manual bioquimica clinica_corregido julio 2013
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[Año]
Programa Educativo: Químico Farmacéutico
Biólogo
Manual de Prácticas de Bioquímica Clínica
Compiladores: M. en C. Rosa María De La A. Escalante Magaña
M. en C. Ligia Ma. Del C. Tolosa Mendoza
M. en C. Josefina Graciela Ancona León
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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CAMPECHE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO BIOLÓGICAS
PROGRAMA EDUCATIVO: QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA CLÍNICA
UNIDAD DE APRENDIZAJE: BIOQUÍMICA CLÍNICA
SEMESTRE: 5º
PERIODO ESCOLAR: AGOSTO / ENERO
HRS/SEM/MES: 6 HRS. COMPILADOR: M. EN C. ROSA MARÍA DE LA A. ESCALANTE MAGAÑA M. EN C. LIGIA MA. DEL C. TOLOSA MENDOZA M. EN C. JOSEFINA GRACIELA ANCONA LEÓN REVISIÓN: 01/2013.
CAMPECHE, CAM., JULIO 2013.
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DIRECTORIO
Lic. Adriana Ortíz Lanz
Rectoría
Lic. Gerardo Montero Pérez
Secretaria General
Mtra. María Guadalupe Maldonado Velázquez
Directora
Facultad de Ciencias Químico Biológicas
Mtro. Pedro Pablo Kú Pech
Coordinador
Licenciatura en Químico Farmacéutico Biólogo.
Mtra. Patricia Margarita Garma Quen
Presidente
Academia de Químico Farmacéutico Biólogo.
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PRESENTACIÓN
La Bioquímica es la ciencia que estudia las moléculas químicas que desempeñan
una función biológica. Gran parte de la historia de la investigación de esta ciencia
se ha realizado en torno a las enzimas. Muchas de ellas se han aislado en forma
pura y homogénea, y alrededor de unas 200 se han podido cristalizar.
Las enzimas son proteínas especialidad que realizan rápidamente múltiples
reacciones esenciales que hacen posible la vida en la tierra y de aquí su impacto
en numerosos campos de la ciencia biomédica. Los químicos se dedican
continuamente al estudio de estas biomoléculas ya que tienen la propiedad
especialmente notable de llevar acabo reacciones químicas con un rendimiento
del 100% en el laboratorio.
El presente manual de prácticas de laboratorio, se ha diseñado con la finalidad de
que el alumno, a través de experimentos sencillos con enzimas comprenda
muchos de los fenómenos bioquímicos que con frecuencia se ponen de
manifiesto en nuestro organismo y en la vida cotidiana. Y además con base en los
fundamentos teóricos que aprenda a interpretar los resultados obtenidos en el
laboratorio relacionándolos con su diario acontecer.
El manual consta de 8 prácticas de laboratorio; las cuales están estrechamente
vinculadas con el contenido teórico de la asignatura. Las primeras 5 prácticas
experimentales muestran los efectos de concentración tanto del sustrato como de
la enzima, tiempo de incubación, temperatura y pH sobre la velocidad de la
reacción enzimática. Las últimas 3 prácticas, se realiza una extracción previa de la
enzima así como la determinación de la actividad de amilasa salival, amilasa
pancreática y lipasa pancreática y las últimas están relacionadas con el
metabolismo de proteínas y ácidos nucleicos.
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Con respecto a las acciones de sustentabilidad, la Universidad Autónoma de
Campeche está comprometida profundamente con el ambiente, como se puede
observar en el Plan de Desarrollo Institucional 2008-2012 y en el Programa
Ambiental Institucional que cuenta con el Sistema de Gestión Ambiental basado en
la Norma ISO 14001:2004 que coordina todas las áreas de la institución para el
logro de los objetivos ambientales. Considerando lo anterior, los Programas
Educativos que comprendan prácticas de laboratorio que generen Residuos
Químicos y/o Peligrosos, Biológico Infecciosos (RPBI), deben promover la
sustentabilidad y la cultura ambiental, en la realización de las prácticas de
laboratorio.
Por ello, el presente manual comprende prácticas considerando los siguientes
criterios: utilización mínima de reactivos químicos, sustituir reactivos tóxicos por
otros menos tóxicos, empleo de técnicas de microescala y el manejo adecuado de
los residuos que se generan en las mismas. A través de los diagramas ecológicos
se muestra de forma esquemática el desarrollo de cada experimento. También se
considera la composición química esperada en cada etapa, el producto,
subproducto y residuos. De igual forma se explica el tratamiento recomendado
para los residuos y contribuyendo así en el cuidado de la salud y el medio
ambiente.
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COMPETENCIAS Y SUBCOMPETENCIAS DE LA UNIDAD DE APRENDIZAJE
QUÍMICA ORGÁNICA APLICADA.
COMPETENCIA DE LA UNIDAD DE APRENDIZAJE
Aplicar los principios del metabolismo de
biomoléculas para el desarrollo e interpretación de
técnicas experimentales de bioquímica clínica
enfocadas a la investigación clínica del estado
fisiológico del paciente y de productos naturales con
actividad farmacológica, siguiendo la metodología y
técnicas estandarizadas de la Bioquímica Clínica.
SUB-COMPETENCIAS
1. Usar los principios de cinética enzimática para
operar e interpretar técnicas enzimáticas de análisis
de muestras biológicas, fármacos, materias primas y
productos naturales basados en los fundamentos de
la bioquímica clínica.
2. Analizar las rutas metabólicas de los carbohidratos,
lípidos y proteínas para inferir los mecanismos de
acción de drogas y fármacos así como el estado
fisiológico de un organismo vivo, utilizando los
fundamentos de la Bioquímica Clínica.
3. Examinar muestras biológicas por medio de técnicas
enzimáticas e instrumentales de análisis para
evaluar las concentraciones de carbohidratos,
lípidos y proteínas, siguiendo métodos
estandarizados de análisis.
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ÍNDICE GENERAL SUBCOMPETENCIA 1 ......................................................................................................... 8
PRÁCTICA 1. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ...................................................................................... 8
PRÁCTICA 2. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN .................................................................................... 14
PRÁCTICA 3. EFECTO DEL TIEMPO DE INCUBACIÓN SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN .................................................................................................................... 20
PRÁCTICA 4. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN .................................................................................................................... 26
PRÁCTICA 5. EFECTO DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA ................................................................................................................. 32
SUBCOMPETENCIA 2 ....................................................................................................... 38
PRÁCTICA 6. EXTRACCIÓN DE AMILASA SALIVAL Y DETERMINACIÓN DE SU ACTIVIDAD ................................................................................................................... 38
PRÁCTICA 7. EXTRACCIÓN DE AMILASA PANCREÁTICA Y DETERMINACIÓN DE SU ACTIVIDAD ................................................................................................................... 42
PRÁCTICA 8. EXTRACCIÓN DE LIPASA PANCREÁTICA Y DETERMINACIÓN DE SU ACTIVIDAD ................................................................................................................... 47
BIBLIOGRAFIA .................................................................... ¡Error! Marcador no definido.
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SUBCOMPETENCIA 1
PRÁCTICA 1. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN
GENERALIDADES.
Las enzimas son proteínas especializadas en las reacciones catalíticas de los sistemas
biológicos. Un catalizador interviene en una reacción para que ésta ocurra más
rápidamente y una vez que la reacción se ha completado, queda tal como estaba al
principio. Poseen un elevado grado de especificidad respecto a sus sustratos acelerando
así sus reacciones químicas específicas.
La cinética de las reacciones catalizadas por la enzima está regulada por la ecuación de
MICHAELIS-MENTEN que presenta los efectos de la concentración del sustrato sobre los
índices de numerosas reacciones enzimáticas. La expresión matemática es:
Vo = Vmax [S]
Km + [S]
Km es la constante de MICHAELIS-MENTEN, la cual tiene las mismas dimensiones de la
concentración molar y es igual a un medio de la velocidad máxima, producida por la
concentración del sustrato.
La enzima ureasa, fue la primera enzima cristalizada en 1926 por James Summer, la ureasa
provino de la soya cuyo sustrato es la urea, y que al catalizarla produjo la hidrólisis de la
urea convirtiéndola a amoniaco y dióxido de carbono, demostrando así que estos cristales
estaban constituidos por proteínas.
La Figura 1 se muestra un complejo enzima-sustrato que ilustra las complementariedades
geométricas y físicas entre enzimas y sustratos.
