inmunología y virología immunology and virologyotros estudios que se estÆn realizando consisten...

101

Memoria 1997/98 CBMSO 1997/98 Report

Inmunología y Virología

Immunology and Virology

103


TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES A TRAVÉS DEL RECEPTORPARA EL ANTÍGENO DE CÉLULAS T SIGNAL TRANSDUCTION THROUGH THE T CELL ANTIGENRECEPTOR

Jefe de Línea / Group Leader: Balbino AlarcónBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Aldo Borroto, Ester San JoséBecarios Predoctorales Graduate Students: Diana Gil, Pilar Delgado

Resumen de Investigación

Los linfocitos T desempeñan un papel central en la regulación de la respuesta

inmune. Reconocen y responden a antígenos a través de un receptor expresado en la

membrana plasmática y que está compuesto de al menos 6 subunidades. Las subuni-

dades TCR-α y TCR-β (TCR-γ y TCR-δ en linfocitos γδ) son las encargadas del recono-

cimiento del antígeno asociado al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Sin

embargo, debido a que sus dominios intracitoplásmicos son extremadamente cortos, la

transmisión de señales al interior celular debe descansar en las otras subunidades del

complejo: CD3-γ, CD3-δ, CD3-ε y CD3-ζ. Las tres primeras subunidades tienen cada

una un motivo YxxL/IxxxxxxxxYxxL/I conocido como ITAM y que cuando está fosfo-

rilado en tirosina es capaz de interaccionar con la tirosina quinasa ZAP70. CD3-ζ con-

tiene tres ITAMs. Tenemos evidencia de que existe una especialización funcional den-

tro de las subunidades del complejo CD3 implicadas en la transducción de señales y así,

CD3-ζ parece ser necesaria para la inducción del programa de apoptosis en linfocitos T

maduros mientras que es prescindible para la inducción de la transcripción de los genes

de citoquinas. En este fenómeno juega un papel importante ZAP70 que no es reclutada

a la membrana plasmática cuando CD3-ζ está débilmente asociada al resto del comple-

jo, por lo que pensamos que esta quinasa debe ser importante en la conexión entre el

complejo TCR/CD3 y la activación de la transcripción del ligando de CD95, implicado

104

en la inducción de apoptosis. Nos queda por dilucidar qué posibles rutas de activación

conectan ZAP70 con CD95L que sean defectuosas en nuestros mutantes.

Además del estudio de la especialización funcional del complejo TCR/CD3, esta-

mos estudiando los mecanismos que regulan su ensamblación intracelular así como su

estequiometría. Hemos establecido un modelo de estequiometría mediante el estudio

de líneas celulares T mutantes y de ratones transgénicos para TCR-β. De acuerdo con

esto, el complejo TCR/CD3 no contiene uno sino dos heterodímeros TCRα/β que for-

man hemicomplejos con CD3-ε y CD3-γ por un lado y con CD3-ε y CD3-δ por el otro.

El homodímero de CD3-ζ sería necesario para unir ambas mitades del complejo. La pre-

sencia de dos heterodímeros α/β capaces de ligar sendas moléculas de MHC cargadas

con el péptido antigénico en el mismo complejo cambiaría la avidez de la interacción y

puede tener una importancia fundamental en la comprensión de los mecanismos de

reconocimiento del antígeno y de activación de los linfocitos T.

Otros estudios que se están realizando consisten en la utilización de una quimera

de CD4 que contiene una señal de retención intracelular de CD3-ε para inhibir la madu-

ración de la glicoproteína de la envuelta de HIV y su empleo en terapia génica contra el

SIDA y en el estudio del efecto del antibiótico megalomicina en el transporte y madu-

ración de glicoproteínas virales.

Research Summary

T cells play a central role in the regulation of the immune response. They recog-

nize and respond to antigens via a membrane receptor composed of at least 6 subunits.

The TCR-α and TCR-β subunits (TCR-γ and TCR-δ in γδ T cells) directly interact with

the peptide antigen associated to the major histocompatibility complex (MHC).

However, due to their short cytoplasmic tails, signal transduction to the cytoplasm

must reside in the other components of the complex: CD3-γ, CD3-δ, CD3-ε and CD3-ζ.

The three first chains contain each a YxxL/IxxxxxxYxxL/I motif, known as

Immunoreceptor Tyrosine-Based Activation Motif (ITAM), that once phosphorylated

on tyrosine is able to interact with the ZAP70 tyrosine kinase. CD3-ζ contains 3 ITAMs.

We have evidence of a functional specialization within the subunits of the CD3 complex

105

in signal transduction and, thus, CD3-ζ seems to be necessary for the induction of the

apoptosis program in mature T lymphocytes whereas it is dispensable for the induction

of cytokine gene transcription. ZAP70 plays an important role in this phenomenon

since it does not become recruited to the plasma membrane when CD3-ζ is weakly asso-

ciated to the other subunits of the complex. We thus think that ZAP70 is important in

connecting the TCR/CD3 complex to the transcription of the CD95 ligand (CD95L),

involved in the induction of apoptosis. We are now trying to decipher possible routes

of activation that connect ZAP70 with CD95L that could be defective in our mutants.

In addition to the study of the functional specialization of the TCR/CD3 complex,

we are studying the mechanisms that regulate its intracellular assembly and stoichio-

metry. We have established a model based on the study of mutant T cell lines and TCR-

β transgenic mice. According to these data, the TCR/CD3 complex appears to have not

one but two TCRα/β heterodimers that form hemicomplexes with CD3-ε and CD3-γ on

one side and with CD3-ε and CD3-δ on the other. The CD3-ζ homodimer would be

necessary to link both halves of the complex. The presence of two α/β heterodimers in

the same complex with the capacity of each binding an antigen-loaded MHC would

change the avidity of interaction and could have a fundamental importance for unders-

tanding the mechanisms of antigen recognition and T cell activation.

Other studies that are being performed in our laboratory try to explore the possi-

ble gene therapy use of a CD4 chimera containing the intracellular retention signal of

CD3-ε to inhibit the maturation of the envelope glycoprotein of HIV and its use in AIDS

treatment. Finally, we are also studying the effect of the antibiotic megalomicin in the

transport and maturation of viral glycoproteins.

Publications / Publications

� Dave, V., Cao, Z.S., Browne, C., Alarcón, B., Fernández-Miguel, G., Lafaille, J., de

la Hera, A., Tonegawa, S. and Kappes, D. CD3-δ deficiency arrests development

of the αβ but not of the γδ T cell lineage. EMBO J. 16, 1360-1370 (1997).

� Bonay, P., Fresno, M. and Alarcón, B. Megalomicin disrupts lysosomal functions.

J. Cell Science 110, 1839-1849 (1997).

106

� Borroto, A., Jiménez, M.A., Alarcón, B. and Rico, M. 1H-NMR analysis of CD3-ε

reveals the presence of turn-helix structures around the ITAM motif in an other-

wise random coil cytoplasmic tail. Biopolymers 42, 75-88 (1997).

� Sun, J.Y., Pacheco-Castro, A., Borroto, A., Alarcón, B., Alvarez-Zapata, D. and

Regueiro, J.R. Construction of retroviral vectors carrying human CD3γ cDNA and

reconstitution of CD3γ expression and T cell receptor surface expression and func-

tion in a CD3γ-deficient mutant T cell line. Hum. Gene Ther. 8, 1041-1048 (1997).

� Niedergang, F., San José, E., Rubin, B., Alarcón, B., Dautry-Varsat, A. and

Alcover, A. Differential cytosolic tail dependence and intracellular fate of T cell

receptors internalized upon activation with superantigen or phorbol ester. Res.

Immunol. 148, 231-245 (1997).

� Alonso, M.A., Fan, L., Alarcón, B. Multiple sorting signals determine apical loca-

lization of a nonglycosylated integral membrane protein. J. Biol. Chem. 272, 30748-

30752 (1997).

� San José, E., Muñoz-Fernández, M.A. and Alarcón, B. Megalomicin inhibits HIV-

1 replication and interferes with gp160 processing. Virology 239, 303-314 (1997).

� San José, E., Sahuquillo, A.G., Bragado, R. and Alarcón, B. Assembly of the

TCR/CD3 complex: CD3ε/δ and CD3ε/γ dimers associate indistinctly with both

TCRα and TCRβ chains. Evidence for a double TCR heterodimer model. Eur. J.

Immunol. 28, 12-21 (1998).

� Sahuquillo, A.G., Roumier, A., Teixeiro, E., Bragado, R. and Alarcón, B. TCR

engagement in apoptosis-defective, but IL-2 producing, T cells results in impaired

ZAP70/CD3-ζ association. J. Exp. Med. 187, 1179-1192 (1998).

� Borroto, A., Mallabiabarrena, A., Albar, J.P., Martínez-A., C. and Alarcón, B.

Characterization of the region involved in CD3 pairwise interactions within the T

cell receptor complex. J. Biol. Chem. 273, 12807-12816 (1998).

107

� San José, E., Muñoz-Fernández, M.A. and Alarcón, B. Retroviral vector-mediated

expression in primary human T cells of an endoplasmic reticulum-retained CD4

chimera inhibits HIV-1 replication. Hum. Gene Ther. 9, 1343-1355 (1998).

� Dave, V.P., Keefe, R., Berger, M.A., Drbal, K., Punt, J.A., Wiest, D.L., Alarcón, B.

and Kappes, D.J. Altered functional responsiveness of thymocyte subsets from

CD3δ-deficient mice to TCR/CD3 engagement. Int. Immunol. 10, 1481-1490 (1998).

� Bonay, P., Durán-Chica, I., Fresno, M., Alarcón, B. and Alcina, A. Anti-parasitic

effects of the intra-Golgi transport inhibitor megalomicin. Antimicrob. Agents

Chemother. 42, 2668-2673 (1998).

� Bartholeyns, J., Romet-Lemonne, J.L., Chokri, M., Buyse, M., Velu, T., Bruyns, C.,

Van de Winkel, J.J., Heeney, J., Koopman, G., Malmsten, M., De Groote, D.,

Monsigny, M., Midoux, P. and Alarcón, B. Cellular vaccines. Res. Immunol. 149,

647-649 (1998).

� Alarcón, B. and Fresno, M. Transferrin receptor (CD71). En: Encyclopedia of

Immunology, second edition. Academic Press, London (1998).

108

BASES MOLECULARES DE LA PATOGENICIDAD Y DELPOTENCIAL ANTI-TUMORAL DE LOS PARVOVIRUSMOLECULAR BASES PATHOGENICITY AND ANTI-TUMOURPOTENTIAL OF PARVOVIRUSES

Jefe de Línea / Group Leader: José M. Almendral Personal Científico Scientific Personnel: Mari P. RubioBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Eleuterio Lombardo, Juan C. RamírezBecarios Predoctorales Graduate Students: Susana Guerra, Eva Hernando, Beatriz Maroto Técnico de Investigación Technical Assistance: José González


El análisis de las bases celulares y moleculares que determinan las patologías cau-

sadas por distintas cepas del parvovirus diminuto del ratón (Minute Virus of Mice,

MVM) en su hospedador natural, constituye un modelo para entender la patogénesis y

quizás prevenir infecciones, en humanos, de virus más complejos y peor conocidos. La

cepa MVMi, pero no la MVMp, muestra un tropismo claro por precursores hemato-

poyéticos y linfoides in vitro. Hemos estudiado recientemente la capacidad patogénica

del MVMi en ratones adultos inmunodeficientes que carecen de una respuesta inmune

específica (SCID). Los ratones SCID, inoculados intranasalmente por la ruta natural de

la infección, desarrollan una leucopenia muy severa dependiente de la dosis viral alre-

dedor de 30 días pos-infección, aunque el número de plaquetas circulantes y eritrocitos

se mantuvo inalterado durante la enfermedad. En la médula ósea de cada ratón inocu-

lado letalmente, una supresión profunda de progenitores clonogénicos CFU-GM y

BFU-E se correspondió con el máximo de multiplicación del MVMi. La infección indu-

jo un drástico y duradero desequilibrio de la hematopoyesis medular, caracterizado por

la eliminación de células granulomacrofágicas (GR-1+, Mac-1+), y un aumento absoluto


109

de dos veces de células eritroides (TER-119+). Esta enfermedad inducida por MVMi en

ratones SCID que describimos (J. Virol. 73, 1774-84, 1999), aporta un modelo donde

ensayar inmunoterapia humoral y celular contra parvovirus, así como para evaluar la

capacidad de los parvovirus para evadir estos tratamientos.

En el análisis de funciones relevantes en las infecciones de parvovirus, hemos

buscado los determinantes de transporte nuclear en las proteínas VP1 y VP2 de la cáp-

sida del MVMi, construyendo una serie de delecciones y mutaciones puntuales en un

plásmido infeccioso. La partícula de MVM está construida por sesenta subunidades de

las proteínas VP1 y VP2, que son idénticas en secuencia excepto por los primeros 142

aminoácidos del extremo N-terminal de VP1. Hemos encontrado que cada proteína

estructural lleva una señal de localización nuclear (NLS) con características propias.

VP1 contiene una NLS convencional en su secuencia específica amino-términal. Sin

embargo, la NLS no-convencional 528KGKLTMRAKLR538 se encontró que era necesaria

para el transporte nuclear de VP2. En la estructura de la cápsida icosahédrica de MVM,

esta secuencia forma parte de la lámina β I, y todos sus aminoácidos básicos están posi-

cionados de forma contigua en la cara que en la subunidad no-ensamblada estarían

expuestos al solvente. El análisis mutacional demostró que la configuración así como la

carga básica neta de esta secuencia era esencial para el transporte nuclear de VP2 y para

el ensamblaje de la cápsida. Además, ambas proteínas están involucradas en interac-

ciones citoplasmáticas cooperativas para el transporte nuclear. Estamos actualmente

investigando los dominios que median las interacciones, los cambios conformacionales

que desencadenan el transporte nuclear, así como los mecanismos reguladores celula-

res implicados.

Algunos parvovirus muestran un tropismo selectivo por células humanas trans-

formadas. El uso potencial de los parvovirus como agentes anti-cáncer demanda un

conocimiento profundo de su oncotropismo. Con este objeto, hemos estudiado el signi-

ficado biológico de la fosforilación de la cápsida del parvovirus MVMp en la infección

de células humanas transformadas. VP2, la proteína principal de la cápsida del MVMp,

se encontró fosforilada exclusivamente en residuos de serina y treonina. Mapas trípti-

cos obtenidos por cromatografía bidimensional en capa fina de VP2 mostraron un

patrón reproducible de diez péptidos con fosforilación desigual. El péptido denomina-

110

do B, que contenía veinte veces más marca de 32P que cualquiera de los demás, se mapeó

en el extremo N-terminal de VP2, que es procesado durante la maduración de los virio-

nes. Este péptido está fosforilado en tres residuos de serina consecutivos, y virus muta-

dos en estos residuos mostraron una capacidad disminuida de progresar en células

humanas transformadas. Actualmente, estamos estudiando las kinasas celulares impli-

cadas en la fosforilación del péptido B en células transformadas y no-transformadas

para desvelar este proceso esencial del oncotropismo de parvovirus.

Research Summary

The analysis of molecular and cellular basis that determine the pathologies caused

by different strains of parvovirus Minute Virus of Mice (MVM) in their natural host, pro-

vide a model to understand the pathogenesis and perhaps to prevent human infections

of more complex and poorly known viruses. The MVMi strain, but not MVMp, shows a

marked tropism for hemopoietic and lymphoid precursors in vitro. We have recently stu-

died the pathogenic capacity of MVMi in adult immunodeficient mice lacking a specific

immune response (SCID). The SCID mice inoculated by the natural intranasal route of

infection developed a very severe leukopenia viral dose-dependent by 30days post-infec-

tion, even though the number of circulating platelets and erythrocytes remained unalte-

red throughout the disease. In the bone marrow of every lethally inoculated mouse, a

deep suppression of CFU-GM and BFU-E clonogenic progenitors was corresponded with

the maximal MVMi multiplication. The infection induced a sharp and lasting unbalance

of the marrow hemopoiesis, denoted by a marked depletion of granulomacrophagic cells

(GR-1+, Mac-1+), and a two fold absolute increase in erythroid cells (TER-119+). This

reported MVMi induced disease in SCID mice (J. Virol. 73, 1774-84, 1999) provides a

model where to assay humoral and cellular immunotherapy against parvoviruses, as

well as to study the capacity of the parvoviruses to evade these treatments.

In the analysis of relevant functions of parvovirus infections, we have sought the

determinants of nuclear transport in the VP1 and VP2 capsid proteins of MVMi by

constructing a set of deletions and point mutations in an infectious plasmid. The MVM

particle is built by sixty subunits of the VP1 and VP2 proteins that are identical in

sequence except for the first 142 aminoacids of the VP1 N-terminus. We found that each

111

structural protein carries a nuclear localization signal (NLS) with own features. VP1

contains a conventional NLS in its specific aminoterminal domain. However, the non-

conventional NLS sequence 528KGKLTMRAKLR538 was found necessary for VP2 nucle-

ar uptake. In the structure of the MVM icosahaedral capsid, this sequence forms part of

the β-strand I, and all its basic aminoacids are contiguously positioned at the face that

in the unassembled VP2 subunit would be exposed to the solvent. Mutational analysis

showed that the configuration as well as the net basic charge of this entire sequence was

essential for the VP2 nuclear transport and capsid assembly. Moreover, both proteins

are involved in cooperative cytoplasmic interaction for nuclear cotransport. We are

currently investigating the protein domains mediating these interactions, the confor-

mational changes that trigger nuclear transport, as well as the regulatory cellular

mechanisms involved.

