Gua de trabajo prctico para estudiantes de segundo ao de la carrera de medicina

www.monografias.com

Gua de trabajo prctico para estudiantes de segundo ao de la carrera de medicinaMara Espino Hernndez - mespino@elacm.sld.cu1. Orientaciones generales para la utilizacin del folleto2. Prctica de Laboratorio No. 13. Prctica de Laboratorio No: 24. Prctica de laboratorio 35. Clase prctica No 4:6. Prctica de laboratorio 57. Clase Prctica 68. Bibliografa

Orientaciones generales para la utilizacin del folletoESTUDIANTE:

El material que ponemos en tus manos es una gua para el desarrollo del trabajo en el laboratorio durante las actividades prcticas de nuestra asignatura y a la vez es un cuaderno complementario para tu preparacin previa a dicha actividad.

En cada una de las clases prcticas que ste recoge encontrars, adems de los objetivos, materiales y reactivos a utilizar, problemas y procedimientos a desarrollar en el laboratorio, un contenido terico el que debers estudiar previo al desarrollo de cada actividad.

Es importante que tengas en cuenta que este contenido NO SUSTITUYE a lo que en la seccin de autopreparacin se te orienta estudies por tu libro de texto, ya que ambos materiales se complementan. Es muy importante que al finalizar tu autoestudio, trates siempre de responder cada una de las preguntas que aparecen en esta seccin pues de este modo adems de corroborar la calidad de tu autopreparacin, te garantizar un mejor desenvolvimiento durante el trabajo prctico.

Esperamos que este material te sea de gran utilidad para la adquisicin de habilidades y contribuya a mejorar tu aprovechamiento docente en nuestra asignatura.

LOS PROFESORES

Laboratorio Docente de Agentes biolgicos.Normas generales para el trabajo en el laboratorio:El laboratorio de prcticas de Agentes biolgicos, es un lugar convenientemente habilitado donde se manipulan productos patolgicos y se examinan microorganismos. Estos pueden ser patgenos o no, pero an en este ltimo caso deben ser manejados con extrema precaucin por su potencial patogenicidad.Es indispensable por lo tanto el cumplimiento de las siguientes orientaciones: 1. Mantener la disciplina establecida para todas las actividades docentes. 2. Los alumnos asistirn vistiendo sus uniformes. No se permitir la estancia en el laboratorio a personas sin batas sanitarias. 3. Atender de manera organizada al pase de lista. No formar grupos en la puerta del laboratorio que obstaculicen la entrada al mismo.4. Todos los artculos personales deben ser colocados en la mesa aledaa o en el sitio que le indique el profesor. Nunca sobre la meseta de trabajo. 5. El alumno asistir a la clase prctica con la preparacin terica necesaria, adquirida y/o reafirmada mediante su auto preparacin segn las orientaciones y ejercicios sealados para cada clase en el folleto de Actividades prcticas.6. Es imprescindible trabajar en todo momento con calma y concentracin, procurando no distraer al resto de los alumnos que se encuentran en el laboratorio. 7. Durante la permanencia en el laboratorio queda terminante prohibido: fumar; ingerir comidas y bebidas; aplicarse cosmticos y peinarse; as como llevarse las manos y utensilios a la boca, nariz, ojos y odos.8. El profesor dar una introduccin e indicaciones generales de cada actividad prctica con el objetivo de hacerla ms comprensible y eficaz.9. El alumno debe leer cada ejercicio de laboratorio. Los realizar en la secuencia sealada y anotar los datos en el cuaderno. 10. Es indispensable el uso de guantes desechables para la manipulacin del material contaminado. 11. El material contaminado que se deseche ser colocado en los depsitos correspondientes designados por el profesor. 12. El material desechable no contaminado se depositar en los cestos colocados al efecto. 13. No se permite tirar basura al piso, vertederos, ni colocarlas sobre o bajo las mesetas. 14. En caso de rotura de envases con material contaminado o cualquier otro tipo de accidente, llamar inmediatamente al profesor. 15. Lave sus manos antes de salir del laboratorio.16. Comprobar antes de salir, que su rea de trabajo queda perfectamente limpia, cerradas las llaves de agua, apagados los mecheros, apagadas las luces de las mesetas, y los microscopios limpios. Las banquetas deben quedar en orden.17. No abandonar el laboratorio sin la debida autorizacin del profesor.18. El incumplimiento de alguno de los aspectos relacionados, se considera una indisciplina. Prctica de Laboratorio No. 1

Tema 2: Parasitologa Mdica

Ttulo: Diagnstico de laboratorio de protozoos intestinales y sanguneos.

Objetivos:

Enumerar los diferentes productos patolgicos que se requieren para el diagnstico de los protozoos intestinales y sanguneos.

Mencionar las caractersticas que deben cumplir las diferentes muestras para el diagnstico de protozoos intestinales y sanguneos, as como los mtodos diagnsticos empleados en cada caso.

Observar al microscopio quistes de protozoos intestinales y formas parasitarias de Plasmodium.

Aspectos tericos

Las enfermedades asociadas a protozoos tienen en la actualidad una elevada incidencia en la poblacin mundial algunas de ellas acompaadas de una alta tasa de mortalidad, tal es el caso del paludismo y la tripanosomiasis africana, entre otras. Algunos protozoos intestinales como Giardia lamblia y Entamoeba histolytica son causa de mal nutricin, prdida de peso y diarreas severas; otros, como Plasmodium sp, Trypanosoma sp y Leishmania producen afecciones cardacas y del SNC, daan las membranas mucosas, la piel y diferentes rganos de la economa.

Los ciclos de vida de los protozoos son muy variados y complejos. El conocimiento de stos permite realizar una toma de la muestra en el momento adecuado con el fin de poder observar el agente biolgico y con ello realizar el diagnstico certero de la enfermedad. Demostrar e identificar el agente infectante se considera la regla de oro en el diagnstico parasitolgico.Diagnstico de los protozoos sanguneos.

Dentro de los protozoos sanguneos se destacan por su incidencia e importancia epidemiolgica Plasmodium sp, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei y Leishmania donovanii.

a) Toma de la muestra: Es necesario tener en cuenta el perodo en el cual el parsito de acuerdo a su ciclo de vida, transita por la sangre (parasitemia) o se encuentra presente en determinados rganos y/o tejidos (sitios de inoculacin) en los que produce lesiones caractersticas. Atendiendo a ello las muestras pueden ser:

Sangre perifrica

Tejidos

LCR

Exudado de las lesiones

Aspirado del chancro inicial o del ganglio linftico

b) Mtodos de diagnstico: Pueden ser indirectos o directos. Los primeros se basan en la determinacin de la respuesta inmune del organismo ante la infeccin parasitaria a travs de pruebas inmunoserolgicas y los directos se sustentan en la observacin de las formas parasitarias. Los mtodos directos son los ms empleados. Estos pueden ser:

Examen en fresco de la sangre: se coloca una gota de sangre entre cubre y portaobjetos y se observa al microscopio con objetivo seco de 40x.

Frotis de la sangre: se extiende una gota de sangre sobre un portaobjeto, se seca al aire y se fija con metanol. Teimos por el mtodo de Giemsa y observamos al microscopio con objetivo de inmersin (100x).

Gota gruesa: se extiende una gota de sangre en un rea del portaobjeto de 1cm2, se deja secar, se tie por el mtodo de Giemsa y se observa al microscopio con objetivo de inmersin (100x).

Los mtodos indirectos ms utilizados son: ELISA, Inmunofluorescencia, Inmunoprecipitacin, Fijacin del complemento y Aglutinacin.

