ingene q paratb (sondas detección)

INSTRUCCIONES DE USO – ESPAÑOL

(Versión 2601-15) – PAG.1.

INgene q ParaTB (Sondas Detección) R.10.MAP.K.5TX/Q

Kit qPCR para la detección y cuantificación de Mycobacterium avium

subsp. Paratuberculosis en muestras biológicas/ qPCR kit for the

detection and quantification of Mycobacterium avium subsp.

Paratuberculosis

PCR Real-time. 100 Reacciones.

Producto fabricado en

INGENASA. Empresa certificada

bajo Normas ISO 9001 y 14001.

Índice de Contenidos (ESPAÑOL) INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................................................................................. 2

COMPOSICIÓN DEL KIT ................................................................................................................................................................................ 2

CONSERVACIÓN DEL KIT ............................................................................................................................................................................. 2

MATERIALES NECESARIOS NO SUMINISTRADOS .............................................................................................................................. 3

NORMAS BÁSICAS PARA EVITAR CONTAMINACIONES .................................................................................................................. 3

RECOGIDA Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS .................................................................................................................................. 3

EXTRACCIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO ............................................................................................................................................... 4

AMPLIFICACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO ......................................................................................................................................... 4

ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS ........................................................................................................................ 6

LOCALIZACIÓN Y RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS ............................................................................................................................... 9

CONTROL DE CALIDAD ................................................................................................................................................................................. 9

ASISTENCIA TÉCNICA .................................................................................................................................................................................... 9

Table of Contents (ENGLISH) INTRODUCTION ............................................................................................................................................................................................ 10

KIT COMPOSITION ....................................................................................................................................................................................... 10

GUIDELINES FOR THE CORRECT CONSERVATION OF THE KIT COMPONENTS .................................................................... 10

MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED ....................................................................................................................................... 11

PRECAUTIONS TO AVOID CONTAMINATION ................................................................................................................................... 11

SAMPLES COLLECTION AND TRANSPORTATION ............................................................................................................................ 11

DNA EXTRACTION ........................................................................................................................................................................................ 12

AMPLIFICATION OF THE GENETIC MATERIAL .................................................................................................................................... 12

ANALYSIS AND INTERPRETATION OF RESULTS ................................................................................................................................ 14

TROUBLESHOOTING .................................................................................................................................................................................... 17

QUALITY CONTROL ...................................................................................................................................................................................... 17

TECHNICAL ASSITANCE AND PRODUCT SUPPORT ......................................................................................................................... 17

9191.INGE 9175.INGE IT-73840

IT-73780


(Versión 2601-15) – PAG.2.

INTRODUCCIÓN

INgene q ParaTB Sondas es un ensayo diseñado para poner de manifiesto la presencia de ADN de Mycobacterium avium

subsp. Paratuberculosis (MAP) en muestras biológicas de un modo sencillo y con unos niveles de sensibilidad y

especificidad extremadamente altos. Bajo condiciones óptimas es capaz de detectar 1 copia de MAP por reacción.

El kit posee los reactivos y enzimas necesarios en dos mezclas que una vez unidas en un único envase (Maxter mix) se

encuentran en concentraciones idóneas, y está diseñado con el objeto de que únicamente sea necesaria la adicción del

ADN de la muestra problema, para detectar y cuantificar MAP, amplificándose una región del gen F57 de copia única

específica del patógeno. El ensayo utiliza una sonda Taqman marcada con FAM-BHQ1®. Por otro lado, cada Master Mix,

proporciona un control interno positivo (CIP) con cebadores y sonda Taqman marcada con JOE-BHQ1®, permitiendo

detectar falsos negativos debidos a una inhibición de la PCR. Además, contiene un fluorocromo pasivo de referencia,

ROX, que permite realizar una normalización pasiva de la señal evitando posibles errores en la cuantificación debidos a

diferencias de pipeteo, y que en el caso de utilizar modelos ABI PRISM de PCR a tiempo real de Applied Biosystems, es

necesario para eliminar interferencias entre los datos recogidos de varios canales de emisión.

Para la determinación del nº de copias de MAP y como control positivo de PCR, el kit incluye un control positivo estándar

con un nº de copias conocido de MAP. A partir de este control, puede ser generada la curva estándar que relaciona el nº

de copias del patógeno con el valor del ciclo umbral (Ct, cycle threshold).

