminal (TT)

------------------------------------------------------------------CTGCAGCTGCAG--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GACGTCGACGTC--------------------------------------------------------------------

Pst IPst I

----------------------------------------------------CTGCACTGCA3’3’ GG------------------------------------------------------------------------------------------------------------G G 3’3’ACGTCACGTC----------------------------------------------------

------------------------CTGCACTGCAGGGGGGGGGGGG3’3’ GG----------------------------------------G G 3’3’GGGGGGGGGGGGACGTCACGTC--------------

TTTT

Desoxyribonucleasa I (DNasa I)Desoxyribonucleasa I (DNasa I)

Endonucleasa de páncreas que hidróliza cadena doble o sencilla Endonucleasa de páncreas que hidróliza cadena doble o sencilla de DNA.de DNA.

No hidroliza RNANo hidroliza RNAPreferencialmente corta en enlaces adyacentes a residuos de C o Preferencialmente corta en enlaces adyacentes a residuos de C o

T (es por tanto una endonucleasa). T (es por tanto una endonucleasa). Con Mg hidroliza cada cadena independientemente al azarCon Mg hidroliza cada cadena independientemente al azarCon Mn hidroliza ambas cadenas en el mismo sitio y proporciona Con Mn hidroliza ambas cadenas en el mismo sitio y proporciona

extremos romos o protuberantes de 1 o 2 bases. extremos romos o protuberantes de 1 o 2 bases. Productos: di, tri y tetranucleótidos 5’Productos: di, tri y tetranucleótidos 5’--fosforilados. fosforilados.

Aplicaciones de la Dnasa I:Aplicaciones de la Dnasa I:

Elimina DNA de preparaciones de RNAElimina DNA de preparaciones de RNAAnaliza interacciones DNAAnaliza interacciones DNA--proteina mediante “Footprinting” de proteina mediante “Footprinting” de

DnasaDnasaIncision de DNA para marcaje de DNAIncision de DNA para marcaje de DNA

λλ--ExonucleasaExonucleasa5’5’--GpApApTpTGpApApTpTOHOH--3’3’ 5’5’--GpApApTpTGpApApTpTOHOH--3’3’

3’3’--CpTpTpApApCpTpTpApAp--5’5’ 3’3’--CpCp + Np+ Np--5’5’

Exonucleasa III Exonucleasa III (E. coli)(E. coli)5’5’--GpApApTpTGpApApTpTOHOH--3’3’ 5’5’--GGOHOH--3’3’ + Np+ Np--5’5’

3’3’--CpTpTpApApCpTpTpApAp--5’5’ 3’3’--CpTpTpApApCpTpTpApAp--5’5’

Exonucleasa Bal 31 Exonucleasa Bal 31 (Alteromonas)(Alteromonas)5’5’--GpApApTpTGpApApTpTOHOH--3’3’ 5’5’--pApApApAOHOH--3’3’ + Oligo y mono+ Oligo y mono3’3’--CpTpTpApApCpTpTpApAp--5’5’ 3’3’-- TpTpTpTp--5’5’ nucleótidosnucleótidos

S1S1-- Nucleasa Nucleasa (Aspergillus)(Aspergillus)5’5’--GGOHOH--3’3’ 5’5’--GGOHOH--3’3’

3’3’--CpTpTpApApCpTpTpApAp--5’5’ 5’5’--CpCp--5’5’

Nucleasa de alubia chinaNucleasa de alubia china5’5’--GpApApTpTGpApApTpTOHOH--3’ 3’ 5’5’--GpAGpAOHOH--3’3’

3’3’--CpTpCpTp--5’5’ 5’5’--CpTpCpTp--5’5’

Ribonucleasa A (RNasa A)Ribonucleasa A (RNasa A)

Endoribonucleasa de páncreas que hidróliza cadena sencilla de Endoribonucleasa de páncreas que hidróliza cadena sencilla de RNA al extremo 3’ de residuos de pirimidinas (C y T).RNA al extremo 3’ de residuos de pirimidinas (C y T).