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Figura 1. Complejo enzima-sustrato
Si las concentraciones del sustrato aumenta y las demás condiciones se mantienen
constantes, la velocidad de las reacciones catalizadas por las enzimas aumentan hasta un
máximo, los aumentos ulteriores en la concentración del sustrato no producen efectos
adicionales, probablemente porque se ha alcanzado el límite de velocidad de formación
de complejo enzima-sustrato y desde se momento la concentración de la enzima se
convierte en el factor limitante.
OBJETIVO.
Demostrar el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción, por
medio de la cinética enzimática, para conocer su variabilidad en una reacción enzima-
sustrato.
MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS.
MATERIAL Y EQUIPO
10 tubos de ensayo de 15 X 150 mm 2 pipetas graduadas de 10 mL 1 pipeta graduada de 5 mL 2 pipetas graduadas de 1 mL 10 matraces Erlenmeyer de 25 mL 2 vasos de precipitado de 50 mL 1 gotero 1 bureta graduada de 25 mL 1 piceta con agua destilada
1 propipeta 1 pinza para bureta 1 pinza para tubo de ensayo 1 soporte universal 1 gradilla 1 Cubrebocas 1 par de Guantes de látex 1 Googless Baño maría a 50ºC (POTE DE PELTRE)
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REACTIVOS
Enzima ureasa HgCl2 al 1% (veneno) Solución de urea 0.25 M (con 250 Mmolas/mL (reciente) Rojo de metilo como indicador (solución alcalina) Solución amortiguadora de pH 7.2 Solución de HCl 0.1 N (50 Mmoles de urea) TÉCNICA Precauciones: téngase cuidado en usar los tubos y todo el material de estos experimentos
bien lavados y enjuagados, pues si se queda Hg en ellos pueden inactivar a la enzima e
impedir la observación de los resultados.
Dispóngase una serie de tubos como sigue:
* Cantidad de urea de acuerdo a la muestra ** Cantidad de Sol. Buffer de acuerdo a la muestra de la cual va a ser testigo. T = testigo (o blanco) De la muestra 1- 5 todos deben tener un tubo como testigo.
NOTAS:
Mezclar el contenido del tubo después de agregar cada reactivo. El HgCl2 detiene
instantáneamente la acción de la ureasa y después de su adición no ocurre cambio
enzimático en el contenido de los tubos. Remojar los tubos en agua de la llave durante 15
min. Después del procedimiento anterior, antes de titular.
PROCEDIMIENTO
1. Con una pipeta graduada pásese 5mL del contenido del tubo T1 (blanco) a un
matraz Erlenmeyer de 25 mL.
2. Agregue 2 gotas del indicador rojo de metilo, que vira del amarillo en medio
alcalino, al rojo, en medio ácido tomando como punto final de la titulación
Procedimiento/tubos 1 2 3 4 5 Testigos Urea 0.25 M (mL) 0.5 1.0 2.0 5.0 7.5 * Sol. Buffer pH 7.2 (mL) 11.5 11.0 10.0 7.0 4.5 ** HgCl2 1% (gotas) - - - - - 4 Baño María 50ºC (5 min.) Ureasa (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Baño María 50ºC (30 min.) HgCl2 (gotas) 4 4 4 4 4 -
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cuando el contenido del matraz adquiera un color intermedio (canela) que
debe ser igual para todas las titulaciones de la serie.
3. Titule con HCl 0.1 N agregándole de la bureta poco a poco al mismo tiempo
que se mueve el matraz. Anótese los mL de HCl gastados que constituyen “la
titulación del blanco”.
4. Repita el procedimiento descrito en los incisos 1, 2 y 3 para los tubos 1, 2, 3,4 y
5, así como sus respectivos testigos (2, 3,4 y 5). Anote los mL de HCl 0.1N
gastados en cada caso.
5. Reste la titulación del blanco de cada uno de los valores obtenidos, haga una
tabla y grafique micromolas de urea descompuesta en 30 min. contra
micromolas de urea hidrolizadas. RESULTADOS IDEALES E INTERPRETACIÓN (ver en anexos el procedimiento de conversión a micromolas µmolas) Tubo Concentración inicial de
Urea en µmolas por mL en el
medio
Valores de titulación
corregidos
Micromolas de
urea hidrolizadas
1
2
3
4
5
CUESTIONARIO
1. ¿Cómo es la concentración del sustrato con respecto a la velocidad de
reacción?
2. ¿Qué relación existe entre la velocidad de reacción con la Km?
3. ¿Qué cuidados debemos tener en el momento de titular?
4. ¿Por qué titulamos después de llevada a cabo la reacción?
5. ¿Qué objetivo se pretende alcanzar en la Práctica No 1?
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TRATAMIENTO Y DISPOSICIÓN DE RESIDUOS.
Figura 1. Diagrama ecológico de la práctica efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción.
D1, D2: Mezclar los residuos de D1 y D2, y confinar para su posterior tratamiento.
3) Titular con HCl (0.1 N)
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2 + HCl + rojo de metilo
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2
5 mL. Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2
D1
D2
2) Baño María 50°C por 5
minutos
1) Baño María 50°C por 5 minutos
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2)
Ureasa
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa
4 gotas de HgCl2
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BIBLIOGRAFÍA
1. Quesada M.S. (2007). Manual de Experimentos de Laboratorio para Bioquímica. (1
ed.). San José, Costa Rica. Editorial Universidad Estatal a Distancia.
2. Flores, A.L. (2008). Manual de Prácticas de Bioquímica. (2 ed.). México: Mc Graw-
Hill / Interamericana.
14
SUBCOMPETENCIA 1
PRÁCTICA 2. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA
SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN
GENERALIDADES
Las enzimas son catalizadores extraordinarios. Los aumentos de velocidad
conseguidos por las enzimas son de 7 a 14 órdenes de magnitud.
La velocidad de una reacción es proporcional a la concentración de la enzima. Por lo
tanto, si el sustrato se encuentra siempre en concentraciones saturantes y medimos
la velocidad de reacción a distintas concentraciones de la enzima, obtendremos la
línea recta en nuestra gráfica.
La urea es el sustrato sobre el cual actúa la enzima ureasa: esta enzima posee una Km
(M) igual a 2.5 x 10-2, una constante de Kcat (1/S) igual a 1.0 x 104 esta constante es
también llamada número de recambio de una enzima.
Figura 3. Estructura de una enzima.
Figura 4. Complejo específico: enzima-sustrato
Enzima
Sustrato
Sitio activo
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Empleando una enzima purificada, la velocidad de la reacción a la concentración de la
enzima, dentro de un amplio margen de variación: en forma eventual la
concentración del sustrato o la acumulación de productos de reacción puede limitar
la velocidad.
OBJETIVO
Demostrar el efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la
reacción, por medio de la cinética enzimática, para conocer su variabilidad en una
reacción enzima-sustrato.
MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS.
MATERIAL Y EQUIPO
8 tubos de ensayo de 15 X 150 mm 4 pipetas graduadas de 10 mL 2 pipeta graduada de 5 mL 2 pipetas graduadas de 1 mL 8 matraces Erlenmeyer de 25 mL 2 vasos de precipitado de 50 mL 1 gotero 1 bureta graduada de 25 mL 1 piceta con agua destilada
1 propipeta 1 pinza para bureta 1 pinza para tubo de ensayo 1 soporte universal 1 gradilla 1 Cubrebocas 1 par de Guantes de látex 1 Googless Baño maría a 50ºC (POTE DE PELTRE)
REACTIVOS
Enzima ureasa HgCl2 al 1% (veneno) Solución de urea 0.25 M (con 250 Mmolas/mL (reciente) Rojo de metilo como indicador (solución alcalina) Solución amortiguadora de pH 7.2 Solución de HCl 0.1 N (50 Mmoles de urea)
TÉCNICA
Precauciones: téngase cuidado en usar los tubos y todo el material de estos
experimentos bien lavados y enjuagados, pues si se queda Hg en ellos pueden
inactivar a la enzima e impedir la observación de los resultados.
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Dispóngase una serie de tubos como sigue con un volumen total de 13.5 mL.
* Por cada tubo un blanco. ** Gotas de HgCl2 ***Dependiendo de la muestra es la cantidad de ureasa añadida al testigo correspondiente. Nota: Volumen Total de 13.5 mL PROCEDIMIENTO
1. Con una pipeta graduada pásese 5mL del contenido del blanco a un matraz
Erlenmeyer de 50 mL.
2. Agregue 2 gotas del indicador rojo de metilo, que vira del amarillo en medio
alcalino, al rojo, en medio ácido, tomando como punto final de la titulación
cuado el contenido del matraz adquiera el primer tono rojo, el cual perdure
durante 30 seg. sin cambio alguno.
