·论著· ho-1修饰的bmmsc对大鼠小肠移植 免疫功能的影响...·108·...
TRANSCRIPT
·108· 《实用器官移植电子杂志》 2018 年 3 月第 6 卷第 2 期 Prac J Organ Transplant（Electronic Version）， March 2018，Vol.6，No.2
·论著·
HO-1 修饰的 BMMSC 对大鼠小肠移植免疫功能的影响
宋红丽 1，杨洋 1，尹明丽 1，郑卫萍 1，刘涛 2，董冲 1，沈中阳 1（1. 天津市第一中心医院器官移植外科，天津市器官移植重点实验室，天津市器官移植临床医学研究中心，天津 300192 ；2. 天津市第一中心医院，卫生部危重病急救医学重点实验室，天津 300192）
【摘要】 目的 探讨在小肠移植排斥反应中血红素加氧酶 -1（HO-1）是否能增强骨髓间充质干细胞
（BMMSC）对移植免疫功能的影响。方法 建立异位大鼠小肠移植排斥反应模型，实验分为生理盐水组 （NS）、
BMMSC 组和 HO-1/BMMSC 组，经阴茎背静脉给予输注 BMMSC 和 HO-1/BMMSC，观察术后各组移植小肠
组织病理、调节 T 细胞（Tregs）、自然杀伤细胞（NK）及细胞因子的改变。结果 小肠移植急性排斥反
应模型组术后 5 天发生轻至中度的急性排斥反应，术后 7 天发生中至重度的急性排斥反应，术后第 10 天
发生重度的急性排斥反应。HO-1/BMMSC 处理组与 BMMSC 处理组相比，显著提高了 BMMSC 保护移植
小肠的作用 ；并且 NK 细胞活性显著下降而 Tregs 水平显著升高 ；细胞因子白细胞介素 -10（IL-10）、转
化生长因子 -β（TGF-β）显著上升而白细胞介素 -2（IL-2）、白细胞介素 - 6（IL-6）、白细胞介素 -17
（IL-17）、白细胞介素 -23（IL-23）、肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）及 γ- 干扰素（IFN-γ）则显著降低。
结论 HO-1/BMMSC 能够更好地发挥移植免疫抑制作用，HO-1 可增强 BMMSC 抑制小肠移植急性排斥
反应大鼠体内免疫功能的作用。
【关键词】 小肠移植 ； 急性排斥反应 ； 骨髓间充质干细胞 ； 血红素加氧酶 -1 ； 大鼠免疫功能
Effects of HO-1 modified BMMSC on the immunological function of small bowel transplantation in rats
Song Hongli1，Yang Yang1，Yin Mingli1，Zheng Weiping1，Liu Tao2，Dong Chong1，Shen Zhongyang1. 1.Liver
Transplantation Department of Tianjin First Center Hospital，Tianjin Key Laboratory for Organ Transplantation,
Tianjin Clinical Research Center for Organ Transplantation, Tianjin 300192，China ；2. Tianjin First Center Hospital，
Key Laboratory for Critical Care Medicine of the Ministry of Health, Tianjin 300192，China
Corresponding author：Shen Zhongyang，Email：[email protected]
【Abstract】 Objective To investigate whether heme oxygenase-1（HO-1） could enhance the
immunosuppressive effects of bone marrow mesenchymal stem cells （BMMSC） on the rejection of transplanted
small bowel allograft in rats. Methods The rejection model of ectopic small bowel transplantation in rats was
established， then BMMSC or HO-1/BMMSC were transfused via the dorsal penis vein. The histopathological
changes of the transplanted small bowel and the change of regulatory T cell （Tregs）， natural killer cell （NK） and
cytokines after transplantation were observed in different groups. Results The acute rejection model rats after
small bowel transplantation showed mild to moderate on post operation day 5（POD5） and severe acute rejection
on POD7. BMMSC showed strong protective effects on rejection within the first 7 days after transplantation， and
DOI：10.3969/j.issn.2095-5332.2018.02.006
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81670574，81441022，81270528）；国家国际科技合作专项项目（2015DFG31850）；