El kit ha sido probado en todos los equipos de Applied Biosystem (StepOne, HT7300, HT7500) y LC 480 de Roche. Es

posible su uso en otros equipos que permitan la medida de dos fluoróforos aunque pueden cambiar los valores de Ct,

según el equipo utilizado.

COMPOSICIÓN DEL KIT

COMPONENTES (100 reacciones) Nº VIALES VOLUMEN/VIAL

Reactivo A 1 275 µl

Reactivo B 1 1375 µl

Control Positivo Estándard (107 copias/ µl) 1 100 µl

Control Negativo 1 200 µl

Tris-HCl 10 mM pH8 1 1000 µl

CONSERVACIÓN DEL KIT

Una vez recibido el kit, añadir el contenido del reactivo “A” en el tubo del reactivo “B” y homogeneizar la mezcla (de

aquí en adelante AB). Mantener el kit a -20ºC hasta su utilización. En el caso de que la mezcla de los reactivos A y B no

pudiera realizarse en el momento de recepción del kit, mantener el kit a -20ºC hasta que los reactivos puedan ser

mezclados. Los componentes del kit se deben mantener a -20ºC y son estables durante 1 año desde la fecha de

fabricación (mirar fecha de caducidad en el envase).


(Versión 2601-15) – PAG.3.

MATERIALES NECESARIOS NO SUMINISTRADOS

Guantes desechables libres de polvo (sin talco),

Microcentrífuga,

Agitador de tubos,

Termociclador de tiempo real,

Micropipetas (0,5-1000 μl),

Puntas de pipeta estériles con filtro,

Agua estéril libre de DNAsas / RNAsas.

NORMAS BÁSICAS PARA EVITAR CONTAMINACIONES

En general deben mantenerse las siguientes precauciones:

Ausencia de DNasas/RNasas en el material fungible a utilizar.

Uso de agua destilada autoclavada (25 min., 120ºC) libre de DNasas/RNasas.

Uso de puntas estériles con filtro.

Buena homogeneización de los componentes del kit una vez descongelados.

Mantener en todo momento las mezclas en hielo.

Repetidos ciclos de congelación y descongelación podrían reducir la sensibilidad de los reactivos y con ello la

sensibilidad del método, por lo que es conveniente dispensar los reactivos en alícuotas de un solo uso.

manteniéndolas a -20ºC y protegidas de la luz hasta su utilización.

Para evitar contaminaciones que generen falsos positivos, es importante:

Separar físicamente el control positivo de PCR del resto de reactivos del kit.

La manipulación de las muestras a testar se debe realizar en un espacio físico diferente de donde se realizan los

análisis de productos amplificados.

El control positivo de PCR debe ser añadido en un espacio físico diferente de donde se añade la mezcla y de

donde se manipulan las muestras a testar.

RECOGIDA Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS

INgene q ParaTB Sondas está indicado para la detección y cuantificación de MAP a partir de diferentes muestras

biológicas, preferiblemente de muestras de heces y cultivos puros.

El transporte al laboratorio se realizará en frío dentro de las primeras 24 horas. Si bien, es posible el almacenamiento de

las muestras a -20ºC hasta su extracción.


(Versión 2601-15) – PAG.4.

EXTRACCIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO

Una vez aislado el ADN, se recomienda chequear la calidad y cantidad del ADN aislado realizando una medida de

absorbancia. Se utilizará cualquier procedimiento disponible en el laboratorio con el que se obtenga una buena calidad

de material genético a partir de las muestras. INGENASA puede suministrar un protocolo y buffer de extracción bajo

pedido.

Ingenasa ha realizado este ensayo con los métodos de extracción basados en:

- Método de Chomczynski and Sacchi de extracción fenólica.

- Métodos automáticos con uso de bolas magnéticas (Mag Max TM96 total NA isolation Ref AM1840).

- Métodos de purificación por columna: The QIAamp® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN). High pure PCR template

Preparation kit (ROCHE)

Existen varias casas comerciales con productos para extracción que dan una calidad óptima de ácido nucleico, siguiendo

las indicaciones del fabricante. Entre ellas: Life-technologies, ROCHE, Qiagen, Marchery-Nalgene, otras.

PRECAUCIÓN: si la amplificación no es inmediata, conservar el DNA a -20ºC.

AMPLIFICACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO

MATERIALES NECESARIOS

- Hielo picado.

- ADN extraído de las muestras.