Some parvoviruses display a selective tropism for transformed human cells. The

potential use of parvoviruses as anti-cancer agents demands a comprehensive know-

ledge of this unique oncotropism. To this end, we have studied the biological signifi-

cance of parvovirus MVMp capsid phosphorylation when infecting transformed

human cells. The major capsid protein of MVMp (VP2) was found phosphorylated

exclusively in serine and threonine residues. Tryptic maps obtained by two-dimensio-

nal thin-layer chromatography of VP2 showed a reproducible pattern of ten phospho-

peptides unevenly phosphorylated. The peptide named B, harbouring twenty times

more 32P-label than any of the others, was mapped to the amino terminus of VP2, which

is cleavaged during virion maturation. This peptide is phosphorylated in three conse-

cutive serine residues, and virus mutated on these residues showed an impaired capa-

city to progress in transformed human cells. We are currently studying the cellular

kinases involved in peptide B phosphorylation in transformed and non-transformed

cells to unravel this essential process of parvovirus oncotropism.

Tesis Doctorales/ Doctoral ThesesEleuterio Lombardo de la Camara: �Transporte nuclear de las proteínas de la cápsida

del parvovirus MVMi: caracterización de un nuevo motivo de localización nuclear�.

Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación: Sobresaliente cum laude.

112

Beatriz Maroto López: �Química y biología del dominio principal de fosforilación de la

proteína VP2 del parvovirus MVMp�. Universidad Autónoma de Madrid. 1998.

Calificación: Sobresaliente cum laude.

Organización de Reuniones Científicas/ Organization of ScientificMeetingsJosé M. Almendral: Simposio Internacional sobre Cáncer y Virus. SEV/FESEO.

Hospital Ramón y Cajal. Madrid. 1998.

113

BIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN DE CÉLULAS POR VIRUS ANIMALESBIOLOGY OF ANIMAL VIRUS INFECTION

Jefe de Línea / Group Leader: Luis CarrascoPersonal Científico Scientific Staff: Elena Feduchi, Mª Eugenia González, Rosario

Guinea, José Antonio López Becarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Angel Barco, Maria Boceta, Asier Etxarri, Alicia

Irurzun, Ivan Ventoso Becarios Predoctorales Graduate Students: Carlos Calandria, Beatriz González, Ana Oña, Celia

PeralesTécnicos de Investigación Technical Assistance: Carmen Hermoso, Miguel Angel SanzCientíficos Visitantes Visiting Scientists: Mª José Abad (Universidad Complutense de

Madrid), Valerie Robin (Université de RENNES. Francia).


La replicación de los virus animales produce en las células infectadas toda una

serie de alteraciones tanto morfológicas como metabólicas. Nuestro grupo está interesa-

do en identificar las proteínas virales responsables de estas alteraciones y en el estudio

de su mecanismo de acción a nivel molecular. El sistema modelo utilizado para estos

estudios es la infección de células humanas por el virus de la polio. Además estamos

interesados en el estudio de proteínas citotóxicas de otros virus como son el virus de la

inmunodeficiencia humana (VIH) el virus de la gripe y el virus del bosque Semliki.

Muchos virus animales codifican para proteínas de pequeño tamaño, de carácter

hidrofóbico y que forman oligómeros. Estas proteínas, cuando se expresan individual-

mente en bacterias o en células animales, inducen profundos cambios en la permeabili-


114

dad celular. Por ello, a estas proteínas se las ha denominado de forma genérica �viro-

porinas�. Entre las proteínas virales que alteran la permeabilidad celular están las pro-

teínas 2B, 2BC y 3A del virus de la polio, la 6K de los togavirus, la M2 del virus de la

gripe y la Vpu del VIH-1.

La proteína 2BC del virus de la polio además de aumentar la permeabilidad celu-

lar, también induce la proliferación de vesículas citoplasmáticas y altera el tráfico de gli-

coproteínas tanto en células animales como en levaduras. El uso de distintos mutantes

de la proteína 2BC ha servido para identificar las regiones de la proteína que están

implicadas en estas alteraciones.

Además de cambiar la permeabilidad celular, el virus de la polio inhibe la expre-

sión genética en las células infectadas. La proteasa 2A del virus de la polio es respon-

sable de la hidrólisis de un factor de la iniciación de la traducción, el eIF-4G. Mediante

la introducción de la proteasa purificada 2Apro en células intactas hemos conseguido la

hidrólisis del eIF-4G. Esto ha servido para estudiar el papel que juega el eIF-4G en la

traducción de mRNAs tanto celulares como virales. Nuestros estudios indican que el

eIF-4G se requiere para la traducción de los mRNAs sintetizados de novo en las células,

mientras que la reiniciación de los mRNAs que ya se están traduciendo no sería tan

dependiente del eIF-4G. Además de interaccionar la 2Apro con el eIF-4G, es probable que

esta proteína reconozca otros substratos celulares. Para descubrir estos substratos se ha

utilizado el sistema de los dos híbridos. Nuestros estudios indican que la 2A reconoce

otras proteínas celulares y, en este momento, se están caracterizando.

El hecho de que la expresión de la proteasa 2A resulte tóxica para las levaduras

ha servido de base para desarrollar un sistema genético para obtener una variedad de

mutantes de la 2A. La caracterización de estas proteínas 2A mutantes y su reconstitu-

ción en el virus de la polio han dado mas información sobre el funcionamiento de esta

proteasa y sobre las regiones implicadas en el reconocimiento de sustratos.

Por último, se han clonado y expresado las proteínas accesorias del VIH-1. Esto

ha servido no solo para identificar la capacidad permeabilizante de la proteína Vpu,

sino que también se ha descrito una nueva función para la proteína Nef. La función

exacta del gen nef ha sido objeto de controversia durante los últimos años, nuestros

estudios indican que Nef pertenece a la familia de las proteínas que unen RNA. Estos

resultados son de interés no solo para conocer mejor la función de las proteínas acceso-

rias del VIH-1, sino que también pueden servir de base para el desarrollo de nuevas

estrategias dirigidas a bloquear de forma selectiva la multiplicación de este virus.

Research Summary

The replication of animal viruses in susceptible cells induces a number of mor-

phological and metabolic alterations. Our group is interested in identifying the viral

proteins responsible for these alterations and in analyzing their mode of action at the

molecular level. The model system used for these studies consists of the infection of

human cells by poliovirus. In addition we are interested in the study of cytotoxic pro-

teins from other viruses including human immunodeficiency virus (HSV), influenza

virus and Semliki Forest virus.

Many animal viruses encode proteins of low molecular weight, which are

hydrophobic and form oligomers. When these proteins are individually expressed in

bacteria or in animal cells, they induce profound modifications in cellular permeability.

These proteins therefore, proteins have been collectively termed as �viroporins�.

Amongst the viral proteins that enhance membrane permeability are poliovirus 2B, 2BC

and 3A, the togavirus 6K polypeptide, influenza M2 and Vpu from HIV-1.

Protein 2BC from poliovirus not only alters membrane permeability, but also

induces the proliferation of cytoplasmic vesicles and blocks glycoprotein trafficking

both in yeast and mammalian cells. The use of a number of 2BC variants has helped to

identify the regions of 2BC involved in these modifications.

In addition to increasing membrane permeability, poliovirus infection also blocks

gene expression in the infected cells. Poliovirus protease 2A is responsible for the

hydrolysis of the translation initiation factor eIF-4G. The internalization of purified

poliovirus 2Apro in intact HeLa cells leads to efficient hydrolysis of eIF-4G. This system

has been used to analyze the role this factor plays in the translation of both cellular and

viral mRNAs. Our findings indicate that eIF-4G is required for the translation of

mRNAs synthesized de novo, while the re-initiation of cellular mRNA already engaged

115

116

in translation does not depend on the integrity of eIF-4G. In addition to eIF-4G, 2Apro

may recognize other cellular substrates. To uncover these substrates the two-hybrid

system has been used. Our findings indicate that poliovirus 2Apro may interact with

several cellular proteins.

The fact that poliovirus 2Apro is toxic for yeast cells, has permitted the develop-

ment of a genetic system for obtaining a variety of 2Apro variants. The characteristics of

these 2Apro mutants and the reconstitution of polioviruses mutated in this gene is pro-

viding additional information on the function of this protease in the poliovirus infec-

tious cycle.

Finally, the HIV-1 accessory proteins have been cloned and expressed permitting

us to identify the membrane permeabilizing capacity of Vpu. Our studies have also

shown that the Nef belongs to the family of RNA-binding proteins suggesting a new

role for Nef in the replicative cycle of HIV. These results are of interest not only becau-

se they give a better understanding of HIV accessory proteins, but also in allowing the

development of new strategies for selectively blocking the replication of HIV.

Publicaciones / Publications

� Irurzun, A., Nieva, J.L. and Carrasco, L. Entry of Semliki Forest virus into cells:

effects of concanamycin A and nigericin on viral membrane fusion and infection.

Virology 227, 488-492 (1997).

� Novoa, I., Benavente, J., Cotten, M. and Carrasco, L. Permeabilization of mam-

malian cells to proteins: Poliovirus 2Apro as a probe to analyze entry of proteins

into cells. Exp. Cell Res. 232, 186-190 (1997).

� Echarri, A., González, M.E. and Carrasco, L. The N-terminal Arg-rich region of

human immunodeficiency virus types 1 and 2 and simian immunodeficiency

virus Nef is involved in RNA binding. Eur. J. Biochem. 246, 38-44 (1997).

� Sandoval, I.V. and Carrasco, L. Poliovirus infection and expression of the polio-

virus protein 2B provoke the disassembly og the Golgi complex, the organelle tar-

get for the antipoliovirus drug Ro-090179. J. Virol. 71, 4679-4693 (1997).

� Aldabe, R., Irurzun, A. and Carrasco, L. Poliovirus protein 2BC increases cytoso-

lic free calcium concentrations. J. Virol. 71, 6214-6217 (1997).

� Novoa, I., Martínez-Abarca, F., Fortes, P., Ortín, J. and Carrasco, L. Cleavage of

p220 by purified poliovirus 2Apro in cell-free systems. Effects on translation of

capped and uncapped mRNAs. Biochemistry 36, 7802-7809 (1997).

� Barco, A., Ventroso, I. and Carrasco, L. The yeast Saccharomyces cerevisiae as a

genetic system for obtaining variants of poliovirus protease 2A. J. Biol. Chem. 272,

12683-12691 (1997).

� Abad, M.J., Bermejo, P., Villar, A., Sánchez Palomino, S. and Carrasco, L. Antiviral

activity of medicinal plant extracts. Phytotherapy Res. 11, 198-202 (1997).

� López-Guerrero, J.A. and Carrasco, L. Effect of nitric oxide on poliovirus infection

of two human cell lines. J. Virol. 72, 2538-2540 (1998).

� Barco, A. and Carrasco, L. Identification of regions of poliovirus 2BC protein that

are involved in cytotoxicity. J. Virol. 72, 3560-3570 (1998).

� Lama, J., Sanz, M.A. and Carrasco, L. Genetic analysis of poliovirus protein 3A:

characterization of a non-cytopathic mutant virus defective in killing Vero cells. J.

Gen. Virol. 79, 1911-1921 (1998).

� Ventoso, I., MacMillan, S.E., Jershy, J.W.B. and Carrasco, L. Poliovirus 2A proteina-

se cleaves directly the eIF-4G subunit of eIF-4F complex. FEBS Lett. 435, 79-83 (1998).

� González, M.E. and Carrasco, L. The human immunodeficiency virus type 1 Vpu

protein enhances membrane permeability. Biochemistry 37, 13710-13719 (1998).

� Ventoso, I., Barco, A. and Carrasco, L. Mutational analysis of poliovirus 2Apro. J.

Biol. Chem. 273, 27960-27967 (1998).

� Barco, A. and Carrasco, L. Co-expression of human eIF-4G and poliovirus 2Apro in

Saccharomyces cerevisiae: effects on gene expression. J. Gen. Virol. 79, 2651-2660 (1998).

117

118

Tesis Doctorales / Doctoral Theses

Asier Echarri: �Caracterización funcional de la proteína NEF del virus de la inmuno-

deficiencia humana (VIH)�. Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación:

Apto cum laude.

Maria Boceta: �Cambios de permeabilidad inducidos por las glicoproteínas del VIH-1�.

Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación: Apto cum laude.

Ivan Ventoso: �Análisis genético y bioquímico de la proteasa 2Apro de poliovirus�.


Miguel Angel Sanz: �Caracterización funcional de la proteína 6K de alfavirus. El virus

Sindbis como vector de expresión�. Universidad Autónoma de Madrid. 1998.


Organización de Reuniones Científicas / Organization of ScientificMeetings

M. Barbacid, E. Ródenas y L. Carrasco. IV Encuentros en Segovia. 1997. El virus del

SIDA.

Colaboraciones con la Industria / Collaborations with Industry

� Contrato de investigación con Bristol Myers-Squibb. 1997

119

VARIABILIDAD GENÉTICA DEL VIRUS RNA GENETIC VARIABILITY OF RNA VIRUSES

Jefe de Línea / Group Leader: Esteban DomingoPersonal Científico Scientific Personnel: Cristina Escarmís, Luis Menéndez-AriasBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Eric Baranowski, Antonio Mas, Noemí SevillaBecarios Predoctorales Graduate Students: Juan Francisco García-Arriaza, Mónica Gutierrez-

Rivas, Nonia Pariente, Carmen M. Ruiz-Jarabo, Saleta Sierra, Miguel Toja

Técnicos de Investigación Technical Assistance: Mercedes Dávila, Gema Gómez-MarianoCientíficos Visitantes Visiting Scientists: Wendy Fernández-Ochoa, Nuria Verdaguer (CID,

CSIC, Barcelona), Eva Borrás, María Luz Valero (Univ. Barcelona)


Nuestro grupo de trabajo está interesado en las bases moleculares e implicaciones

biológicas de la elevada variabilidad genética de virus RNA. Con el virus de la fiebre

aftosa (VFA) se han estudiado los siguientes problemas: i) Variaciones antigénicas y de

tropismo celular del virus sometido a distintas pautas de evolución (pases seriados

masivos, diferencias de multiplicidad de infección, etc.). ii) Mecanismo de neutraliza-

ción de la infectividad, abordado por métodos bioquímicos y estructurales. iii) Bases

moleculares de la ganancia de eficacia biológica de virus RNA. En particular hemos

completado un estudio sobre la rápida superación por el VFA de la resistencia impues-

ta por células que coevolucionaron con el virus durante una infección persistente. Este

proyecto se ha realizado en colaboración con el grupo de la Dra. Maria Teresa Franze

(CEVAN, Buenos Aires, Argentina). iv) Estructura tridimensional de complejos virus-

anticuerpo, combinando técnicas de difracción de rayos X y crio-microscopía electróni-

ca. Este proyecto se ha realizado en colaboración con los grupos de los Dres. I. Fita y N.


Verdaguer (CID, Barcelona) y Dres. E. Giralt y D. Andreu (Univ. Barcelona). v) Un

experimento masivo de vacunación de bóvidos con péptidos sintéticos que incorpora-

ron epítopos B y T del VFA. Se han identificado varias mutaciones de escape del virus

asociados a la falta de protección. Este proyecto se ha realizado en colaboración con los

grupos del Dr. E.L. Palma (INTA, Buenos Aires, Argentina) y Dr. F. Sobrino (CISA-

INIA, Valdeolmos, Madrid).

Una de las razones de la elevada variabilidad genética de los virus RNA es la limi-

tada fidelidad de copia de las replicasas víricas. El estudio de las bases moleculares de

la fidelidad de polimerasas se está abordando con la retrotranscriptasa (RT) del virus

de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1). Mediante mutagénesis dirigida se han

obtenido RTs con cambios de aminoácido que afectan a residuos próximos al centro

catalítico de la enzima. Asimismo, se han obtenido variantes con deleciones en el extre-

mo C-terminal de p66 que presentan menor afinidad por el molde-iniciador.

Actualmente también estamos analizando la estabilidad de varios virus que incorporan

las mutaciones de la RT durante su replicación en cultivos celulares. Estas investigacio-

nes sobre viabilidad de mutantes de VIH-1 se están realizando en colaboración con los

grupos de los Dres. C. López-Galíndez (Ito. de Salud Carlos III, Majadahonda) y M.A.

Martínez (Fundación IRSI-Caixa, Badalona).