天津市科技计划项目（14RCGFSY00147）；天津市器官移植临床医学研究中心（15ZXLCSY00070）
通讯作者：沈中阳，Email：[email protected]
·109·《实用器官移植电子杂志》 2018 年 3 月第 6 卷第 2 期 Prac J Organ Transplant（Electronic Version）， March 2018，Vol.6，No.2
小 肠 移 植（small bowel transplantation，SBT）
是公认的能够挽救小肠功能衰竭合并全胃肠外营
养并发症患者的有效治疗手段［1-2］。但由于小肠
富含淋巴组织以及肠腔内存在大量细菌，小肠
移植排斥反应明显，目前尚无有效的控制手段。
现有的免疫抑制治疗效果不佳，并会带来一些
相应的风险，如恶性肿瘤、感染及高额费用等，
这些将会严重影响小肠移植受者长期的存活率，
也制约了小肠移植事业的发展。免疫耐受是一
种受体免疫系统对移植物长期特异性的不应答
状态，仍然具有正常的针对其他外来抗原的免
疫应答能力。因此，如何诱导一种持久稳定且
无需药物的免疫耐受是迫切需要解决的问题［3］。
骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal
stem cell，BMMSC）在器官移植中具有重要的应
用价值［4］。BMMSC 具有低免疫原性，对于抑制
器官移植后 T 细胞介导的免疫排斥具有一定的效
果［5-6］。其能够通过分泌一些免疫抑制细胞因子
如 白 细 胞 介 素 -10（interleukin-10，IL-10）、 转
化 生 长 因 子 -β（transforming growth factor-β，
TGF-β）等以及干扰辅助性 T 淋巴细胞的分化来
诱导免疫耐受［7-8］，是一种具有应用前途的治疗方
法。但也有报道单纯 BMMSC 输注在组织内的活
性偏低［9］，而研究证明，应用基因工程方法干预
BMMSC 的基因表达是一个有效的方法［10］。血红素
加氧酶 1（hemeoxygenase 1， HO-1）是一种具有免
疫调节作用的活性因子，参与器官移植后免疫耐受
的调控过程［11］。HO-1 可以转染到 BMMSC 上，并
增强 BMMSC 的活性，从而增强其免疫调节和抗氧
化能力，同时还可以延长其作用时间［12］。
本研究在单纯应用 BMMSC 保护小肠移植排斥
反应的基础上，以腺病毒为载体将大鼠 HO-1 基因
体外转染 BMMSC 形成 HO-1/BMMSC，研究其对大
鼠异位小肠移植排斥反应的影响，探讨 HO-1 是否
能增强 BMMSC 在移植免疫中的调节作用以及其作
用机制。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和实验器材：DMEM/F12（1：1）培养
基（Hyclone，美国），胎牛血清（PAA，澳大利亚），
谷氨酸胺、青霉素 / 链霉素双抗混合液（Gibco，美国），
胰蛋白酶消化液、二甲基亚砜、磷酸盐缓冲溶液
（Sigma，美国），10× 红细胞裂解液（BD，美国），
大鼠 IL-10、TGF-β、白细胞介素 -2（interleukin-2，
IL-2）、白细胞介素 -17（interleukin-17，IL-17）、白细
胞介素-23 （interleukin-23，IL-23）及肿瘤坏死因子-α
（tumor necrosis factor-α，TNF-α）试剂盒（Santa cruz
biotechnology，美国），表达大鼠HO-1的重组腺病毒 （上
海吉凯基因化学技术有限公司，中国）。Leica c0269
手术显微镜（Leica microsystems AG，德国），显微手
术器械 （金钟医疗器械，中国），正置荧光显微镜（Nikon
Ni-U，日本），流式细胞仪（BD FACSCalibur，美国），
酶标仪（Bio Tek Synergy 2，美国）。
1.2 实验动物、分组及处理 ：实验动物购自军事
医学科学院实验动物中心 SPF 级健康雄性 BN 大鼠
a downward trend since POD10. While HO-1/BMMSC showed stronger effects than BMMSC， which provided
enhanced protective effects on the transplanted small bowel. In addition， the activity of natural killer （NK）
cell decreased significantly， the levels of regulatory T cells（Tregs）， interleukin-10（IL-10） and transforming
growth factor-β（TGF-β） increased significantly， and the levels of interleukin-2（IL-2）， interleukin-6
（IL-6）， interleukin-17（IL-17）， interleukin-23（IL-23）， tumor necrosis factor -α（TNF-α） and interferon-γ
（IFN-γ）decreased significantly in the HO-1/BMMSC group， when compared with the BMMSC group.
Conclusion HO-1/BMMSC showed better immunosuppressive effects after transplantation. HO-1 could enhance
the effects of BMMSC inhibiting the immune response of acute rejection in ectopic small bowel transplantation model
of rats.