- Mezcla A – MANTENER EN HIELO PICADO SIEMPRE QUE ESTÉ FUERA DEL REFRIGERADOR.

- Mezcla B - MANTENER EN HIELO PICADO SIEMPRE QUE ESTÉ FUERA DEL REFRIGERADOR.

- O Mezcla AB- MANTENER EN HIELO PICADO SIEMPRE QUE ESTÉ FUERA DEL REFRIGERADOR.

- Control positivo de amplificación A1 (MAP)

- Agua libre de DNAsas y RNAsas.

Consideraciones previas a la preparación de la PCR

En cada experimento de PCR además de las muestras problema hay que incluir los siguientes controles:

Control negativo de extracción:

La muestra es sustituida por un buffer de elución o agua y es sometido al proceso de extracción de ácidos nucleicos.

Control negativo de PCR:

Incluye todos los reactivos de PCR excepto el ADN, en cuyo lugar se añade agua. Permite comprobar que los reactivos de

PCR no están contaminados.

Control positivo de PCR o Curva estándar en caso de cuantificación:

Las diluciones de la curva estándar, además de permitir cuantificar MAP en las muestras problemas, son un control positivo

de PCR de concentración conocida, cuyo resultado debe de ser positivo. Permite comprobar que los parámetros y

condiciones de PCR elegidos son adecuados y que no se ha producido ningún incidente en la reacción.


(Versión 2601-15) – PAG.5.

Réplicas (opcional):

Para que la cuantificación sea estadísticamente óptima se aconseja realizar 3 réplicas tanto de los puntos de la curva

estándar como de las muestras problema, y poder calcular así la desviación estándar con un nº mínimo de 3 datos.

Preparación de diluciones seriadas de la Curva Estándar para la cuantificación absoluta de MAP (Opcional)

Para la preparación de las diluciones necesarias en la generación de la curva estándard se recomienda el uso de microtubos

de centrifuga “Maximum Recovery” (no suministrados). Utilizar Tris-HCl 10 mM pH 8 como diluyente (suministrado).

Las diluciones seriadas se realizan a partir del Control Positivo Std siguiendo estas indicaciones:

1. Pipetear 90 μl de Tris-HCl 10 mM pH 8 en 7 tubos que se identificarán con nºs correlativos del 1 al 7.

2. Pipetear 10 μl del Control Positivo Std en el tubo identificado con el nº 1.

3. Vórtex.

4. Cambiar de punta y pipetear de nuevo 10 μl de tubo 1 en el tubo 2.

5. Vórtex.

6. Repetir los pasos 4 y 5 hasta completar las diluciones seriadas.

7. Utilizar los tubos 1, 4 y 6 como estándares en la PCR ver tabla:

Curva Estándar Concentración Curva

Estándar

Nº de copias

MAP*

Tubo 1 106 copias / µl Punto 1 107

Tubo 4 103 copias / µl Punto 4 104

Tubo 6 10 copia / µl Punto 6 100

*En el caso de que se añadan 10 µl de muestra

PROCEDIMIENTO

1. Preparar y marcar convenientemente, tantos tubos para la amplificación como muestras vayan a procesarse,

incluyendo los controles y los puntos de la curva estándar según la tabla previa de curva estándar. Siempre

contar al menos con un control positivo de amplificación, y otro para el control negativo.

2. Sacar las mezclas A y B del congelador. O si ya han sido mezclados en el momento de la recepción del kit sacar la

mezcla AB. Mantener en hielo picado hasta su total descongelación. En caso de no haber sido mezcladas ambas

mezclas en el momento de recepción del kit, agitarlas ligeramente para su correcta homogenización y preparar

la mezcla de amplificación AB volcando el contenido de la mezcla A en B y marcarla como AB. El tubo que

contiene la mezcla, es conveniente que se mantenga en todo momento en hielo picado.

3. Determinar el nº de reacciones que se van a desarrollar.

4. Tomar en un tubo el volumen necesario de AB para el número de muestras que vayan a procesar. Se recomienda

preparar la mezcla en exceso (calcular un 10% adicional de todos los reactivos) a fin de compensar las posibles

pérdidas de volumen durante los pipeteos. Una vez preparada la mezcla homogeneizar correctamente.


(Versión 2601-15) – PAG.6.

