enzimas de restriccion
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Enzimas de restricción y
electroforesis
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Enzimas de restricción
• Son endonucleasas específicas capaces de
reconocer secuencias palindrómicas de
DNA y cortar los enlaces fosfodiéster delmaterial genético en un punto específico.
• Palindrómicas quiere decir que leen en
direcciones opuestas el mismo orden denucleótidos.
5’ G T T A A C 3’
3’ C A A T T G 5’
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Tipos de endonucleasas
• Endonucleasa Tipo I – corta lejos de lasucuencia que reconoce, ya sea río arriba o
río abajo.• Endonucleasa Tipo II – cortan dentro de la
secuencia que reconocen.
• Endonucleasa Tipo III – cortan de 5-8bases antes o después de la secuencia quereconocen.
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Enzimas de restricción
• Son suceptibles a cambios en temperatura, pH, etc.
• Estas enzimas se obtienen de células bacterianas.
• El nombre de estas está dado según el género y laespecie de la bacteria de dónde se aisló por
primera vez esta enzima.
• La primera letra representa el género de labacteria, las próximas dos indican la especie, la
cuarta letra indica la cepa y el número al final
indica el número de enzima que se ha aislado de
esa cepa.
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Enzimas de restricción
• Por ejemplo:
EcoRI
• Otros ejemplos:
– BamHI – la primera que se aisló de la cepa H de Bacillus amyloliquefaciens
– SmaI – la primera que se aisló de Serratia marcesens
– HindIII – la tercera que se aisló de la cepa d de
Haemophilus influenzae
Escherichia
(género)coli
(especie) cepa R
Primera enzima aislada
de ese organismo.
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Tipos de corte• “Sticky” o pegajosos – es
más fácil para volver a
ligarse los extremos.
– Ejms.• EcoRI
• Bam HI
• HindIII
• “Blunt” o abruptos – Ejm.
• SmaI
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Enzimas de restricción
• Las endonucleasas son de gran importancia
para la ingeniería genética, ya que permiten
desarrollar técnicas de clonación.
• Además, te permite realizar mapas de
restricción y determinar si existe homología
entre otras moléculas de DNA.
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Electroforesis
• Se define como elmovimiento departículas de cargabajo la influencia deun campo eléctrico através de un mediosemisólido.
• Este medio puede serde agarosa o depoliacrilamida.
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Electroforesis
• El DNA es de carganegativa, por lo quelas partículas migran
del electrodo negativo(cátodo) al electrodopositivo (ánodo).
• Esta migración es
inversamenteproporcional al pesomolecular de lasmuestras.
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Electroforesis
• Materiales necesarios para
llevar a cabo una
electroforesis:
– Gel de agarosa – generalmente se utiliza de
1% - 2% de agarosa.
– Cámara de electroforesis
– contiene los electrodos – “Power supply” – genera
el campo eléctrico
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Electroforesis – Amortiguador de
electroforesis - usualmenteTBE 1X; facilita la
migración de DNA ymantiene una estabilidad
– Bromuro de etidio – compuesto carcinógeno quese entrecruza entre lasmoléculas de DNA y cuandose irradia con luz ultravioletaemite fluorescencia.
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Electroforesis
– “Loading dye” – compuesto
que se añade a las muestras de
DNA; contiene glicerol, que le
da peso a la muestra y nopermite que se salgan de la fosa,
y bromofenol azul que tiñe la
muestra de color azul y sirve
como indicador de migración
– Lámpara de UV – permite ver
las bandas generadas
– Cámara – para tomar una foto
de la gel
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