Diagnstico de protozoos intestinales:

Dentro de los protozoos intestinales se destacan por su inters clnico Entamoeba histolytica y Giardia lamblia.

a) Toma de la muestra: La muestra ideal son las heces las que deben ser colectadas preferiblemente en un recipiente de cristal o plstico correctamente lavado y seco. Deben ser adems frescas (recin emitidas) y procesadas rpidamente en particular cuando queremos observar los trofozotos de estos parsitos. De no ser posible el procesamiento inmediato se deben conservar por diferentes medios que pueden ser: refrigeracin a 4oC, en formol al 5 10 %, alcohol polivinlico (PVA) en una solucin de Mertiolato-yodo-formol (MIF). La muestra debe ser recogida directamente sobre un papel limpio colocado en el suelo para evitar que se mezcle con la orina ya que las sustancias aqu presentes pueden daar los trofozotos. En los parasitismos es comn que no se excreten constantemente las formas parasitarias, este fenmeno est estrechamente relacionado con el ciclo de vida del parsito y se conoce como fase de excrecin negativa, por tal motivo se recomienda siempre indicar de tres a seis exmenes de heces con un periodo de dos a tres das entre uno y otro (exmenes seriados). En los casos de alta sospecha clnica de giardiosis se puede obtener tambin una muestra de aspirado duodenal o de biopsia duodenal para realizar el diagnstico, siempre que los anlisis de las heces hayan resultado negativos.

b) Mtodos de diagnstico:

Examen directo entre cubre y portaobjeto: Se coloca una pequea porcin de las heces en un portaobjeto mezclada con una gota de eosina, lugol o solucin salina fisiolgica, se coloca sobre la preparacin una lmina cubreobjeto y se examina al microscopio con objetivo de 40x.

Mtodos de concentracin: Aumentan considerablemente la sensibilidad del diagnstico. Utiliza una mayor cantidad de muestra (1 gramo aproximadamente) y se basan en la diferencia que pueda existir entre el peso especfico de la sustancia en la cual se disuelve la muestra y las formas parasitarias. Basado en ello se han diseado diferentes mtodos, dentro de ellos el de Ritchie (solucin formol-ter/acetato de etilo) es el ms utilizado para el diagnstico de los protozoos y por el cual se obtiene un concentrado de los quistes por un proceso de sedimentacin.

Mtodos indirectos: Los ms utilizados son ELISA y aglutinacin.

Problema: Usted tendr en su puesto de trabajo un extendido de sangre teido con Giemsa con formas parasitarias de Plasmodium sp., as como diferentes muestras de heces conservadas en formol que contienen quistes de protozoarios. Realizar el montaje para el exmen directo de las heces y observar al microscopio las diferentes formas parasitarias.

Reactivos y Materiales Frotis de sangre perifrica teido con Giemsa.

Lminas portaobjetos y cubreobjetos

Microscopio ptico

Muestras de heces conservadas en formol

Aplicadores

Guantes

Lugol

Procedimiento

Para el exmen de las heces: (Guarde las medidas adecuadas de bioseguridad, colquese los guantes antes de proceder)

a) Coloque en la lmina portaobjeto una gota de reactivo de lugol.

b) Con un aplicador tome una pequea porcin de heces y mezclela con la gota de lugol en el portaobjetos haciendo un pequeo crculo. (Utilice una lmina para cada muestra)

c) Coloque encima una lmina cubreobjetos.

d) Lleve la lmina al microscopio ptico y enfoque con objetivo de 10x. Al lograr una imagen ntida, pase al objetivo de 40x.

e) Observe detenidamente las caractersticas de los quistes observados y realice en su cuaderno un esquema de las diferentes formas parasitarias.

Para observar la lmina de sangre perifrica:

a) Adicione sobre la preparacin una gota de aceite de cedro.

b) Enfoque con objetivo de inmersin 100x

c) Realice en su cuaderno un esquema de las caractersticas de las formas de Plasmodium observadas.

Presentacin de los resultados

- Realice un informe escrito de lo observado en cada una de las preparaciones.

Autopreparacin

Consulte en su libro de texto, Microbiologa y Parasitologa Mdica Tomo III, los siguientes captulos:

Captulo 76, Generalidades, los tema: Ciclo evolutivo, Proceso infeccioso parasitario, Fuentes de infeccin, Vas de entrada al hospedero y Diagnstico clnico y de laboratorio de las enfermedades parasitarias (pginas 9, 11,12, 16 y 17)

Captulo 78, Giardia lamblia (pginas 31-35)

Captulo 84, Ameba (pginas 107-109)

Captulo 88, Plasmodium (pginas 151-153 y 159-160)

Despus proceda a responder las siguientes preguntas:

1. Cules son las formas infectantes de Giardia lamblia y Entamoeba histolytica y cules son sus caractersticas ms sobresalientes?

2. Qu requisitos deben cumplir las muestras de heces para estudio parasitolgico y en particular para la bsqueda de protozoos intestinales? Qu otra muestra puede ser til para el diagnstico de la giardiosis?

3. Ante un paciente con sospecha clnica de paludismo, Qu examen usted indicara? qu muestra sera necesaria para el estudio? Basado en el ciclo de vida de este parsito, qu formas parasitarias pudiera encontrar en dicha muestra?4. En un paciente con un cuadro de diarrea aguda en el que sospecha una amebiasis, result negativo el primer examen de las heces. Considera usted este resultado concluyente? Fundamente su respuesta.

Prctica de Laboratorio No: 2

Tema 2: Parasitologa Mdica

Ttulo: Diagnstico de helmintos intestinalesObjetivos:

Mencionar los requisitos que debe cumplir la muestra de heces para el diagnstico de infecciones por helmintos intestinales y los mtodos de diagnstico ms frecuentemente empleados.

Observar al microscopio huevos y larvas de helmintos.

Observar las caractersticas macroscpicas de formas adultas de helmintos.

Aspectos tericos.

Las helmintiasis afectan a una gran parte de la poblacin mundial, en particular a aquellas personas que no guardan las condiciones higinico sanitarias adecuadas; la defecacin al aire libre, la ingestin de agua no potable para el consumo y de alimentos contaminados con tierra, el no lavado o el lavado incorrecto de las manos antes de ingerir alimentos, entre otras, constituyen muchas de las causas por las cuales las personas se infectan con estos parsitos.

Tal y como ocurre con los protozoos, los helmintos tambin poseen ciclos de vida variados y complejos y su conocimiento es importante toda vez que permite establecer las pautas tanto para el diagnstico de laboratorio como para la prevencin de estas enfermedades.

En los helmintos podemos observar tres formas parasitarias diferentes: el adulto, el huevo y la larva. Los helmintos adultos, de forma general, tienen una talla que permite ser observados a simple vista, sin embargo los huevos y las larvas son microscpicas. Por tal motivo, el diagnstico de laboratorio en estos casos se basa tanto en la observacin macroscpica de las muestras buscando las formas adultas del parsito, como en la observacin microscpica en la bsqueda de huevos y larvas.

Diagnstico de laboratorio

a) Toma de la muestra: La muestra generalmente son las heces y los requisitos para su obtencin y conservacin son los mismos que para el diagnstico de los protozoarios. A diferencias de las infecciones por protozoarios, en estos parasitismos la diarrea no es un sntoma clnico comn por lo que a veces a determinados pacientes se les hace difcil obtener la muestra. Es importante en estos casos aclarar que la muestra siempre debe ser obtenida por defecacin espontnea ya que la utilizacin de laxantes y/o lavados intestinales incrementa el volumen de lquido y con ello la dilucin de las formas parasitarias que puedan estar presentes en ella. Para el diagnstico especfico de Fasciola heptica, Ancylostoma duodenalis, Necator americanus y Strongyloides stercoralis la muestra de aspirado duodenal tambin puede ser til en la bsqueda de huevos del parsito cuando los seriados de heces son negativos.

b) Mtodos de diagnstico: Al igual que para protozoos los mtodos pueden ser directos e indirectos, siendo los directos los ms recomendados.

