introduction sur pcr, clonage et séquençage sébastien tempel umr ecobio 6553, symbiose irisa

Introduction sur PCR, Introduction sur PCR, Clonage et Clonage et

SéquençageSéquençage

Sébastien TempelSébastien TempelUMR EcoBio 6553, Symbiose IrisaUMR EcoBio 6553, Symbiose Irisa

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RappelsRappels– Historique de la biologie moléculaire.Historique de la biologie moléculaire.– Notion de biologie.Notion de biologie.

La PCRLa PCR– Ses buts, sa technique.Ses buts, sa technique.

Les méthodes de ClonageLes méthodes de Clonage– Les vecteurs de clonage.Les vecteurs de clonage.– Exemple d’un BAC.Exemple d’un BAC.

Le séquençageLe séquençage– Nucléotidique : méthode de Sanger.Nucléotidique : méthode de Sanger.– Protéique : méthode Edman.Protéique : méthode Edman.

ConclusionConclusion

33






44

Rappels historiquesRappels historiques

1869 - F. 1869 - F. MiescherMiescher : substance dans les noyaux : : substance dans les noyaux : l’ADN.l’ADN.

1896 - G. Mendel : lois de l’hérédité.1896 - G. Mendel : lois de l’hérédité. 1910 - T. Morgan : chromosomes portent les gènes1910 - T. Morgan : chromosomes portent les gènes 1930 - W. Astbury : structure filamenteuse de 1930 - W. Astbury : structure filamenteuse de

l’ADN.l’ADN. 1944 - O. Avery : lien entre l’hérédité et l’ADN 1944 - O. Avery : lien entre l’hérédité et l’ADN 1953 - J. Watson et F. Crick : double hélice de 1953 - J. Watson et F. Crick : double hélice de

l’ADN.l’ADN. 1955 - F. Sanger : séquençage de l’insuline1955 - F. Sanger : séquençage de l’insuline 1962 - J. Monod et F. Jacob : ARNm intermédiaire 1962 - J. Monod et F. Jacob : ARNm intermédiaire

ADN-protéineADN-protéine

55

Rappels historiquesRappels historiques

1968 - M. Nirenberg, G. Khorana et R. Holley : code 1968 - M. Nirenberg, G. Khorana et R. Holley : code génétiquegénétique

1970 : M. Temin, D. Baltimore : identification de la 1970 : M. Temin, D. Baltimore : identification de la reverse transcriptase.reverse transcriptase.

1975 - E.M. Southern : Méthode de séquençage des 1975 - E.M. Southern : Méthode de séquençage des nucléotidesnucléotides

1978 - 1978 - W. Arber, D. Nathans, H. Smith W. Arber, D. Nathans, H. Smith : Identification : Identification des endonucléases.des endonucléases.

1978 : Premier génome séquencé (virus 1978 : Premier génome séquencé (virus SV40SV40 de de 5kb).5kb).

1983 - K. Mullis : invention de la PCR. 1983 - K. Mullis : invention de la PCR. 1995 : Premier procaryote séquencé : 1995 : Premier procaryote séquencé : Haemophilus Haemophilus

influenzae.influenzae. 15 avril 2003 : Séquençage génome humain terminé.15 avril 2003 : Séquençage génome humain terminé.

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77

Notion de biologieNotion de biologievirus, cellules, organellesvirus, cellules, organelles

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1212

Notion de biologieNotion de biologieADN et ARNADN et ARN

ADN : Acide DésoxyriboNucléiqueADN : Acide DésoxyriboNucléique Rôle de l’ADN : pérenniser de génération en Rôle de l’ADN : pérenniser de génération en

génération les informations de l’organisme.génération les informations de l’organisme.

Localisation de l’ADNLocalisation de l’ADN : : – Virus à ADN : intérieur de la capsideVirus à ADN : intérieur de la capside– Procaryote : chromosome circulaire, plasmideProcaryote : chromosome circulaire, plasmide– Eucaryote : Eucaryote :

Cellule végétale : chromosome, mitochondrie, chloroplaste …Cellule végétale : chromosome, mitochondrie, chloroplaste … Cellule animale : chromosome, mitochondrie …Cellule animale : chromosome, mitochondrie …

1313


1414

Notion de biologie Notion de biologie ADN et ARNADN et ARN

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ARN : Acide RiboNucléiqueARN : Acide RiboNucléique

Rôles de l’ARN : même que celui de l’ADN dans les Rôles de l’ARN : même que celui de l’ADN dans les virus à ARN, intermédiaire entre l’information virus à ARN, intermédiaire entre l’information portée par l’ADN et son expression par les portée par l’ADN et son expression par les protéines …protéines …

Localisation de l’ARN : Localisation de l’ARN : – ARNm présent partout dans les cellules eucaryotes et ARNm présent partout dans les cellules eucaryotes et

procaryotes.procaryotes.– ARNr et ARNt présents dans les organelles où est localisé ARNr et ARNt présents dans les organelles où est localisé

l’ADN.l’ADN.