5. Tomar en un tubo (n x 15) μl de la Mezcla AB. El volumen por cada una de las muestras será:

Volumen Mezcla AB

Por muestra a procesar 15µl

Para un total de 10 muestras 150 µl

Para un total de N muestras 15*(N)

6. Una vez homogeneizada la mezcla anterior se dispensan 15 μl por muestra a analizar en n tubos de PCR.

7. Se añaden 10 μl* de ADN de cada muestra problema, 10 μl de los controles y 10 μl de cada una de las diluciones

seriadas de la Curva Estándar. (*Alternativamente se pueden añadir entre 2-10 μl de ADN y el resto de Tris-HCl

pH 8, 10Mm hasta completar un volumen final de muestra de 10 μl.)

8. Mezclar suavemente el contenido de cada tubo y asegurarse de que todo el líquido se encuentra depositado en

el fondo del tubo. Si no fuera así, centrifugar ligeramente hasta conseguirlo.

Siguiendo el manual de instrucciones de uso del termociclador a tiempo real, la reacción se coloca en el

termociclador y se programa con arreglo a las siguientes condiciones:

Etapas Temperatura (ºC) Tiempo Ciclos

Desnaturalización 95 10 min 1

Amplificación 95 15 sg

45 60 * 60 sg

La lectura de la fluorescencia se realiza en el paso de elongación (señalado en la tabla)* y los canales por los que se

recogen los datos relativos a las fluorescencias se detallan en la tabla siguiente:

Reporter Quencher

MAP FAM BHQ-1®

C.I. JOE BHQ-1®

Referencia pasiva ROX

ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

De cada muestra problema analizada se obtienen datos relativos a la fluorescencia proveniente del canal FAM; elegir para

el análisis la selección automática del umbral. En el caso de que esta opción no sea viable, el análisis podría desarrollarse

de forma manual siguiendo las instrucciones de uso del termociclador.

Los posibles resultados se resumen en la tabla:

Canal FAM: Detección del patógeno

Un resultado positivo en la amplificación implica la obtención de una curva de fluorescencia típica con un valor del ciclo

umbral Ct <38.

Serán muestras dudosas aquellas con Ct´s que se encuentren entre 38-40, para estos casos recomendamos:

• Repetir el análisis.

• Secuenciar el producto amplificado.


(Versión 2601-15) – PAG.7.

Canal VIC: Detección del Control Interno (JOE)

Un resultado positivo en la amplificación implica la obtención de una curva de fluorescencia típica con un valor del ciclo

umbral Ct <45. Normalmente los valores que se registran son 30 < Ct < 45.

Tabla: Posibles resultados.

Casos Canal FAM Canal VIC Resultado

A + + Positivo

B + - Positivo

C - + Negativo

D* - - Nulo/inhibido

* Repetir el análisis diluyendo el molde 1/40 para evitar inhibidores, antes de considerar la muestra negativa.

Tabla: Validación de los resultados

Caso Muestra problema Control negativo

de extracción Control positivo de PCR

Control negativo

de PCR

Resultado

muestra problema

1 + - + - +

2 - - + - -

3 + Nulo

4 - + Nulo

Caso 1. Si tanto la muestra problema como el control positivo de PCR muestran un resultado positivo, y por el contrario

los controles negativos de extracción y PCR muestran un resultado negativo.

Resultado positivo: La muestra contiene MAP.

Caso 2. Si el control positivo de PCR muestra un resultado positivo y, por el contrario, la muestra problema y los controles

negativos de extracción y PCR muestran un resultado negativo.

Resultado negativo: La muestra no contiene MAP.

Caso 3. Si el control negativo de extracción muestra un resultado positivo.

Resultado invalidado o nulo desde la etapa de extracción.

Caso 4. Si el control negativo de extracción muestra un resultado negativo, sin embargo, el control negativo de PCR

muestra un resultado positivo.

Resultado invalidado o nulo desde la etapa de amplificación.

Análisis cuantitativo (Opcional)

El número de copias de MAP de cada muestra problema puede ser cuantificado al inicio de la reacción con gran precisión

a través del ciclo umbral (Ct). De esta manera, utilizando las muestras patrones que contienen diluciones seriadas de

concentraciones conocidas de MAP, se construye una recta de calibración que relaciona los Ct con el logaritmo de la

cantidad inicial de molde, es decir, con el nº de copias de MAP que contiene la muestra. Extrapolando en esta recta los Ct

obtenidos para las muestras problema, se puede estimar el nº de copias inicial de MAP en las mismas.


(Versión 2601-15) – PAG.8.