【Key words】 Small bowel transplantation ； Acute rejection ； Bone marrow mesenchymal stem cells ；
Heme oxygenase-1； Rat immune function
·110· 《实用器官移植电子杂志》 2018 年 3 月第 6 卷第 2 期 Prac J Organ Transplant（Electronic Version）， March 2018，Vol.6，No.2
（RT-1n）及雄性 Lewis 大鼠（RT-11），BN 大鼠体
重 180 ～ 200 g，Lewis 大鼠 200 ～ 220 g。动物购
进后置于光照与黑暗每 12 小时循环的环境，适应
性喂养7天。以 BN 大鼠为供体，Lewis 大鼠为受体，
建立异基因（allogeneic，Allo）急性排斥反应模
型，实验鼠术后经阴茎背静脉注射生理盐水或细胞，
供受体术前分别禁食 24 小时和 12 小时。实验分为
生理盐水 （NS） 组、BMMSC 组和 HO-1/BMMSC 组，
每组分别在 0、1、5、7、10 天各个时间点分配
5 只实验鼠。实验各组均选择输注细胞 5×106/ml
剂量（1 ml/ 只鼠），对照组输注 NS（1 ml/ 只鼠）。
观察移植术后各个时间点分别处死的实验大鼠，收
集外周静脉血及组织标本。
1.2.1 异位小肠移植动物模型的建立方法同之前的
研究［7］。将供体小肠的肠系膜上动脉及门静脉分
别于受体大鼠的腹主动脉及下腔静脉做端侧吻合。
吻合完毕后开放血流，于下腹两侧腹壁分别戳孔将
移植肠两断端牵引出腹腔行造瘘。温生理盐水冲洗
腹腔后关腹。烤灯加温保暖至受体大鼠清醒。
1.2.2 受体术后护理 ：术后给予单笼喂养，清醒后
即可自由饮水，12 小时后给予自由进食。定期清
洗消毒笼具并更换敷料保持清洁。每天至少巡视
3 次，对堵塞的造瘘口进行护理。观察移植大鼠术
后的生存状态并记录各组大鼠生存时间。
1.3 实验方法
1.3.1 BMMSC 的 提 取、 培 养 以 及 HO-1 转 染
BMMSC 与验证的方法参照我们之前的研究［10］。应
用免疫细胞化学荧光染色检测 HO-1/BMMSC 中
HO-1 的表达，步骤如下 ：将灭菌后的盖玻片置于
无菌的培养皿底部，取 5 ml 腺病毒载的 HO-1 转
染的 BMMSC 悬液（密度为 1×106/ml）加入培养
皿进行爬片 ；待细胞生长融合后用 PBS 漂洗 3 次 ；
4% 多聚甲醛处理 20 分钟，漂洗；0.5% Txiton X-100
室温处理20分钟，漂洗；3% H2O2 室温处理15分钟，
漂洗 ；100 ml/L 正常羊血清封闭液封闭 l 小时 ；在
玻片上滴加浓度为 1：100 的兔抗鼠 HO-1 抗体，4℃
冰箱过夜；漂洗后滴加浓度为 1：400 的 PE 标记的
羊抗兔免疫荧光抗体，37℃水浴箱中避光孵育 1 小
时 ；漂洗后封片，于荧光显微镜下观察红色荧光。
1.3.2 组织病理学检测及急性排斥反应评分 ：分别
于术后 1、5、7、10 天搜集各组移植肠标本行组织
病理学检测，光学显微镜观察组织病理学改变，按
急性排斥评分标准对各组大鼠各时间点排斥反应程
度进行评分并进行统计学分析。
光学显微镜下随机选择 5 个视野观察两组动物
在各时间点的病理改变，并根据 Wu 等［13］报道的
小肠移植排斥评分标准进行排斥反应评分。此标准
依据黏膜层及黏膜下层细胞浸润、腺窝上皮损伤、
腺窝凋亡小体形成、结构破坏及黏膜溃疡程度，将
小肠移植排斥反应程度划分为不明确的、轻度的、
中度的以及重度的排斥反应。
1.3.3 受体大鼠 NK 细胞活性检测 ：提取各组受体
鼠脾脏淋巴细胞与靶细胞 YAC-1 细胞共培养，通
过测定乳酸脱氢酶的释放量计算 NK 细胞的活性，
统计学分析各组间差异。
1.3.4 免疫相关细胞因子检测 ：酶联免疫吸附试
验（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）检
测各组大鼠在各时间点血清的 IL-10、TGF-β、
IL-2、IL-17、IL-23 及 TNF-α 的水平。具体步骤
按照试剂盒说明书操作。
1.3.5 流式细胞术检测脾脏 Tregs 水平 ：分离受体
鼠脾淋巴细胞，PBS 重悬至 1×107/ml，取 0.1 ml 分
别加入抗 CD4 抗体 0.5 μl，抗 CD25 抗体 0.625 μl，
4℃避光孵育30分钟。PBS 洗涤后加入穿孔素1 ml，
4℃避光孵育过夜。PBS 洗涤并定容至 0.1 ml，加入
抗 Foxp3 抗体 5 μl，4℃避光孵育 2 小时。PBS 洗
涤后固定于 4% 的多聚甲醛等待上机检测。流式细
胞术检测其中 CD4+、CD25+、Foxp3+ 和 Tregs 的变化，