El grupo colabora también en la caracterización molecular de aislados de VIH-1,

a fin de identificar mutaciones de resistencia a inhibidores, seleccionadas en la protea-

sa y RT en virus de pacientes sometidos a terapia agresiva. Los objetivos de estas cola-

boraciones son entender mejor la dinámica de las cuasiespecies de VIH-1 in vivo y tra-

tar de aconsejar posibles cambios de terapia, a la vista del repertorio de mutaciones de

resistencia en los virus de cada paciente. Estos estudios se realizan en colaboración con

los grupos de los Dres. V. Soriano (Hospital Carlos III, Madrid) y M. Leal (Hospital

Virgen del Rocío, Sevilla).

El grupo mantiene también colaboraciones con los Dres. J.J. Holland, Profesor

Emérito de la Universidad de California en San Diego; Dra. Olga Lavrik, Institute of

Bioorganic Chemistry, Novosibirsk, Rusia; Dr. Alain Favre, Institut Jacques Monod

(CNRS, Universidad de Paris); y Dr. K. McCullough, Institut für Viruskrankheiten und

Immunprophylaxe, Suiza.

120

Finalmente durante 1997 y 1998 varios componentes del grupo fueron coautores

de artículos de revisión sobre cuasiespecies víricas y enfermedades emergentes, todos

ellos por invitación.

Research Summary

Our group has been interested in the molecular basis and biological implications

of the high genetic variability of RNA viruses. We have employed foot-and-mouth dise-

ase virus (FMDV) to approach the following questions: i) Alterations of antigenicity and

cell tropism of virus subjected to different evolutionary regimens massive population

(passages, differences in multiplicity of infection, etc.). ii) Mechanism of neutralization

of infectivity, studied by structural and biochemical methods. iii) Molecular basis of fit-

ness gain of RNA viruses. Specifically, we have completed an analysis of the genetic

changes associated to infection by FMDV of highly resistant cells. These cells had beco-

me resistant, specifically to FMDV, as a result of coevolution with the virus in the cour-

se of a persistent infection in cell culture. This project has been carried out in collabora-

tion with the group od Dr. Maria Teresa Franze (CEVAN, Buenos Aires, Argentina). iv)

Three-dimensional structure of antigen-antibody complexes, by combining X ray dif-

fraction techniques and cryo-electron microscopy. This project has been carried out in

collaboration with the groups of Drs. I. Fita, N. Verdaguer (CID, Barcelona) and Drs. E.

Giralt, D. Andreu (Univ. Barcelona). v) A massive experiment of cattle vaccination

using synthetic peptides which included B- and T-cell epitopes of FMDV. We have

identified escape-mutations associated with lack of protection. This project has been

carried out in collaboration with the groups of Dr. E.L. Palma (INTA, Buenos Aires,

Argentina), and Dr. F. Sobrino (CISA-INIA, Valdeolmos, Madrid).

One of the reasons for the large genetic variability of RNA viruses is the limited

copying fidelity of viral replicases. The study of the molecular basis of polymerase fide-

lity is being pursued employing reverse transcriptase (RT) of human immunodeficiency

virus type 1 (HIV-1). Using site-directed mutagenesis we have obtained RTs with amino

acid substitutions at residues located in the vicinity of the catalytic site of the enzyme.

Also, variant RTs with deletions at the C-terminal end of p66 have been synthesized.

These altered enzymes show a decreased affinity for the template-primer. The copying

121

122

fidelity of all these RTs has been analyzed. Currently we are also studying the stability,

upon propagation in cell culture, of several engineered HIV-1s which have incorpora-

ted the mutations in their RTs. Research on viability of RT mutants is carried out in

collaboration with the groups of Drs. C. López-Galindez (Ito. Salud Carlos III,

Majadahonda) and M.A. Martínez (Fundación IRSI-Caixa, Badalona).

Our group contributes also to the molecular characterization of natural isolates of

HIV-1, with the aim of identifying inhibitor-resistant replacements, selected in the pro-

tease and RT of viruses from patients subjected to highly active antiretroviral therapy.

The objectives of these collaborations are a better understanding of the HIV-1 quasis-

pecies dynamics in vivo, and to try to advise on possible changes of therapy, in view of

the repertoire of resistant mutations found in the virus of individual patients. These stu-

dies are carried out in collaboration with the groups of Drs. V. Soriano (Hospital Carlos

III, Madrid) and M. Leal (Hospital Virgen del Rocio, Sevilla).

Our group maintains collaborations also with Drs. J.J. Holland, Emeritus

Professor, Univ. of California, San Diego; Dr. Olga Lavrik, Institut of Bioorganic

Chemistry, Novosibirsk, Rusia; Dr. Alain Favre, Institut Jaques Monod (CNRS-Univ. de

Paris); and Dr. K. McCullough, Institut für Viruskrankheiten und Immunoprophylaxe,

Switzerland. Finally, during 1997 and 1998, members of our team have coauthored a

number of review articles on viral quasispecies and emerging infections, which were

requested to us.


� Holguín, A., Hernández, J., Martínez, M.A., Mateu, M.G. and Domingo, E. Differentialrestrictions on antigenic variation among antigenic sites of foot-and-mouth diseasevirus in the absence of antibody selection. J. Gen. Virol. 78, 601-609 (1997).

� Taboga, O., Tami, C., Carrillo, E., Núñez, J.I., Rodríguez, A., Saiz, J.C., Blanco, E.,Valero, M.-L., Roig, X., Camarero, J.A., Andreu, D., Mateu, M.G., Giralt, E.,Domingo, E., Sobrino, F. and Palma, E.L. A large scale evaluation of peptide vac-cines against foot-and-mouth disease: lack of solid protection in cattle and isola-tion of escape mutants. J. Virol. 71, 2606-2614 (1997).

123

� Domingo, E. and Holland, J.J. RNA virus mutations and fitness for survival.

Annu. Rev. Microbiol. 51, 151-178 (1997).

� Martín-Hernández, A.M., Gutierrez-Rivas, M., Domingo, E. and Menéndez-Arias,

L. Mispair extension fidelity of human immunodeficiency virus type 1 reverse

transcriptase with amino acid substitutions affecting Tyr-115. Nucleic Acids Res.

25, 1383-1389 (1997).

� Lee, C.H., Gilbertson, D.L., Novella, I.S., Huerta, R., Domingo, E. and Holland, J.J.

Negative effects of chemical mutagenesis on the adaptive behavior of vesicular

stomatitis virus. J. Virol.71, 3636-3640 (1997).

� Medrano Soria, L., Menéndez-Arias, L. and Nájera Morrondo, R. Proteasa del

VIH e inhibidores de interés terapéutico. Publicación Oficial de la Sociedad Española

Interdisciplinaria del S.I.D.A. 8, 662-669 (1997).

� Hewat, E.A., Verdaguer, N., Fita, I., Blakemore, W., Brookes, S., King, A.,

Newman, J., Domingo, E., Mateu, M.G. and Stuart, D. Structure of the complex of

an Fab fragment of a neutralizing antibody with foot-and-mouth disease virus:

Positioning of a highly mobile antigenic loop. EMBO J. 16, 1492-1500 (1997).

� Domingo, E., Menéndez-Arias, L., Quiñones-Mateu, M.E., Holguín, A., Gutierrez-

Rivas, M., Martínez, M.A., Quer, J., Novella, I.S. and Holland, J.J. Viral quasispe-

cies and the problem of vaccine-escape and drug-resistant mutants. Progress in

Drug Research 48, 99-128 (1997).

� Domingo, E., Escarmís, C., Sevilla, N. and Martínez, M.A. Population dynamics

and molecular evolution of RNA viruses. In: Factors in the emergence of arbovi-

rus disease, J.F. Saluzzo and B. Dodet, eds. Elsevier, Paris, pp. 273-278 (1997).

� Domingo, E., Menéndez-Arias, L. and Holland, J.J. RNA virus fitness. Reviews in

Medical Virology 7, 87-96 (1997).

� Domingo, E. RNA virus evolution, population dynamics, and nutritional status.

Biological Trace Element Research 56, 23-30 (1997).

� Domingo, E. Rapid evolution of viral RNA genomes. J. Nutrition 127, 958S-961S

(1997).

� Haack, T., Camarero, J.A., Roig, X., Mateu, M.G., Domingo, E., Andreu, D. and

Giralt, E. A cyclic disulfide peptide reproduces in solution the main structural fea-

tures of a native antigenic site of foot-and-mouth disease virus. Int. J. Biol.

Macromol. 20, 209-219 (1997).

� Martínez, M.A., Verdaguer, N., Mateu, M.G. and Domingo, E. Evolution subver-

ting essentiality: Dispensability of the cell attachment Arg-Gly-Asp motif in mul-

tiply passaged foot-and-mouth disease virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 6798-

6802 (1997).

� Mateu, M.G. and Domingo, E. Péptidos sintéticos en estudios de la interacción

antígeno-anticuerpo. In: Peptidos, en Biología y Medicina, D. Andreu y L. Rivas,

eds. Colección Nuevas Tendencias, C.S.I.C. Madrid, pp. 409-431 (1997).

� Domingo, E. Virus en evolución. ¿Se pueden prevenir nuevas enfermedades víri-

cas? El Médico 635, 54-62 (1997).

� Verdaguer, N., Fita, I., Domingo, E. and Mateu, M.G. Efficient neutralization of

foot-and-mouth disease virus by monovalent antibody binding. J. Virol. 71, 9813-

9816 (1997).

� Quiñones-Mateu, M.E., Soriano, V., Domingo, E. and Menéndez-Arias, L.

Characterization of the reverse transcriptase of a human immunodeficiency virus

type 1 group O isolate. Virology 236, 364-373 (1997).

� Domingo, E., Mas, A. and Quiñones-Mateu, M.E. Variabilidad genética del VIH-

1. In �Manual del SIDA�, V. Soriano and J. González-Lahoz, eds. IDEPSA,

Madrid, pp.41-50 (1997).

� Mateu, M.G., Escarmís, C. and Domingo, E. Mutational analysis of discontinuous

epitopes of foot-and-mouth disease virus using an unprocessed capsid protomer

precursor. Virus Res. 53, 27-37 (1998).

124

125

� Verdaguer, N., Sevilla, N., Valero, M.L., Stuart, D., Brocchi, E.. Andreu, D., Giralt,

E., Domingo, E., Mateu, M.G. and Fita, I. A similar pattern of interaction for dif-

ferent antibodies with a major antigenic site of foot-and-mouth disease virus:

Implications for intratypic antigenic variation. J. Virol. 72, 739-748 (1998).

� Tözsér, J., Menéndez-Arias, L. and Oroszlan, S. Equine infectious anemia virus

retropepsin. In: Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J. Barrett, N.D. Rawlings

and J.F. Woessner, Jr. eds., pp. 932-935. Academic Press, London (1998).

� Menéndez-Arias, L., Tözsér, J. and Oroszlan, S. Mouse mammary tumor virus


and J.F. Woessner, Jr., eds., pp. 944-946. Academic Press, London (1998).

� Menéndez-Arias, L., Tözsér, J. and Oroszlan, S. Moloney murine leukemia virus


and J.F. Woessner, Jr., eds., pp. 946-949. Academic Press, London (1998).

� Menéndez-Arias, L. Studies on the effects of truncating α-helix E� of p66 human

immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase on template-primer binding

and fidelity of DNA synthesis. Biochemistry 37, 16636-16644 (1998).

� Menéndez-Arias, L., Mas, A. and Domingo, E. Cytotoxic T lymphocyte responses

to HIV-1 reverse transcriptase. Viral. Immunol. 11, 167-181 (1998).

� Domingo, E. and Escarmís, C. De Fagos al SIDA. In: Fago φ29 y los orígenes de la

Biología Molecular en España. Libro-homenaje a Eladio Viñuela. J. Avila, M.

Perucho and C. López-Otín, eds., pp. 256-261. Toral Impresores, Madrid (1998).

� Elena, S.F., Dávila, M., Novella, I.S., Holland, J.J., Domingo, E. and Moya, S.

Evolutionary dynamics of fitness recovery from the debilitating effects of Muller�s

ratchet. Evolution 52, 309-314 (1998).

� Domingo, E. Enfermedades infecciosas emergentes y reemergentes en la alborada

de un nuevo milenio. Indufarma 28, 26-29 (1998).

126

� Holland, J.J. and Domingo, E. Origin and evolution of viruses. Virus Genes 16, 13-

21 (1998).

� Menéndez-Arias, L. and Domingo, E. Resistance tables for antiretroviral drugs.

AIDS Cyber Journal (http://www.prous.com/ttmsida) 1, 95-127 (1998).

� Baranowski, E., Sevilla, N., Verdaguer, N., Ruiz-Jarabo, C.M., Beck, E. and

Domingo, E. Multiple virulence determinants of foot-and-mouth disease virus in

cell culture. J. Virol. 72, 6362-6372 (1998).

� Domingo, E., Escarmís, C., Sevilla, N. and Baranowski, E. Population dynamics in

the evolution of RNA viruses. Adv. Exp. Med. Biol. 440, 721-727 (1998).

� Domingo, E. Quasispecies and the implications for viral persistence and escape.

Clinical and Diagnostic Virology 10, 97-101 (1998).

� Domingo, E. RNA virus quasispecies and their significance for viral pathogene-

sis. Bioforum International 2, 14-16 (1998).

� Domingo, E. Population dynamics and fitness of RNA viruses. In: Is it possible to

eradicate HIV?. B. Clotet and Ch. A. Boucher, eds. Merck Sharp and Dohme de

España, S.A. and Fundació irsiCaixa, pp. 61-62 (1998).

� Domingo, E. Biological implications of the quasispecies populations of RNA viru-

ses. VIII International Symposium on viral hepatitis. Hepatología Clínica 6, suppl.

1, 59-64 (1998).

� Fares, M.A., Barrio, E., Becerra, N., Escarmís, C., Domingo, E. and Moya, A. The

foot-and-mouth disease RNA virus as a model in experimental phylogenetics.

Internatl. Microbiol. 1, 311-318 (1998).

� Quiñones-Mateu, M.E., Mas, A., Lain de Lera, T., Soriano, V., Alcamí, J.,

Lederman, M.M. and Domingo, E. LTR and tat variability of HIV-1 isolates from

patients with divergent rates of disease progression. Virus. Res. 57, 11-20 (1998).

127

� Domingo, E., Baranowski, E., Ruiz-Jarabo, C.M., Martín-Hernández, A.M., Sáiz,

J.C., and Escarmís, C. Quasispecies structure and persistence of RNA viruses.

Emerging Infectious Diseases 4, 521-527 (1998).

� Schuster, P., Hogeweg, P., von Gabain, A. and Domingo, E. Molecular Evolution

and Biotechnology. Trends, vol. 5. Science Research, Development. Published by

the European Commission, Directorate General XII, Belgium (1998).

� Escarmís, C., Carrillo, E.C., Ferrer, M., García, Arriaza, J.F., López, N., Tami, C.,

Verdaguer, N., Domingo, E. and Franze-Fernández, M.T. Rapid selection in modi-

fied BHK-21 cells of a foot-and-mouth disease virus variant showing alterations

in cell tropism. J. Virol. 72, 10171-10179 (1998).

� Sevilla, N., Ruiz-Jarabo, C.M., Gómez-Mariano, G., Baranowski, E. and Domingo,

E. An RNA virus can adapt to the multiplicity of infection. J. Gen. Virol. 79, 2971-

2980 (1998).


Noemí Sevilla Hidalgo: �Variaciones genéticas y fenotípicas de un virus persistente en

infecciones citolíticas: Implicaciones evolutivas y antigénicas�. (Tesis dirigida por el Dr.

E. Domingo). Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación: Apto cum laude por

unanimidad y Premio Extraordinario.

Miguel Toja Aguirre: �Caracterización molecular de un virus de la fiebre aftosa y de

sus derivados persistentes. Construcción de un clon infeccioso� (Tesis codirigida por

los Dres. E. Domingo y C. Escarmís). Universidad Autónoma de Madrid. 1997.

Calificación: Apto cum laude por unanimidad.

128

Premios y Distinciones / Prizes and Distinctions

Esteban Domingo:

� Editor del Journal of General Virology (1998-2002) / Editor of Journal of General

Virology (1998-2002).

� Miembro de la Academia Europaea / Member of Academia Europaea.

� Miembro Honorario de la Sociedad Europea de Virología Veterinaria / Honorary

Member of the European Society of Veterinary Virology.

� Miembro del comité editorial de Archives in Virology, Virologie (Francia) y AIDS

Cyber Journal / Member of the editorial board of Archives in Virology, Virologie

(France) and AIDS Cyber Journal.

Luis Menéndez-Arias:

� Miembro del comité editorial del AIDS Cyber Journal / Member of the editorial

board of AIDS Cyber Journal.