3. Titule con HCl 0.1 N agregándole de la bureta poco a poco al mismo tiempo
que se mueve el matraz para mezclar perfectamente. Anótese los mL de
gastados que constituyen “la titulación Testigo 1”.
4. Repita el procedimiento descrito en los incisos 1, 2 y 3 para las muestras 2, 3, y
4. Anote los mL de HCL 0.1N gastados en cada caso.
5. Reste la titulación del testigo de cada uno de los valores obtenidos, haga una
tabla y grafique micromolas de urea hidrolizada contra mL de enzima
empleada en cada tubo.
RESULTADOS Tubo mL de
Ureasa
Valores de titulación
corregidos
Micromolas de urea
hidrolizadas.
1 2 3 4
Procedimiento/tubos 1 2 3 4 Testigos* Urea 0.25 M (mL) 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 Sol. Buffer pH 7.2 (mL) 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5 HgCl2 1% (gotas) - - - - 4** Agua destilada (mL) 1.5 1.0 0.5 0.0 Baño María 50ºC (5 min.) Ureasa (mL) 1.0 1.5 2.0 2.5 *** Baño María 50ºC (30 min.) HgCl2 (gotas) 4 4 4 4 -
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CUESTIONARIO 1. ¿Qué factores pueden afectar la velocidad de reacción en forma eventual?
2. ¿Qué pasaría si en los experimentos añadiéramos 10 gotas de HgCl2 en vez de
4? 3. ¿Qué pasa, si en nuestro material existen residuos de HgCl2 y por qué? 4. ¿Qué objetivo se prende alcanzar en la Práctica No 2?
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TRATAMIENTO Y DISPOSICIÓN DE RESIDUOS.
Figura 5. Diagrama ecológico de la práctica efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción.
D1, D2: Mezclar los residuos de D1 y D2, y resguardar para su posterior tratamiento.
3) Titular con HCl (0.1 N)
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2 + HCl + rojo de metilo
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2
5 mL. Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2
D1
D2
2) Baño María 50°C por 5
1) Baño María 50°C por 5 minutos
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2)
Ureasa
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa
4 gotas de HgCl2
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BIBLIOGRAFÍA
1. Quesada M.S. (2007). Manual de Experimentos de Laboratorio para Bioquímica.
(1 ed.). San José, Costa Rica. Editorial Universidad Estatal a Distancia.
2. Flores, A.L. (2008). Manual de Prácticas de Bioquímica. (2 ed.). México: Mc
Graw-Hill / Interamericana.
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SUBCOMPETENCIA 1
PRÁCTICA 3. EFECTO DEL TIEMPO DE INCUBACIÓN SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN
GENERALIDADES
La manera más usual de medir la velocidad de una enzima es incubar la preparación
enzimática, generalmente de 37- 50ºC por periodos variables de tiempo y medir el
producto de la reacción en enzimática en un tiempo dado. Si la reacción es lineal en
el tiempo, hasta un periodo determinado, se puede expresar la cantidad enzimática
en términos de velocidad, o sea la cantidad de producto formado por unidad de
tiempo de incubación.
La velocidad de reacción se expresa generalmente como micromolas de producto
formado por minuto, aunque cualquier otra expresión es correcta, si los valores se
toman dentro de la linealidad de la reacción.
Las razones de que la gráfica de resultados no sea indefinidamente lineal son varias:
1. Que la reacción haya alcanzado su equilibrio.
2. Que la enzima empiece a desnaturalizarse al cabo de cierto tiempo y pierda
su actividad.
3. Que el producto de la reacción tenga un efecto inhibitorio sobre la actividad
de la enzima, de modo que esta disminuye cuando el producto llega a cierta
concentración.
Figura 6. Comportamiento de la velocidad de la reacción enzimática.
Medida de la actividad
enzimática a diferentes tiempos de incubación
Y
X
Y/X = velocidad Y/X = cantidad de producto formado/tiempo. Y/X = velocidad.
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A concentraciones óptimas de enzima y sustrato y si no hay factores de interferencia
(como la acumulación de productos de reacción), la actividad enzimática es
proporcional al tiempo de incubación.
OBJETIVO
Demostrar cómo influye el tiempo de incubación sobre la velocidad de la reacción,
por medio de la cinética enzimática, para conocer su variabilidad en una reacción
enzima-sustrato.
MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS.
MATERIAL Y EQUIPO
4 tubos de ensayo de 15 X 150 mm 4 pipetas graduadas de 10 mL 4 pipeta graduada de 5 mL 2 pipetas graduadas de 1 mL 6 matraces Erlenmeyer de 25 mL 2 vasos de precipitado de 50 mL 1 gotero 1 bureta graduada de 25 mL 1 piceta con agua destilada
1 propipeta 1 pinza para bureta 1 pinza para tubo de ensayo 1 soporte universal 1 gradilla 1 Cubrebocas 1 par de Guantes de látex 1 Googless Baño maría a 50ºC (POTE DE PELTRE)
REACTIVOS
Enzima ureasa HgCl2 al 1% (veneno) Solución de urea 0.25 M (con 250 Mmolas/mL (reciente) Rojo de metilo como indicador (solución alcalina) Solución amortiguadora de pH 7.2 Solución de HCl 0.1 N (50 Mmoles de urea)
TÉCNICA
Precauciones: téngase cuidado en usar los tubos y todo el material de estos experimentos
bien lavados y enjuagados, pues si se queda Hg en ellos pueden inactivar a la enzima e
impedir la observación de los resultados.
Dispóngase una serie de tubos como sigue con un volumen total de 13.0 mL
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Procedimiento 1 2*
Urea 0.25 M (mL) 7.5 7.5 Sol. Buffer pH 7.2 (Ml) 4.5 4.5 Agua destilada (ml) 0.0 1.0 Baño María 50ºC (5 min.) Ureasa (mL) 1.0 0.0
* Testigo
A partir del tiempo de acción de la ureasa, transcurridos 10 min., se extraen 3 mL del
contenido de cada uno de los tubos y se pasan a un matraz Erlenmeyer de 25 mL que
contenga 4 gotas de HgCl2 al 1%, cuando los 3 mL procedan del tubo 1, y un matraz de
Erlenmeyer vacio para el tubo 2 (testigo).
Se titula a los 20 min., se repite el proceso a los 30 min., se hace la tercera titulación. La
titulación es de la forma acostumbrada. Realizar por duplicado.
A los resultados calcule las micromolas de urea hidrolizada a cada tiempo de análisis.
Admitiendo que las concentraciones de enzima y sustrato son óptimas, es posible considerar
la reacción como monomolecular y en tal caso la constante de velocidad por la fórmula:
K = 1/t log a/(a-x)
En donde: t = es el tiempo en minutos, a = concentración de urea inicial (sustrato) expresada
como 100%, x = cantidad de urea hidrolizada en %.
1. Determinar k para los tres tiempos de la reacción.
2. Haga una tabla y grafique: log a/(a-x) contra tiempo y micromolas de urea
hidrolizada contra tiempo.
RESULTADOS
Tiempo de
incubación
Tubo mL de Ureasa Micromolas de urea
hidrolizadas.
k
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CUESTIONARIO 1. ¿Cuáles son las condiciones mínimas para trabajar en el laboratorio con un
buen control de calidad?
2. ¿Qué importancia tiene el cloruro de mercurio en esta práctica? 3. ¿Por qué la cantidad de urea hidrolizada es proporcional al tiempo de
incubación?
4. ¿Cómo debe ser la gráfica que se obtiene?
5. ¿Qué objetivo se alcanzó en ésta práctica?
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TRATAMIENTO Y DISPOSICIÓN DE RESIDUOS.
Figura 7. Diagrama ecológico de la práctica efecto del tiempo de incubación sobre
la velocidad de la reacción. D1, D2: Mezclar los residuos de D1 y D2, y resguardar para su posterior tratamiento.
3) Titular con HCl (0.1 N)
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2 + HCl + rojo de metilo
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2
5 mL. Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2
D1
D2
2) Baño María 50°C por 5
1) Baño María 50°C por 5 minutos
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2)
Ureasa
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa
4 gotas de HgCl2
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BIBLIOGRAFÍA
1. Quesada M.S. (2007). Manual de Experimentos de Laboratorio para Bioquímica.
(1 ed.). San José, Costa Rica. Editorial Universidad Estatal a Distancia.
2. Flores, A.L. (2008). Manual de Prácticas de Bioquímica. (2 ed.). México: Mc
Graw-Hill / Interamericana.