Exmen directo entre cubre y portaobjeto: se coloca una pequea porcin de las heces en un portaobjeto mezclada con una gota de eosina, lugol o solucin salina fisiolgica, se coloca sobre la preparacin una lmina cubreobjeto y se examina al microscopio con objetivo de 40x buscando huevos y larvas.

Mtodos de concentracin:

Mtodo de Ritchie (ver clase prctica 1)

La Copa Cnica: est basado en la sedimentacin y es el ms utilizado para el diagnstico de Fasciola dado el gran tamao y peso de estos huevos.

Mtodo de Faust: es una tcnica basada en la flotacin que emplea sulfato de zinc.

Mtodo de Sheather: es un mtodo comn basado en la flotacin que emplea una solucin sobresaturada de azcar, sal y formol.

Tamizaje de la heces: Consiste en hacer pasar las heces por un tamiz (colador) para observar parsitos adultos o fragmentos de ellos. Auxiliados con una lupa podemos identificar el agente por sus caractersticas macroscpicas.

Mtodo de Graham o de la cinta adhesiva: Es un mtodo especial para la identificacin de huevos de Enterobius vermicularis, (tambin puede ser til en el diagnstico de Taenia sp). Consiste en aplicar un fragmento de cinta adhesiva transparente en la zona perianal del paciente, se retira y luego se coloca sobre una lmina portaobjeto para observar al microscopio los huevos caractersticos. Mtodo de Harada-Mori: Es una tcnica empleada para el cultivo de larvas de nemtodos de inters clnico. Es un mtodo til para la diferenciacin de ancylostomideos cuyos huevos son idnticos y es indispensable para el diagnstico y seguimiento de las infecciones por Strongyloides stercoralis. Mtodo de la tinta china: Permite la diferenciacin de las especies de Taenia a travs del conteo de las ramas uterinas de los progltides.

Problema: Usted encontrar en su puesto de trabajo diferentes vidrios reloj que contienen formas adultas de helmintos para la observacin y descripcin de sus caractersticas macroscpicas. Asimismo encontrar diferentes muestras de heces conservadas en formol las que contienen huevos y larvas de parsitos, proceder al montaje de las heces por examen directo y la observacin posterior al microscopio.Reactivos y materiales: Guantes

Lminas portaobjetos

Lminas cubreobjetos

Aplicadores

Reactivo de Lugol.

Vidrios reloj con parsitos adultos.

Muestras de heces conservadas en formol

Procedimiento:

- Exmen directo de las heces:

a) Proceda de la misma forma que en la prctica anterior (Diagnstico de protozoos intestinales) Recuerde guardar las medidas de bioseguridad requeridas, colquese los guantes antes de comenzar a trabajar.

b) Observe detenidamente las caractersticas de los huevos y larvas. Realice un esquema de lo observado en su cuaderno relacionando cada uno de ellos con el parsito correspondiente

- Parsitos adultos:

a) Observe detenidamente los parsitos adultos contenidos en cada vidrio reloj y detalle cada una de sus caractersticas.

b) Realice las siguientes anotaciones en su cuaderno de trabajo: clasificacin (si es Nematelminto o Platelminto y en este ltimo caso si es Cestode o Trematodo), tamao aproximado, diferencias entre hembra y macho, otras caractersticas distintivas.

Presentacin de los resultados:

Confeccione un informe que recoja las observaciones macroscpicas y microscpicas realizadas.

Autopreparacin:

Consulte en su libro de texto, Microbiologa y Parasitologa Mdica Tomo III, los Captulos siguientes:

Captulo 95, Ascaris, (pgina 211-214)

Captulo 96 Trichuris (pgina 217-219)

Captulo 97 Acylostomas y Necator (pginas 221-224)

Captulo 98 Strongyloides (pgina 229-231)

Captulo 100 Enterobius (pginas 243-245)

Captulo 112 Taenia saginata y Taenia solium (pginas 331-335

Captulo 121 Fasciola (pgina 381-383 y 385)

Proceda luego a responder las siguientes preguntas:

1. Plantee las diferencias morfolgicas fundamentales entre nematodos, cestodes y trematodos

2. Cul es el nematodo intestinal de mayor tamao? Cmo usted reconocera a simple vista la hembra de este parsito? Qu caractersticas distintivas tienen sus huevos?

3. Qu diferencias presentan las formas adultas de la hembra y el macho de Trichuris trichiura que permiten su reconocimiento? Qu caractersticas tienen sus huevos?

4. Para qu se utiliza el mtodo de Graham?

5. Qu caractersticas poseen los huevos de Enterobius vermicularis?

6. Por que es necesario la tincin con tinta china de los progltides, para la diferenciacin entre T. solium y T. saginata?7. En un paciente infectado por Fasciola heptica qu forma parasitaria usted espera encontrar en las heces?, qu caractersticas fundamentales poseen los huevos de este parsito?

Prctica de laboratorio 3

Tema 3: Bacteriologa mdica

Microscopa y coloraciones. Cultivo de los microorganismos.

Objetivos:

Realizar tincin de preparaciones por los mtodos de Gram y Ziehl Neelsen.

Identificar al microscopio diferentes morfologas bacterianas y sus caractersticas tintoriales.

Observar las caractersticas del crecimiento bacteriano en diferentes medios de cultivo

Aspectos tericos

Durante el transcurso de una investigacin bacteriolgica la definicin de la morfologa y las caractersticas tintoriales de un microorganismo constituyen elementos claves para su identificacin y el punto de partida para la realizacin posterior de pruebas fisiolgicas y bioqumicas indispensables para la clasificacin definitiva en gnero y especie.

El trabajo con microorganismos en el laboratorio se realiza en condiciones aspticas, tanto para evitar la contaminacin de la muestra con los microorganismos ambientales como del investigador con la muestra. Es por esto que es necesario trabajar siempre en el entorno de la llama de un mechero bunzen, en un cuarto climatizado (cuarto de siembra) y en determinadas actividades bajo la proteccin de un gabinete de seguridad o flujo laminar.

Definicin de las caractersticas morfolgicas y tintoriales: Para definir las caractersticas morfolgicas y tintoriales de una bacteria presente en una muestra lo primero es la preparacin del frotis y la tincin posterior con colorantes apropiados.Una de las tcnicas de tincin ms empleadas en Bacteriologa es la Tincin de Gram. Este mtodo, descrito por Christiam Gram en el ao 1884, permite dividir a las bacterias en dos grandes grupos (grampositivas y gramnegativas). Utiliza dos colorantes bsicos (violeta cristal y safranina) una solucin mordiente encargada de fijar el colorante violeta (lugol) y una solucin decolorante (alcohol al 70%). Las bacterias Gram positivas retienen el colorante violeta cristal, por lo que se observan teidas de color violeta, mientras que las gramnegativas se decoloran por la accin del alcohol y toman el segundo colorante (safranina) por lo que se ven de color rosado.

El fundamento de este mtodo, se consider hasta hace pocos aos, estaba basado en la diferencia en la composicin qumica de la pared celular de ambos grupos bacterianos, sin embargo, estudios ms recientes han demostrado la participacin de protenas citoplasmticas en esta respuesta.

Algunas bacterias no son capaces de teirse por el mtodo de Gram, para estos casos se utilizan mtodos de tincin especiales. Uno de los ms utilizados es el de Ziehl Neelsen para la identificacin de micobacterias. Esta es una tincin diferencial que utiliza la fucsina fenicada como primer colorante, alcohol cido como solucin decolorante y el azul de metileno como colorante de contraste. Los gneros Mycobacterium, Nocardia y algunos actinomicetos resisten la decoloracin por el alcohol cido y permanecen teidos con el primer colorante (rojo). Es por esto que se conocen como bacilos cido alcohol resistente (BAAR). El principio de este mtodo se basa en la alta proporcin de cidos miclicos (lpidos) presentes en la pared celular de estos microorganismos que los hace resistentes a la decoloracin una vez teidos por la fucsina. El resto de las bacterias s se decoloran y se tien con el segundo colorante observndose de color azul.