La mayor parte de los equipos de PCR a tiempo real que existen actualmente en el mercado poseen software que realiza

automáticamente una cuantificación absoluta si todos los parámetros están correctamente configurados.

En función del termociclador, para realizar el análisis cuantitativo, una vez analizados los datos relativos a la fluorescencia

proveniente de dos canales, FAM (detección del patógeno) y VIC (control interno positivo, JOE) y validados los resultados,

puede ser necesario desactivar el canal que lee la fluorescencia del control interno positivo. Para más información

consultar el manual del equipo correspondiente.

Los datos relativos a la curva estándar necesarios para introducir en el programa de cuantificación son los específicos de

la tabla

Datos relativos a la curva estándar

Curva Estándar Nº Copias MAP

Punto 1 107

Punto 4 104

Punto 6 100

Los parámetro de una curva estándar apta deben ajustarse a los siguientes valores :

Parámetros de la Curva Estándar

Pendiente de la recta (-3,45) – (3,67)

Coeficiente de Correlación (R2) 0.995

Punto de la curva Rango de Cts +d de los puntos de la

curva Estándar

1 15-17 (+3)

2 18-20 (+3)

3 21-23 (+3)

4 24-27 (+3)

5 28-31 (+3)

6 32-35 (+3)

7 35-38* (+5)

*En un número determinado de réplicas el resultado podría ser indeterminado.

d- Variaciones posibles dependientes del equipo de real time que se utilice. Los valores de Ct corresponden a los obtenidos

con equipos de AB y Roche.


(Versión 2601-15) – PAG.9.

LOCALIZACIÓN Y RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS

1. Detección de señal de fluorescencia en el canal FAM en el control negativo de extracción.

Posible causa Solución

Contaminación ocurrida durante el

proceso de extracción

Repetir el proceso de extracción del ADN y el desarrollo de la

PCR usando nuevos reactivos.

Asegurarse de que el espacio de trabajo, equipos y los

diferentes instrumentos necesarios para la elaboración de la

PCR están descontaminados, libres de ácidos nucleicos.

2. Detección de señal de fluorescencia en el canal FAM (patógeno) en los controles negativos de PCR.


Contaminación ocurrida durante la

preparación de la PCR.

Repetir la reacción de PCR con nuevos reactivos y si es posible

varias réplicas de cada muestra.

Si se utilizan tubos, cerrar cada uno de ellos directamente

después de la adición de la muestra.

Como norma estricta el control positivo se debe añadir el

último y en un espacio físico distinto de dónde se añaden las

muestras problema.

Asegurarse de que el espacio de trabajo, equipos y los

diferentes instrumentos necesarios para la elaboración de la

PCR están descontaminados, libres de ácidos nucleicos.

3. Ausencia de señal de fluorescencia en el canal FAM en los controles positivos de PCR.


Selección incorrecta del canal del

fluorocromo.

Selección del canal FAM para todas las muestras y controles a

analizar.

CONTROL DE CALIDAD

Cada lote de producción ha sido contrastado con arreglo a nuestra certificación ISO de Sistema de Gestión de Calidad.

ASISTENCIA TÉCNICA

Para disponer de más información o realizar cualquier consulta relativa al producto, contactar con:

INGENASA

C/ Hnos. García Noblejas, 41 – 28037 MADRID

Tel (+34) 91 368 0501

e-mail: [email protected]

INSTRUCTIONS – ENGLISH

(Versión 2601-15) – PAG.10.

INTRODUCTION

INgene q ParaTB Probes is a real-time PCR kit suited for the detection and quantification of Mycobacterium avium subsp.

Paratuberculosis (MAP). Under optimal conditions it is able to detect 1 MAP copy per reaction.

The kit contains all necessary reagents and enzymes in two mixes. When mixed together, they are at the required

concentrations designed to detect and quantify MAP simply by adding the DNA of the problem sample. This results in

amplification of a single-copy F57 gene region which is specific to the pathogen. This kit makes use of a Taqman probe marked

with FAM-BHQ1®. On the other hand, each Master Mix provides a positive internal control (PIC) with primers and a Taqman

probe marked with JOE-BHQ1®, allowing detection of false negatives due to an inhibition of the PCR. In addition, it contains

a passive reference fluorochrome, ROX, allowing passive normalisation of the signal avoiding possible quantification errors

deriving from pipetting differences. When using Applied Biosystems' ABI PRISM PCR models in real time, this ROX is necessary

to prevent interferences between the data collected from various emission channels.