129

ACTIVACIÓN DEL SISTEMA INMUNE ACTIVATION OF THE IMMUNE SYSTEM

Jefe de Línea / Group Leader: Manuel FresnoPersonal Científico Scientific Personnel: Pedro BonayBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Iñigo Angulo, Cedric Burg, Nuria Gironès, Oscar

Goñi, Miguel Angel IñiguezBecarios Predoctorales Graduate Students: Pilar Alcaide, Angel Garcia, Ester González San

Martín, Carmen Punzón, Clara I. Rodriguez, Belén San Antonio, Virginia Vila

Técnico de Investigación Technical Assistance: Mª de los Angeles de Chorro y de Villa-CeballosCientífico Visitante Visiting Scientist: Felipe Kierzembaum (Michigan University. USA)


Las citoquinas juegan un papel muy importante en la respuesta inmune. Hemos

estudiado la regulación de la activación de linfocitos T y macrófagos por citoquinas y

caracterizado su mecanismo molecular y celular de acción. Además hemos aplicado

estos estudios a 2 patologías infecciosas: a) la relación entre la infección por HIV-1 y la

activación T; b) la infección por Trypanosoma cruzi, parásito intracelular de macrófagos

que afecta a su capacidad de producir citoquinas y activarse.

La activación de los linfocitos T por TcR/CD3 depende de la secreción autocrina

de TNF, que controla la segunda fase de la activación del factor de transcripción NF-

κB.. Esta segunda fase depende principalmente de c-rel y no de otros miembros de la

familia NF-κB. TNF controla la síntesis y activación/translación nuclear de c-rel proba-

blemente a través de su fosforilación. También hemos aislado, clonado y caracterizado,

un nuevo factor de transcripción de la familia �basic-Helix-Loop-Helix� (bHLH), deno-

minado Cha 912, que se expresa de modo constitutivo en linfocitos T en reposo y su


expresión desaparece tras la activación por TcR.CD3. Hemos determinado exactamen-

te la secuencia �E-box� en el DNA a la que se une y comprobado que heterodimeriza

con otros miembros de la familia como son USF-1 y USF-2 regulando negativamente la

activación T. La cicoloxigenasa 2 (cox-2) se había descrito como una enzima inducible

por estímulos proinflamatorios en macrófagos. Hemos demostrado por vez primera

que cox-2 es un gen inmediatamente temprano de activación de linfocitos T, cuya

expresión viene regulada por los factores de transcripción NFAT y AP-1.

Sorprendentemente cox-2 controla múltiples pasos de activación T ya que metabolitos

de la cox-2 se requieren para la completa activación de NF-κB en linfocitos T.

La patogénesis del SIDA esta relacionada con la activación de linfocitos T. La acti-

vación por TcR/CD3 de linfocitos T infectados por HIV-1 induce la transcripción de

HIV. Mediante el uso de inhibidores específicos hemos demostrado que tanto NF-κB

como NF-AT controlan la replicación de HIV. La producción autocrina de TNF contro-

la la replicación de HIV en linfocitos T debido a su efecto sobre los niveles de c-rel NF-

κB. La activación T solo requiere la mínima activación de p65/p50 NF-κB mientras que

la replicación de HIV-1 requiere de la activación de c-rel. Ese requerimiento diferencial

de NF-κB por linfocitos y HIV-1 así como por NFAT puede permitir diseñar nuevas

estrategias terapéuticas contra el SIDA. Por otra parte la proteína tat de HIV ejerce un

efecto inmunosupresor en la activación T debido a regular negativamente la transcrip-

ción de citoquinas como IL�2. Tat disminuye la activación de NF-κB, aunque aumen-

ta la actividad de NFAT. También hemos estudiado el efecto de las citoquinas produci-

das por células Th1 (IFN-γ y TNF) vs Th2 (IL-4, IL-10) en la activación de macrófagos,

IFN-γ y TNF inducen de modo sinérgico la oxido nitrico sintasa (iNOS), mientras que

IL-4 e IL-10 desactivan macrófagos actuando de modo diferencial sobre la iNOS

La enfermedad de Chagas, causada por Trypanosoma cruzi, afecta a 24 millones de

personas en America Central y del Sur. Nuestro objetivo primordial es estudiar las com-

plejas relaciones hospedador-parásito especialmente la relación entre la infección por T.

cruzi y la activación inmune con el objeto de entender la patología de esta enfermedad.

Hemos caracterizado una mucina deT. cruzi , (AgC10) es que se une a L-selectina en la

membrana de los macrófagos y afecta la capacidad microbicida y la activación de los

mismos. Además, ejerce efectos inmunosupresores en células T. También hemos

demostrado que Cha 912 es un autoantígeno dominante en la infección por T. cruzi.

130

Research Summary

Cytokines play a very important role in controlling the immune response. We

have studied the regulation by cytokines of the T and macrophage cell activation and

characterized their molecular and cellular mechanisms of action. Besides, we have

applied those studies to 2 infectious models: a) the relationship between HIV-1 infec-

tion and T lymphocyte activation, b) Infection by Trypanosoma cruzi, an intracellular

parasite of macrophages, able to alter activation and cytokine secretion by those cells.

T cell activation by TcR/CD3 depends on the autocrine secretion of TNF that pro-

motes the second phase of activation of transcription factor NF-kB. This second phase

mainly depends on the family members, c-rel/p50. TNF controls the synthesis of c-rel

and its activation/translocation most likely by phosphorylation. On the other hand, we

have isolated, cloned and characterized a new transcription factor form the �basic-

Helix-Loop-Helix� (bHLH) family named as Cha 912. This factor is constitutively

expressed in resting T cells and its synthesis is repressed after TcR/CD3 activation. We

have determined its exact �E-box� binding site in the DNA and shown that heterodi-

merizes with others bHLH members, as USF-1 y USF-2, negatively controlling T cell

activation. Cycloxigenase 2 (cox-2) has been previously described as an enzyme indu-

ced in macrophages by proinflammatory stimuli We have shown that cox-2 is an imme-

diate early gene in T cell activation. NFAT and AP-1 transcription factors regulate its

expression. Surprisingly, cox-2 controls many aspects of T cell activation, since their

metabolites are required for complete NF-κB activation in T cells.

AIDS pathogenesis in intimately related with T cell activation. TcR/CD3 activa-

tion in HIV-1-infected T cells leads to HIV transcription. By using specific inhibitors, we

have demonstrated the involvement of NF-κB and NFAT in controlling HIV replication

in T cells. Autocrine TNF control HIV replication in T cell due to its effect on c-rel NF-

κB. T cell activation only requires a minimal translocation of p65/p50 NF-κB, whereas

HIV-1 replication requires of c-rel function. This differential requirement of NF-κB acti-

vation as well as NFAT may allow to design new therapeutic strategies against AIDS.

On the other hand, HIV-1 tat downregulates T cell activation by suppressing cytokine

secretion, mainly IL-2. Tat inhibits NF-κB but enhance NF-AT activation. In addition we

have studied the effects of Th1 cytokines (IFN-γ y TNF) vs Th2 (IL-4, IL-10) on macrop-

131

132

hage activation. IFN-γ y TNF synergistically induce nitric oxide synthase (iNOS). whe-

reas IL-4 e IL-10 deactivate macrophages differentially acting on iNOS.

Chagas� disease caused by Trypanosoma cruzi, afects to 24 million people in

Central and South America. Our main goal is to study the complex host-parasite rela-

tionship especially the relationship between T. cruzi and immune activation aiming to

understand the pathology of this disease. We have characterized a T. cruzi, mucin

(AgC10), that bind to L-selectin in the macrophage membrane and affects their activa-

tion and therirmicrobicidal activity. Besides, we have demonstrated that Cha 912 is

dominant autoantigen in Chagas�disease.


� Gómez, J., García, A., Borlado, L., Bonay, P., Martinez, C., Fresno, M., Carrera, A.,

Silva, A. and Rebollo, A. IL-2 signalling controls actin organization through Rho-

like protein family, PI3 kinase and PKC-zeta. J. Immunol. 157, 432-441 (1997).

� Rodriguez, E., Bonay, P., Fresno, M. and Gárate, T. Rab proteins in Trichinella spe-

cies. En: Trichinellosis ICT9 (G. Ortega-Perrez, H.R. Gamble, F. van Knapen and

D. Wakelin, Eds.). Centro de Investigación y Estudios Avanzados del Instituto

Politécnico Nacional México, D.F. México. (1997).

� Fresno, M., Kopf, M. and Rivas, L. Cytokines and infectious diseases. Immunol.

Today 18, 56-58 (1997).

� Bonay, P., Fresno, M. and Alarcón, B. Megalomycin disrupts lysosomal functions.

J. Cell. Sci. 110, 1839-1849 (1997).

� Alarcón, B. and Fresno, M. Transferrin receptor (CD71). En: Encyclopedia of

Immunology, second edition. Academic Press, London. (in press) (1997).

� de Diego, J., Punzón, C., Duarte, M. and Fresno, M. Alteration of macrophage func-

tion by a Trypanosoma cruzi membrane mucin. J. Immunol. 159, 4983-4989 (1997).

133

� Obregón, E., Punzón, C., González-Nicolás, J., Fernández-Cruz, E., Fresno, M. and

Muñoz-Fernández, M.A. Induction of adhesion differentiation of human neuro-

blastoma cells by tumor necrosis factor-α requires the expresion of an inducible

nitric oxide synthase. Eur. J. Neurosci. 9, 1184-1193 (1997).

� Muñoz-Fernández, M.A., Navarro, J., Garcia, A. Punzón, C., Fernández-Cruz, E.

and Fresno, M. Replication of human immunodeficiency virus-1 in primary

human T cells is dependent on the autocrine secretion of tumor necrosis factor

through the control of nuclear factor kappa-B activation. J. Aller. Clin. Immunol.

100, 838-845 (1997).

� Fresno, M. Respuesta inmune e infección. Medicine 7(51), 2281-2286 (1997).

� Bonay, P., Solis, J., de la Calle, H., Fresno, M., Grubb. A. and Méndez, E. Massive

glycation of protein HC. A low molecular weight lipocalin, in non-diabetic indi-

viduals. FEBS Lett. 416, 276-280 (1997).

� Revilla, Y., Callejo, M., Culebras, E., Rodríguez, J.M., Salas, M.L., Viñuela, E. and

Fresno, M. Inhibition of nuclear factor kappa B activation by a virus encoded IκB-

like protein. J. Biol. Chem. 273, 5405-5411 (1998).

� Muñoz-Fernández, M.A. and Fresno, M. The role of tumor necrosis factor, inter-

leukin 6, interferon-γ and inducible nitric oxide synthase in the development and

pathology of the nervous suystem. Prog. Neurobiol. 56, 307-340 (1998).

� Fresno, M. and Muñoz-Fernández, M.A. Monografía. Anticuerpos monoclonales

en terapia oncológica. Ed. Farma Roche. (1998).

� Navarro, J., Punzón, C., Fernández-Cruz, E., Pizarro, A., Fresno, M. and Muñoz-

Fernández, M. A. Inhibition of phosphodiesterase type-IV suppresses HIV-1

replication and cytokine production in primary T cells. Involvement of NF-κB and

NFAT. J. Virol. 72, 4712-4720 (1998).

134

� Bonay, P., Durán-Chica, I., Fresno, M., Alarcón, B. and Alcina, A. Antiparasitic

effects of the intra-golgi transport inhibitor megalomicin. Antimicob. Ag. Chem.

42, 2668-2673 (1998).

� Bertot, G.M., Corral, R.S., Fresno, M., Rodriguez, C., Katzin, A.M. and Grinstein,

S. Trypanosoma cruzi tubulin eliminated in the urine of the infected host. J.

Parasitol. 84, 608-614 (1998).

� Fresno, M. and Muñoz-Fernández, M.A. Inmunidad e infección. En

�Inmunología� (ed. Peña Martínez, J.). Ediciones Pirámide Madrid. pp 329-334

(1998).

� Larrucea, S., González-Rubio, C., Cambronero, R., Ballou, B., Bonay, P., López-

Granados, E., Bouvet, P., Fontan, G., Fresno, M. and López-Trascasa, M. Cellular

adhesion mediated by factor J, a complement inhibitor. Evidence for nucleolin

involvement. J. Biol. Chem. 273,31718-25 (1998).

Colaboraciones con la Industria / Collaborations with Industry

Glaxo-Wellcome; Laboratorios del Dr. Esteve

135

REPLICACIÓN DEL DNA Y CICLO CELULAR: Geminivirus DNA REPLICATION AND CELL CYCLE: Geminiviruses

Jefe de Línea / Group Leader: Crisanto GutiérrezBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: M. Beatrice Boniotti, Corinne Fründt, Riccardo

Missich, Qi Xie Becarios Predoctorales Graduate Students: María del Mar Castellano, Elena Ramírez-Parra,

Andrés P. Sanz-BurgosCientíficos Visitantes Visiting Scientists: Alejandro Luque (IBCG, Burdeos), Javier Plasencia

(UNAM, Mexico)


Nuestro interés general es el estudio de la replicación del DNA, de los factores

celulares implicados y de su conexión con el ciclo celular, especialmente en plantas.

Utilizamos como modelo los geminivirus (virus del enanismo del trigo, WDV) ya que

su ciclo replicativo, excepto por la proteína viral Rep, depende absolutamente de facto-

res celulares. Su genoma, (ssDNA, 2750 nucleótidos) codifica 4 proteínas, de las que

RepA y Rep intervienen en la replicación del DNA viral y en su conexión con el ciclo

celular. Recientemente, hemos clonado el cDNA de una proteína de maíz de la familia

de retinoblastoma (Rb), relacionada con la Rb humana supresora de tumores. Nuestro

trabajo se ha centrado en estudiar (1) la replicación del DNA de WDV, y (2) la ruta de

Rb en plantas.

La replicación del DNA de WDV ocurre a través de un mecanismo de círculo

rodante. Utilizando vectores derivados de WDV que replican en células de trigo, hemos

demostrado que su amplificación depende del tamaño del vector y de la estructura del

origen de replicación (localizado en la región intergénica grande, LIR). Hemos identifi-

cado el origen mínimo de replicación (core), absolutamente necesario, y dos regiones


auxiliares que lo flanquean y que estimulan su actividad. La replicación depende de la

interacción de la proteína iniciadora, Rep, con el origen, mediante la formación de, al

menos, un complejo que hemos analizado mediante retraso en gel y microscopía electró-

nica, y que se forma a unos 140 pb upstream del sitio de iniciación de la replicación.

La Rb de plantas posee en su �pocket A/B� una significativa conservación de

aminoácidos con otros miembros de la familia. El residuo C653, homólogo del C706 de

la Rb humana, mutado frecuentemente en tumores, es crítico para la interacción de la

Rb de plantas con ciclina D y con la proteína RepA de geminivirus, a través de su moti-

vo LxCxE. Hemos demostrado que RepA, pero no Rep, interacciona con la Rb, aunque

Rep posee también un motivo LxCxE. Esta diferencia parece deberse a que el dominio

C-terminal de Rep oculta su motivo LxCxE. Para identificar proteínas que interaccionan

con Rb (RbIPs), hemos realizado un screening de dos híbridos en levadura de una geno-

teca de cDNA utilizando Rb como blanco. De la colección de clones positivos, hemos

aislado uno que codifica una proteína de la familia E2F, actualmente en estudio. La

expresión de la proteína Rb está regulada durante el desarrollo de las hojas, acumulán-

dose a medida que las células se diferencian. Estamos estudiando su nivel de fosforila-

ción a lo largo del ciclo celular y durante la diferenciación.

Nuestros objetivos inmediatos se centran en (1) estudiar la replicación del DNA de

geminivirus y su relación con la de la célula, (2) identificar los factores celulares que cons-

tituyen el complejo de iniciación y su función, (3) estudiar la oligomerización de las pro-

teínas virales RepA y Rep, (4) identificar los genes que se expresan de forma dependien-

te de las proteínas virales y del complejo Rb/E2F, y (5) determinar la función de los com-

ponentes de la ruta Rb durante el ciclo celular, el crecimiento y el desarrollo de la planta.

Research Summary

Our general interest is the study of DNA replication, the cellular factors involved

and its coupling to cell cycle regulation, with especial emphasis in plants. We use gemi-

niviruses as model systems (wheat dwarf virus, WDV) because their replicative cycle,

except for the viral Rep protein, depends absolutely on cellular functions. The WDV

genome (ssDNA, 2750 nt) encodes for only 4 proteins, of which Rep and RepA partici-

pate in viral DNA replication and its coupling to cell cycle control. Recently, we have

136

cloned a cDNA encoding a maize protein which belongs to the human retinoblastoma

(Rb) family of tumor suppressors. Our work has been focused, so far, on (1) WDV DNA

replication, and (2) the Rb pathway in plants.

WDV DNA replication occurs by a rolling-circle mechanism. By using WDV-

derived replicons which can be amplified in cultured wheat cells, we have shown that

replication efficiency is largely affected by vector size and origin structure. We have

identified the minimal DNA replication origin (core), absolutely required, within the

WDV large intergenic region (LIR), and two flanking auxiliary regions which stimula-

te viral DNA replication. WDV DNA replication depends on the interaction between

the initiator Rep protein and the minimal origin. One of the complexes identified by gel-

shift assays and electron microcopy maps ~140 bp upstream from the site where DNA

replication starts. Other complexes are now under study.