Cultivo de los microorganismos: Los medios de cultivo son soluciones acuosas de diferentes sustancias nutritivas, necesarias para el crecimiento y la reproduccin de los microorganismos. Estos son clasificados: Segn su estado fsico en: lquidos, slidos o semislidos. La solidez de los medios se consigue por la adicin de agar. El agar es una sustancia inerte, es decir, no es un nutriente ni tampoco interfiere con otros constituyentes del medio de cultivo.

Segn su finalidad los medios se clasifican en:

Generales o universales: Garantizan el crecimiento de un elevado nmero de microorganismos. Ej. Agar nutriente, Agar sangre, Caldo cerebro-corazn, etc.

Enriquecimiento: Son medios complejos con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente exigentes). Ej. Caldo selenito, Caldo tetrationato de sodio, etc.

Selectivo: Son aquellos que favorecen por su diseo el crecimiento especfico de un microorganismo (o grupo de microorganismos). Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una poblacin microbiana mixta. Ej. Agar SS, Agar Mc Conkey, Agar TCBS

Diferencial: Destinados a facilitar la discriminacin de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales del crecimiento en dichos medios.

Instrumentos de siembra: Los instrumentos empleados son:

Asa de alambre

Aguja de alambre

Hisopo

Pipeta

Esptula de Drigalsky

Jeringuilla

Mtodos de siembra: La siembra de acuerdo a los propsitos, el instrumento utilizado y las caractersticas del medio donde se va a realizar el cultivo puede realizarse por:

Diseminacin: se realiza de diferentes formas y con instrumentos variados dependiendo del objetivo que se persiga. Ejemplo: para obtener colonias aisladas en un medio de cultivo slido se utiliza la diseminacin por estras, para lo que se emplea el asa de alambre. (Fig. 3.1) Picadura: se realiza con aguja de alambre, fundamentalmente en medios slidos o semislidos contenidos en tubos de cultivo. A profundidad: Tambin conocido como placa vertida. Es un mtodo de siembra especial donde por lo regular el inculo se mezcla con el medio de cultivo. (Fig. 3.2)

Incubacin: Los medios de cultivo sembrados se colocan en incubadoras a la temperatura, humedad y concentracin de oxgeno ptimas para el crecimiento. Las condiciones de incubacin dependen de las caractersticas y del tiempo de generacin del microorganismo. Las bacterias que comnmente parasitan al hombre se desarrollan bien a temperaturas entre 35 y 37 oC en perodos de 18 a 24 horas.

Observacin del crecimiento: Despus de la incubacin se observan las caractersticas del crecimiento del microorganismo y los cambios ocurridos en el medio de cultivo. En medios de cultivo en placas Petri pueden ser apreciados los caracteres de las colonias microbianas: color, borde (entero o festonado) brillo, superficie (lisa o rugosa) tamao y produccin de lisis de los glbulos (ste ltimo solo si el medio de cultivo empleado fuera Agar Sangre).

Problema: usted encontrar en su puesto de trabajo placas con cultivo bacteriano los que debern identificar morfolgicamente por la tcnica de Gram definiendo forma, modo de agrupacin y carcter tintorial del microorganismo, describir adems las caractersticas ms sobresalientes observadas en los cultivos. Encontrar frotis elaborados a partir de una muestra de esputo para realizar tincin de Ziehl Neelsen.

Reactivos y materiales. Asa de siembra

Portaobjetos

Colorantes para la tincin de Gram

Colorantes para la tincin de Ziehl Neelsen

Preparaciones para teir por Ziehl Neelsen

Mechero bunzen

Aceite de cedro

Agua destilada estril

Placas y tubos con cultivos.

Procedimiento. Preparacin del frotis a partir del cultivo:

1. Coloque sobre la lmina portaobjeto una gota de agua destilada estril.

2. Esterilice el asa de siembra a la llama del mechero. (Fig. 3.3)

3. Arrastre una pequea porcin del cultivo bacteriano con el asa en condiciones aspticas.

4. Suspenda las clulas en la gota de agua sobre el portaobjeto.

5. Deje secar al aire.

6. Fije la preparacin cortando con la lmina tres veces la llama del mechero (Fig. 3.4).

Tincin de Gram

Cubra el frotis con cristal violeta al 1%, espere 30 segundos y lave con agua corriente.

Cubra el frotis con lugol, espere 30 segundos y lave con agua corriente.

Cubra el frotis con alcohol etlico o alcohol acetona, espere 30 segundos y lave con agua corriente

Cubra el frotis con el colorante safranina, espere 30 segundos y lave con agua corriente.

Secar al aire.

Adicione una gota de aceite de cedro sobre la preparacin y observe al microscopio con el objetivo de mayor aumento (100X).

Realice un esquema en su cuaderno de lo observado y anote las caractersticas morfolgicas y tintoriales del microorganismo problema.

Tincin de Ziehl Neelsen

Cubra el frotis con fucsina y caliente el colorante sobre la lmina dndole calor a la lmina por debajo hasta que se observe la emisin de vapores. Espere 5 minutos y lave con abundante agua corriente.

Cubra la lmina con alcohol-cido, espere 2 minutos y lave con agua corriente.

Cubra la preparacin con azul de metileno, espere 30 segundos y lave con agua corriente.

Secar al aire.

Coloque sobre la preparacin una gota de aceite de cedro y observe al microscopio con objetivo de inmersin (100X).

Anote en su cuaderno los resultados de la observacin.

Definicin de caractersticas culturales Observe detenidamente los cultivos en las placas y determine las diferentes caractersticas de las colonias: tamao, color, borde, superficie, aspecto, produccin de hemlisis, etc.

Anote los resultados de lo observado en su cuaderno de trabajoPresentacin de los resultados:

Prepare un informe con los resultados obtenidos del trabajo realizado en el laboratorio de acuerdo a las indicaciones de su profesor.

Autopreparacin

Revise en su libro de texto, Microbiologa y Parasitologa Mdica Tomo I, los captulos que a continuacin se relacionan:

Captulo 4, Microscopa y coloraciones (Pg. 20-28)

Captulo 5, Caractersticas de las clulas procariticas y eucariticas (Pg. 29-36)

Captulo 7 Cultivo y crecimiento de los microorganismos (Pg. 45-54)

Proceda despus a responder las siguientes preguntas:

1. La coloracin de Gram es una de las ms utilizadas en Bacteriologa, en qu se fundamenta este mtodo?

2. La tincin de Ziehl Neelsen se utiliza para la observacin al microscopio de las micobacterias. Cul es el fundamento de este mtodo de tincin?, considera usted que si se omitiera el paso del calentamiento de la fucsina sobre la lmina, se obtendran los mismos resultados? Fundamente.

3. Qu se conoce como cultivo o siembra en Bacteriologa? Cite ejemplos de medios de cultivo generales, diferenciales, selectivos y de enriquecimiento.

4. El agar es una sustancia inerte que aporta solidez a los medios de cultivo permitiendo el desarrollo de colonias aisladas. Qu ventajas representa esto para el diagnstico?

5. La tincin negativa es uno de los mtodos empleados en el laboratorio de microbiologa. Al respecto diga: qu tipo de colorantes usted utilizara en este caso?, qu diferencias tiene este mtodo con un mtodo de tincin simple?

Clase prctica No 4:

Tema III Bacteriologa Mdica

Ttulo: Quimioterapia antimicrobiana. Mtodos de respaldo al tratamiento antimicrobiano.

Objetivos:

Interpretar los mecanismos de accin de las drogas antimicrobianas y los mecanismos de resistencia desarrollados por las bacterias para contrarrestar su efecto.

Interpretar los resultados de un antibiograma por mtodos de difusin y dilucin de acuerdo a las categoras de susceptibilidad establecidas.