Productos: mono y oligonucleótidos 3’Productos: mono y oligonucleótidos 3’--fosforilados. fosforilados.

Aplicaciones de la RNasa A:Aplicaciones de la RNasa A:

Elimina RNA de preparaciones de DNAElimina RNA de preparaciones de DNAMapeo de mutaciones en DNA o RNA mediante escisión de Mapeo de mutaciones en DNA o RNA mediante escisión de

desapareamiento: La RNAsa hidroliza el RNA en los híbridos desapareamiento: La RNAsa hidroliza el RNA en los híbridos de RNA:DNA en lugares de desapareamiento de una base y el de RNA:DNA en lugares de desapareamiento de una base y el producto puede ser analizadoproducto puede ser analizado

Fosfatasa alcalína: Fosfatasa alcalína: Hidroliza grupos fosfato 5’ de DNA, de RNA de nucleótidos y de Hidroliza grupos fosfato 5’ de DNA, de RNA de nucleótidos y de proteínas.proteínas.

5’5’--GGOHOH--3’3’ 5’5’--GGOHOH--3’3’

3’3’--CpTpTpApApCpTpTpApAp--5’5’ 3’3’--CpTpTpApACpTpTpApAOHOH--5’5’

3 ORIGENES:3 ORIGENES:

Bacteriano: Bacteriano: Es el enzima mas activo pero el mas dificil de destruir al Es el enzima mas activo pero el mas dificil de destruir al final de la reacción.final de la reacción.

Intestino de ternera.Intestino de ternera. Es la mas utilizada en biología molecular porque Es la mas utilizada en biología molecular porque aunque es menos activa que la bacteriana se inactiva por proteasaunque es menos activa que la bacteriana se inactiva por proteasas o as o mediante calor (75ºC 10 min). mediante calor (75ºC 10 min).

Gamba:Gamba: Se obtiene de una gamba de agua fría que permite que se Se obtiene de una gamba de agua fría que permite que se destruya facilmente por calor (65ºC 15 min).destruya facilmente por calor (65ºC 15 min).

Fosfatasa alcalína: Fosfatasa alcalína:

APLICACIONES:APLICACIONES:

Antes de una reacción de ligación permite eliminar los grupos 5’Antes de una reacción de ligación permite eliminar los grupos 5’--fosfato de vectores que han sido digeridos con enzimas de fosfato de vectores que han sido digeridos con enzimas de restricción. Previene la autorestricción. Previene la auto--ligación del vector y facilita la ligación ligación del vector y facilita la ligación de otros fragmentos dentro del vector.de otros fragmentos dentro del vector.

Eliminar los grupos 5’Eliminar los grupos 5’--fosfato de fragmentos de DNA antes de fosfato de fragmentos de DNA antes de marcarlos con fosfato radioactivo mediante la polinucleótido marcarlos con fosfato radioactivo mediante la polinucleótido quinasaquinasa

T4 Polinucleótido quinasa + T4 Polinucleótido quinasa + λλ--3232PP--ATPATPCataliza la transferencia de un grupo fosfato del ATP al extremoCataliza la transferencia de un grupo fosfato del ATP al extremo 5’ 5’ de DNA o de RNA.de DNA o de RNA.

Se utiliza en dos tipos de reacciones:Se utiliza en dos tipos de reacciones:La reacción directa:La reacción directa: Transferencia del fosfato gamma del ATP al extremo 5’ de Transferencia del fosfato gamma del ATP al extremo 5’ de un polinucleotido (DNA o RNA). un polinucleotido (DNA o RNA). En la reacción de intercambioEn la reacción de intercambio:: El ADN o RNA diana con un 5’fosfato se incuba El ADN o RNA diana con un 5’fosfato se incuba con exceso de ADP y el fosfato se desfosforila y se tranfiere alcon exceso de ADP y el fosfato se desfosforila y se tranfiere al ADP para formar ADP para formar ATP. Despues se realiza la reacción directa con ATP con fosfato ATP. Despues se realiza la reacción directa con ATP con fosfato marcado que se marcado que se transfiere al acido nucleíco.transfiere al acido nucleíco.