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SUBCOMPETENCIA 1
PRÁCTICA 4. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN
GENERALIDADES
Las enzimas son los catalizadores de naturaleza proteica de la biosfera, las cuales rompen o
forman enlaces covalentes en los sustratos sobre los cuales actúan.
Al igual que ocurre con la mayoría de las reacciones químicas, la velocidad de las reacciones
catalizadas por enzimas se incrementan en general con la temperatura, dentro del intervalo
en que la enzima es estable y permanece totalmente activa.
La velocidad de muchas reacciones enzimáticas se duplica, aproximadamente, por cada 10ºC
de aumento de la temperatura (Q10 = 2.0). Sin embargo el coeficiente de temperatura Q10
varia algo, de una enzima a otra según la energía de activación (barrera de energía), de la
reacción catalizada; que después de excederla se rompen los enlaces débiles de hidrógeno e
hidrófobos llegando así a una desnaturalización (pérdida irreversible de la enzima).
Las enzimas presentan este proceso con una marcada fragilidad térmica a temperaturas
cercanas a los 55ºC o más, perdiendo así su estructura terciaria, y como consecuencia se
alteran los sitios alostéricos e isostéricos. Como consecuencia del proceso anterior para casi
todas las enzimas muestran una temperatura óptima de acción igual o mayor a las
temperaturas de las células en las que se encuentran. A temperatura bajas se inactivan pero
recuperan su actividad a temperatura ambiente, sin perder su estructura terciaria.
A temperaturas muy bajas la acción enzimática se reduce hasta ser nula y al aumentar la
temperatura también lo hace la velocidad de la reacción y al mismo tiempo la velocidad de
desnaturalización de la enzima (proteína hasta su destrucción total probablemente a
coagulación por el calor).
El punto de equilibrio entre estos procesos, aumenta de velocidad de la reacción por la
temperatura y desnaturalización en los que constituye la temperatura óptima de acción
enzimática que es alrededor de 37ºC para las de origen animal y un poco más alto 50ºC
para las procedentes de tejidos vegetales.
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Se conoce con el nombre de reacción de Vant’Hoff o coeficiente de temperatura Q10, la
proporción en que aumenta la actividad enzimática por cada 10ºC de temperatura.
Figura 5. Desnaturalización de una enzima.
OBJETIVO
Demostrar cómo influye la temperatura sobre la velocidad de la reacción, por medio de la
cinética enzimática, para conocer su variabilidad en una reacción enzima-sustrato.
MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS.
MATERIAL Y EQUIPO
8 tubos de ensayo de 15 X 150 mm 4 pipetas graduadas de 10 mL 4 pipeta graduada de 5 mL 2 pipetas graduadas de 1 mL 8 matraces Erlenmeyer de 25 mL 2 vasos de precipitado de 50 mL 1 gotero 1 bureta graduada de 25 mL 1 piceta con agua destilada 1 propipeta
1 pinza para bureta 1 pinza para tubo de ensayo 1 soporte universal 1 gradilla 1 Cubrebocas 1 par de Guantes de látex 1 Googless Baño maría a 50ºC (POTE DE PELTRE) Baño de hielo
REACTIVOS
Enzima ureasa HgCl2 al 1% (veneno) Solución de urea 0.25 M (con 250 Mmolas/mL (reciente) Rojo de metilo como indicador (solución alcalina) Solución amortiguadora de pH 7.2 Solución de HCl 0.1 N (50 Mmoles de urea)
Arrollamiento al azar
Desnaturalización IRREVERSIBLE
(INACTIVA)
Estructura terciaria
Estructura
primaria
28
TÉCNICA
Precauciones: téngase cuidado en usar los tubos y todo el material de estos experimentos
bien lavados y enjuagados, pues si se queda Hg en ellos pueden inactivar a la enzima e
impedir la observación de los resultados.
Dispóngase una serie de tubos como sigue:
Procedimiento 1 2 3 4 Testigo*
Urea 0.25 M (mL) 0.5 1.0 2.0 5.0 7.5
Sol. Buffer pH 7.2 (mL) 11.5 11.0 10.0 7.0 4.5
Baño María ºC (5 min.) 0º 22º 50º 80º **
Ureasa (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Baño María 50ºC (30 min.) 0º 22º 50º 80º ***
HgCl2 gotas 4 4 4 4 -
Volumen total 12. 5 mL * Testigo para cada muestra ** Temperatura de cada tubo y en seguida 4 gotas de cloruro mercúrico al 1 %. ***Temperatura de cada tubo
La titulación es de forma acostumbrada como en las prácticas anteriores.
Hágase una tabla y grafique las micromolas de urea hidrolizada contra
temperatura y calcule para distintos intervalos de temperatura entre 10º y 20ºC
entre 20º y 30ºC, etc.
RESULTADOS
Tiempo de
incubación
Tubo mL de
Ureasa
Valores de titulación
corregidos
Micromolas de
urea hidrolizada
29
CUESTIONARIO
1. ¿Por qué se desnaturalizan las enzimas?
2. ¿Cómo es la actividad enzimática a 3ºC?
3. ¿Qué pasaría en esta práctica si no utilizo para nada el cloruro mercúrico?
4. ¿A qué temperatura actúa idealmente la enzima ptialina?
5. ¿Qué objetivo se pretende alcanzar en la práctica número cuatro?
6. ¿Por qué en la gráfica se obtiene una campana de gauss y explíquela?
30
TRATAMIENTO Y DISPOSICIÓN DE RESIDUOS.
Figura 8. Diagrama ecológico de la práctica efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reacción.
D1, D2: Mezclar los residuos de D1 y D2, y resguardar para su posterior tratamiento.
3) Titular con HCl (0.1 N)
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2 + HCl + rojo de metilo
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2
5 mL. Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2
D1
D2
2) Baño María 50°C por 5
1) Baño María 50°C por 5 minutos
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2)
Ureasa
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa
4 gotas de HgCl2
31
BIBLIOGRAFÍA
1. Quesada M.S. (2007). Manual de Experimentos de Laboratorio para Bioquímica.
(1 ed.). San José, Costa Rica. Editorial Universidad Estatal a Distancia.
2. Flores, A.L. (2008). Manual de Prácticas de Bioquímica. (2 ed.). México: Mc
Graw-Hill / Interamericana.
32
SUBCOMPETENCIA 1
PRÁCTICA 5. EFECTO DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA
GENERALIDADES
La mayoría de las enzimas poseen un pH entre 5 y 9 al cual por debajo o por encima de ese
intervalo de pH la actividad disminuye, también posee un pH característico al cual su
actividad es la máxima. Al ser solo activas las enzimas en el intervalo antes mencionado, esto
es resultado de los efectos del pH sobre una combinación de factores:
1. La fijación del sustrato a la enzima.
2. La actividad catalítica de la enzima.
3. La ionización del sustrato y
4. La variación de la estructura proteica (normalmente, solo significa a pH extremos)
La Figura 5 nos muestra una enzima a pH óptimo y uno elevado.
Figura 9. Comportamiento ácido-base de una enzima.
La forma de la curva de pH óptimo está determinada por:
1. Desnaturalización de la enzima a pH altos o bajos.
2. Alteraciones en el estado de carga de la enzima y/o sustrato.
3. pH óptimo de la enzima.
4. Cambio a una concentración más activa o inactiva.
5. Efectos anteriores combinados.
33
Figura 10. Curva de actividad en función del pH de algunas enzimas.
Los cambios extremos en el pH suelen causar la destrucción de la enzima por posible
desnaturalización pero cuando se modifica el pH dentro de límites discretos la actividad de
la enzima varía desde un punto óptimo disminuyendo hacia ambos lados de la zona hasta la
inactivación completa.
OBJETIVO
Demostrar cómo influye el pH sobre la velocidad de la reacción catalítica, por medio de la
cinética enzimática, para conocer su variabilidad en una reacción enzima-sustrato.
MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS.