Aspectos tericos

El descubrimiento de los antibiticos en el pasado siglo dio inicio a una nueva era en el tratamiento de las enfermedades infecciosas que estuvo marcada en la dcada de los aos 20 por la obtencin de la penicilina a cargo del notable cientfico Sir Alexander Fleming. La introduccin de este antibitico por primera vez en la clnica a inicios de la dcada del 40 y los subsiguientes descubrimientos de otras drogas con mecanismos y espectro de accin variados, permiti ganar una de las ms importantes batallas libradas por el hombre en la lucha por la supervivencia.

Prcticamente desde los inicios en el uso de las entonces consideradas drogas milagrosas se evidenci la capacidad que tenan los microorganismos tanto para desarrollar mecanismos capaces de contrarrestar el efecto de estos frmacos, como de trasmitir tal caracterstica a otros miembros de su progenie. Los mecanismos de resistencia desarrollados por las bacterias estn estrechamente relacionados con el blancoo estructura de la clula sobre la que acta un antibitico o grupos de antibiticos en especfico.

En la actualidad existen en uso ms de un centenar de drogas pertenecientes a diferentes grupos y generaciones de antimicrobianos con capacidad variada para inhibir y matar microorganismos. Los mecanismos de accin de estos frmacos se agrupan generalmente en los siguientes:

1) Los que inhiben la sntesis de la pared celular

2) Los que inhiben la funcin de la membrana celular

3) Los que inhiben la sntesis proteica

4) Los que inhiben la sntesis de los cidos nucleicos

Inhibicin de la sntesis de la pared celular: Los antibiticos que actan afectando la pared celular, tienen la capacidad de unirse a protenas de la membrana citoplasmtica bacteriana conocidas como PBP, siglas provenientes del ingls penicilin binding protein o lo que es lo mismo, protenas de unin a penicilina. Estas, en su mayora transpeptidasas, son las encargadas de transportar las pequeas cadenas peptdicas que junto a las subunidades repetidas de N-acetilglucosamina y N-acetilmurmico conforman la estructura de enrejado caracterstico del peptidoglucano, sustancia que aporta rigidez a la pared de la bacteria y que le permite garantizar su forma e integridad celular. La unin de la penicilina a esta enzima por su centro activo, impedir a la transpeptidasa cumplir su funcin; como consecuencia se debilita la pared y la bacteria muere por lisis celular. Ejemplos de antibiticos que actan por esta va son todos los pertenecientes al grupo de los -lactmicos (antibiticos que se caracterizan por presentar en su estructura qumica un anillo -lactmico) que son los ms abundantes y utilizados en la clnica. Entre los ms conocidos podemos citar las penicilinas y todos sus derivados, adems de otros como el ceporn, cefazolina y ceftriaxone, representantes de las cefalosporinas.

Inhibicin de la funcin de la membrana celular: Los antibiticos que actan a este nivel realizan funcin de detergentes o surfactantes, estos compuestos se adosan a la superficie externa de la membrana celular alterando su estructura y propiedades osmticas. La unin de estos compuestos a la membrana se cree producen una reorientacin de la estructura de mosaico fluido caracterstico. Actan por esta va las polimixinas y los antifngicos, fundamentalmente.

Inhibicin de la sntesis proteica: Los frmacos que actan impidiendo esta funcin tienen la capacidad de interactuar con el ribosoma bacteriano de forma selectiva en alguno de los eventos que ocurren a nivel de las subunidades 30S y/o 50S, interfiriendo de algn modo en la fidelidad de la lectura del cdigo gentico o por interferencia directa en alguno de los procesos de la sntesis proteica propiamente dicha. Una variedad de antibiticos actan de esta forma entre los que se encuentran el cloramfenicol, la eritromicina, tetraciclina, kanamicina y gentamicina, entre otros.

Inhibicin de la sntesis de los cidos nucleicos: Por este mecanismo los antibiticos actan alterando la estructura organizada de doble hlice del ADN bacteriano por bloqueo de la enzima ADN gyrasa o Topoisomerasa II afectndose el proceso de replicacin y posteriores eventos de transcripcin y traduccin para la sntesis proteica. Ejemplos de antibiticos que actan a este nivel son las quinolonas representadas por el cido nalidxico y la ciprofloxacina, entre otros as como tambin la rifampicina.

Mecanismos de resistencia de las bacterias a los agentes antimicrobianos.

Se plantea que la resistencia de las bacterias a los antibiticos puede tener dos orgenes, uno gentico y otro no gentico. El no gentico est relacionado con la aparicin de resistencia debido a la prdida del blanco de accin de una droga especfica en la bacteria o por un proceso de inactivacin (no multiplicacin) que sufren algunas especies en determinados tejidos que infectan. Por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis tiene la capacidad de sobrevivir en los tejidos durante aos sin multiplicarse despus de causar un proceso infeccioso tiempo durante el cual se hace resistente al tratamiento. En cualquiera de estos casos la resistencia al frmaco no se transfiere a otras generaciones celulares y la susceptibilidad se recupera tan pronto el microorganismo comience nuevamente a multiplicarse o recupere la estructura perdida.

El mecanismo de resistencia gentico, por su carcter heredable y transmisible horizontalmente incluso entre diferentes poblaciones microbianas, es el ms importante y es el que desarrolla la bacteria como respuesta al ataque del agente antimicrobiano. Puede ser:

Cromosmico: cuando se produce una mutacin en un locus que controla dentro del genoma la susceptibilidad a un medicamento dado.

Extracromosmico: cuando en el intervienen elementos no cromosomales conocidos como plsmidos los que pueden ser ntegramente transmitidos de una bacteria a otra por los diferentes procesos de intercambio gentico (conjugacin, transduccin y transformacin). De este modo la adquisicin de uno solo de estos plsmidos R (plsmidos de resistencia) codifica en la bacteria resistencia para tantos antibiticos como informacin contenida tenga cada uno de ellos. Los transposones son pequeos segmentos de plsmidos R con capacidad de insertarse en cualquier sitio del genoma (mecanismo de transposicin) que tambin codifican resistencia especfica a diferentes frmacos.

Los mecanismos genticos de resistencia a los antimicrobianos ms comunes son los siguientes:

1. Inactivacin enzimtica

2. Modificacin estructural del blanco o sitio de accin

3. Disminucin de la permeabilidad a la droga

4. Desarrollo de bombas de eflujo activo

Inactivacin enzimtica: Es el ms comn. Las enzimas ms conocidas son las denominadas -lactamasas desarrolladas por bacterias grampositivas y gramnegativas para inactivar a los antibiticos del tipo -lactmicos. La enzima es capaz de actuar sobre el antibitico antes de que ste se una a las PBP que constituyen su blanco de accin Del mismo modo que son estos los antibiticos ms utilizados en la clnica, en correspondencia con ello ya se han identificado ms de 300 enzimas -lactamasas, que se diferencian en su perfil bioqumico y estn destinadas a la hidrlisis de diferentes sustratos.

Modificaciones estructurales en los blancos o sitios de accin: La bacteria desarrolla un blanco estructural alterado incapaz de ser reconocido por el antibitico especfico. Ej. las bacterias resistentes a la oxacilina (penicilina capaz de resistir el efecto de las enzimas -lactamasas) eluden el efecto del antibitico produciendo una modificacin estructural de su blanco que son las PBP.

Disminucin de la permeabilidad a la droga: Ante el ataque de determinados frmacos las bacterias pueden evadirlo por modificaciones en la permeabilidad de la membrana al medicamento. Por ejemplo, prdida de poros de membrana especializados en el transporte de determinadas sustancias.