Plant Rb exhibits, within its A/B pocket domain, a significant amino acid conser-

vation with animal members of the family. We have shown that the residue C653,

homologous to the C706 of human Rb, frequently mutated in human tumors, is critical

for plant Rb-cyclin D (cycD) interaction as well as for geminivirus RepA-Rb interaction,

through a LxCxE motif present in cycD and RepA. Interestingly, RepA, but not Rep

which also contains a LxCxE motif, binds to Rb. This distinctive feature is likely due to

hindrance of the Rb-binding motif by the C-terminal domain of Rep. To identify Rb-

interacting proteins (RbIPs), we have carried out a yeast two-hybrid screening of a

cDNA library using maize Rb as a bait. From the positive clones, we have isolated a

cDNA clone encoding a member of the E2F family of transcription factors, which is

currently under study. Rb protein expression is regulated during leaf development,

and accumulates in differentiated leaves. We are analyzing the phosphorylation level

during the cell cycle and differentiation.

Our immediate research objectives are (1) the study of geminivirus DNA replica-

tion and its relationship to cellular DNA replication, (2) the identification of cellular fac-

tors involved in the assembly of a viral DNA initiation complex, (3) the study of oligo-

merization of viral RepA and Rep proteins, (4) the effects of RepA, Rep and Rb/E2F on

cellular gene expression, and (5) the identification of components of the Rb pathway

and the elucidation of its function during plant cell cycle, growth and development.

137

138


� Suárez-López, P., Gutiérrez, C. DNA replication of wheat dwarf geminivirus vec-

tors: effects of origin structure and size. Virology 227, 389-399 (1997).

� Soengas, M.S., Mateo, C.R., Salas, M., Acuña, A.U. and Gutiérrez, C. Structural

features of φ29 single-stranded DNA binding protein. I. Environment of tyrosines

in terms of complex formation with DNA. J. Biol. Chem. 272, 295-302 (1997).

� Soengas, M.S., Mateo, C.R., Rivas, G., Salas, M., Acuña, A.U and Gutiérrez, C.

Structural features of φ29 single-stranded DNA binding protein. II. Global conforma-

tion of φ29 single-stranded DNA binding protein and the effects of complex forma-

tion on the protein and the single-stranded DNA. J. Biol. Chem. 272, 303-310 (1997).

� Sanz-Burgos, A. P. and Gutiérrez, C. Organization of the cis-element required for

wheat dwarf geminivirus DNA replication and visualization of a Rep protein-

DNA complex. Virology 243, 119-129 (1998).

� Huntley, R., Healy, S., Freeman, D., Lavender, P., de Jager, S., Greenwood, J.,

Makkerh, J., Walker, E., Jackman, M., Xie, Q., Bannister, A. J., Kouzarides, T.,

Gutiérrez, C., Doonan, J. H. and Murray, J.A.H. The plant retinoblastoma protein

homologue ZmRb1 is regulated during leaf development and displays conserved

interactions with G1/S regulators and plant cyclin D (CycD) proteins. Plant Mol.

Biol. 37, 155-169 (1998).

� Horvath, G. V., Pettko-Szandtner, Kelemen, K., Bilgin, M., Boulton, M., Davies,

J.W., Gutiérrez, C. and Dudits, D. Prediction of functional regions of the maize

streak virus replication-associated proteins by protein-protein interaction analy-

sis. Plant Mol. Biol. 38, 699-712 (1998).

� Gutiérrez, C. The retinoblastoma pathway in plant cell cycle and development.

Curr. Opin. Plant Biol. 1, 492-497 (1998).

139


Andrés P. Sanz-Burgos: �Regulación de la replicación del DNA del virus del enanismo

del trigo (WDV, Geminiviridae)�. Universidad Autónoma de Madrid. 1998.


Patentes / Patents

� Gutiérrez, C., Xie, Q., Sanz-Burgos, A. (1997) �Plant GRAB proteins�, CSIC-BTG,

PCT / ES97 / 01292 (España-Europa-USA-Canadá-Japón).

� Gutiérrez, C., Ramirez-Parra, E., Xie, Q. (1998) �Transgenic plants - E2F�, CSIC-

BTG, P9800975 (8 mayo, España).

� Gutiérrez, C., Ramirez-Parra, E., Xie, Q. (1998) �Transgenic plants - E2F�, CSIC-

BTG, P9800981 (11 mayo, España).


Crisanto Gutiérrez:

� Miembro Electo de la European Molecular Biology Organization (Octubre, 1998)

/ Elected Member of the European Molecular Biology Organization (October,

1998)

� Premio de la �Fundación Domingo Martínez� (Curso académico 1998-99) / Prize

of the �Fundación Domingo Martinez� (Academic course 1998-99).

140

INMUNOLOGÍA DE LOS ANTÍGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD IMMUNOLOGY OF HISTOCOMPATIBILITY ANTIGENS

Jefe de Línea / Group Leader: José Antonio López de Castro AlvarezBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Stefan Krebs, Mercé Martí RipollBecarios Predoctorales Graduate Students: Iñaki Alvarez Pérez, Fernando García Martínez,

Marina García-Peydró, José Ramón Lamas López, David Obeso Domingo, Alberto Paradela Elizalde, Manuel Ramos Alvarez-Buylla, Jesús Yagüe Gallardo


HLA-B27 y enfermedad

Las proteínas HLA de clase I presentan péptidos endógenos a los linfocitos T

citotóxicos (CTL). El polimorfismo de HLA modula la especificidad de unión de pépti-

dos y el reconocimiento por CTL. HLA-B27 está fuertemente asociado a la espondilitis

anquilosante (EA) y a otras espondiloartropatías mediante un mecanismo desconocido

pero probablemente relacionado con la presentación de péptidos.

HLA-B27 es estructuralmente heterogéneo y algunos subtipos no están asociados

a EA. Por tanto, el efecto del polimorfismo de HLA-B27 sobre la presentación de pépti-

dos es probablemente un aspecto crítico de la asociación de este antígeno a enfermedad.

Nuestro grupo ha efectuado un análisis comparativo de los repertorios peptídi-

cos, buscando las propiedades que son comunes a los subtipos asociados a enfermedad

y están ausentes en los subtipos que no determinan susceptibilidad. Además de deter-

minar algunas propiedades diferenciales de los repertorios peptídicos de HLA-B27 que

se correlacionan con enfermedad, estos estudios han revelado nuevos efectos del poli-

morfismo de HLA sobre la especificidad de unión de péptidos. Algunos de los princi-


141

pales resultados son los siguientes: 1) algunos subtipos de HLA-B27 presentan in vivo

un péptido derivado de la proteolisis de esta molécula, que posee homología con pro-

teínas de bacterias gram-negativas; aunque algunas de estas bacterias inducen artritis

reactiva asociada a HLA-B27, la presentación de este péptido no se correlaciona con

enfermedad; 2) una importante diferencia entre B*2704, que está asociado a EA, y

B*2706, que no lo está, es la mucho menor preferencia de este subtipo por péptidos con

Tyr C-terminal. Esta es la primera diferencia funcional conocida entre dos subtipos de

HLA-B27 asociados diferencialmente a enfermedad; 3) prácticamente todos los pépti-

dos unidos a HLA-B27 poseen Arg en posición 2; este residuo interacciona con una

región de HLA-B27, llamada cavidad B, conservada entre subtipos. Sin embargo, en

B*2701, posiciones polimórficas localizadas fuera de esta cavidad modifican su especi-

ficidad, permitiendo la entrada de residuos de Gln, lo que altera considerablemente el

repertorio peptídico de este subtipo; 4) B*2703 tiene una mutación que afecta el anclaje

del extremo peptídico N-terminal a HLA-B27. Sin embargo este efecto se compensa par-

cialmente por el reforzamiento de la interacción de HLA-B27 con la Arg2. Estos resul-

tados revelan una complejidad inesperada en la modulación de la unión de péptidos

por el polimorfismo de HLA.

A pesar de sus diferencias, los subtipos de HLA-B27 unen muchos péptidos en

común. Por tanto, una cuestión esencial es si la antigenicidad de los péptidos se man-

tiene en el contexto de los diferentes subtipos. Que esto no es necesariamente así lo

sugiere el hecho de que B*2710 y B*2705, que presentan una reactividad cruzada muy

baja con CTL, unen repertorios peptídicos similares. Por tanto, analizamos si los CTL

pueden reconocer peptídos específicos presentados por distintos subtipos asociados a

enfermedad. Para ello determinamos el péptido específicamente reconocido por un clon

de CTL alorreactivo anti-B*2705, que reaccionaba cruzadamente con B*2702 y B*2703, y

demostramos que esta reacción cruzada era debida al reconocimiento del mismo pépti-

do en los tres subtipos. La capacidad de varios subtipos asociados a enfermedad de pre-

sentar un mismo péptido a los CTL es un requisito crítico si el mecanismo de asociación

de HLA-B27 a enfermedad implica presentación antigénica y reconocimiento por CTL.

Evolución de HLA-B39 en Africa: ¿está condicionada por la malaria?

Aunque se admite que la evolución del polimorfismo HLA de clase I está influi-

do por los antígenos ambientales, es extremadamente difícil establecer una correlación

entre presiones de selección concretas y cambios específicos en HLA. En áreas de Africa

donde la malaria es endémica, los individuos generan respuestas de CTL específicas

contra antígenos pre-eritrocíticos de Plasmodium falciparum. Algunos de los antígenos

peptídicos inmunodominantes que han sido identificados tienen Pro en posición 2. Uno

de ellos, que es presentado específicamente por HLA-B53, genera respuestas de CTL

que protegen contra la malaria.

HLA-B39 (B*3901) presenta péptidos con Arg2 o His2 y es por tanto funcional-

mente diferente de los alotipos relacionados con respuestas anti-malaria. Sin embargo,

un subtipo de origen africano, B*3910, difiere de B*3901 en un solo aminoácido.

Estudios de nuestro laboratorio han revelado que esta mutación altera drásticamente la

especificidad peptídica, de forma que B*3910 une solamente péptidos con Pro2. Por

tanto esta mutación ha aproximado HLA-B39 en Africa a HLA-B53 y a otros alotipos

HLA-B implicados en respuestas de CTL contra malaria.

Research Summary

HLA-B27 and disease

HLA class I proteins bind endogenous peptides and present them to cytotoxic T

lymphocytes (CTL). HLA polymorphism modulates peptide binding and T-cell recog-

nition. HLA-B27 is strongly associated to ankylosing spondylitis (AE) and other

spondyloarthropathies through an unknown mechanism that is probably related to the

peptide presenting function of this molecule.

HLA-B27 is structurally heterogeneous, and some subtypes are not associated to

AS. Therefore the effect of HLA-B27 polymorphism on peptide presentation is probably

a critical pathogenetic feature.

Our group has undertaken a comparative analysis of subtype-bound peptide

repertoires, looking for features that are common to disease-associated subtypes and

absent among subtypes not associated to disease. Besides finding some differences bet-

142

ween HLA-B27-bound repertoires that correlate with disease susceptibility, these stu-

dies have shed new light on the effect of HLA polymorphism on peptide specificity.

Some of the main findings are the following: 1) several HLA-B27 subtypes present in

vivo a peptide derived from proteolytic processing of its own molecule with homology

to proteins from gram-negative bacteria; although some of these bacteria induce B27-

associated reactive arthritis, presention of this peptide does not correlate with disease;

2) a major difference between the disease-associated B*2704 and the non-associated

B*2706 is the much lower preference of this subtype for peptides with C-terminal Tyr.

This is the first known functional feature distinguishing between two HLA-B27 subty-

pes differentially associated to disease; 3) virtually all HLA-B27-bound peptides have

Arg at position 2. This residue interacts with a region of HLA-B27 (called pocket B) that

is conserved among subtypes. However, in B*2701 long range effects of polymorphic

positions located outside this pocket modify its specificity, allowing Gln residues to

enter the pocket. This has large consequences on the B*2701-bound peptide repertoire;

4) B*2703 has a mutation that affects anchoring of the peptidic N-terminus to HLA-B27.

However, its detrimental effect was partially compensated by reinforcement of interac-

tions involving Arg2. Together these findings reveal unexpected complexities in the

modulation of peptide specificity by HLA polymorphism.

In spite of their differences, HLA-B27 subtypes have overlapping peptide reper-

toires. Thus, a critical question is whether peptide antigenicity is maintained upon pre-

sentation by different subtypes. That this is not necessarily the case was suggested

because B*2710 and B*2705, which show very low T-cell crossreaction, had nevertheless

similar peptide repertoires. Thus, we analysed whether peptide-specific CTL would

recognise a peptide epitope when presented by various disease-associated subtypes.

We determined the peptide recognised by an alloreactive CTL clone raised against

B*2705, which crossreacted with B*2702 and B*2703, and demonstrated that this cross-

reaction was due to recognition of the same peptide on the three subtypes. The capacity

of various disease-associated subtypes to present the same peptide to CTL is a critical

requirement if the mechanism of association of HLA-B27 to disease involves antigen

presentation and T-cell recognition.

143

144

HLA-B39 evolution in Africa: is it driven my malaria?

Although it is generally admitted that the evolution of HLA class I polymorphism

is antigen-driven, establishing precise relationships between particular selective pres-

sures and specific HLA changes is extremely difficult. In areas of Africa where malaria

is endemic, individuals mount CTL responses against pre-erythrocytic-stage antigens

of Plasmodium falciparum. Several of the immunodominant peptide antigens that have

been identified have Pro at position 2. One of them, which is specifically presented by

HLA-B53, elicits CTL responses that protect against malaria.

HLA-B39 (B*3901) presents peptides with Arg2 or His2, and is therefore distinct

from malaria-related allotypes. However, an HLA-B39 subtype of African origin,

B*3910, was shown to differ from B*3901 by a single amino acid change. Studies in our

laboratory revealed that this mutation dramatically altered the peptide specificity, so

that B*3910 binds only peptides with Pro2. Therefore this mutation has functionally

approached HLA-B39 in Africa to HLA-B53 and other HLA-B allotypes involved in

CTL responses against the malaria parasite.


� Barber, D.F. and López de Castro, J.A. T cell recognition of HLA-B27. In: �HLA-

B27 in the development of spondyloarthropathies�. R.G. Landes Company,, U.K. (Ed.

By C. López-Larrea). P. 145-165 (1997).

� Ramos, M., García, E., Barber, D., Layrisse, Z. and López de Castro, J.A. The HLA-

B repertoire of the Warao indinas from Venezuela: novel and conserved alleles

and the nature of HLA-B evolution in South America. In : �Genetic Diversity of

HLA: Functional and Medical Implication�. EDK, Paris, France (Ed. D. Charron),

Vol. II: 262-263 (1997).

� García, F., Marina, A., Albar, J.P. and López de Castro, J.A. HLA-B27 presents a

peptide from a polymorphic region of its own molecule with homology to pro-

teins from arthritogenic bacteria. Tissue Antigens 49, 23-28 (1997).

145

� Lamas, J.R., Galocha, B., Villadangos, J.A., Albar, J.P. and López de Castro, J.A.The differentially disease-associated HLA-B*2704 and B*2706 subtypes differ intheir binding of peptides with C-terminal tyrosine residues . In: �Genetic Diversity

of HLA: Functional and Medical Implication�. EDK, Paris, France (Ed. D. Charron),Vol II: 439-441 (1997).

� Luque, I., Galiani, D., González, R., García, F., López de Castro, J.A., Peña, J. and

Solana, R. Recognition of Threonine 80 on HLA-B27 subtypes by NK clones. In:

�Genetic Diversity of HLA: Functional and Medical Implication�. EDK, Paris, France

(Ed. D. Charron), Vol II: 482-484 (1997).

� García, F., Marina, A. and López de Castro, J.A. Lack of Carboxyl-terminal tyro-

sine distinguishes the B*2706-bound peptide repertoire from those of B*2704 and

other HLA-B27 subtypes associated with ankylosing spondylitis. Tissue Antigens

49, 215-221 (1997).

� García, F., Galocha, B., Villadangos, J.A., Lamas, J.R., Albar, J.P., Marina, A. and

López de Castro, J.A. HLA-B27 (B*2701) specificity for peptides lacking Arg2 is deter-

mined by polymorphism outside the B pocket. Tissue Antigens 49, 580-587 (1997).

� Rognan, D., Krebs, S., Kuonen, O., Lamas, J.R., López de Castro, J.A. and Folkers,

G. Fine specificity of antigen binding to two class I major histocompatibility pro-

teins (B*2705 and B*2703) differing in a single amino acid residue. J. Comp. Aid.

Mol. Des. 11, 463-478 (1997).

� García, F., Rognan, D., Lamas, J.R., Marina, A. and López de Castro, J.A. An HLA-

B27 polymorphism (B*2710) that is critical for T-cell recognition has limited effects

on peptide specificity. Tissue Antigens 51, 1-9 (1998).

� López de Castro, J.A. The pathogenetic role of HLA-B27 in chronic arthritis. Curr.

Op. Immunol. 10, 59-66 (1998).

� Lamas, J.R., Brooks, J.M., Galocha, B., Rickinson, A.B., and López de Castro, J.A.Relationship between peptide binding and T-cell epitope selection: a study withsubtypes of HLA-B27. Int. Immunol. 10, 259-266 (1998).

146

� Krebs, S., Lamas, J.R., Poenaru, S., Folkers, G., López de Castro, J.A., Seebach, D.and Rognan, D. Substituting nonpeptidic spacers for the T-cell receptor bindingpart of class I MHC-binding peptides. J. Biol. Chem. 273, 19072-19079 (1998).