统计学分析各组间差异。
1.4 统计分析：用 GraphPad Prism 5.0软件进行数据
分析和图片制作，应用 SPSS 统计学软件（19.0版）
进行统计学分析。数据比较如为两组间的，则用
Student's t 检验；如为3组及以上，则用单因素方差分
析 （One-Way ANOVA）。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 体外提取 BMMSC 和制备 HO-1/BMMSC
·111·《实用器官移植电子杂志》 2018 年 3 月第 6 卷第 2 期 Prac J Organ Transplant（Electronic Version）， March 2018，Vol.6，No.2
2.1.1 大鼠 BMMSC 的培养和鉴定 ：体外成功培养
和扩增出大鼠 BMMSC。可从以下三个方面对其进
行鉴定：① 细胞贴壁生长，传代后的细胞呈长梭形，
部分呈漩涡或菊花状排列，具备典型的 BMMSC 形
态特征 （图 1a）。② 细胞能够诱导分化成为脂肪
细胞（油红 O 染色显示胞浆内出现红色脂滴，图
1b）和成骨细胞（von Kossa 染色显示细胞中出
现黑色钙盐） （图 1c）。③ 细胞表面标记检测显示
CD29+CD34-、CD90+CD45- 和 RT1A+RT1B- 的阳性
率分别为 99.5%、99.8% 和 98.5% （图 1g，h，i）。
2.1.2 重组腺病毒载体能够成功介导 HO-1 基因
到 BMMSC 中 ：用表达 HO-1 基因的重组腺病毒感
染 BMMSC，Ad-GFP 作为对照。感染后 48 小时观
察细胞，荧光显微镜发现细胞中绿色荧光表达阳性
率＞ 80% （图 1d），免疫组化检测发现 Adv-HO-1/
BMMSC 组红色标记的 HO-1 表达量明显高于单纯
Adv/BMMSC 组（图 1e ~ f），HO-1 基因表达明显
上调，表达量约为对照细胞的 5 倍。以上这些结果
表明腺病毒介导的 HO-1成功在 BMMSC 中过表达。
HO-1 转染成功，为下一步实验打下基础。
图 2 各组移植小肠病理表现（100×）
2.2 大鼠小肠移植排斥反应模型建立成功
2.2.1 一般表现和生存时间 ：BMMSC 治疗在一
定程度上减轻了移植大鼠的急性排斥症状，受体
大鼠的精神状态、活动以及对外界刺激的反应均
有一定程度的好转，生存率也有显著提高，但总
体效果还是不太令人满意。HO-1/BMMSC 组的
观察结果则十分令人鼓舞，在整个观察期内，大
部分受体鼠的生存状况良好，没有出现典型的急
性排斥反应症状。各组的中位生存时间分别为 ：
NS 组 10 天、BMMSC 组 15 天和 HO-1/BMMSC 组
24 天。HO-1/BMMSC 治疗进一步提高了移植大鼠
的生存率，与 BMMSC 组相比，差异具有统计学
意义。
2.2.2 各组移植小肠的病理表现（图 2）：NS 组移
植肠表现为进行性加重的急性排斥反应。黏膜及黏
膜下层逐渐加重的炎性细胞浸润，腺窝上皮损伤及
凋亡小体形成，小肠绒毛破坏以及黏膜溃疡出血。
BMMSC 组移植肠在 5 天及 7 天时的病理改变大大
减轻，一般仅有少至中等量的炎性细胞浸润以及有
限的腺窝上皮损伤及凋亡等轻至中度的排斥反应表
现，而 10 天时虽然也相对好转，但依然表现出中至
重度的急性排斥反应。HO-1/BMMSC 治疗组在各时
间点的病理学表现较 BMMSC 组明显改善，特别是
在第 10 天，仅有少数发展为中度急性排斥反应。
图 1 BMMSCs 形态、特性、表型及转染 HO-1
a ：三 代 BMMSCs 形 态 表 现（100×）；b ：BMMSCs 的 成 脂 性 验证（200×）；c: BMMSCs 成骨性验证（200×）；d ：转染 HO-1 的BM MSCs 的暗场（100×）；e ：未转染 HO-1 的 BMMSCs 组 HO-1的表达情况（200×）；f ：转染 HO-1 的 BMMSCs 组 HO-1 的表达情况（200×），表达量明显高于未转染组。BMMSCs 表型检测 ： g：CD29+CD34；阳性率为 99.5%；h：CD90+CD45 阳性率为 99.8%； i ：RT1A+RT1B 阳性率为 98.5%。e 和 f 中红色为 HO-1 蛋白染色，蓝色为细胞核染色
ig h
·112· 《实用器官移植电子杂志》 2018 年 3 月第 6 卷第 2 期 Prac J Organ Transplant（Electronic Version）， March 2018，Vol.6，No.2
图 3 受体脾中 Tregs 水平
a．术后各时间点 HO-1/BMMSC 组大鼠脾脏中 Tregs 流式散点图 ；b．各组大鼠 Tregs 表达水平统计图（与 NS 组