Desarrollo de bombas de eflujo activo: Diferentes microorganismos han creado esta defensa ante el ataque de un gran diversidad de frmacos. Producen protenas especializadas en extraer el antibitico del interior de la clula una vez que ha penetrado en el espacio periplsmico. Este mecanismo es extremadamente eficiente dado que la velocidad con que la bacteria saca de su interior el antibitico es mayor que la velocidad con que ste penetra.

Resistencia cruzada: Cuando determinadas bacterias presentan resistencia a varios antibiticos que comparten parcial o totalmente un mismo mecanismo de accin, se dice entonces que existe resistencia cruzada.

Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos.

Tan pronto como fue introducido en la prctica clnica el uso de los antibiticos, surgi tambin la necesidad de implementar mtodos de laboratorio capaces de medir el grado de efectividad de las diferentes drogas empleadas en el tratamiento de un proceso infeccioso especfico.

La variedad de mtodos y pruebas especiales destinadas al estudio de la susceptibilidad y respaldo al tratamiento antimicrobiano son muy variados y se han ido perfeccionando a travs del tiempo con el propsito de hacerlos cada vez ms eficientes y efectivos.

Antibiograma: Es la prueba en la cual enfrentamos un microorganismo a una concentracin conocida de una droga antimicrobiana para evaluar su efecto midiendo el crecimiento microbiano a una temperatura y tiempo dados y comparndolo con un estndar de referencia. Los mtodos se basan en la dilucin o difusin del antibitico en medios especficos en los que se cultiva el microorganismo y en todos los casos los resultados se interpretan a travs de las siguientes categoras de susceptibilidad:

Susceptible (S) Significa que el microorganismo causante del proceso infeccioso debe responder exitosamente al tratamiento aplicado a las dosis habituales y por una va apropiada.

Medianamente Susceptible o Intermedio: (MS o I) Significa que el microorganismo solo se inhibir por la droga si se aplica una dosis mxima y por una va parenteral. (Salvo excepciones, estos medicamentos no deben ser seleccionados para el tratamiento, sobre todo aquellos en los que la dosis teraputica est muy cercana a los rangos de toxicidad).

Resistente: (R) Significa que el microorganismo no se inhibe por el antibitico a las concentraciones sistmicas usualmente alcanzables por la droga cuando es aplicada por la va y en las dosis adecuadas.

Mtodos

a) Macrodilucin en caldo: Fue el primero que se desarroll y constituye el mtodo de referencia. Se realiza en tubos de ensayo conteniendo un medio de cultivo lquido (caldo Mueller Hinton) y en el que se realizan diluciones sucesivas de un antibitico partiendo de una concentracin conocida. Posteriormente se inocula cada tubo con igual cantidad de un inculo estandarizado del microorganismo de prueba. Se incuba durante 18-24 horas tiempo al cual se realiza la lectura a simple vista buscando turbidez indicadora de crecimiento microbiano. Lectura: se identifica el tubo con la menor concentracin del antibitico a la cual no se obtuvo crecimiento microbiano visible (ausencia de turbidez) o lo que es lo mismo, la concentracin mnima inhibidora (CMI) que se expresa en g/mL (Figura 1) y los resultados se comparan con los estndares de referencia especficos que han sido internacionalmente normados para diferentes microorganismos o grupos microbianos. El laboratorio informa el valor de la CMI determinada para cada antibitico acompaado de la categora de susceptibilidad correspondiente. Ventajas: mtodo ms exacto. Desventajas: gran complejidad de realizacin y costo elevado.

Fig.4.1: Test de macrodilucin en caldo. En los tubos donde hay menor concentracin del antibitico (tubos de la izquierda) aparece turbidez indicadora de crecimiento bacteriano. Contando de derecha a izquierda, la concentracin de la droga contenida en el tubo ( 6 se correspondera con la CMI para ese antibitico.

b) Microdilucin en caldo: El mismo mtodo llevado a microtcnica. Tiene como ventajas que emplea menor cantidad de recursos y se facilita su ejecucin Se realiza en placas de microttulo de fondo plano con tapa, destinadas para estos fines. Diferentes mtodos automatizados utilizan como base esta variante y se considera el mtodo ideal para monitorear el tratamiento antimicrobiano en el paciente grave. La lectura, informe del laboratorio e interpretacin de los resultados se realiza de igual forma a la antes descrita.

c) Mtodo de Bauer-Kirby: Es el internacionalmente recomendado para la prctica hospitalaria de rutina dada su sencillez y bajo costo, no obstante, est sujeto a mltiples errores tcnicos razn por la que su realizacin requiere de un exhaustivo control de la calidad. Se realiza en placas de cultivo con Agar de Mueller-Hinton sobre las que se extiende el microorganismo de prueba con un hisopo de algodn estril. Posteriormente sobre la superficie de la placa inoculada se colocan pequeos discos, comercialmente preparados, impregnados con concentraciones estandarizadas de los diferentes antibiticos y debidamente identificados. Las placas se incuban por un periodo de18-24 horas. Lectura: El antibitico impregnado en el disco al hacer contacto con la superficie hmeda de la placa de agar difundir en el medio impidiendo el crecimiento del microorganismo de prueba en correspondencia con su grado de susceptibilidad (halo de inhibicin). Con una regla plana se mide en milmetros el halo obtenido en cada caso y se compara ste con los datos reflejados en las tablas de referencia para la interpretacin de los resultados. Fig. 3 y 4. El Laboratorio informar el antibitico acompaado de la categora de susceptibilidad correspondiente.

Fig.4.2 Antibiograma por mtodo de Fig. 4.3 Ejemplo de antibiticos sensible

difusin y resistente

Problema: Usted tendr en su puesto de trabajo un antibiograma realizado por el mtodo de Bauer-Kirby y los datos correspondientes a otro realizado por uno de los mtodos de dilucin. Realizar la lectura, informar e interpretar los resultados correspondientes en cada caso.

Procedimiento.

Antibiograma por el mtodo de Bauer-Kirby:

Realice meticulosamente la medicin en milmetros de los halos de inhibicin de los diferentes antibiticos. Para ello coloque la regla sobre cada uno de los discos por el reverso de la placa, determinando en cada caso el tamao del dimetro del halo. Identifique el antibitico y escriba en su cuaderno la medida en mm obtenida para cada uno. Compare los resultados por usted obtenidos con los datos que se ofrecen en la tabla de referencia (Tabla 1) y determine la categora de susceptibilidad correspondiente a cada antibitico. Informe e interprete los resultados.Antibiograma por mtodo de dilucin:

Compare los valores de CMI para cada antibitico que se le ofrecen en el problema con los datos de la tabla de referencia (Tabla 2).

Determine las categoras de susceptibilidad en cada caso.

Informe e interprete los resultados.

Tabla 1. REFERENCIA PARA LA DETERMINACIN DE LAS CATEGORAS DE SUSCEPTIBILIDAD POR MTODOS DE DIFUSIN

Agente antimicrobianoContenido del disco (g)Tamao del dimetro (mm)

RIS

Ampicilina 10 1314-16 17

Cefazolina 30 1415-17 18

Ceftriaxone30 1314-20 21

Gentamicina 10 1213-14 15

Kanamicina 30 1314-16 18

Tetraciclina 30 1415-18 19

Ciprofloxacina 5 1516-20 21

Acido Nalidxico 30 1314-18 19

Cloramfenicol 30 1213-17 18

Fosfomicina200 1213-15 1

Tabla 2. REFERENCIA PARA LA DETERMINACIN DE LAS CATEGORAS DE SUSCEPTIBILIDAD POR MTODOS DE DILUCINAgente antimicrobianioConcentracin Mnima Inhibitoria (g/ml)

RIS

Ampicilina 3216 8

Cefazolina 3216 8

Ceftriaxone 6416-32 8

Gentamicina 8- 4

Kanamicina 32- 16

Tetraciclina 168 4

Ciprofloxacina 42 1

Acido Nalidxico 3216 8

Cloramfenicol 1213-17 18

Fosfomicina 1213-15 16

Presentacin de Resultados.