MATERIAL Y EQUIPO
10 tubos de ensayo de 15 X 150 mm 5 pipetas graduadas de 10 mL 1 pipeta graduada de 5 mL 2 pipetas graduadas de 1 mL 5 matraces Erlenmeyer de 25 mL 2 vasos de precipitado de 50 mL 1 gotero 1 bureta graduada de 25 mL 1 piceta con agua destilada
1 propipeta 1 pinza para bureta 1 pinza para tubo de ensayo 1 soporte universal 1 gradilla 1 Cubrebocas 1 par de Guantes de látex 1 Googless Baño maría a 50ºC (POTE DE PELTRE)
Reacción catalizada por una enzima Energía
Sustrato
Producto
Sentido de la reacción
34
REACTIVOS
Enzima ureasa HgCl2 al 1% (veneno) Solución de urea 0.25 M (con 250 Mmolas/mL (reciente) Rojo de metilo como indicador (solución alcalina) Solución amortiguadora de pH 5.0, 6.0, 7.2, 9.0 Y 10 Solución de HCl 0.1 N (50 Mmoles de urea) TÉCNICA Precauciones: téngase cuidado en usar los tubos y todo el material de estos experimentos bien lavados y enjuagados, pues si se queda Hg en ellos pueden inactivar a la enzima e impedir la observación de los resultados. Dispóngase una serie de tubos como sigue:
Procedimiento 1 2 3 4 5 Testigos
Urea 0.25 M (mL) en agua 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 *
Sol. Buffer de pH (5 mL) pH 5.0 pH 6.0 pH 7.2 pH 9.0 pH 10 **
***
Baño María 50ºC (5 min.)
Ureasa (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Baño María 50ºC (30 min.)
HgCl2 gotas 4 4 4 4 4 -
* Testigo para cada muestra. ** pH de acuerdo al tubo *** 4 gotas de cloruro mercúrico.
Titular de forma acostumbrada, restando el valor del testigo despreciando las pequeñas
diferencias que pudieran deberse al valor de titulación de los buffers de distinto pH de 7.2
Hágase una tabla y grafique las micromolas de urea hidrolizada a contra los distintos pH.
Señale el pH óptimo para la ureasa.
35
RESULTADOS
Tubo pH Valores de titulación corregidos Micromolas de urea
hidrolizadas.
1
2
3
4
5
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es el objetivo que se persigue en esta práctica?
2. ¿Qué es el pH y cómo influye en la velocidad de la reacción?
3. ¿Por qué es importante utilizar soluciones buffer en todas las prácticas?
4. ¿Qué le sucede a la ureasa si se somete a un pH de 12?
5. ¿Qué es la desnaturalización, qué le sucede a la enzima y por qué se inactiva?
36
TRATAMIENTO Y DISPOSICIÓN DE RESIDUOS.
Figura 11. Diagrama ecológico de la práctica efecto del pH sobre la velocidad de la reacción.
D1, D2: Mezclar los residuos de D1 y D2, y resguardar para su posterior tratamiento.
3) Titular con HCl (0.1 N)
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2 + HCl + rojo de metilo
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2
5 mL. Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2
D1
D2
2) Baño María 50°C por 5
1) Baño María 50°C por 5 minutos
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2)
Ureasa
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa
4 gotas de HgCl2
3) Titular con HCl (0.1 N)
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2 + HCl + rojo de metilo
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2
5 mL. Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2
D1
D2
2) Baño María 50°C por 5
1) Baño María 50°C por 5 minutos
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2)
Ureasa
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa
4 gotas de HgCl2
3) Titular con HCl (0.1 N)
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2 + HCl + rojo de metilo
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2
5 mL. Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2
D1
D2
2) Baño María 50°C por 5
1) Baño María 50°C por 5 minutos
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2)
Ureasa
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa
4 gotas de HgCl2
3) Titular con HCl (0.1 N)
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2 + HCl + rojo de metilo
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2
5 mL. Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2
D1
D2
2) Baño María 50°C por 5
1) Baño María 50°C por 5 minutos
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2)
Ureasa
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa
4 gotas de HgCl2
3) Titular con HCl (0.1 N)
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2 + HCl + rojo de metilo
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2
5 mL. Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa + HgCl2
D1
D2
2) Baño María 50°C por 5
1) Baño María 50°C por 5 minutos
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2)
Ureasa
Urea + Solución Buffer (pH= 7.2) +
ureasa
4 gotas de HgCl2
37
BIBLIOGRAFÍA
1. Quesada M.S. (2007). Manual de Experimentos de Laboratorio para Bioquímica.
(1 ed.). San José, Costa Rica. Editorial Universidad Estatal a Distancia.
2. Flores, A.L. (2008). Manual de Prácticas de Bioquímica. (2 ed.). México: Mc
Graw-Hill / Interamericana.
38
SUBCOMPETENCIA 2
PRÁCTICA 6. EXTRACCIÓN DE AMILASA SALIVAL Y
DETERMINACIÓN DE SU ACTIVIDAD
GENERALIDADES
Las amilasas son enzimas hidrolíticas que degradan el almidón (polímero de glucosa);
para producir glucosa, maltosa o pequeños oligosacáridos llamados dextrinas límite.
La amilasa salival, es una enzima que también es conocida como ptialina; esta inicia la
degradación de los almidones y de glucógeno hasta maltosa, sin embargo, esto es de
poca importancia en el cuerpo debido al corto tiempo que puede actuar sobre los
alimentos. Esta enzima actúa en un pH óptimo de 6.8; pero es fácilmente inactiva a pH
4.0 o menos, cesando su actividad en el ácido del estómago.
La función de la amilasa, es degradar los puentes químicos entre los monosacáridos en
los carbohidratos para producir los polisacáridos de cadena larga hacia el disacárido
maltosa. En los alimentos deglutinados continúa esta enzima sobre los almidones
durante otros 14 a 30 minutos en el estómago entes de que los ácidos estomacales la
inactiven.
Figura 12. Glándulas salivales.
39
Al tratar el almidón con solución de lugol, da una coloración azul-oscuro. Al
desdoblarse por la amilasa salival, el almidón por hidrólisis, da dextrinas de peso
molecular menor, el color producido con el lugol es similar a la paja.
OBJETIVO
Demostrar la actividad de la amilasa salival, por medio de una reacción sencilla, para
conocer dicha actividad catalítica de los carbohidratos.
MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS.
MATERIAL Y EQUIPO
7 tubos de ensayo de 15 X 150 mm 3 pipeta graduada de 5 mL 1 pipetas graduadas de 1 mL 2 vasos de precipitado de 50 mL 1 gotero 1 piceta con agua destilada
1 propipeta 1 pinza para tubo de ensayo 1 gradilla 1 Cubrebocas 1 par de Guantes de látex 1 Googless Baño maría a 40ºC (POTE DE PELTRE)
REACTIVOS
Solución de almidón Lugol
TÉCNICA Extraer 10 mL de saliva, siendo esta la dilución. Tomar el pH de la saliva. Dispóngase una serie de tubos como sigue:
PROCEDIMIENTO 1 2 3 4 5 6 Testigo*
Dilución mL 2.5 2.0 1.6 1.2 0.8 0.5 -
Almidón mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
Agua Destilada mL 0.0 0.5 0.9 1.3 1.7 2.0 2.5
Baño María a 40ºC (30
min.)
** ** ** ** ** ** **
Lugol (gotas) 3 3 3 3 3 3 3
* Solo un testigo ** Agitar cada 5 minutos para evitar sedimentación. Y se observa la coloración, anotar los colores y concluir.
40
CUESTIONARIO
1. ¿Por qué las muestras son sometidas a baño maría a 40ºC durante 30 minutos y no a otra temperatura?
2. ¿Por qué el testigo no se le agrega muestra?
3. ¿Por qué se le agrega lugol a las muestras?
4. ¿Por qué se desarrolla el color?
TRATAMIENTO Y DISPOSICIÓN DE RESIDUOS.
.
Figura 13. Diagrama ecológico de la práctica extracción de amilasa salival y determinación de su actividad.
D1: Se inactiva con hipoclorito de sodio al 5% y se desecha en un recipiente de
plástico.
1) Medir pH
2) Agitar 3) Baño María a 40°C por 30 minutos.
Saliva 10mL
Saliva + Almidón+ Lugol
Saliva + Almidón+ Lugol
D1
41
BIBLIOGRAFÍA
1. Quesada M.S. (2007). Manual de Experimentos de Laboratorio para Bioquímica.
(1 ed.). San José, Costa Rica. Editorial Universidad Estatal a Distancia.
2. Flores, A.L. (2008). Manual de Prácticas de Bioquímica. (2 ed.). México: Mc
Graw-Hill / Interamericana.
42
SUBCOMPETENCIA 2
PRÁCTICA 7. EXTRACCIÓN DE AMILASA PANCREÁTICA Y
DETERMINACIÓN DE SU ACTIVIDAD
FUNDAMENTACIÓN
Las amilasas son enzimas hidrolíticas que degradan el almidón (polímero de glucosa); para
producir glucosa, maltosa o pequeños oligosacáridos llamados dextrina límite.
La amilasa pancreática o amilopepsina, cataliza específicamente la hidrólisis de enlaces
glucosídicos alfa (1-4), al igual que la enzima salival. Los enlaces 1,6 no son hidrolizados por
estas enzimas y por ello se forman las dextrinas. Tampoco los enlaces beta pueden ser
hidrolizados por este tipo de amilasas.