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1717

Notion de biologieNotion de biologieAcide AminéAcide Aminé

1818

Notion de biologieNotion de biologie ProtéineProtéine

Structure primaire : séquence d’acide Structure primaire : séquence d’acide aminé.aminé.

Structure secondaire : hélice alpha, feuillet Structure secondaire : hélice alpha, feuillet bêta, pont disulfure.bêta, pont disulfure.

Structure tertiaire : suite de structure Structure tertiaire : suite de structure primaire et secondaire.primaire et secondaire.

Structure quaternaire : association de Structure quaternaire : association de structure tertiaire structure tertiaire – Ex : tétramère d’hémoglobine, insuline...Ex : tétramère d’hémoglobine, insuline...

1919

Notion de biologieNotion de biologieProtéineProtéine

2020


2121


2222


2323

Notion de biologieNotion de biologie

2424






2525

PCRPCRPolymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction

But de la PCR :But de la PCR :– Amplification d’ADN.Amplification d’ADN.– Base pour différentes techniques de biologie moléculaire Base pour différentes techniques de biologie moléculaire

:: Séquençage Séquençage Amplification de l’ADN pour le clonageAmplification de l’ADN pour le clonage mutation ponctuellemutation ponctuelle « differential display »« differential display » préparation d’ADNc « RT-PCR »préparation d’ADNc « RT-PCR » détermination de polymorphisme entre génomes (RFLP…)détermination de polymorphisme entre génomes (RFLP…) ……..

2727






2828

Clonage de séquencesClonage de séquences

Vecteur de clonage :Vecteur de clonage :– Plasmide bactérien ( 3-4 kb )Plasmide bactérien ( 3-4 kb )– Phage Phage λλ ( 9-22 kb )( 9-22 kb )– Cosmide ( Cosmide ( ≈ ≈ 45 kb )45 kb )– PAC : P1-derived Artificial Chromosome ( 75-95 PAC : P1-derived Artificial Chromosome ( 75-95

kb )kb )– BAC : Bacterial Artificial Chromosome ( 100-350 BAC : Bacterial Artificial Chromosome ( 100-350

kb )kb )– YAC : Yeast Artificial Chromosome ( 300-500 kb )YAC : Yeast Artificial Chromosome ( 300-500 kb )

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3030


Structure du BAC :Structure du BAC :– oriS : origine de oriS : origine de

réplicationréplication– repE : maintient du repE : maintient du

nombre de plasmide à 1 nombre de plasmide à 1 ou 2 par cellule.ou 2 par cellule.

– parA, parB : stabilité du parA, parB : stabilité du plasmide, plasmide, incompatibilité avec les incompatibilité avec les autres facteurs F.autres facteurs F.

– CMCMRR : gène de : gène de résistance au résistance au chloramphénicol.chloramphénicol.

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Structure du BAC :Structure du BAC :– Site de clonage dans le Site de clonage dans le

gène LacZ.gène LacZ.– T7 et SP6 : promoteurs T7 et SP6 : promoteurs

forts de bactériophage.forts de bactériophage.– NotI, HindIII, BamHI : NotI, HindIII, BamHI :

site de reconnaissance site de reconnaissance des endonucléases. des endonucléases.

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Digestion du vecteur et de l’ADN à cloner par HindIII.Digestion du vecteur et de l’ADN à cloner par HindIII. Sélection de l’ADN >150kb par électrophorèse.Sélection de l’ADN >150kb par électrophorèse.