Elabore un informe con los resultados obtenidos donde destaque:

Antibiticos susceptibles, intermedios y resistentes en cada caso.

Realice un comentario sobre los resultados por usted obtenidos donde seale cuales pudieran ser los antibiticos posibles a seleccionar por el mdico.

Autopreparacin

Adems de estudiar los aspectos tericos de la prctica que aparecen en el folleto, lea detenidamente en su libro de Texto (Microbiologa y Parasitologa Mdica, Tomo I) los Captulos 10 y 11, Pg. 81-99. Luego, proceda a responder las siguientes preguntas:

1. Cul usted considera constituye una de las causas fundamentales del acelerado incremento de la resistencia bacteriana a los agentes antimicrobianos? Fundamente su respuesta.

2. En el laboratorio se aisl un estafilococo que present el siguiente patrn de susceptibilidad: Penicilina: R, Kanamicina: S, cefazolina: S, Tetraciclina: I y cloramfenicol: S

a) Interprete los resultados obtenidos

b) Qu mecanismo de resistencia bacteriano usted considera se puso de manifiesto en la resistencia observada a la penicilina?. Justifique su respuesta.

c) Qu otros mecanismos de resistencia bacterianos a las drogas antimicrobianas usted conoce?

3. Qu se conoce como antibiograma?

4. Cules son los mecanismos ms frecuentes que utilizan las bacterias para resistir el ataque de los antibiticos?

Prctica de laboratorio 5

Tema 3: Bacteriologa Mdica

Ttulo: Diagnstico de laboratorio de los cocos pigenosObjetivos:

Diferenciar al microscopio las caractersticas morfolgicas y tintoriales de los diferentes gneros y/o especies bacterianas incluidas dentro de este grupo.

Observar las caractersticas diferenciales de las colonias producidas por estas bacterias sobre los medios empleados para el primocultivo.

Aspectos tericos

Bajo la denominacin de cocos pigenos se agrupan las especies bacterianas con morfologa coccea (forma redondeada) y que producen pus. Dentro de este grupo se encuentran las especies patgenas de los gneros: Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus y Neisserias.

Estas bacterias estn implicadas en procesos infecciosos diversos, que van desde un absceso localizado hasta una sepsis generalizada de mal pronstico.

Diagnstico de cocos pigenos grampositivos: Para el diagnstico de las infecciones ocasionadas por estafilococos, estreptococos y enterococos las muestras pueden ser variadas y dependern de la localizacin del proceso infeccioso. Entre las ms comunes se encuentran:

Secrecin de heridas y/o abscesos

Secrecin nasal y/o farngea

Sangre

Esputo

Secrecin tica

Lquido cefalorraqudeo

Orina

El primer paso del diagnstico consiste en la realizacin de un examen directo de la muestra (frotis y coloracin por Gram) para determinar las caractersticas morfolgicas y tintoriales del agente causal. Paralelamente tambin se realiza una siembra en placas con Agar Sangre (primocultivo) para observar las caractersticas culturales del microorganismo y realizar posteriormente las pruebas fisiolgicas especficas para la determinacin de las especies.

Los pasos generales del diagnstico se muestran en el siguiente esquema:

Esquema para la identificacin de los cocos pigenes Gram positivos

Diagnstico de cocos pigenos gramnegativos (N. meningitidis y N. gonorrhoeae):

En las infecciones causadas por N. gonorrhoeae, las muestras fundamentales son:

Secrecin endocervical

Secrecin uretral

Secrecin conjuntival

En las infecciones por N. meningitidis las muestras pueden ser:

LCR

Aspirados de petequias

Sangre (para cultivo)

Secrecin nasofarngea (estudio de portadores)

En ambos casos se realiza un examen directo de la muestra (frotis y coloracin por Gram) para determinar las caractersticas morfolgicas y tintoriales del agente causal. Paralelamente tambin se efecta una siembra en placas con Agar Thayer Martin y/o Agar Chocolate (primocultivo) para observar las caractersticas culturales del microorganismo y realizar posteriormente las pruebas fisiolgicas especficas para la determinacin de las especies. Estas especies bacterianas son microaerfilas por lo que requieren de condiciones especiales de incubacin para su adecuado desarrollo; se deben mantener los cultivos a temperatura de 35-37 o C en atmsfera conteniendo de 5-10% de CO2 por 48 horas.

Los pasos generales del diagnstico se muestran en el siguiente esquema:

Esquema para la identificacin de los cocos pigenes Gram negativos

Problema: Usted tendr en su puesto de trabajo preparaciones (exmenes directos) de diferentes muestras a las que realizar tincin de Gram y observar al microscopio para identificar las caractersticas morfolgicas y tintoriales de las bacterias presentes en ellas. Tambin encontrar placas de primocultivos para la observacin de las caractersticas culturales de los microorganismos en estudio.

Reactivos y materiales:

Microscopio

Aceite de cedro

Preparaciones de muestras (exmenes directos)

Placas con cultivos de cocos pigenos

Colorantes de Gram

Procedimiento:

Para observar las caractersticas morfolgicas y tintoriales de las bacterias en estudio:

Realice la tincin de las preparaciones procediendo de igual modo que en la Prctica No. 3

Coloque la lmina teida en el microscopio y adicione sobre ella una gota de aceite de cedro.

Enfoque con el objetivo de 100 x

Anote las caractersticas observadas (forma, modo de agrupacin, respuesta a la tincin de Gram).

Para determinar las caractersticas del crecimiento:

Observe las colonias desarrolladas sobre la superficie de placas de cultivo y anote sus caractersticas ms distintivas (tamao, color, aspecto, borde, superficie).

Mire alrededor de las colonias y refiera si hay lisis o no de los eritrocitos de la sangre del medio de cultivo y si esta es total o parcial.

Anote cada resultado en su cuaderno de trabajo.

Presentacin de los resultados:

Prepare un informe de los resultados obtenidos en la prctica. Escriba el nombre del gnero bacteriano (o especie, si procede) que deba corresponder a cada una de las morfologas por usted observada. Tenga en cuenta respetar la nomenclatura binomial para la escritura de los nombre cientficos de los microorganismos.

Autopreparacin

Revise en su libro de texto, Microbiologa y Parasitologa Mdica Tomo I los Captulos que a continuacin se refieren:

Captulo 18 Estafilococos, Pg. 153-156, 159 y 160

Captulo 19 Estreptococos, Pg. 165-170 y 173-175

Captulo 20 Enterococos, Pg. 179-186

Captulo 24 Neissserias y Moraxella catarrhalis, Pg. 217-219, 222-223, 225, 228 y 229

Proceda posteriormente a responder las siguientes preguntas:

1. Qu entiende usted por cocos pigenos?

2. Qu valor considera usted que tiene el examen directo de la muestra en el diagnstico presuntivo de las infecciones por estas bacterias?

3. La catalasa es una enzima producida por algunos cocos grampositivos. Qu valor tiene la deteccin de la produccin de esta enzima en el laboratorio?

4. Cul es la morfologa y el modo de agrupacin de estafilococos, estreptococos, neumococos, enterococos y neisserias?

5. Qu importancia tiene la prueba de la coagulasa para el diagnstico de estafilococos?

6. Cmo se clasifican los estreptococos de acuerdo al tipo de lisis que producen en las placas de Agar Sangre?Qu significan los trminos , y hemolticos?

7. A su consulta llega un paciente del sexo masculino con una uretritis purulenta en el que usted sospecha una gonorrea. Qu examen microbiolgico usted indicara en este caso? Qu muestra se debe colectar para realizar el diagnstico? De ser el resultado positivo, qu informe esperara usted del laboratorio? Si su paciente fuese del sexo femenino, qu examen usted indicara?