Las amilasas son de utilidad en algunas industrias como la cervecera y textil y en
detergentes biológicos. Las amilasas industriales se obtienen de diversos microorganismos,
ya que el proceso de obtención que se realizará en esta práctica, resulta demasiado costoso
y no incluye beta-amilasas.
De la amilasa pancreática se tienen los siguientes datos:
Se activa y se trabaja en condiciones óptimas a un pH de 7.1
Los sustratos sobre los que trabajan son: almidón y glucógeno.
Productos finales o acción: maltosa más 1:6 glucósidos (oligosacáridos) más
maltosa.
Figura 14. Anatomía del páncreas.
43
Al tratar el almidón con solución de lugol, da una coloración azul-oscuro. Al desdoblarse por
la amilasa salival, el almidón por hidrólisis, da dextrinas de peso molecular menor, el color
producido con el lugol es similar a la paja.
OBJETIVO
Demostrar la actividad de la amilasa pancreática extraída del páncreas de un porcino, para
conocer dicha actividad y comportamiento sobre los carbohidratos.
MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS.
MATERIAL Y EQUIPO
7 tubos de ensayo de 15 X 150 mm 3 pipeta graduada de 5 mL 1 pipetas graduadas de 1 mL 2 vasos de precipitado de 50 mL 1 gotero 1 piceta con agua destilada Material para extracción: mortero y pistilo de porcelana, navaja, matraz erlenmayer de 1000 mL
1 propipeta 1 pinza para tubo de ensayo 1 gradilla 1 Cubrebocas 1 Par de Guantes de látex 1 Googless Baño maría a 40ºC (POTE DE PELTRE) Balanza granataria Placa de agitación mecánica
REACTIVOS
Solución de almidón al 5% Alcohol etílico al 96% Lugol Arena lavada y seca 500 g Material Biológico:
Un Páncreas de cerdo desengrasado
TÉCNICA 1. EXTRACTO ENZIMÁTICO DE PÁNCREAS.
Pese el páncreas de cerdo, fresco y lo más desengrasado posible; córtelo en trozos pequeños y mézclelo en un mortero con arena lavada, agregue a la mezcla 3 veces su peso de agua y una vez su peso de alcohol etílico al 96%. Deje esta mezcla bien tapada y a temperatura ambiente, durante 2 días, agitando suavemente en un agitador mecánico.
44
Filtre a través de 3 capas de grasa y guarde el extracto filtrado en refrigeración. Este extracto tiene actividad lipolítica y proteolítica también; si se filtra a través de papel, pierde la actividad lipolítica Prepare dos diluciones del extracto pancreático, así: la primera 1:10 y la segunda 1:100, conservando también una parte sin diluir. Rotule los extractos en la forma siguiente: A-Sin diluir; B-diluido 1:10: C-diluido 1:100 2. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE AMILASA
Los alumnos se distribuirán en 3 grupos, y cada uno trabajará con una dilución (A, B, o C). Prepare una serie de 6 tubos marcados con números progresivos seguidos de la letra que corresponda a la dilución que le haya tocado trabajar. Agregue a los tubos lo que se indica en el cuadro. Ponga simultáneamente todos los tubos en un baño de agua a 40ºC y almidón al 2%. Después de la adición del almidón, mantenga en el baño exactamente durante media hora, agitando bien cada 5 minutos. Al completar la media hora se saca los tubos, se ponen en una gradilla en orden numérico y se agregan a cada uno 3 gotas de disolución de lugol. Agite. Dispóngase una serie de tubos como sigue:
PROCEDIMIENTO 1 2 3 4 5 6 Testigo*
Dilución mL 2.5 2.0 1.6 1.2 0.8 0.5 -
Almidón mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
Agua destilada mL 0.0 0.5 0.9 1.3 1.7 2.0 2.5
Baño María a 40ºC (30
min.)
** ** ** ** ** ** **
Lugol (gotas) 3 3 3 3 3 3 3
* Solo un testigo ** Agitar cada 5 minutos para evitar sedimentación. Y se observa la coloración.
CÁLCULOS Una unidad de enzimática de amilasa se define como el número de mL de solución al 1%, que pueden ser hidrolizados en 30 min. por 1 mL de extracto, puro, en las condiciones de pH y temperatura a que se haya trabajado. De acuerdo con esta definición, se tomará en cuenta para los cálculos, el tubo que haya presentado hidrólisis total con la menor cantidad posible de extracto. Obviamente, para
45
todas las cantidades mayores de extracto también es completa la hidrólisis. Si por ejemplo, este tubo fue el 3B, dicho tubo contiene 1.6 mL de extracto diluido 1:10 o sea, contiene 0.16 mL del extracto puro. La cantidad de sustrato es 2 mL al 2% o sea, el equivalente a 4 mL al 1%. Por lo tanto. 0.16 mL del extracto hidrolizan 4 mL de almidón al 1% 1.0 mL ------------------- X En este caso: X = 4(1.0)/0.16 = 25 unidades de actividad enzimática. 1.6 mL del extracto hidrolizan 10 mL de almidón al 1% 1.0 mL ------------------- X En este caso: X = 10(1.6)/1.6 = 6.25 unidades de actividad enzimática CUESTIONARIO
1. ¿Por qué el páncreas debe ser lo más desengrasado posible y mezclado con arena lavada?
2. ¿Por qué se guarda en refrigeración el extracto? 3. ¿Por qué si se filtra el extracto a través de papel, pierde su actividad lipolítica?, ¿Nos
ayuda esto en algo, sí o no y porque? 4. ¿Por qué se debe evitar la sedimentación?
46
TRATAMIENTO Y DISPOSICIÓN DE RESIDUOS.
Figura 15. Diagrama ecológico de la práctica extracción de amilasa pancreática y determinación de su actividad.
D1 y D2: Se esteriliza en autoclave a 121°C y se desecha en recipientes adecuados. D3: Se inactiva con hipoclorito de sodio al 5%y se desecha en recipiente adecuado.
BIBLIOGRAFÍA
1. Quesada M.S. (2007). Manual de Experimentos de Laboratorio para Bioquímica.
(1 ed.). San José, Costa Rica. Editorial Universidad Estatal a Distancia.
2. Flores, A.L. (2008). Manual de Prácticas de Bioquímica. (2 ed.). México: Mc
Graw-Hill / Interamericana.
4) Baño María a 40°C por 30 minutos
1) Agregar agua y alcohol etílico al 96% 2) Agitar durante 2 días. 3) Filtrar
Páncreas de cerdo +
Arena lavada
Resto de grasa de Hígado
D1 Extracción Resto de Hígado
con arena después de la extracción
D2
Extracto + Almidón al 2% + lugol
D3
47
SUBCOMPETENCIA 2
PRÁCTICA 8. EXTRACCIÓN DE LIPASA PANCREÁTICA Y
DETERMINACIÓN DE SU ACTIVIDAD
GENERALIDADES
Las enzimas exocrinas son aquellas que vierten sus productos en conductos diferentes al
torrente sanguíneo. La secreción pancreática contiene enzimas que atacan a todos los
alimentos principales.
La lipasa pancreática generalmente degrada al enlace éster primario de trigliceroles. Esta
enzima actúa en la interfase aceite-agua, de las gotitas finalmente emulsificadas de lípidos
formadas por la agitación mecánica en el intestino en presencia de los productos de la
actividad de la lipasa lingual, sales biliares, colipasa, fosfolípidos y fosfolipasa. La presencia
de ácidos grasos libres a partir de la acción de lipasa pancreática, particularmente de los
triacilgliceroles de la leche.
La lipasa es una enzima lábil y se inactiva en forma irreversible a un pH menor de 4.
Es activada por las sales biliares, fosfolípidos, colipasa a un pH de 8.0. En condiciones
normales, el bicarbonato, las sales biliares y un cofactor sintetizado y secretado por el
páncreas, la colipasa protege a la lipasa de ser inactivada.
La lipasa es una enzima que hidroliza a las grasas neutras hasta sus componentes: glicerol y
tres ácidos grasos, y se encuentran en las secreciones pancreáticas. Cuando existe una
enfermedad del páncreas y obstrucción de su conducto-secretor, las grasas no son
desdobladas por lo que son absorbidas normalmente produciéndose un aumento de ellas en
las materias fecales que recibe el nombre de “Esteatorrea”.