� Yagüe, J., Vázquez, J. and López de Castro, J.A. A single amino acid changemakes the peptide specificity of B*3910 unrelated to B*3901 and closer to a groupof HLA-B proteins including the malaria-protecting allotype HLA-B53. TissueAntigens 52, 416-421 (1998).

� Paradela, A., García-Peydró,M., Vázquez, J., Rognan, D. and López de Castro, J.A.The same natural ligand is involved in allorecognition of multiple HLA-B27subtypes by a single T-cell clone: role of peptide and the MHC molecule in allo-reactivity. J. Immunol. 161, 5481-5490 (1998).

� Marina, A., García, M.A., Albar, J.P., Yagüe, J., López de Castro, J.A., Vázquez, J.High-sensitivity analysis and sequencing of peptides and proteins by QuadrupleIon Trap Mass Spectrometry. J. Mass Spectrom. 34, 17-27 (1999).

� Yagüe, J., Ramos, M, Marina, A., Albar, J.P., López de Castro, J.A. The southAmeridian Allotype HLA-B*3909 has the largest known similarity in peptid spe-cificity and common natural ligands with HLA-B27. Tissue Antigens 54, 227-236(1999).


Fernando García Martínez: �Modulación de la unión de péptidos por el polimorfismode HLA-B27�. Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación: Apto cum laude.


José A. López de Castro

� Premio Euskadi de Investigación en Ciencia y Tecnología, 1998.

147

REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN EN LA ACTIVACIÓNENDOTELIAL Y LINFOCITARIA TRANSCRIPTIONAL REGULATION DURING ENDOTHELIALAND LYMPHOCYTE ACTIVATION

Jefe de Línea / Group Leader: Juan Miguel RedondoBecario Postdoctoral Postdoctoral Fellow: Angel Luis Armesilla Becarios Predoctorales Graduate Students: Pablo Gómez del Arco, Elisa Lorenzo Alvarez, Janet

Lynn Maldonado, Sara Martínez-Martínez


Nuestro interés científico se centra en el estudio de los factores de transcripción y

la regulación de la expresión génica en la activación de linfocitos y células endoteliales.

Estamos analizando los mecanismos que integran la transducción de señales extracelu-

lares con la activación de factores de transcripción, a su vez encargados de regular pro-

gramas específicos de inducción génica.

En el proceso de activación linfocitaria hemos estudiado el papel de distintos fac-

tores de transcripción en la inducción de genes como el de la Interleukina-2 (IL-2), cuyo

promotor génico hemos usado como modelo por su propiedad de integrar señales pro-

venientes de distintas rutas de señalización. Usando agentes antioxidantes e inmuno-

supresores hemos diseccionado la contribución relativa de los factores de transcripción

NF-κB, AP-1 y NF-AT en el control del promotor de IL-2. Este análisis nos ha permiti-

do identificar antioxidantes que actúan inhibiendo la activación linfocitaria interfirien-

do con el factor de transcripción NF-AT a través de mecanismos diferentes a los que

ejercen las drogas inmunosupresoras convencionales ciclosporina A y FK506.

Asimismo, este abordaje nos ha conducido a estudiar la función de la familia de la

kinasas activadas por mitógenos (MAPKs) en la desactivación de NF-AT.


Un objetivo básico de este trabajo es caracterizar los mecanismos que regulan la

localización subcelular de familia de factores de transcripción NF-AT. Esta familia está

constituida por al menos 4 miembros, los cuales residen en el citoplasma en células en

reposo y se translocan al núcleo en respuesta a aumentos intracelulares de calcio pro-

ducidos durante la activación celular. Si bien este proceso esta relativamente caracteri-

zado y conlleva la defosforilación de NF-AT mediada por la fosfatasa calcineurina, más

tarde, una vez cesan las señales de calcio y NF-AT ha ejercido sus funciones transacti-

vadoras, el factor es exportado al citoplasma por la acción de kinasas nucleares aún

poco caracterizadas. Mediante diferentes abordajes hemos identificado MAPKs cuya

activación o inhibición conduce a la respectiva exclusión o retención de NF-AT en el

núcleo. Nos planteamos delimitar las regiones de los NFATs que interaccionan con

MAPKs, mutagenizar los residuos fosforilados por las MAPKs e identificar aquellos

cuya mutación origine cambios que afecten la importación/exportación de NFATs.

Estos estudios podrían ayudar a identificar mecanismos de desactivación de factores de

transcripción eucarióticos, y contribuir a la identificación de nuevas dianas terapéuticas

en inmunosupresión.

En células endoteliales estamos analizando las rutas de señalización y el papel de

distintos factores de transcripción en la respuesta al factor de crecimiento del endotelio

vascular (VEGF).VEGF no es solo un mitógeno muy potente de células endoteliales,

también es un factor con marcada actividad proangiogénica. Recientemente, hemos

determinado que la respuesta del endotelio humano a VEGF conduce a la activación

transcripcional y unión al ADN de AP-1 y NFAT1, factores que median la inducción del

promotor y expresión del gen del factor tisular. Esta implicación de NF-AT y AP-1 nos

va a permitir diseccionar las rutas de señalización de VEGF mediante experimentos de

cotransfección usando vectores reporteros dirigidos por NF-AT y AP-1 y vectores de

expresión (constitutivamente activos o dominantes negativos) de distintas kinasas o

GTPasas. La caracterización de estas rutas permitirá estudiar los mecanismos de inter-

ferencia de distintos antiangiogénicos con la señalización de VEGF y su efecto activador

sobre AP-1 y NF-AT. Finalmente, estamos desarrollando modelos de apoptosis en células

endoteliales para analizar el papel de distintos inhibidores de angiogénesis en procesos de

sensibilización e inducción de apoptosis en las células endoteliales este tipo celular.

148

Research Summary

Our research interest is focused on the study of transcription factors and the regu-

lation of gene expression in the lymphocyte and endothelial activation processes. We are

analyzing the mechanisms that integrate extracellular signal transduction with the acti-

vation of transcription factors which in turn regulate specific gene expression programs.

We are analyzing the relative roles of different transcription factors in the induci-

ble gene expression program of lymphocyte activation. For this purpose, we are using

the Interleukin-2 (IL-2) promoter as a model given its capacity to integrate signals from

different transduction cascades. By using immunosuppressive and antioxidant agents

we have dissected the relative contributions of NFκB, AP-1 and NF-AT to the trans-

criptional activation of the IL-2 promoter. These analyses have allowed the identifica-

tion of antioxidant agents that inhibit lymphocyte activation by interfering with NF-AT

through mechanisms different from those exerted by the immunosuppressive drugs

cyclosporin A or FK-506. In addition, this experimental approach has led us to the cha-

racterization of a role of MAPKs in the deactivation of NF-AT.

A major goal of our research is the characterization of the molecular mechanisms

that control the subcellular localization of the NF-AT family members of transcription

factors. This family is composed of at least four members that are found in the cyto-

plasm of resting cells and translocate to the nucleus in response to calcium signals trig-

gered upon cell activation. Although this process is relatively well characterized and

involves the calcineurin-mediated dephosphorylation of NF-AT, later on , once calcium

signals are curtailed and NF-AT has already exerted its transactivation functions, the

transcription factor is exported from the nucleus to the cytoplasm through the action of

nuclear kinases yet poorly understood. By using different experimental approaches, we

have identified MAPKs whose activation or inhibition results in the nuclear exclusion

or accumulation of NF-AT, respectively. We are mapping the NF-AT regions that inte-

ract with MAPKs to perform site-directed mutagenesis of the NF-AT sites phosphory-

lated by MAPKs and to further identify the mutants that result in changes in the shut-

tling of NF-AT members. These analyses may help to define new mechanisms by which

eukaryotic transcription factors are deactivated and contribute to the identification of

new therapeutic targets for immunosuppression.

149

150

In endothelial cells, we are analyzing the signalling pathways and the role of

transcription factors involved in the activation induced by Vascular Endothelial

Growth Factor (VEGF). VEGF is a very potent mitogen for endothelial cells and also

has a marked activity as a pro-angiogenic factor. Recently, we have found that VEGF

induces the transcriptional activation and DNA-binding activity of AP-1 and NF-AT in

human endothelial cells. As a result, VEGF induces Tissue Factor (TF) gene expression

and the binding of NF-AT and AP-1 to functional sites within the TF gene promoter.

The involvement of NF-AT and AP-1 in the VEGF-mediated response opens the possi-

bility of dissecting the signalling pathways triggered by VEGF by cotransfection expe-

riments using NF-AT- and AP-1-driven reporter constructs together with expression

vectors encoding constitutively active or dominant negative versions of kinase cascade

components or small GTPases. Such an analysis may also further elucidate the level at

which antiangiogenic agents interfere with VEGF-induced signal transduction and NF-

AT- and AP-1 transcriptional activation.

Finally, we are developing models to analyze endothelial apoptosis in order to

investigate the role of different antiangiogenic agents in the sensitisation to and induc-

tion of apoptosis in endothelial cells.


� Gómez del Arco, P., Martínez-Martínez, S., Calvo, V., Armesilla, A.L. and

Redondo, J.M. Redox pathways in AP-1 activation. Immunobiol. 197, 247-252.

(Review) (1997).

� Martínez-Martínez, S., Gómez del Arco, P., Aramburu, J., Luo, C., Rao, A.,

Armesilla, A.L. and Redondo, J.M. Blockade of T cell activation by dithiocarba-

mates involves novel mechanisms of inhibition of Nuclear Factor of Activated T

cells (NFAT). Mol. Cell. Biol. 17, 6437-6447 (1997).

� González-Amaro, R., Portales-Pérez, D., Baranda, L., Redondo, J.M., Martínez-

Martinez, S., Yáñez-Mó, M., García-Vicuña, R. and Sánchez-Madrid, F.

Pentoxifylline inhibits adhesion and activation of human T lymphocytes. J.

Immunol. 161, 65-72 (1998).

151

� Lara-Pezzi, E., Armesilla, A.L., Majano, P.L., Redondo, J.M. and López-Cabrera,

M. The hepatitis B virus protein activates nuclear factor of activated T cells

(NFAT) by a ciclosporin A-sensitive pathway. EMBO J. 23, 7066-7077 (1998).

� Armesilla, A.L., Lorenzo, E., Gómez del Arco, P., Martínez-Martínez, S., Alfranca,

A. and Redondo, J.M. VEGF activates Nuclear factor of activated T cells (NFAT)

in human endothelial cells; a role for tissue factor gene expression. Mol. Cell. Biol.

19, 2032-2043 (1999).

Organización de Reuniones Científicas / Organization of ScientificMeetings

Juan Miguel Redondo

� II Jornadas Nacionales sobre Transcripción Génica. Córdoba. Septiembre 1998.

� Workshop on �Transcription Factors in Lymphocyte development and function.

Fundación Juan March. Madrid. Octubre 1998.

152

REPLICACIÓN Y TRANSCRIPCIÓN DEL DNA DELBACTERIÓFAGO Ø29 REPLICATION AND TRANSCRIPTION OF BACTERIOPHAGEØ29

Jefe de Línea / Group Leader: Margarita SalasPersonal Científico Scientific Personnel: Luis Blanco, Alicia Bravo, Ana Camacho, Montserrat

Elías, José Miguel HermosoBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Ana Bonnin, Paola Crucitti, Belén Illana, Wilfried

Meijer, María Monsalve,Verónica TrunigerBecarios Predoctorales Graduate Students: Ana Abril, Belén Calles, Irene Gascón, Víctor

González-Huici, José A. Horcajadas, Javier Saturno,Alejandro Serna, Miguel de Vega

Técnicos de Investigación Technical Assistance: José M. Lázaro, Mª Angeles Martínez, Laurentino

Villar


Replicación del DNA de ø29

El objetivo del trabajo es profundizar en el conocimiento del mecanismo de ini-

ciación de la replicación del DNA de ø29 mediante proteína terminal (TP), y de las pro-

teínas implicadas en replicación.

Se ha demostrado que el dominio N-terminal de la DNA polimerasa de ø29 se

requiere, no solo para la actividad 3�-5� exonucleasa y para desplazamiento de cadena,

sino también para interaccionar con la TP y con el DNA �primer�, así como para la esti-

mulación de la reacción de iniciación por la proteína p6. El residuo Ser122 del dominio

N-terminal, que es un ligando de DNA de banda simple, también se requiere para inte-

raccionar con la TP. Por otra parte, el motivo conservado YxGG/A, localizado entre los


dominios N- y C-terminales, está también implicado en la interacción con TP. Se ha

caracterizado el primer Asp (Asp456) del motivo YxDTDS en el dominio C-terminal

como un ligando de metal en la síntesis de DNA utilizando TP o DNA como �primer�.

Asimismo, el Asp456 es crítico durante la transición en el uso del DNA respecto a TP

como �primer�. Se ha caracterizado que el residuo Tyr254 del motivo Dx2SLYP está

implicado en la discriminación de ribonucleótidos.

Se ha estudiado el mecanismo de activación por la SSB de ø29 de la replicación

mediada por la DNA polimerasa de ø29 y se han comparado las propiedades de las

SSBs de los fagos Nf y GA-1 relacionados con ø29. Solamente la SSB de ø29 estimula la

velocidad de replicación del DNA de M13 mientras que las tres SSBs estimulan la can-

tidad de DNA sintetizado. Las SSBs de ø29 y de Nf son monómeros en solución, mien-

tras que la de GA-1 es un hexámero. De acuerdo con esto, los parámetros de interacción

con el DNA de la SSB de GA-1 difieren de los de las SSBs de ø29 y Nf. Así, la SSB de

GA-1 compacta 5 veces el DNA de M13 de banda simple (en colaboración con el Dr.

Crisanto Gutiérrez, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, CBMSO).

La proteína p6, que se une a los extremos del DNA de ø29 para activar la inicia-

ción de la replicación, interacciona para formar dímeros in vivo. Mediante el uso de un

sistema de dos híbridos se han localizados dos zonas en p6 implicadas en la interacción

proteína-proteína. Cuando la p6 se entrecruza con glutaraldehido y se estudia al

microscopio electrónico se observan estructuras en forma de bastoncillos y de rosqui-

llas. Por procesamiento de imagen (en colaboración con los Dres. Sergio Marco y José L.

Carrascosa, Centro Nacional de Biotecnología, CNB) las rosquillas corresponden a dos

bastoncillos unidos cabeza-cola y podrían constituir el núcleo proteico del complejo p6-

DNA. Después de un mes a 4ºC las estructuras anteriores dan lugar a filamentos que

recuerdan a los que se observan en la enfermedad de Alzheimer. La proteína p17, impli-

cada en replicación, que se sintetiza inmediatamente después de la infección, inte-

racciona con la p6 y facilita la unión de ésta a los orígenes de replicación del DNA de

ø29. La proteína p1, también implicada en replicación, que se encuentra asociada a

membranas, polimeriza en hojas de protofilamentos cuya estructura se parece a la tubu-

lina eucariótica y a los polímeros de la proteína bacteriana FtsZ, implicada en división

celular. La estructura formada por la p1 podría suministrar un sitio de anclaje para la

153

154

maquinaria de replicación del DNA viral. La proteína p16.7, cuyo gen está contiguo al

17 y se expresa inmediatamente después de la infección, contiene un dominio trans-

membrana, forma dímeros e interacciona con DNA de doble cadena de un modo no

específico. La región C-terminal presenta homología con el homeodominio de la pro-

teína Antennapedia. Utilizando técnicas de fluorescencia (en colaboración con el Prof.

J. Errington, Universidad de Oxford) se ha localizado la proteína p16.7 en los polos de

la célula. Para ello, parece requerir las proteínas virales de replicación, TP, DNA poli-

merasa, p1, p6 y p17.

Transcripción del DNA de ø29

Se ha estudiado la unión de la proteína p4, que reprime el promotor temprano

A2c de ø29, a dicho promotor. En ausencia de RNA polimerasa (RNAP) la p4 se une a

una región centrada en la posición -39 respecto al sitio de iniciación de la transcripción,

mientras que en presencia de RNAP se une a la posición -71 estabilizándose dicha unión

(en colaboración con el Dr. F. Rojo, CNB). En presencia de proteína p4, la proteína p6

reprime al promotor A2c, desplazando a la RNAP del mismo. Este efecto de p4 requie-

re la presencia del promotor tardío A3.

Se ha estudiado el papel que juega el motivo �-10 extendido� en varios promoto-

res de ø29. Mutantes en dicho motivo afectan la unión de la RNAP disminuyendo la for-

mación de complejos cerrados y abiertos. Sin embargo, en promotores que tienen región

-35, se obtiene un aumento en la transcripción, indicando que el motivo �-10 extendi-

do� suministra puntos de contacto para la RNAP con un papel restringido a los prime-

ros pasos de la transcripción.

Se ha estudiado la regulación de la transcripción del DNA del fago GA-1 por la

proteína p4 (p4G). A diferencia de ø29, la RNAP inicia la transcripción del promotor

tardío A3 en ausencia de p4G. Evidencia preliminar indica que p4G se comporta como

anti-represor cuya función sea inhibir un posible represor celular del promotor tardío

A3 (en colaboración con el Dr. F. Rojo, CNB).