比较 aP ＜ 0.05，与 BMMSC 组比较 bP ＜ 0.05）
BMMSC 组血清 IL-10 及 TGF-β 等与抗炎或 Tregs
分化相关的细胞因子表达水平较对照组进一步升
高。而与促炎或 Th17 分化相关的细胞因子 IL-2、
TNF-α及 IFN-γ上升幅度较BMMSC组显著缩小，
仅有小幅上升，IL-6、IL-17 及 IL-23 呈现下降或
较小幅度的波动，而不是如 BMMSC 组出现先下降
后上升的趋势，且总体水平较 BMMSC 组表达水平
则明显降低。差异具有统计学意义。
a
b
图 4 血清中各细胞因子水平（与 NS 组相比，aP ＜ 0.05 ；与 BMMSC 组相比，bP ＜ 0.05 ；与 HO-1/BMMSC 相比，cP＜ 0.05）
abc abc abcab
ab
ab
abc
abc
abc abc
abcabc
abc
abcabc
abc
abcab abc
abc abcabc abc
abc
abc
abc
a
ab
a
a
aab
abab
2.3 BMMSC 过表达 HO-1 诱导大鼠脾脏 Treg 细
胞高水平持久表达 ：经流式细胞术检测发现，
BMMSC 治疗显著增加了 CD4+、CD25+、Foxp3+ 和
Tregs 的表达水平，在 7 天时达到峰值，10 天时出
现回落现象（图 3a）。HO-1/BMMSC 组 Tregs 水平
呈现快速稳步上升，10 天时依然保持在高水平。
统计学分析显示，HO-1/BMMSC 组较 BMMSC 组进
一步提高了 Tregs 表达，尤其在第 10 天，差异具
有统计学意义（图 3b）。
2.5 过表达 HO-1 增强 BMMSC 对大鼠 NK 细胞
活性的抑制（图 5）：BMMSC 的治疗虽显著抑制了
NK 细胞活性，但在 7 天和 10 天时，NK 细胞活性
依然呈现较大幅度的上升趋势， BMMSC 组大致情
况与此类似。HO-1/BMMSC 组 NK 细胞活性在观
察期内则无明显大幅上升趋势，仅仅是围绕正常水
平上下波动。统计分析结果表明，NK 细胞活性在
HO-1/BMMSC 组进一步降低至接近正常范围，差
异具有统计学意义。
2.4 过表达 HO-1 增强 BMMSC 对大鼠血清中细胞
因子的调节（图 4）：ELISA 检测结果发现，HO-1/
·113·《实用器官移植电子杂志》 2018 年 3 月第 6 卷第 2 期 Prac J Organ Transplant（Electronic Version）， March 2018，Vol.6，No.2
图 5 NK 细胞活性
与 NS 组比较 aP ＜ 0.05，与 BMMSC 组比较 bP ＜ 0.05
aa
a
abab
ab
3 讨 论
尽管随着新型免疫抑制剂的问世和不断发展，
目前临床小肠移植排斥反应得到了较好的控制，但
排斥反应的发生率依然很高。有报道称小肠移植术
后的急、慢性排斥反应的发生率分别可达 90% 及
30% ～ 50%［14］。而长期使用免疫抑制剂增加了发
生高血压、肾毒性、神经毒性、术后肿瘤以及代谢
性疾病等不良反应的风险［15］。因此，寻找一种全
新的不良反应少的免疫抑制策略显得尤为必要。
由于干细胞（mesenchymal stem cell， MSC）具
有低免疫原性、较低的抗原提呈能力以及独特的免
疫调节作用，使其能够在体内及体外影响免疫系统，
如 T 细胞、B 细胞、NK 细胞、单核细胞以及树
突状细胞［16-18］，从而逃避免疫识别，抑制免疫应
答［19］。目前，MSC 已经被应用于几乎所有的器官
移植基础研究中，同时发现体内移植的 MSC 具有
归巢的特点，在多种因素的作用下，外源性的或
自体的 MSC 能够定向趋向性迁移并定植于靶向组
织［20-21］。并被证实在减轻移植免疫及诱导器官移
植免疫耐受上发挥重要作用［22］。
MSC 能够迁移至炎症性的结肠并发挥抗炎及
调节免疫的作用［23］，但其肠道定植率极低，MSC
被认为至少是部分通过旁分泌发挥治疗作用的。同
时，由于局部组织的缺血、缺氧以及炎症反应，
MSC 移植后的存活率极低，移植后 4 天存活的细
胞数量明显下降，而只有不到 1% 的细胞存活超过
1 周［24］。无论 MSC 是通过何种途径发挥其再生、
抗炎以及免疫调节作用的，其效应均严重受限于体
内低下的生存率。我们的研究中发现，BMMSC 虽
然减轻了小肠移植大鼠的急性排斥反应，但这种
效应维持的时间较为有限，一般在 7 天内效果比较
显著，而 7 天后便大大减弱。病理学检测 10 天时，
BMMSC 治疗组组织结构破坏严重，大量炎性细胞
浸润，凋亡细胞较前显著增多，表现为中至重度的
排斥反应。排斥评分虽较 NS 组降低，但受体鼠的
生存状况及病理学改变均较前显著加重。各种检测