La acción de la lipasa sobre las grasas neutras producen su desdoblamiento hasta ácidos
grasos y glicerol, esta acción puede ponerse de manifiesto mediante la titulación de los
ácidos grasos liberados por acción hidrolítica de la lipasa con NaOH 0.1 N. Cuando la grasa
no está emulsificada, la superficie que presenta es muy poca, por lo que la acción de la lipasa
es incompleta, pero si hay una buena emulsificación, la superficie de contacto aumenta y
también la acción de la enzima.
48
OBJETIVO
Demostrar la actividad de la lipasa pancreática, extraída de un páncreas porcino, para
conocer la actividad enzimática sobre los lípidos.
MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS.
MATERIAL Y EQUIPO
2 tubos de ensayo de 15 X 150 mm 3 pipeta graduada de 5 mL 1 pipetas graduadas de 1 mL 2 vasos de precipitado de 50 mL 1 gotero 1 piceta con agua destilada
1 propipeta 1 pinza para tubo de ensayo 1 gradilla 1 Cubrebocas 1 Par de Guantes de látex 1 Googless Baño maría a 40ºC (POTE DE PELTRE)
REACTIVOS
Crema de leche (media crema) con polvo tornasol (o rojo de fenol 0.04%) Sol. de NaHCO3 al 15% Extracto pancreático o Sol. de pancreatina al 10% NaOH 0.1 N Rojo de fenol al 0.04% Material Biológico:
Un Páncreas de cerdo (150 gr. aprox.)
TÉCNICA
1. EXTRACTO ENZIMÁTICO DE PÁNCREAS:
Pese el páncreas de cerdo, fresco y lo más desengrasado posible; córtelo en trozos
pequeños y mézclelo en un mortero con arena lavada, agregue a la mezcla 3 veces
su peso de agua y una vez su peso de alcohol al 96%. Deje esta mezcla bien
tapada y a temperatura ambiente, durante 2 días, agitando suavemente en un
agitador mecánico.
49
Filtre a través de 3 capas de grasa o gasa y guarde el extracto filtrado en
refrigeración. Este extracto tiene actividad lipolítica y proteolítica también; si se
filtra a través de papel, pierde la actividad lipolítica
Dispóngase una serie de tubos como sigue:
Procedimiento 1 2
Crema dulce diluida al 1% (mL) 5.0 5.0 Diluir a 1:100
Rojo de fenol 0.04% gotas: 5 5
Extracto pancreático fresco (mL) 1.0 - Añadir 5 mL de extracto
Extracto pancreático hervido (mL) - 1.0
NaHCO3 al 5% gotas 2 2
Hasta color rosa en ambos
Incubar a 37º C 1 hora
Al terminar el período de incubación e hidrólisis el tubo con pancreatina fresca debe tener color amarillo. El tubo con pancreatina hervida debe conservar el color rosa. Para hacer cuantitativamente la acción de la lipasa, pesar el contenido de los tubos a dos veces de precipitado y titular con NaOH 1.0 N hasta neutralización completa, lo cual se observará por el retorno del color amarillo al rosado.
CÁLCULOS Calcular los meq. de ácido graso liberado por la pancreatina en una hora de incubación, aplicando la siguiente fórmula:
Gasto del álcali X normalidad del álcali = meq Ác Grasos libres.
Calcular los miligramos de ácidos grasos liberados por la pancreatina en una hora de incubación, suponiendo que el peso molecular promedio de un ácido graso = 265, aplicando la siguiente fórmula:
meq de ácido graso X P.M. = mg de ácidos grasos liberados
CUESTIONARIO
1. ¿Por qué al terminar el periodo de incubación e hidrólisis el tubo con pancreatina fresca debe tener color amarillo?
2. ¿Por qué el tubo con pancreatina hervida debe conservar el color rosa?
3. ¿Por qué el extracto pancreático hervido se emplea como testigo?
4. ¿Por qué se emplea NaOH 1.0 N para titular?
50
TRATAMIENTO Y DISPOSICIÓN DE RESIDUOS.
Figura 16. Diagrama ecológico de la práctica extracción de lipasa pancreática y determinación de su actividad.
D1: Se esterilizan en autoclave a 121 grados C y se desechan en recipiente adecuado. D2: Se esterilizan en autoclave a 121 grados C y se desechan en recipiente adecuado. D3: Se neutraliza con hipoclorito de sodio al 5 % y se desecha en recipiente adecuado.
BIBLIOGRAFÍA
1. Quesada M.S. (2007). Manual de Experimentos de Laboratorio para Bioquímica.
(1 ed.). San José, Costa Rica. Editorial Universidad Estatal a Distancia.
2. Flores, A.L. (2008). Manual de Prácticas de Bioquímica. (2 ed.). México: Mc
Graw-Hill / Interamericana.
RESTOS DE GRASA DE HIGADO
CONTENIDO DE LOS TUBOS
D2 D3 D2
D1
RESTOS DE HIGADO CON ARENA DESPUES DE LA EXTRACCIÓN
CONTENIDO DE TUBOS: EXTRACTO + ROJO DE FENOL+ BICARBONATO DE
SODIO
D3
RESTOS DE GRASA DE HIGADO
CONTENIDO DE LOS TUBOS
RESTOS DE HIGADO CON ARENA DESPUES DE LA EXTRACCIÓN
CONTENIDO DE TUBOS: EXTRACTO + ROJO DE FENOL+ BICARBONATO DE
SODIO
51
BIBLIOGRAFÍA
1. Quesada M.S. (2007). Manual de Experimentos de Laboratorio para Bioquímica.
(1 ed.). San José, Costa Rica. Editorial Universidad Estatal a Distancia.
2. Flores, A.L. (2008). Manual de Prácticas de Bioquímica. (2 ed.). México: Mc
Graw-Hill / Interamericana.
3. Conm-Stumpt; et.al. (1996). Bioquímica Fundamental. (5ta. Edición). México:
LIMUSA.
4. Díaz, H. (1995). Bioquímica. (2da. Edición). México: INTERAMERICANA-Mc-Graw
Hill.
5. Lehninger, A. (1991). Bioquímica. (2da. Edición). Barcelona, España. OMEGA.
6. Lehninger, A., Nelson, D.L. y Cox, M.M. (1993). Principios de Bioquímica.
Barcelona, España. Ed. Omega.
7. Murria, Robert K; et.al.(1992). Bioquímica de Harper. 13ª Edición. México, D.F.
Ed. El Manual Moderno.
8. Peña, D.A., Arroyo, B.A., Gómez, P.A. y Tapia, I.R. (1995). Bioquímica. (2da
Edición). México, D.F. Editorial LIMUSA.
9. Scanlon, V. C. (1995). Essential of anatomy and physiology. (2da Edción).
Philadelphia. Editorial David Company.
10. Toperek, M. (1981). Bioquímica. (3ra. Edición). México, D.F. Editorial
Interamericana.
11. Tortora, G.J. (1993). Principios de anatomía y fisiología. (6ta. Edición). México,
.D.F. Editorial HARLA.
12. Voet, D. et.al.(1992). Bioquímica. (1ra. Edición). Barcelona, España. Editorial
OMEGA.
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ANEXOS
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ANEXO 1 CONVERSIÓN A MICROMOLAS
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CONVERSIÓN A MICROMOLAS
1 mol________1000 milimoles/litro si 1 milimol_________1000 micromoles/litro
entonces
1000 milimoles___X X= 1’000’000 micromoles/litro
Por lo tanto 1 mol_____1'000'000 micromoles/litro
0.25 molar______X X= 250,000 micromoles/litro
250,000 micromoles_____1000 mL
X micromoles_____ 1mL
X= 250 micromoles/mL
APLICANDO A CADA UNO DE LOS TUBOS QUE CONTIENEN DIFERENTE
CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO (UREA) 0.25 M NO DEBE QUEDAR DE LA
SIGUIENTE MANERA:
Tubo 1 Sí 250 micromoles______1 mL
X_________________0.5 mL
X= 125 micromoles de Urea entre los 12.5 mL de volumen total nos
queda
125 micromoles de Urea = 10 micromoles/mL
12. 5 mL de Vol. total en el tubo
Tubo 2 Si 250 micromoles ____1 mL
X _______________ 1 mL
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X= 250 micromoles de Urea entre los 12.5 mL de volumen total nos
queda
250 micromoles de Urea = 20 micromoles/mL
12. 5 mL de Vol. total en el tubo
Tubo 3 Si 250 micromoles ____1 mL
X _______________ 2 mL
X= 500 micromoles de Urea entre los 12.5 mL de volumen total nos
queda
500 micromoles de Urea = 40 micromoles/mL
12. 5 mL de Vol. total en el tubo
CALCULAR LOS DEMÁS TUBOS
Cada molécula de UREA da origen a 2 iones de amonio que reaccionan con el HCl
0.1N que contiene 100 micromoles por mL, por lo que 1 mL de ésta solución vale
100 entre 2 nos da 50 micromoles de urea, factor que se debe multiplicar por los
micromoles de UREA hidrolizadas después de la titulación y que son
transformadas en amoniaco.