Research Summary

ø29 DNA Replication

The aim is to get a further insight in the mechanism of initiation of ø29 DNA repli-

cation primed by the terminal protein (TP) and of the proteins involved in replication.

We have shown that the N-terminal domain of ø29 DNA polymerase is required, not only

for 3�-5� exonuclease an strand displacement, but also for interaction with the TP and the DNA

primer, as well as to stimulate the initiation reaction by protein p6. Residue Ser122 of the N-termi-

nal domain, a ligand for ssDNA, is also required for interaction with the TP. On the other hand,

the conserved motif YxGG/A, located between the N- and C-terminal domains, is also involved

in interaction with the TP. The first Asp (Asp456) of the YxDTDS motif in the C-terminal domain,

has been characterized as a metal ligand during both TP-primed and DNA-primed DNA synt-

hesis. Moreover, Asp456 is critical during transition from TP priming to DNA priming. On the

other hand, residue Y254 of the Dx2SLYP motif, has been shown to be involved in ribonucleotide

discrimination.

The mechanism of activation of ø29 SSB of the replication catalyzed by ø29 DNA

polymerase has been studied, and the properties of the SSBs of phages Nf and GA-1,

related to ø29, have been compared. Only the ø29 SSB stimulates the replication rate of

M13 DNA, whereas the three SSBs stimulate the amount of DNA synthesized. The SSBs

of ø29 and Nf are monomers in solution, whereas GA-1 SSB is an hexamer. In agree-

ment with this, the parameters of the interaction with DNA of GA-1 SSB differ from

those of ø29 and Nf SSBs. Thus, GA-1 SSB produces a 5-fold compaction of M13 ssDNA

(work in collaboration with Dr. Crisanto Gutiérrez, CBMSO).

Protein p6, that binds to the ø29 DNA ends to activate the initiation of replication,

interacts with itself forming dimers in vivo. By using a two-hybrid system we have

located two regions in p6 involved in protein-protein interaction. By glutaraldehyde

crosslinking and electron microscopy, protein p6 forms crook-shaped and doughnut-

shaped structures. By image processing (in collaboration with Drs. Sergio Marco and

José L. Carrascosa, CNB) the latter correspond to two crook-shaped aggregates in a

head to tail arrangement that could correspond to the protein core predicted for the p6-

DNA complex. After one month at 4ºC the latter structures form filaments that resem-

ble those observed in Alzheimer disease.

155

156

Protein p17, the earliest induced protein, involved in replication, interacts with p6

and facilitates p6 interaction with the origins of replication of ø29 DNA. Protein p1, also

involved in replication, that is found associated to membranes, polymerizes into long

protofilament sheets. These structures resemble eukaryotic tubulin and bacterial FtsZ

polymers, involved in cell division. This structure could provide an anchoring site for

the viral DNA replication machinery. Protein p16.7, whose gene is contiguous to gene

17 and is expressed very early after infection, contains a transmembrane domain, forms

dimers in solution, and interacts with dsDNA in a non-specific way. The C-terminal

domain of p16.7 has homology with the homedomain of the Antennapedia protein. By

using fluorescence techniques (in collaboration with Prof. J. Errington, Oxford

University), protein p16.7 has been located in the cell poles. For this location, the viral

replication proteins TP, DNA polymerase, p1, p6 and p17 seem to be required.

Transcription of ø29 DNA

The interaction of protein p4, a repressor of the early ø29 promoter A2c, to this

promoter has been studied. In the absence of RNA polymerase (RNAP), p4 binds to a

region centered at position -39 with respect to the transcription start site, whereas in the

presence of RNAP p4 binds to position -71, stabilizing the binding of p4 to the promo-

ter (in collaboration with Dr. F. Rojo, CNB). In the presence of protein p4, protein p6

repressed the A2c promoter displacing the RNAP from it. This p4 effect requires the

presence of the late A3 promoter.

The role of the �extended -10� motif in several ø29 promoters has been studied.

Mutants in this motif impair RNAP binding reducing the yield of closed and open com-

plex. However, in promoters containing -35 region, transcription was increased indica-

ting that the �extended -10� motif provides contact points for RNAP with a role res-

tricted to the first steps of transcription.

The regulation of phage GA-1 DNA transcription by protein p4 (p4G) has been

studied. Contrary to what happens in ø29, the RNAP starts transcription of the late A3

promoter in the absence of p4G. Preliminary evidence indicates that p4G behaves as an

anti-repressor inhibiting the binding of a putative cellular repressor of the late A3 pro-

moter (in collaboration with Dr. F. Rojo, CNB).

157


� Soengas, M.S., Mateo, C.R., Salas, M., Acuña, A.U. and Gutiérrez, C. Structural

features of ø29 single-stranded DNA binding protein. I. Environment of tyrosines

in terms of complex formation with DNA. J. Biol. Chem. 272, 295-302 (1997).

� Soengas, M.S., Mateo, C.R., Rivas, G., Salas, M., Acuña, A.U. and Gutiérrez, C.

Structural features of ø29 single-stranded DNA binding protein. II. Global con-

formation of ø29 SSB and the effects of complex formation on the protein and the

ssDNA. J. Biol. Chem. 272, 303-310 (1997).

� Méndez, J., Blanco, L. and Salas, M. Protein-primed DNA replication: A transition

between two modes of priming by a unique DNA polymerase. EMBO J. 16, 2519-

2527 (1997).

� Esteban, J.A., Blanco, L., Villar, L. and Salas, L. In vitro evolution of terminal pro-

tein-containing genomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 2921-2926 (1997).

� Bravo, A. and Salas, M. Initiation of bacteriophage ø29 DNA replication in vivo:

Assembly of a membrane-associated multiprotein complex. J. Mol. Biol. 269, 102-

112 (1997).

� Saturno, J., Lázaro, J.M., Esteban, F.J., Blanco, L. and Salas, M. ø29 DNA polyme-

rase residue Lys 383, invariant at motif B of DNA-dependent polymerases, is

involved in dNTP binding. J. Mol. Biol. 270, 1-13 (1997).

� King, A.J., Teertstra, W.R., Blanco, L., Salas M. and van der Vliet, P. Processive

proofreading by the adenovirus DNA polymerase. Association with the priming

protein reduces exonucleolytic degradation. Nucl. Acids Res. 25, 1745-1752 (1997).

� de Vega, M., Ilyina, T., Lázaro, J.M., Salas, M. and Blanco, L. An invariant lysine

residue is involved in catalysis at the 3�-5� exonuclease active site of eukaryotic-

type DNA polymerases. J. Mol. Biol. 270, 65-78 (1997).

158

� Abril, A., Salas, M., Andreu, J.M., Hermoso, J.M. and Rivas, G. Phage ø29 protein

p6 is in a monomer-dimer equilibrium that shifts to higher association states at

the millimolar concentrations found in vivo. Biochemistry 36, 11901-11908 (1997).

� Elías-Arnanz, M. and Salas, M. Bacteriophage ø29 DNA replication arrest caused

by codirectional collisions with the transcription machinery. EMBO J. 16, 5775-

5783 (1997).

� Monsalve, M., Calles, B., Mencía, M., Salas, M. and Rojo, F. Transcription activa-

tion or repression by phage ø29 protein p4 depends on the strength of the RNA

polymerase-promoter interactions. Molecular Cell 1, 1-9 (1997).

� Mencía, M. Monsalve, M., Rojo, F. and Salas, M. Substitution of the C-terminal

domain of the Escherichia coli RNA polymerase α subunit by that from Bacillus sub-

tilis makes the enzyme responsible to a B. subtilis transcriptional activator. J. Mol.

Biol. 275, 177-185 (1998).

� Truniger, V., Lázaro, J.M., Salas, M. and Blanco, L. ø29 DNA polymerase requires

the N-terminal domain to bind terminal protein and DNA primer substrates. J.

Mol. Biol. 278, 741-755 (1998).

� de Vega, M., Lázaro, J.M., Salas, M. and Blanco, L. Mutational analysis of ø29

DNA polymerase residues acting as ssDNA ligands for 3�-5� exonucleolysis. J.

Mol. Biol. 279, 807-822 (1998).

� Rojo, F., Mencía, M. Monsalve, M. and Salas, M. Transcription activation and

repression by interaction of a regulator with the α subunit of RNA polymerase:

the model of phage ø29 protein p4. Progress Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 60, 9-46

(1998).

� Illana, B., Zaballos, A., Blanco, L. and Salas, M. The �RGD� sequence in phage ø29

terminal protein is required for interaction with ø29 DNA polymerase. Virology

248, 12-19 (1998).

159

� Crucitti, P., Lázaro, J.M., Benes, V. and Salas, M. Bacteriophage ø29 early protein

p17 is conditionally required for the first rounds of viral DNA replication. Gene

223, 135-142 (1998).

� Murthy, V., Meijer, W., Blanco, L. and Salas, M. DNA polymerase template swit-

ching at specific sites on the ø29 genome causes the in vivo accumulation of sub-

genomic ø29 DNA molecules. Mol. Microbiol. 29, 787-798 (1998).

� de Vega, M., Blanco, L. and Salas, M. ø29 DNA polymerase residue Ser122, a

ssDNA ligand for 3�-5� exonucleolysis, is required to interact with the terminal

protein. J. Biol. Chem. 273, 28966-28977 (1998).

� Monsalve, M., Calles, B., Mencía, M., Rojo, F. and Salas, M. Binding of phage ø29

protein p4 to the early A2c promoter: recruitment of a repressor by the RNA poly-

merase. J. Mol. Biol. 283, 559-569 (1998).

� Rowe-Magnus, A., Mencía, M., Rojo, F., Salas, M. and Spiegelman, G.B.

Transcription activation of the Bacillus subtilis spoIIG promoter by the response

regulator SpoOA is independent of the C-terminal domain of the RNA polyme-

rase alpha subunit. J. Bacteriol. 180, 4760-4763 (1998).

� Saturno, J., Lázaro, J.M., Blanco, L. and Salas, M. Role of the first aspartate of the

�YxDTDS� motif of ø29 DNA polymerase as a metal ligand during both TP-pri-

med and DNA-primed DNA synthesis. J. Mol. Biol. 283, 633-642 (1998).

� Bravo, A. and Salas, M. Polymerization of bacteriophage ø29 replication protein

p1 into protofilament sheets. EMBO J. 17, 6096-6105 (1998).


Mª Belén Illana Calero: �Proteínas terminales como iniciadores de la replicación de

genomas lineales: análisis funcional en los bacteriófagos ø29 y GA-1 de Bacillus subtilis�.


160

María Monsalve Pérez: �Mecanismo de represión del promotor temprano A2c por la

proteína p4 del bacteriófago ø29 de B. subtilis�. Universidad Autónoma de Madrid.

1997. Calificación: Apto cum laude.


Margarita Salas

� Miembro de la Comisión Asesora para los Estudios de Ciencias de la Salud y de

la Vida, Universidad Pompeu Fabra (1997� ).

� Miembro del Comité Científico del Parc Cientific de Barcelona (1997� ).

� Miembro de la Academia Scientiarum et Artium Europaea (1997� ).

� Premio a los Valores Humanos del Grupo Correo de Comunicación (1998).

� Miembro del Consejo Científico del Institut D�Investigacions Biomèdiques

August Pi i Sunyer (IDIBAPS) (1998� ).

� Premio de Investigación de la Comunidad de Madrid (1998).

� Premio Mexico de Ciencia y Tecnología (1998).

� Premio Heroína 1998 de Charter 100 (1998).

161

DESARROLLO DEL SISTEMA LINFOHEMATOPOYETICO DEVELOPMENT OF THE LYMPHOHEMATOPOIETIC SYSTEM

Jefe de Línea / Group Leader: María Luisa ToribioBecario Postdoctoral Postdoctoral Fellow: Graciela CarrilloBecarios Predoctorales Graduate Students: Almudena R. Ramiro, César Trigueros, Yolanda R.

Carrasco, Virginia G. de Yébenes


Nuestro trabajo, junto con el de otros grupos, ha proporcionado evidencias direc-

tas de que el timo humano es colonizado por un precursor hematopoyético procedente

de la médula ósea, diferente de la célula hematopoyética multipotencial (HSC), que

mantiene la capacidad de generar no sólo células T, sino también células B, células natu-

ral killer (NK), y células dendríticas (DCs). La identificación de este �precursor común

linfoide� (CLP) cuestiona la hipótesis ampliamente aceptada del origen mieloide de las

DCs, y sugiere que las DCs, o al menos un linaje particular de DCs, está más estrecha-

mente ligado al desarrollo del sistema linfoide que del sistema mieloide. Con objeto de

analizar esta hipótesis, intentamos establecer la relación ontogénica entre las DCs

intratímicas y el resto de los linajes linfoides del individuo, para lo que diseñamos un

sistema experimental capaz de inducir la generación exclusiva de DCs a partir de pro-

genitores intratímicos. En este sistema, observamos que las DCs se generan a partir de

precursores intermediarios de gran tamaño, diferentes de los precursores del linaje T,

capaces de generar no sólo DCs, sino también células NK, en respuesta a IL-2 (o IL-15).

Los datos obtenidos, junto con estudios adicionales de dilución límite, ponen de mani-

fiesto la estrecha relación existente en el desarrollo de ambos linajes NK y DC y sugie-

ren, además, que las DCs y las células NK divergen del linaje T a través de un precur-

sor bipotencial común NK/DC. La relevancia fisiológica de este precursor intermedia-

rio, así como la identificación de las señales que controlan su diferenciación en linajes

alternativos, constituyen uno de nuestros objetivos de estudio en la actualidad.


Por otra parte, hemos obtenido información relevante a nivel molecular sobre los

eventos críticos que determinan la diferenciación del CLP en diferentes estirpes celula-

res y, en concreto, aquellos que controlan el desarrollo temprano de las células T en el

timo. Nuestros estudios previos habían mostrado que uno de los puntos de control crí-

ticos en este proceso viene determinado por la expresión de un pre-receptor (pre-TCR)

asociado al complejo CD3, compuesto por la cadena TCRβ unida a una cadena pre-

TCRα (pTα). Sin embargo, quedaba por establecer cómo se regula la expresión del pre-

TCR durante el desarrollo intratímico para garantizar la transición a estadios madura-

tivos posteriores donde se induce la expresión del complejo maduro TCRα/β. Mediante

la generación de un anticuerpo policlonal que reconoce un epítopo expuesto de la pro-

teína pTα humana, observamos que la expresión en membrana de la molécula pTα está

restringida in vivo a una población pre-T enriquecida en células grandes en división

que coexpresan bajos niveles del complejo CD3 . Este restringido patrón de expresión

nos permitió identificar una nueva subpoblación de timocitos pequeños CD3- que care-

cen de la molécula pTα en superficie, pero que expresan la cadena TCRβ en el citoplas-

ma. La nueva subpoblación incluye células pre-T tardías, quiescentes, en donde se

induce la reexpresión de los genes de activación de las recombinasas (RAG), y desapa-

rece la transcripción en línea germinal de TCRα (TEA), coincidiendo con la parada del

ciclo celular, e inmediatamente antes de la expresión del gen TCRα. Es importante decir

que los timocitos en este estadio pre-T tardío constituyen los intermediarios funciona-

les entre las células pre-T pTα+ y los primeros timocitos maduros TCRα/β+. Estos resul-

tados se encuadran en un modelo hipotético en el que la expresión en membrana del

pre-TCR induce la rápida activación del ciclo celular y la consiguiente expansión de las

células pre-T pre-TCR+, que posteriormente internalizan el complejo y detienen su acti-

vidad mitótica, previamente a la expresión del gen TCRα.

La información obtenida sobre los eventos críticos que restringen el potencial lin-

foide del CLP y que determinan su diferenciación en linajes linfoides alternativos nos

ha permitido diseñar estrategias experimentales de diferenciación linfoide, que pueden

suponer valiosas herramientas en estudios preclínicos de transferencia genética, de

futura aplicación en defectos genéticos del sistema hematolinfoide. En particular,

hemos mostrado la idoneidad de un nuevo mutante de la proteína verde fluorescente

162

(EGFP) como marcador genético en precursores linfoides primarios transducidos retro-

viralmente, en los que se mantiene la capacidad de generar, al menos, DCs. Por tanto,

debido a su rápida y fácil detección y a la ausencia de efectos tóxicos, la EGFP consti-

tuye un valioso gen trazador de la eficiencia de transducción de los precursores linfoi-

des humanos en los que, además, mantiene intacto su potencial hematopoyético.