To determine the number of MAP copies and as a positive PCR control the kit includes a standard positive control with a

known number of MAP copies. This control allows generating the standard curve which links the number of pathogen copies

with the cycle threshold (Ct) value.

The kit has been tested for every system from Applied Biosystems (StepOne, HT7300, HT7500) and LC480 from Roche.

Although there is no reason not to work with thermocyclers from other commercial houses, as long as they have at least two

fluorescence channels, Ct values may experiments changes.

KIT COMPOSITION

COMPONENTS Nº VIALS VOLUME/VIAL

Reagent A 1 275 µl

Reagent B 1 1375 µl

Standard Positive Control (107 copies/ µl) 1 100 µl

Negative Control 1 200 µl

Tris-HCl 10 mM pH8 1 1000 µl

GUIDELINES FOR THE CORRECT CONSERVATION OF THE KIT COMPONENTS

On receiving the kit, add the contents of reagent A to the tube of reagent B and homogenise the mix (henceforth called AB).

Keep the kit at -20ºC until use. If the reagents A and B cannot be mixed immediately upon receipt of the kit, keep the kit at

-20ºC until reagents can be mixed. For longer storage periods, the components of the kit must be maintained at -20ºC and

are stable for 1 year from the manufacturing date (see expiry date on packaging).


(Versión 2601-15) – PAG.11.

MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED

Dust-free disposable gloves (without talcum powder).

Microcentrifuge.

Tube shaker.

Real-time thermocycler.

Micropipettes (0.5-1000 μl).

Sterile pipette tips (with filter).

Sterile DNAses / RNAses free water.

PRECAUTIONS TO AVOID CONTAMINATION

The following points should be read with care:

Disposable items must be DNAse and RNAse-free.

Use DNAse and RNAse-free distilled, autoclaved water (25 min., 120ºC).

Use sterile filtered tips.

Ensure good homogenisation of the kit components once defrosted.

Maintain the A and B mixes stored in ice at all times. Exposing them to temperatures above 4ºC reduces the efficacy

of the PCR.

Repeated cycles of freezing and thawing may reduce the sensitivity of the reagents. Protect them from exposure to

light until use.

To avoid contaminations giving rise to false positives it is important to:

Physically separate the positive PCR control from the remaining reagents of the kit.

To carry out any handling of samples to be tested in a different location/room from the one where the amplified

products are being analyzed.

Add the positive PCR control in a different location/room from the one where the mix is added and where the

samples to be tested are being handled.

SAMPLES COLLECTION AND TRANSPORTATION

The assay could be performed using any biological sample considered of interest by the clinician. Our technique has been

standardised and contrasted with a considerable number of samples. INgene q ParaTB Probes is suitable for detection and

quantification of MAP using different biological samples, preferably samples from faeces and pure cultures.

The following are some recommendations and/or limitations relating to the method of obtaining and sending the samples

to the laboratory:

The samples must be cooled from the moment they are obtained until they are processed. Processing needs to occur within

24 hours after obtaining the samples. In case a longer time is envisaged, we recommend freezing the samples.


(Versión 2601-15) – PAG.12.

DNA EXTRACTION

Any extraction procedure should be used which yields good-quality of the extracted material.

In case you have no extraction procedures optimized, INGENASA could provide extraction protocol and buffer under

request.

Ingenasa has tested the following methods for the DNA extraction:

- Method of Chomczynski and Sacchi (Phenol extraction).

- Automatic magnetic methods (Mag Max TM96 total NA isolation kit, Ref AM1840.)

- Colum purification methods: QIAamp® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN), High pure PCR template Preparation kit

(ROCHE).

There are several commercial houses that provide high quality extraction kits that could be used following the manufacture

instructions. Houses like: Life-technologies, ROCHE, Qiagen, Marchery-Nalgene, others.

CAUTION: If the amplification is not going to be done immediately, preserve the DNA at -20 ° C .

AMPLIFICATION OF THE GENETIC MATERIAL

REQUIRED MATERIALS

- Crushed ice.

- DNA extracted from the samples.

- Mixture A – KEEP IN CRUSHED ICE AT ALL TIMES.

- Mixture B - KEEP IN CRUSHED ICE AT ALL TIMES.

- Or Mixture AB- KEEP IN CRUSHED ICE AT ALL TIMES.