结果提示，BMMSC 组在抑制 NK 细胞活性、调节
细胞因子表达水平以及诱导 Tregs 生成等方面均不
能维持 1 周内的良好态势。这均与 BMMSC 移植体
内 1 周后存活率显著降低有关。为了改善 BMMSC
移植体内后的生存率，我们的研究引入了 HO-1 这
种细胞保护性的基因。
HO-1 是 HO 的诱导型，是一种细胞保护性酶，
通过发挥抗炎、抗凋亡、抗氧化应激以及抗缺血 /
再灌注损伤等效应而起到保护细胞的作用［25-27］。
研究发现，HO-1 对各种原因引起的肠道损伤同
样具有保护及修复作用，其主要机制包括抗氧
化、抗炎、抗凋亡以及调节微循环的作用等［28-30］。
另外，HO-1 对 MSC 具有调控作用，能够在缺氧
和氧化应激状态下减轻 MSC 的凋亡［31］。然而，
在器官移植的研究中，HO-1 亦具有减轻排斥反
应、延长移植物存活时间甚至诱导移植物免疫耐
受的作用［32-33］。本研究将 HO-1 通过基因工程修
饰 BMMSC，一方面希望借助这种具有细胞保护作
用的酶能够提高 BMMSC 在小肠移植大鼠体内的
存活率，另一方面希望 HO-1 与 BMMSC 两者的免
疫抑制效应叠加，从而发挥更强大的免疫抑制效
应，进而更好地控制小肠移植排斥反应。结果发现，
小肠移植排斥反应中，NK 细胞是参与其中的效应
细胞之一，使用未处理的 BMMSC 治疗时，NK 细
胞的活性虽有显著降低，但依然呈现出上升的趋势，
而使用 HO-1 基因转染的细胞治疗后，NK 细胞的
活性被抑制在正常范围内，并没有出现大幅度地升
高，我们推测这是因为 BMMSC 在体内的存活时间
延长发挥了更持久的免疫抑制作用，同时也可能与
·114· 《实用器官移植电子杂志》 2018 年 3 月第 6 卷第 2 期 Prac J Organ Transplant（Electronic Version）， March 2018，Vol.6，No.2
过表达的 HO-1 的免疫调节相关。
器官移植中移植物排斥反应是由 T 细胞介导
的针对供体抗原的免疫反应，Th1、Th2、Th17 及
Tregs 等 CD4+ 的 Th 细胞分别发挥着不同的免疫效
应，Th1/Th2 及 Th17/Treg 的比率在调节 T 细胞免
疫反应中发挥重要的作用［34］。Th1 细胞主要分泌
IL-2、IFN-γ 以及 TNF-α，而 Th2 细胞主要分泌
IL-4、IL-10 以及 IL-13。Th1/Th2 比率及二者相关
细胞因子常被用来解释器官移植免疫相关现象［35］。
Th17 细胞的特点是分泌细胞因子 IL-17、IL-21 及
IL-22［36］，其分化需要 TGF-β 和 IL-6 的参与［37］，
其表型的稳定需要 IL-23、TNF-α 及 IL-1β［38］。
Tregs 则通过分泌 IL-10 及 TGF-β 产生抗炎效应
及促进自我耐受。Th17 细胞及其细胞因子 IL-6、
IL-17 及 IL-23 可能介导移植排斥［39］。而 Tregs
则可能阻止排斥反应的发生，甚至诱导并维持免
疫耐受［40］。MSC 的免疫调节作用与 Tregs 的扩
增相关，其中一些研究中 MSC 可以诱导 Foxp3+
和 Tregs 依赖性的免疫耐受［41］。本研究中，炎症
相关性细胞因子以及 Th 分化相关的细胞因子在
BMMSC 与 HO-1/BMMSC 治疗作用下均发生显著变
化。具体来说，IL-10 和 TGF-β 的浓度显著升高，
而 IL-2、IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α 及 IFN-γ
浓度显著降低。不同的是，与单纯 BMMSC 组相比，
HO-1/BMMSC 组中升高 IL-10、TGF-β 以及降低
IL-2、IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α 及 IFN-γ 浓
度更显著，甚至不同程度地逆转了 IL-6、IL-17
和 IL-23 的上升趋势。Tregs 的变化也十分显著，
HO-1/BMMSC 不仅进一步上调了 Tregs 的表达，而
且其高水平表达更为稳定持久。我们推测以上这些
效应与 HO-1 保护 BMMSC 并增强其免疫调节的作
用有关。
总之，本研究中与单独 BMMSC 相比，HO-1/
BMMSC 组对小肠移植排斥反应的抑制作用更强
大更持久。主要是通过抑制免疫细胞如 NK 细胞、
Treg 细胞和细胞因子发挥作用的。
参考文献
［1］ Yildiz BD. Where are we at with short bowel syndrome and small
bowel transplant［J］. World J Transplant， 2012， 2（6）： 95-103.