Research Summary

Current studies, including ours, support the notion that the thymus is seeded by

a yet uncommitted bone marrow-derived progenitor cell, distinct from the hemato-

poietic stem cell (HSC), that retains the capability to generate T cells, B cells, Natural

killer (NK) cells, and also Dendritic cells (DCs). The identification of such a �common

lymphoid progenitor� (CLP) challenges current views on the myeloid lineage affiliation

of most DCs, and supports the notion that the DC lineage, or at least a particular linea-

ge of DCs, is developmentally more closely related to lymphoid cells than to myeloid

cells. Thus, we shought to determine the developmental relationship between such a

�lymphoid DC� and the other lymphoid cell lineages, in humans. To this end, we set

up a multicytokine-supported cell culture system that induced the most immature

intrathymic progenitors to develop exclusively to DCs. Under these culture conditions,

generation of DCs was shown to proceed through a transient population of large-sized

cells, distinct from T-cell precursors, that was capable of generating not only DCs, but

also NK cells, in response to IL-2 (or IL-15). Limiting dilution studies provided further

evidence of linked pathways of NK cell and DC development from intrathymic precur-

sors, and suggested that NK cells and DCs branch off the T cell lineage through a bipo-

tential NK/DC progenitor. The physiological relevance of such a common NK/DC

intermediate, as well as the molecular signals that control its commitment decisions, are

currently under investigation.

Additional studies allowed us to obtain relevant information about the critical

points of lineage decision leading the CLP to commit to each alternative lymphoid cell

lineage. Particularly, molecular processes that control early T-cell development inside

the thymus have been analyzed in order to identify some of the regulatory mechanisms

163

164

that control T-lineage commitment in man. Our previous studies showed that one of the

earliest control points in human T-cell development involves the expression of a CD3-

associated pre-T cell receptor (pre-TCR) complex composed of the TCRβ chain paired

with a pre-TCRα (pTα) chain. A major issue is how surface expression of the pre-TCR

is regulated during thymocyte development to control further transition to TCRα rea-

rrangement and TCRα/β expression. To address this issue, we derived a polyclonal

antibody that recognizes an exposed epitope of the native human pTα protein and sho-

wed that developmental expression of pTα is time- and stage-specific, and is confined

in vivo to a limited subset of large cycling human pre-T cells that coexpress low density

CD3. This restricted expression pattern allowed the identification of a novel subset of

small CD3- thymocytes lacking surface pTα, but expressing cytoplasmic TCRβ, that

represent late noncycling pre-T cells in which recombination activating gene (RAG)

reexpression, and dowregulation of T early α (TEA) transcription, are coincident events

associated with cell cycle arrest, and immediately preceding TCRα gene expression.

Importantly, thymocytes at this late pre-T cell stage are shown to be functional inter-

mediates between large pTα+ pre-T cells and TCRα/β + mature thymocytes. The results

support a model in which pre-TCR-expressing pre-T cells are brought into cycle,

rapidly downregulate surface pre-TCR, and finally become small resting pre-T cells,

before the onset of TCRα gene expression.

The information obtained on the critical events that control the developmental

decisions leading the CLP to individual lymphoid commitment has allowed us to set up

in vitro experimental systems of lymphoid development, as powerful tools to approach

gene transfer protocols in preclinical trials of genetic defects affecting the lymphohema-

topoietic system. Particularly, we showed the feasibility of a novel mutant gene of the

green fluorescent protein (EGFP) as a genetic marker in retroviral-mediated transduc-

tion of primary lymphoid precursors, which were shown to retain their developmental

capabilities and to generate efficiently DCs. Therefore, because of its rapid and easy

detectability and its nontoxic characteristics, EGFP proves itself to be a valuable reporter

gene by allowing the transduction of hematopoietic lymphoid progenitors, and by being

compatible with the developmental programs of lymphoid lineage generation.

165


� Guérin, S. Mari, B., Fernández, E., Belhacene, N., Toribio, M.L. and Auberger, P.

CD10 is expressed on human thymic epithelial cell lines and modulates thymo-

poietin-induced cell proliferation. FASEB J. 11, 1003-1011 (1997).

� Castellanos, A., Martín-Seisdedos, C., Toribio, M.L., San Miguel , J.F. and

González-Sarmiento, R. TCR-gamma gene rearrangement with interstitial dele-

tion within the TRGV2 gene segment is not detected in normal T lymphocytes.

Leukemia 12, 251-253 (1998).

� Márquez, C., Trigueros, C., Franco, J.M., Ramiro, A.R., Carrasco, A.R., López-

Botet, M. and Toribio, M.L. Identification of a common developmental pathway

for thymic natural killer cells and dendritic cells. Blood 91, 2760-2771 (1998).

� Ramiro, A.R., de Yébenes, V.G., Trigueros, C., Carrasco, Y.R. and Toribio, M.L.

Enhanced green fluorescent protein as an efficient reporter gene for retroviral

transduction of human multipotent lymphoid precursors. Hum. Gene Ther. 9,

1103-1109 (1998).

� Trigueros, C., Ramiro, A.R., Carrasco, Y.R., de Yébenes, V.G., Albar, J.P. and

Toribio, M.L. Identification of a late stage of small noncycling pTα- pre-T cells as

immediate precursors of TCRα/β+ thymocytes.J. Exp. Med. 188, 1401-1412 (1998).

Colaboraciones con la Industria / Collaborations with the Industry

GLAXO WELLCOME S.A. Ayuda a la investigación farmacéutica (1996-1998).

GLAXO WELLCOME S.A. Research Grant (1996-1998).

166

VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA AFRICAN SWINE FEVER VIRUS

Jefe de Línea / Group Leader: Eladio ViñuelaPersonal Científico Scientific Personnel: Ángel L. Carrascosa, Yolanda Revilla, Javier M.

Rodríguez, José Salas, María Luisa SalasBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Germán Andrés, Esther Culebras, Ramón García,

Mariano OliverosBecarios Predoctorales Graduate Students: Alí Alejo, Ana Cebrián, Inmaculada Galindo, Gema

RojoTécnicos de Investigación Technical Assistance: María José Bustos, María Luisa Nogal


Estudio de la función de genes virales

Se está estudiando la función de genes del virus de la peste porcina africana

(VPPA) que codifican proteínas con homología a otras proteínas de las bases de datos.

La proteína codificada por uno de estos genes ha sido caracterizada como una trans-

preniltransferasa que cataliza la síntesis del compuesto isoprenoide geranilgeranil

difosfato, el cual podría servir como sustrato para la prenilación de proteínas virales o

celulares, regulando de esta manera su función durante la infección viral.

El VPPA codifica también por una nueva DNA polimerasa de tan sólo 20 kDa per-

teneciente a la familia X de DNA polimerasas, que incluye a las polimerasas de tipo

reparativo. La DNA polimerasa reparativa del VPPA es un enzima monomérico y alta-

mente distributivo, que conserva los residuos críticos para la unión al DNA y a los

nucleótidos, así como para la catálisis de la reacción de polimerización. Esta DNA poli-

merasa representa la mínima versión funcional de este tipo de polimerasas reparativas


167

y puede formar parte, junto con otros enzimas codificados por el virus, de un sistema de

reparación del tipo de excisión de base para eliminar bases modificadas en el DNA viral.

Por otra parte, se ha continuado con el estudio de genes virales implicados en el

control de la apoptosis y de la respuesta inmune. Se ha demostrado que el homólogo

viral del Bcl-2, que actúa como inhibidor de la apoptosis, interacciona con la proteína

celular pro-apoptótica Bax durante la infección, sugiriendo que la proteína viral lleva a

cabo su función anti-apoptótica por un mecanismo similar al del Bcl-2 celular, que tam-

bién heterodimeriza con Bax.

Previamente, se había demostrado que el homólogo viral del IkB celular, un inhi-

bidor de los factores de transcripción NFkB implicados en la expresión de genes de res-

puesta inmune, bloquea la activación de NFkB e inhibe la unión de éste al DNA . Dado

que los factores NFkB son dímeros constituídos por distintas subunidades que pueden

responder a diferentes estímulos e interaccionar con distintas secuencias en el DNA, se

ha llevado a cabo un estudio de las subunidades NFkB que interaccionan con el IkB del

VPPA. Estos estudios han demostrado que el IkB viral, como el IkB-α celular, inte-rac-

ciona con heterodímeros p50-p65, que es el complejo NFkB que se induce más frecuen-

temente en una gran variedad de sistemas celulares.

Estudio de la interacción del ligando del virus con receptores celulares

El estudio de la interacción ligando-receptor puede conducir al descubrimiento

de nuevas terapias para la prevención o tratamiento de la enfermedad, mediante un

bloqueo específico del primer paso en el ciclo infectivo. Se ha iniciado, por tanto, una

caracterización de los receptores celulares para el VPPA mediante el tratamiento de la

superficie celular con distintos enzimas y lectinas. Los resultados indican que el recep-

tor es de naturaleza proteica y que en la unión del virus a la membrana celular no par-

ticipan carbohidratos ni lípidos .

Morfogénesis del VPPA

Con el fin de estudiar la función de proteínas virales, se ha desarrollado un méto-

do para la generación de recombinantes del VPPA que expresan de una manera indu-

cible genes del virus. El análisis por microscopía electrónica de células infectadas con

un virus recombinante que expresa induciblemente la proteína mayoritaria de la cápsi-

168

da p72 ha permitido demostrar que la acumulación progresiva de la cápsida sobre

estructuras membranosas precursoras conduce al ensamblaje de las partículas virales.

Otros estudios de microscopía electrónica indican que la envuelta interna del VPPA

está constituida por una cisterna colapsada, con dos membranas, derivada del retículo

endoplasmático.

Emigración de mitocondrias a los sitios de ensamblaje del VPPA

En células infectadas con el VPPA, se ha observado la presencia de grandes acú-

mulos de mitocondrias en la periferia de factorías virales que contienen partículas en

formación. Estas mitocondrias presentan la morfología ultraestructural característica de

orgánulos respirando activamente, mientras que la mayoría de las mitocondrias de

células no infectadas tienen la ultraestructura correspondiente al estado de reposo.

Estas observaciones son consistentes con un papel de las mitocondrias que rodean a las

factorías virales en proporcionar la energía que probablemente se requiere para los

complejos procesos morfogenéticos del virus. Estos acúmulos mitocondriales se origi-

nan por una emigración masiva de las mitocondrias a las factorías virales, estando

implicados en este transporte los microtúbulos del citoesqueleto celular. El fenómeno

de emigración mitocondrial que se observa en la célula infectada por VPPA hace de ella

un sistema muy adecuado para estudiar los mecanismos implicados en el movimiento

de las mitocondrias en células de mamífero.

Research Summary

Study of the function of viral genes

The function of African swine fever virus (ASFV) genes encoding proteins with

sequence homology to other proteins in the databases is being studied. The protein

encoded by one of these genes has been characterized as a trans-prenyltransferase

catalyzing the synthesis of the isoprenoid compound geranylgeranyl diphosphate,

which could serve as a substrate for the prenylation of viral or cellular proteins, thus

regulating their function during the infection.

ASFV also encodes a novel DNA polymerase of only 20 kDa belonging to the X

family of DNA polymerases that includes the polymerases involved in DNA repair. The

169

reparative DNA polymerase of ASFV is a monomeric and highly distributive enzyme

that conserves the most critical residues involved in DNA and nucleotide binding, as

well as in catalysis of the polymerization reaction. This DNA polymerase represents the

minimal functional version of this type of reparative polymerases and may constitute,

together with other virus-encoded enzymes, a base excision repair system to eliminate

modified bases in the viral DNA.

On the other hand, the study of viral genes involved in the control of apoptosis

and the immune response has been continued. It has been shown that the viral homo-

logue of Bcl-2, which is an inhibitor of apoptosis, interacts with the cellular pro-apop-

totic protein Bax during infection, suggesting that the viral protein performs its anti-

apoptotic function by a mechanism similar to that of the cellular Bcl-2, which also hete-

rodimerizes with Bax.

It had been previously shown that the viral homologue of cellular IkB, an inhibitor of

transcription factors NFkB involved in the expression of immune response genes, inhibits

the binding of NFkB to DNA and prevents the activation of NFkB. Since NFkB factors are

dimers of variable subunits, recognizing different DNA targets or responding to different

stimuli, an study of the NFkB subunits that interact with the virus IkB has been carried out.

These studies have shown that the viral IkB, as the cellular IkB-α, interacts with p50-p65

heterodimers, which is the most commonly induced NFkB complex in many cell systems.

Study of the interaction of the virus ligand with cell receptors

The study of the ligand-receptor interaction could lead to new therapies for pre-

vention or treatment of the disease, by specifically blocking the first step in the infection

cycle. Therefore, a characterization of the cell receptor for ASFV has been initiated by

treatment of the cell surface with different enzymes and lectins. The results indicate that

the receptor is composed of protein, with no carbohydrates or lipids involved in the

virus attachment to the cellular membrane.

ASFV morphogenesis

In order to study the function of viral proteins, a method has been developed for

the generation of recombinant ASFV that inducibly express virus genes. An analysis by

electron microscopy of cells infected with a recombinant virus inducibly expressing the

170

major capsid protein p72 has allowed to demonstrate that the progressive building of the

capsid on precursors membranous structures leads to the assembly of the virus particles.

Other electron microscopic studies indicate that the inner envelope of ASFV is constitu-

ted by a two-membraned collapsed cisterna derived from the endoplasmic reticulum.

Migration of mitochondria to ASFV assembly sites

The presence of large clusters of mitochondria in the periphery of viral factories

containing assembling particles has been observed in cells infected with ASFV. These

mitochondria present the ultrastructural morphology characteristic of actively respi-

ring organelles, while most of the mitochondria of uninfected cells have the ultrastruc-

ture corresponding to the resting state. These observations are consistent with a role for

the mitochondria that surround the viral factories in providing the energy that is pro-

bably necessary for the complex morphogenetic process of ASFV. These mitochondrial

accumulations are originated by a massive migration of the mitochondria to the viral

factories, being involved in this transport the microtubules of the cell cytoskeleton. The

phenomenon of mitochondrial migration observed in the ASFV-infected cell makes of

this cell a most suitable system to study the mechanisms involved in the movement of

mitochondria within the mammalian cell.


� Andrés, G., Simón-Mateo, C. and Viñuela, E. Assembly of African swine fever

virus: Role of polyprotein pp220. J. Virol. 71, 2331-2341 (1997).

� Revilla, Y., Cebrián, A., Baixerás, E., Martínez-A., C., Viñuela, E. and Salas, M.L.

Inhibition of apoptosis by the African swine fever virus Bcl-2 homologue: Role of

the BH1 domain. Virology 228, 400-404 (1997).

� Martínez-Pomares, L., Simón-Mateo, C., López-Otín, C. and Viñuela, E.

Characterization of the African swine fever virus structural protein p14.5: A DNA

binding protein. Virology 229, 201-211 (1997).

� Alejo, A., Yáñez, R., Rodríguez, J.M., Viñuela, E. and Salas, M.L. African swine

fever virus trans-Prenyltransferase. J. Biol. Chem. 272, 9417-9423 (1997).

171

� Simón-Mateo, C., Andrés, G., Almazán, F. and Viñuela, E. Proteolytic processing

in African swine fever virus: evidence for a new structural polyprotein, pp62. J.

Virol. 71, 5799-5804 (1997).

� Alonso, F., Domínguez, J., Viñuela, E. and Revilla, Y. African swine fever virus-

specific cytotoxic T lymphocytes recognize the 32 kDa immediate early protein

(vp32). Virus Res. 49, 123-130 (1997).

� Galindo, I., Viñuela, E. and Carrascosa, A.L. Protein cell receptors mediate the

saturable interaction of African swine fever virus attachment protein p12 with the

surface of permissive cells. Virus. Res. 49, 193-204 (1997).

� Oliveros, M., Yáñez, R.J., Salas, M.L., Salas, J., Viñuela, E. and Blanco L.

Characterization of an African swine fever virus 20kDa-DNA polymerase invol-

ved in DNA repair. J. Biol. Chem. 272, 30899-30910 (1997).

� Revilla, Y., Callejo, M., Rodríguez, J. M., Culebras, E., Nogal, M. L., Salas, M. L.,

Viñuela, E., and Fresno, M. Inhibition of nuclear factor kB activation by a virus-

encoded IkB-like protein. J. Biol. Chem. 273, 5405-5411 (1998).

� García-Escudero, R., Andrés, G., Almazán, F. and Viñuela, E. Inducible gene

expression from African swine fever virus recombinants: analysis of the major

capsid protein p72. J. Virol. 72, 3185-3195 (1998).

� Andrés, G., García-Escudero, R., Simón-Mateo, C. and Viñuela, E. African swine

fever virus is enveloped by a two-membraned collapsed cisterna derived from the

endoplasmic reticulum. J. Virol. 72, 8988-9001 (1998).

� Rojo, G., Chamorro, M., Salas, M. L., Viñuela, E., Cuezva, J. M., and Salas, J.

Migration of mitochondria to viral assembly sites in African swine fever virus-

infected cells. J. Virol. 72, 7583-7588 (1998).

� Baixeras, E., Cebrián, E., Albar, J.P., Salas, J., Martínez-A., C., Viñuela, E. and

Revilla, Y. Vaccinia virus-induced apoptosis in immature B lymphocytes: role of

cellular Bcl-2. Virus Res. 58, 107-113 (1998).

172


Eladio Viñuela

� Placa de la Sociedad Española de Virología (1997).

� Premio a los Valores Humanos del Grupo Correo de Comunicación (1998).

inmunología y virología immunology and virologyotros estudios que se estÆn realizando consisten...

Documents