- Positive amplification control A1 (MAP).

- DNAse/RNAse-free water.

PROCEDURE

Considerations prior to PCR preparation

It is recommended that each PCR experiment includes the following controls in addition to the problem samples:

Negative extraction control:

The sample is replaced by an elution buffer or water and is included in the extraction of nucleic acids, in parallel to the rest of

the samples.

Negative PCR control:

Includes all PCR reagents except the DNA, instead of which water is added. Allows verifying that the PCR reagents are not

contaminated.

Positive PCR control or standard curve in the case of quantification:

The dilutions of the standard curve, in addition to allowing the user to quantify MAP in the problem samples, are a positive

PCR control of known concentration, whose result must be positive. This allows checking that the selected PCR parameters

and conditions are adequate and that the reaction has not been subjected to any incident.


(Versión 2601-15) – PAG.13.

Replicates (optional):

To achieve a statistically optimal quantification it is recommended to perform 3 replicates both of the standard curve points

and of the problem samples, thus allowing calculation of the standard deviation with a minimum amount of 3 values.

Preparation of serial dilutions of the Standard Curve for absolute MAP quantification (optional)

To prepare the dilutions required to generate the standard curve it is recommended to use "Maximum Recovery" centrifugal

microtubes (not supplied) and Tris-HCl 10 mM pH 8 as diluent (supplied). The serial dilutions are performed using the

Standard Positive Control following these indications:

1. Pipette 90 μl of Tris-HCl 10 mM pH 8 into 7 tubes labelled 1-7 accordingly.

2. Pipette 10 μl of the Standard Positive Control into the tube labelled 1.

3. Vortex.

4. Change tip and again pipette 10 μl from tube 1 into tube 2.

5. Vortex.

6. Repeat steps 4 and 5 until the serial dilutions have been completed.

7. Use tubes 1, 4 and 6 as standards in the PCR.

Table: Dilutions of the standard curve.

Standard curve Concentration Standard

curve

No. of MAP

copies*

Tube 1 106 copies / µl Point 1 107



*Based on adding 10 µl of sample to the PCR.

Preparation of the PCR

1. Take mixtures A and B out from the cooler keeping them in crushed ice. If the reagents A and B have not be mixed

upon receipt of the kit, make sure that they are correctly homogenised before using. Add the contents of reagent A

to the tube of reagent B and homogenise the mix (call AB). AB mix should be kept on ice at all times!

2. Determine the number of reactions to be performed, including controls and points on the standard curve according

to table

3. Prepare and identify as many tubes for the amplification as samples to be processed, adding an additional tube for

the positive amplification control, and another one for the negative control.

4. Place (n x 15) μl of AB mix in a tube.

Volumen AB Mix

For 1 sample 15µl

For 10 samples 150 µl

For N samples 15*(N)


(Versión 2601-15) – PAG.14.

5. Once the above mix has been homogenised, 15 μl per sample to be analyzed are dispensed into n PCR tubes.

6. 10 μl* of DNA from each problem sample, 10 μl from the controls and 10 μl from each of the serial dilutions of the

Standard curve are added. (*Alternatively, between 2-10 μl of DNA and the rest of Tris-HCl pH 8, 10Mm, can be

added until the final sample volume of 10 μl is reached).

7. Set the thermocycler to the following conditions:

Thermocycler conditions

Temperature (ºC) Time Cycles

Denaturation 95 10 min 1

Amplification 95 15 s

45 60 * 60 s

8. Reading the fluorescence takes place during the elongation step (marked in the table)*, and the channels through

which the fluorescence data are collected are detailed in table :

Reporter Quencher

MAP FAM BHQ-1®

I.C. JOE BHQ-1®

Passive Reference ROX

ANALYSIS AND INTERPRETATION OF RESULTS

Analysis of results

Each problem sample analyzed yields data regarding the fluorescence originated from channel FAM. Automatic

threshold analysis (threshold and baseline) is recommended.

If this option is not viable, the analysis can be carried out manually following the thermocycler instructions.

Possible results are summarised in the table:

FAM channel: pathogen detection

A positive result during amplification implies a typical fluorescence curve with a Ct value <38.

Samples with Ct´s comprised between 38 and 40 should be regarded as doubtful. In that case we recommend:

• Repeating the analysis.

• Sequencing the amplified product.