［2］ 杨洋 , 沈中阳 , 宋红丽 . 大鼠小肠移植动物模型的进展［J/CD］.
实用器官移植电子杂志，2016，4（4）：93-96.
［3］ Alican F，Hardy JD，Cayirli M，et al. Intestinal transplantation ：
laboratory experience and report of a clinical case［J］. Am J
Surg，1971，121（2）：150-159.
［4］ Lee MW，Ryu S，Kim DS，et al. Strategies to improve the
immunosuppressive properties of human mesenchymal stem
cells［J］. Stem Cell Res Ther， 2015， 6（1）： 1-10.
［5］ Liu W，Song F，Ren L，et al. The multiple functional roles
of mesenchymal stem cells in participating in treating liver
diseases［J］. J Cell Mol Med， 2015， 19（3）： 511-520.
［6］ English K， Wood K J. Mesenchymal stromal cells in transplantation
rejection and tolerance［J］. Cold Spring Harb Perspect Med，
2013， 3（5）： a015560.
［7］ Yang Y， Song H L， Zhang W， et al. Reduction of acute rejection
by bone marrow mesenchymal stem cells during rat small bowel
transplantation［J］. PloS one， 2014， 9（12）： e114528.
［8］ Wang L， Zhao Y， Shi S. Interplay between mesenchymal stem
cells and lymphocytes implications for immunotherapy and tissue
regeneration［J］. J Dent Res， 2012， 91（11）： 1003-1010.
［9］ Li X， Xiao Y， Cui Y， et al. Cell membrane damage is involved in the
impaired survival of bone marrow stem cells by oxidized low‐density
lipoprotein［J］. J Cell Mol Med，2014，18（12）： 2445-2453.
［10］ 付楠楠，宋红丽，吴本娟，等 . HO-1 修饰的大鼠骨髓间充质干
细胞在体外对淋巴细胞的影响［J］. 中华微生物学和免疫学杂
志，2013，33 （11）：801-806.
［11］ Zhang J，Huang X，Wang H，et al. The challenges and promises
of allogeneic mesenchymal stem cells for use as a cell-based
therapy［J］. Stem Cell Res Ther，2015，6（1）：1-7.
［12］ Zeng B，Lin G，Ren X，et al. Over-expression of HO-1 on
mesenchymal stem cells promotes angiogenesis and improves
myocardial function in infarcted myocardium［J］. J Biomed Sci，
2010， 17（1）：80-88.
［13］ Wu T，Abu-Elmagd K，Bond G，et al. A schema for histologic
grading of small intestine allograft acute rejection［J］.
Transplantation，2003，75（8）：1241-1248.
［14］ Tzvetanov IG，Oberholzer J，Benedetti E. Current status of
living donor small bowel transplantation［J］. Curr Opin Organ
Transplant，2010，15（3）：346-348.
［15］ Webber A，Hirose R，Vincenti F. Novel strategies in
immunosuppression ： issues in perspective［J］. Transplantation，
2011，91（10）：1057-1064.
［16］ Uccelli A，Moretta L，Pistoia V. Immunoregulatory function of mesenchymal stem cells［J］. Eur J Immunol，2006，36（10）： 2566-2573.
［17］ Le Blanc K，Tammik L，Sundberg B，et al. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and
·115·《实用器官移植电子杂志》 2018 年 3 月第 6 卷第 2 期 Prac J Organ Transplant（Electronic Version）， March 2018，Vol.6，No.2
宋红丽，杨洋，尹明丽，郑卫萍，刘涛，董冲，沈中阳. HO-1修饰的BMMSCs对大鼠小肠移植免疫功能的影响［J/CD］.实用器官
移植电子杂志，2018，6（2）：108-115.
mitogenic responses independently of the major histocompatibility
complex［J］. Scand J Immunol，2003，57（1）：11-20.
［18］ Le Blanc K，Samuelsson H，Gustafsson B，et al. Transplantation of
mesenchymal stem cells to enhance engraftment of hematopoietic
stem cells［J］. Leukemia， 2007， 21（8）： 1733-1738.
［19］ Lazarus HM，Koc ON，Devine SM，et al. Cotransplantation of
HLA-identical sibling culture-expanded mesenchymal stem
cells and hematopoietic stem cells in hematologic malignancy
patients［J］. Biol Blood Marrow Transplant，2005，11（5）：
389-398.
［20］ Karp JM， Teo GSL. Mesenchymal stem cell homing： the devil is in
the details［J］. Cell stem cell， 2009， 4（3）： 206-216.
［21］ Cornelissen A S， Maijenburg M W， Nolte M A， et al. Organ-specific
migration of mesenchymal stromal cells ： Who， when， where and
why?［J］. Immunology letters， 2015， 168（2）： 159-169.