La titulación corregida se obtiene restando la “titulación del blanco” de los
valores obtenidos en los demás tubos y ésta cifra es multiplicada por 50.
Se realiza la gráfica con los valores de Urea inicial en micromolas en el medio
contra los valores en micromolas de Urea hidrolizada.
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ANEXO 2 FORMA DE REPORTE DE PRÁCTICA DE LABORATORIO
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FORMA DE REPORTE DE PRÁCTICA DE LABORATORIO
PORTADA
• Logotipo de la UAC y de la Facultad o Escuela • Nombre de la Universidad • Nombre de la Facultad o Escuela • Nombre del programa educativo • Nombre de la asignatura • Grado en el que se imparte • Período escolar en el que se imparte • Nombre del maestro responsable de la asignatura • Nombre de los integrantes del equipo de trabajo • Fecha de elaboración
NÚMERO DE LA PRÁCTICA NOMBRE DE LA PRÁCTICA INTRODUCCIÓN
Incluye justificación, objetivo e hipótesis de la práctica MARCO TEÓRICO
Incluir citas bibliográficas METODOLOGÍA UTILIZADA
Incluye procedimientos, materiales equipos, reactivos de laboratorio y muestras problema y/o Biológicas utilizadas.
RESULTADOS OBTENIDOS
En estos resultados se pueden incluir dibujos, tablas o gráficas. OBSERVACIONES CONCLUSIONES CUESTIONARIO RESUELTO BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA
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ANEXO 3 LINEAMIENTOS GENERALES DE SEGURIDAD E HIGIENE EN EL LABORATORIO Y
MARCO JURÍDICO
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LINEAMIENTOS GENERALES EN MATERIA DE SEGURIDAD E HIGIENE A SEGUIR EN LOS LABORATORIOS Las actividades de carácter docente e investigador que se llevan a cabo en las prácticas de laboratorios del Programa Educativo de Químico Farmacéutico Biólogo de la Facultad de Ciencias Químico Biológicas (FCQB) de la Universidad Autónoma de Campeche (UAC) conllevan, en determinados casos, un riesgo dependiendo del tipo de trabajo que se desarrolle. Este documento recoge los lineamientos necesarios para llevar a cabo un trabajo seguro y eficiente atendiendo a las indicaciones del Reglamento Federal de Seguridad e Higiene y Medio ambiente de Trabajo, publicado en el Diario Oficial de la Federación, el 21 de enero de 1997, Normatividad en materia de Seguridad e Higiene de la Secretaria del Trabajo y Previsión Social, Sistema de Gestión Ambiental Yum Kaax ISO 14001:2004 de la Universidad Autónoma de Campeche y Reglamento Interno de los Laboratorios en los que se realizan prácticas de docencia de la FCQB de la UAC.
Solo se permitirá trabajar a los alumnos bajo la responsabilidad de un profesor o de la persona asignada de manera previa por el Coordinador del Programa Educativo o de Posgrado e Investigación.
Realizar únicamente tareas enmarcadas en el ámbito de trabajo del laboratorio para las que ha sido autorizado.
Se deberá llevar siempre la bata de manga larga y los equipos de protección individual exigidos según el tipo de trabajo que se realice (goggles, mascarilla protectora, guantes de latex, calzado cerrado que cubra el empeine, de tacón ancho o corrido con altura máxima de 4 cm, de piel, que no sea de tela ni de material plástico, incluida la suela) según lo solicite el profesor.
No se permite ingresar con bermudas o short y, en el caso de las mujeres, el largo de la falda debe ser debajo de la rodilla.
Hombres y mujeres con cabello largo deberán portar el pelo recogido hacia atrás.
No llevar pulseras, colgantes, mangas anchas ni prendas sueltas que puedan trabarse en montajes, equipos o máquinas.
No fumar, comer ni beber. No realizar reuniones o celebraciones. No guardar alimentos ni bebidas en los frigoríficos del laboratorio. Mantener el orden en las sesiones de laboratorio y tratar con respeto al
laboratorista, compañeros y profesores. Verificar que el material y los equipos de laboratorio a emplear se
encuentren en óptimas condiciones de funcionamiento. Antes de hacer uso de cualquier material y/o equipo consulte su
operatividad con el laboratorista. Mantener las mesas de trabajo limpias y sin objetos personales en las
superficies (libros, cajas o accesorios innecesarios) para el trabajo que se está realizando.
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Tener la autorización para el uso de un producto, equipo o instalación concreta.
Lavar y enjuagar todo el material de vidrio con agua destilada y secarlo. Leer la etiqueta o consultar las fichas de seguridad de productos
químicos antes de utilizarlos por primera vez. Para efectuar pipeteos utilice siempre propipeta o perilla No tocar ni probar, sin el uso de guantes a los productos químicos. Calentar tubos de ensayo de lado y utilizando pinzas. Por su seguridad utilizar gradillas y soportes. Comprobar la temperatura de los materiales antes de sujetarlos
directamente con las manos. En caso de ser necesario utilizar las campanas de extracción. Etiquetar adecuadamente los frascos y recipientes a los que se haya
transvasado algún producto o donde se hayan preparado mezclas, identificando su contenido, a quién pertenece y la información sobre su peligrosidad (reproducir el etiquetado original).
Reportar cualquier accidente o anomalía ocurrida durante la práctica, de manera inmediata al laboratorista.
Salvaguardar todos los implementos y dispositivos de seguridad e higiene (extintor, señalamientos, regadera y lavaojos de emergencia, etc.) habilitados en el interior del laboratorio.
Revisar la Normativa correspondiente de acuerdo a la NOM-062-ZOO-1999, Cuidado y uso de animales de laboratorios y la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos-Clasificación y especificaciones de manejo para el caso de emplear animales de laboratorio y muestras biológico-infecciosas respectivamente.
El material y equipo que se rompa o sufra desperfectos en el transcurso de la práctica, se deberá reportar al laboratorista de inmediato.
Asegurar la desconexión de equipos, agua y gas al terminar el trabajo. Recoger materiales, reactivos, equipos, y depositar los residuos en los
contenedores correspondientes. Lavarse las manos antes de dejar el laboratorio.
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MARCO JURÍDICO
Reglamento Federal de Seguridad e Higiene y Medio ambiente de Trabajo. Publicado en el Diario Oficial de la Federación (D.O.F.), el 21 de enero de 1997. NOM-002-STPS-2010, Condiciones de seguridad - Prevención y protección contra incendios en los centros de trabajo. D.O.F. 9-XII-2010. NOM-005-STPS-1998, Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para el manejo, transporte y almacenamiento de sustancias químicas peligrosas. D.O.F. 2-II-1999 NOM-010-STPS-1999, Condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo donde se manejen, transporten, procesen o almacenen sustancias químicas capaces de generar contaminación en el medio ambiente laboral. D.O.F. 13-III-2000. NOM-017-STPS-2008, Equipo de protección personal - Selección, uso y manejo en los centros de trabajo. D.O.F. 9-XII-2008. NOM-018-STPS-2000, Sistema para la identificación y comunicación de peligros y riesgos por sustancias químicas peligrosas en los centros de trabajo. D.O.F. 27-X-2000. NOM-026-STPS-2008, Colores y señales de seguridad e higiene, e identificación de riesgos por fluidos conducidos en tuberías. D.O.F. 25-XI-2008. NOM-028-STPS-2004, Organización del Trabajo-Seguridad en los Procesos de sustancias químicas. D.O.F. 14-I-2005. NOM-062-ZOO-1999. Cuidado y uso de animales de laboratorio. D.O.F. 18-VI-2001. NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, Protección ambiental-Salud ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos-Clasificación y especificaciones de manejo. D.O.F. 17-II-2003. NOM-052-SEMARNAT-2005, que establece las características, el procedimiento de identificación, clasificación y los listados de los residuos peligrosos. D.O.F. 23-VI-2006. Sistema de Gestión Ambiental Yum Kaax de la Universidad Autónoma de Campeche. Octubre 2010. Reglamento Interno de los Laboratorios en los que se realizan prácticas de docencia de la Facultad de Ciencias Químico Biológicas de la Universidad Autónoma de Campeche. Agosto de 2012.