Clase Prctica 6

Tema V: Micologa Mdica

Diagnstico de laboratorio de las micosis

Objetivos

Interpretar los resultados de los estudios micolgicos emitidos por el laboratorio a travs del conocimiento de los diferentes pasos del diagnstico.

Observar clulas de hongos filamentosos y levaduriformes, as como su modo de reproduccin.

Aspectos tericos:

El trmino micosis se utiliza para referirse a las infecciones causadas por hongos. Estos pueden producir afecciones tanto de tipo superficial, cutnea como sistmica, localizacin sta que determinar la complejidad y gravedad del cuadro clnico. En dependencia de la especie, los hongos patgenos al hombre pueden producir daos en el hospedero que van, desde sencillas manchas en la piel hasta cuadros de mal pronstico que comprometen la vida del paciente.

Muestras: Las muestras a colectar en el laboratorio dependern de la afeccin especfica:

- En la pitiriasis versicolor (agente causal Malassezia furfur) el examen consiste en raspados de la zona de la piel afectada para recoger las escamas de las lesiones. En la piedra blanca y la piedra negra (agentes causales Trichosporon beigelii y Piedraia hortae respectivamente), la muestra la constituyen los pelos infectados.

- En las dermatofitosis (producidas por los gneros Trichophyton, Microsporum y Epidermophyton) las muestras consisten en raspados de la zona afectada de la piel o las uas y los pelos infectados. Candida albicans puede estar implicada en afecciones cutneas, afectando la piel y las uas, por lo que en estos casos las muestras seran los raspados de dichas zonas.- En las infecciones por Candida sp las muestras dependern de la afeccin:

Onicomicosis: raspados de uas.

Candidiasis genital: secrecin vaginal

Candidiasis oral: secrecin de las lesiones.

Intertrigo: secrecin de las lesiones.

Candidiasis urinaria: orina

Candidiasis sistmica: sangre, esputo, LCR y biopsias de tejidos.

Examen microscpico: Para el examen al microscopio de las muestras, stas se colocan entre cubre y portaobjeto con una gota de KOH al 10%. La preparacin se calienta directamente a la llama de un mechero bunzen, sin dejar hervir, y posteriormente se observa al microscopio ptico con objetivos de 20X y 40X. Es importante para la identificacin del microorganismo, la observacin cuidadosa de la morfologa de la clula, presencia de septos y modo de reproduccin.

Para la observacin de cndidas, puede realizarse una tincin de Gram, observando la preparacin teida al microscopio con objetivo de inmersin (100X). Las levaduras responden como grampositivas.

Cultivo: El cultivo de las muestras se realiza en tubos con medio Agar Sabouraud glucosa, los que se incuban a temperatura ambiente durante 7 14 das. Transcurrido este tiempo se observan las caractersticas de las colonias desarrolladas.

Para el diagnstico de pitiriasis versicolor y tia capitis es til la exposicin directa de la lesin a la lmpara de Wood. Esta es una lmpara que emite radiaciones en el rango de la luz ultravioleta y permite observar fluorescencia. En el caso de pitiriasis versicolor la fluorescencia que se produce es de color amarillo-naranja, y en la tia capitis producida por M. gypseum y M. audoinii, la fluorescencia es de color verde.

Problema: Usted encontrar en su puesto de trabajo preparaciones en fresco realizadas a partir de cultivos puros de diferentes especies de hongos filamentosos para observar en ellas sus caractersticas morfolgicas y formas de reproduccin, adems encontrar lminas teidas por Gram para observar las caractersticas morfolgicas y de reproduccin de Candida.

Reactivos y materiales:

Preparaciones en fresco con lactofenol de cultivos puros de diferentes especies de hongos filamentosos causales de micosis.

Preparaciones teidas por Gram de Candida albicans, en cultivo puro.

Microscopio ptico.

Aceite de cedro

Procedimiento:

Para observar las caractersticas morfolgicas y de reproduccin de los hongos filamentosos en estudio:

Coloque la preparacin en el microscopio y enfoque con objetivo de 20X y luego pase a objetivo de 40X

Localice en la preparacin las hifas y aprecie si estas son septadas o aseptadas. Busque campos visuales que le permitan observar los caracteres de las esporas (tamao, presencia de septaciones, forma).

Anote y dibuje lo observado.

Para apreciar los caracteres distintivos de Candida albicans:

Coloque la preparacin teida en el microscopio y agregue sobre ella una gota de aceite de cedro.

Enfoque con el objetivo de mayor aumento de 100 X

Observe la forma de la clula, su modo de reproduccin y si hay presencia de pseudomicelio y de tubos germinativos.

Anote y dibuje lo observado.

Presentacin de los resultados:

Prepare un informe de los resultados obtenidos en la actividad segn las orientaciones de su profesor

Autopreparacin

Revise en su libro de texto, Micobiologa y Parasitologa Mdica Tomo I, los siguientes captulos:

Captulo 41 Generalidades de Micologa Pg. 459-463

Captulo 43 Malassezia furfur Pg. 475-477

Captulo 44 Dermatofitos Pg. 481-485

Captulo 48 Candida Pg. 501-504

Proceda luego a responder las siguientes preguntas:

1. Que exmenes usted recomendara para el diagnstico de la pitiriasis versicolor?

2. Un paciente que llega a su consulta tiene afectado el tejido queratinizado de las uas de los pies qu gneros de hongos pueden estar implicados en este tipo de afeccin? qu examen usted indicara? Qu muestra usted colectara para el diagnstico?

3. Por qu la infeccin por Candida se considera una micosis oportunista?

Bibliografa Basualdo J, Coto C, Torres R. Microbiologa Biomdica: Bacteriologa, Micologa, Virologa, Parasitologa, Inmunologa. Ed. Atlanta, Argentina, 1996.

Botero D, Restrepo M. Parasitosis Humana. 3ra. Ed. Corporacin para Investigaciones Biolgica, Colombia 1998

LLop A, Valds-Dapena M, Zuazo JL. Microbiologa y Parasitologa Mdica. Ed. Ciencias Mdicas, La Habana, 2001

Sitios Web:

http://www.siue.edu/(cbwilso/Staphylococcus.jpg

http://www.cat.cc.md.us/courses/bio141/labmanual/lab1/images/empneumo.jpg http://rockefeller.edu/vaf/16k.htm http://www.cat.cc.md.us/courses/bio141/labmanual/lab16/images/97218a.jpg http://www.meddean.luc.edu/lumen/deptwebs/microbio/med/gram/slides3jpgAutores:

MsC. Lutgarda Abn Vzquez

Profesora Auxiliar

DrC. Mara H. Espino Hernndez

mespino@elacm.sld.cuProfesora Auxiliar

Dra. Mercedes Silva Reyes

Profesora Auxiliar

Coautores:

Dra. Linet Alemn Mondeja

Profesor Asistente

Dra. Mara Julia Valds Hernndez

Profesor Asistente

Lic. Niuris Mirabal Valds

Adiestrada

Asesor:

Dr. Jorge Luis Zuazo Silva

Profesor Consultante y

Profesor Principal del ISCMH

Este documento est protegido por las regulaciones de Derecho de Autor. Fue registrado en el Centro Nacional de Derecho de Autor (CENDA) con el nmero 1201-2005. Escuela Latinoamericana de Medicina, Cuba, 2005.

Escuela Latinoamericana de Medicina (ELAM)Asignatura: Agentes Biolgicos.

2005

Fig. 3.2: Mtodo de siembra por vertido en placas o a profundidad

Fig. 3.1: Mtodo de siembra por estras

Fig. 3.4: Pasos de una tincin. 1: Colocar la muestra, 2: Extender, 3: Secar al aire, 4: Fijar a la llama

1

4

2

3

Fig. 3.3: Esterilizacin del asa de siembra en la llama del mechero

Resistente

Sensible

PAGE 1Para ver trabajos similares o recibir informacin semanal sobre nuevas publicaciones, visite www.monografias.com