3333


Transformation de Transformation de E.coliE.coli par électroporation : par électroporation :– Les bactéries à transformer doivent être en phase Les bactéries à transformer doivent être en phase

exponentielle de croissance.exponentielle de croissance.– Le courant traverse les membranes des E.coli formant Le courant traverse les membranes des E.coli formant

des pores sur les membranes.des pores sur les membranes.– Les macromolécules chargées (comme les vecteurs) Les macromolécules chargées (comme les vecteurs)

pénètrent par les pores des bactéries.pénètrent par les pores des bactéries.– L’intensité et la durée du champ électrique doivent être L’intensité et la durée du champ électrique doivent être

précises:précises: Si trop faible les pores seront trop petits pour laisser entrer les Si trop faible les pores seront trop petits pour laisser entrer les

vecteurs.vecteurs. Si trop fort, les pores ne pourront pas se refermer tuant ainsi la Si trop fort, les pores ne pourront pas se refermer tuant ainsi la

cellule.cellule.

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Étalement des colonies sur un milieu contenant Étalement des colonies sur un milieu contenant du chloramphénicol, de IPTG et de l’X-Gal.du chloramphénicol, de IPTG et de l’X-Gal.– IPTG (isopropylthio-beta-D-galactoside) : sucre induisant IPTG (isopropylthio-beta-D-galactoside) : sucre induisant

la transcription du gène LacZ.la transcription du gène LacZ.– X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactoside) : X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactoside) :

sucre donnant une coloration bleue s’il est utilisé sucre donnant une coloration bleue s’il est utilisé (dégradé) par LacZ. (dégradé) par LacZ.

Bactérie avec le plasmide (BAC) donnera des Bactérie avec le plasmide (BAC) donnera des colonies :colonies :– Couleur bleue si le plasmide ne contient pas d’ADN Couleur bleue si le plasmide ne contient pas d’ADN

recombinant.recombinant.– Couleur blanche si le plasmide en contient.Couleur blanche si le plasmide en contient.

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SéquençageSéquençagenucléotide : méthode de Sangernucléotide : méthode de Sanger

ddNTP : analogues structuraux des dNTP.ddNTP : analogues structuraux des dNTP. ddNTP : incapables de réaliser une liaison ddNTP : incapables de réaliser une liaison

phosphodiester.phosphodiester. ADN polymérase incorpore dNTP ou ddNTP.ADN polymérase incorpore dNTP ou ddNTP.

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Liaison de l’amorce Liaison de l’amorce avec l’ADN à avec l’ADN à séquencer.séquencer.

La fixation des ddNTP La fixation des ddNTP aux brins d’ADN va aux brins d’ADN va créer des brins de créer des brins de différentes tailles.différentes tailles.

Les brins vont migrer Les brins vont migrer sur un gel sur un gel d’électrophorèse selon d’électrophorèse selon leur taille : le plus leur taille : le plus petit migre le plus petit migre le plus vite.vite.

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Automatisation de la méthode :Automatisation de la méthode :– Ajout sur les ddNTP de fluorochrome de différentes Ajout sur les ddNTP de fluorochrome de différentes

couleurs.couleurs.– 1 seul tube regroupant les ddNTP.1 seul tube regroupant les ddNTP.– Lecture par un laser des fragments qui migrent sur le Lecture par un laser des fragments qui migrent sur le

gel.gel.– Stockage des données dans la mémoire de l’ordinateur.Stockage des données dans la mémoire de l’ordinateur.

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SéquençageSéquençageprotéiqueprotéique

Si on possède l’ARNm :Si on possède l’ARNm :– Réalisation d’une RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) :Réalisation d’une RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) :

Transformation de l’ARNm en ADNc par la reverse Transformation de l’ARNm en ADNc par la reverse transcriptase.transcriptase.

PCR classique sur l’ADNc.PCR classique sur l’ADNc.

– Séquençage des nucléotides amplifiés par méthode de Séquençage des nucléotides amplifiés par méthode de SangerSanger

Si on ne possède que la protéine :Si on ne possède que la protéine :– Purification de la protéine par méthode de Purification de la protéine par méthode de

chromatographiechromatographie– Méthode d’Edman.Méthode d’Edman.

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SéquençageSéquençageprotéique : méthode d’Edmanprotéique : méthode d’Edman

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La PCRLa PCR– Ses buts, sa techniqueSes buts, sa technique




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introduction sur pcr, clonage et séquençage sébastien tempel umr ecobio 6553, symbiose irisa

Documents

biologie page

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biologie adn et arn

biologie virus

biologie adn et arn

biologie adn et arn

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biologie acide amin