VIC channel: Internal Control detection (JOE)

A positive result during amplification implies a typical fluorescence curve with a Ct value <45. Normally, values are

comprised within a range of 30 <Ct < 45


(Versión 2601-15) – PAG.15.

Table: Possible results.

Cases Channel

FAM

Channel

VIC Result

A + + Positive

B + - Positive

C - + Negative

D* - - Null/inhibited

*Repeat the analysis diluting DNA 1/40 to avoid inhibitors, before considering the sample as negative.

Table: Results validation

Case Problem

sample

Negative extraction

control

Positive PCR

control

Negative PCR

control

Result of problem

sample

1 + - + - +

2 - - + - -

3 + Nulo

4 - + Nulo

Case 1: both the problem sample and the positive PCR control exhibit a positive result, whereas the negative extraction

and PCR controls yield a negative result.

Positive result: the sample contains MAP.

Case 2: the positive PCR control exhibits a positive result, whereas the problem sample and the negative extraction and

PCR controls yield a negative result.

Negative result: the sample does not contain any MAP.

Case 3: the negative extraction control yields a positive result.

Result invalidated or null. Go back to extraction step.

Case 4: the negative extraction control exhibits a negative result, whereas the negative PCR control yields a positive

result.

Result invalidated or null. Go back to amplification step.

Quantitative analysis (optional)

The number of MAP copies of each problem sample can be quantified through the cycle threshold (Ct) at the start of the

reaction. Thus, using the standard samples containing serial dilutions of known MAP concentrations, a calibration curve

can be plotted which correlates the Cycle thresholds to the logarithm of the initial amount of template, i.e. the number of

MAP copies contained in the sample. Extrapolating the Cycle thresholds obtained for the problem samples on this curve

allows estimating the initial number of MAP copies in them.

Most currently available real-time PCR equipment include software to automatically perform an absolute quantification,

if all parameters are set correctly.


(Versión 2601-15) – PAG.16.

Depending on the thermocycler, after the analysis of the data relating to the fluorescence obtained via the FAM and VIC

channels (detection of pathogen and internal positive control JOE, respectively) and after validation of the results, a

quantitative analysis can be performed, for example, requiring deactivating the channel which reads the fluorescence of

the internal positive control. Please consult corresponding user manual for further details.

The data relating to the standard curve which have to be entered into the quantification programme are presented in

table :

Data related to the standard curve

Standard curve Nr. of MAP copies

Point 1 107

Point 4 104

Point 6 100

The parameters of the standard curve should be within the following ranges:

Parameters of the standard curve

Slope of the linear region (-3,45) – (3,67)

Correlation coefficient (R2) 0.995

Point of the curve Range of Cts+d of the standard

curve points

1 15-17 (+3)

2 18-20 (+3)

3 21-23 (+3)

4 24-27 (+3)

5 28-31 (+3)

6 32-35 (+3)

7 35-38* (+5)

*In a certain number of replicates the result may be inconclusive.

d. Dependind on the thermocycler the Ct value could be different. The Ct value correspond to AB and Roche

thermocycler.


(Versión 2601-15) – PAG.17.

TROUBLESHOOTING

Detection of fluorescence signal on FAM channel in the negative extraction control.

Possible cause Solution

Contamination during extraction

process

Repeat the DNA extraction process and PCR using new reagents.

Ensure that the workplace, equipment and all instruments used to

perform the PCR are decontaminated, i.e. free from nucleic acids.

Detection of fluorescence signal on FAM channel (pathogen) in the negative PCR control.


Contamination during PCR

preparation.

Repeat PCR reaction with new reagents and, if possible, various

replicates of each sample.

If tubes are being used, close each one immediately after adding

the sample.

As a strict rule, the positive control must be added last and in a

separate physical location from where the problem samples are

added.

Ensure that the workplace, equipment and all instruments used for

performing the PCR are decontaminated, i.e. free of nucleic acids.

Absence of fluorescence signal on FAM channel in the positive PCR controls.


Wrong fluorochrome channel

selected

Check that you select the FAM channel for all samples and controls

to be analyzed.

QUALITY CONTROL

Each production batch of this kit, has been checked under our ISO-certified Quality Management System.

TECHNICAL ASSITANCE AND PRODUCT SUPPORT

For further information concerning the assay and its performance, please contact:

INGENASA

C/ Hnos. García Noblejas, 41 – 28037 MADRID

Tel (+34) 91 368 0501

e-mail: [email protected]

ingene q paratb (sondas detección)

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