T4 Polinucleótido quinasa + T4 Polinucleótido quinasa + λλ--3232PP--ATPATPCataliza la transferencia de un grupo fosfato del ATP al extremoCataliza la transferencia de un grupo fosfato del ATP al extremo 5’ 5’ de DNA o de RNA.de DNA o de RNA.

APLICACIONES:APLICACIONES:

1)1) Fosforilación de linkers y adaptadores, o fragmentos de Fosforilación de linkers y adaptadores, o fragmentos de DNA como paso previo a la ligación que requiere un extremo DNA como paso previo a la ligación que requiere un extremo 5’fosfato. Los productos de PCR que se van a ligar 5’fosfato. Los productos de PCR que se van a ligar normalmente se generan con cebadores no fosforilados. normalmente se generan con cebadores no fosforilados.

2)2) Marcaje de oligonucleótidos (con Marcaje de oligonucleótidos (con 3232P) que se utiliza como P) que se utiliza como sondas de hibridación.sondas de hibridación.

DNA polimerasasDNA polimerasas

DNA polimerasa I de DNA polimerasa I de E. coliE. coliFragmento KlenowFragmento KlenowDNA polimerasa T4DNA polimerasa T4DNA polimerasa T7DNA polimerasa T7DNA polimerasas termoestablesDNA polimerasas termoestables

Poseen actividad polimerasa 5’Poseen actividad polimerasa 5’--3’3’y tambien actividades exonucleasas 5’y tambien actividades exonucleasas 5’--3’ y 3’3’ y 3’--5’.5’.

Trancriptasa reversaTrancriptasa reversa

DOS ACTIVIDADES:DOS ACTIVIDADES:

1)1) 3’5’ DNA polimerasa3’5’ DNA polimerasa

2) 2) Actividad RNasa HActividad RNasa H

Proceden de los retrovirusProceden de los retrovirusSon DNA polimerasas que usa RNA como cadena molde: fluye la Son DNA polimerasas que usa RNA como cadena molde: fluye la información genética en sentido reversoinformación genética en sentido reverso

Dos orígenes:Dos orígenes:Moloney Murine Leukemia Virus (MMoloney Murine Leukemia Virus (M--MuLV)MuLV)Avian Myeloblastosis Virus (AMV) Avian Myeloblastosis Virus (AMV)

Trancriptasas reversasTrancriptasas reversas

5’-CGUGCCUAAGGCUAGACCGAUUCGCAAAAAAAAAAAA-3’ RT + dATP + dCTP + dGTP + dTTP3’-TTTTTTTTTTTTTT-5’

5’-CGUGCCUAAGGCUAGACCGAUUCGCAAAAAAAAAAAA-3’

3’-GCACGGATTCCGATCTGGCTAAGCGTTTTTTTTTTTTT-5’

Con Oligo dt(18)Con Oligo dt(18) Hexameros al azarHexameros al azar

[RNA][RNA] [RNA][RNA]

Genoteca de cDNA: Genoteca de cDNA: DNA genomico vs DNA complementarioDNA genomico vs DNA complementario

Genoteca de cDNA: Genoteca de cDNA: Expresión diferencial de genes en tejidosExpresión diferencial de genes en tejidos

Genoteca de cDNA: Genoteca de cDNA: Clonación de diferentes transcritosClonación de diferentes transcritos

Genoteca de cDNA: Genoteca de cDNA: Identificación de diferentes transcritosIdentificación de diferentes transcritos

Genoteca de cDNA: Genoteca de cDNA: Identificando función de diferentes transcritosIdentificando función de diferentes transcritos

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