［22］ Wood K J， Bushell A， Hester J. Regulatory immune cells in
transplantation［J］. Nat Rev Immunol， 2012， 12（6）： 417- 430.
［23］ Castelo-Branco MTL， Soares IDP， Lopes DV， et al.
Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal
stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate
experimental colitis［J］. PLoS One， 2012， 7（3）： e33360.
［24］ Li X，Xiao Y，Cui Y，et al. Cell membrane damage is involved
in the impaired survival of bone marrow stem cells by oxidized
low‐density lipoprotein［J］. J Cell Mol Med，2014，18（12）：
2445-2453.
［25］ Liu B，Qian JM. Cytoprotective role of heme oxygenase-1 in liver
ischemia reperfusion injury［J］ . Int J Clin Exp Med，2015，8（11）：
19867-19873.
［26］ Lawal AO，Marnewick JL，Ellis EM. Heme oxygenase-1 attenuates
cadmium-induced mitochondrial-caspase 3-dependent apoptosis
in human hepatoma cell line［J］. BMC Pharmacol Toxicol，2015，
16（1）： 1-13.
［27］ 曹顺琪 , 郑虹 , 孙超，等 . 胆道闭锁患儿血清血红素氧化酶 -1
水平的检测及其临床意义［J/CD］. 实用器官移植电子杂志，
2017，5（1）：15-17.
［28］ He XH，Yan XT，Wang YL，et al. Transduced PEP-1–heme
oxygenase-1 fusion protein protects against intestinal ischemia/
reperfusion injury［J］. J Surg Res，2014， 187（1）：77-84.
［29］ Li Y，Li Q，Chen H，et al. Hydrogen gas alleviates the intestinal
injury caused by severe sepsis in mice by increasing the expression
of heme oxygenase-1［J］. Shock，2015，44（1）： 90-98.
［30］ 高新跃 , 任从才 , 张欣，等 . 血红素加氧酶 -1 重组乳酸乳球菌
灌胃对失血性休克大鼠肠黏膜屏障的保护作用［J］. 中华危重
病急救医学，2007，19（4）：225-228.
［31］ Hamedi-Asl P，Halabian R，Bahmani P，et al. Adenovirus-
mediated expression of the HO-1 protein within MSCs decreased
cytotoxicity and inhibited apoptosis induced by oxidative
stresses［J］. Cell Stress Chaperones，2012，17（2）： 181-190.
［32］ Petersen B， Ramackers W， Lucas‐Hahn A， et al. Transgenic
expression of human heme oxygenase‐1 in pigs confers resistance
against xenograft rejection during ex vivo perfusion of porcine
kidneys［J］. Xenotransplantation， 2011， 18（6）： 355-368.
［33］ Li SD，Wang L，Wang KY，et al. Heme oxygenase-1 expression and
its significance for acute rejection following kidney transplantation in
rats［J］.Transplant Proc，2011，43（5）：1980-1984.
［34］ Lim JY，Park MJ，Im KI，et al. Combination cell therapy
using mesenchymal stem cells and regulatory T-cells provides
a synergistic immunomodulatory effect associated with reciprocal
regulation of TH1/TH2 and th17/treg cells in a murine acute graft-
versus-host disease model［J］ . Cell transplantation，2014，23（6）：
703-714.
［35］ Li B，Tian L，Diao Y，et al. Exogenous IL-10 induces corneal
transplantation immune tolerance by a mechanism associated with
the altered Th1/Th2 cytokine ratio and the increased expression of
TGF-β［J］. Mol Med Rep，2014，9（6）：2245-2250.
［36］ Korn T，Bettelli E，Oukka M，et al. IL-17 and Th17 Cells［J］.
Annu Rev Immunol，2009，27：485-517.
［37］ Bettelli E，Carrier Y，Gao W，et al. Reciprocal developmental
pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and
regulatory T cells［J］. Nature， 2006， 441（7090）： 235-238.
［38］ Aggarwal S， Ghilardi N， Xie M H， et al. Interleukin-23 promotes
a distinct CD4 T cell activation state characterized by the
production of interleukin-17［J］. J Biol Chem， 2003， 278（3）：
1910-1914.
［39］ Fábrega E，López-Hoyos M，San Segundo D，et al. Changes in
the serum levels of interleukin-17/interleukin-23 during acute
rejection in liver transplantation［J］ . Liver Transpl， 2009，15（6）：
629-633.
［40］ Kendal AR，Chen Y，Regateiro F S，et al. Sustained suppression
by Foxp3+ regulatory T cells is vital for infectious transplantation
tolerance［J］. J Exp Med，2011，208（10）： 2043-2053.
［41］ Ge W，Jiang J，Arp J，et al. Regulatory T-cell generation and
kidney allograft tolerance induced by mesenchymal stem cells
associated with indoleamine 2， 3-dioxygenase expression［J］.
Transplantation，2010，90（12）： 1312-1320.
（收稿日期：2017-10-31）