Novembre, 2008

Adapté de Bruce Bagwell (Verity Software House, USA)

CompensationCompensation

Gérald GrégoriGérald Grégori

Laboratoire de Microbiologie, Géochimie et Ecologie Marines Laboratoire de Microbiologie, Géochimie et Ecologie Marines CNRS UMR 6117 CNRS UMR 6117

163 Avenue de Luminy - Case 901- Bât TPR1 - Entrée F 163 Avenue de Luminy - Case 901- Bât TPR1 - Entrée F 13288 Marseille cedex 9 (France)13288 Marseille cedex 9 (France)

Responsable de la Plateforme Régionale de Cytométrie pour la MicrobiologieResponsable de la Plateforme Régionale de Cytométrie pour la Microbiologiewww.com.univ-mrs.fr/PRECYM www.com.univ-mrs.fr/PRECYM

gerald.gregori@univmed.frgerald.gregori@univmed.fr

Novembre, 2008

Cytométrie en FluxCytométrie en Flux

La cytométrie en flux La cytométrie en flux mesure :mesure :• La lumière diffusée par les cellules dans 2 directions (diffusion La lumière diffusée par les cellules dans 2 directions (diffusion

aux petits angles et à 90°)aux petits angles et à 90°)• La fluorescence produite par les cellules et induite par la La fluorescence produite par les cellules et induite par la

source d’excitation lumineuse. source d’excitation lumineuse.

La fluorescence peut être naturelle (autofluorescence) ou La fluorescence peut être naturelle (autofluorescence) ou induite (colorants fluorescents - fluorochromes)induite (colorants fluorescents - fluorochromes)

Différence avec la Différence avec la spectrophotométriespectrophotométrie : mesure la fraction  : mesure la fraction de lumière absorbée ou transmise dans un volume de lumière absorbée ou transmise dans un volume d’échantillon (méthode globale). d’échantillon (méthode globale).

Mesure (-métrie) des propriétés optiques de cellules (cyto-) transportées par un liquide vecteur (flux) jusq’à une source d’excitation lumineuse (le plus souvent un laser).

Novembre, 2008

Spectres d’absorption et d’émission Spectres d’absorption et d’émission d’un composé organiqued’un composé organique

La fluorescence d’un composé organique est toujours spectrale. Exemples de fluorochromes. (Practical Flow Cytometry, Third Edition, Howard M. Shapiro. P. 245).

Chaque fluorescence mesurée par un cytomètre en flux est spectrale, c’est à dire étalée sur une gamme de longueurs d’ondes (plusieurs nm).

Novembre, 2008

Composés inorganiques (Nanoparticules)Composés inorganiques (Nanoparticules)

10 types de nanocristaux excités en UV (lampe à arc). De gauche à droite (bleu rouge), émissions centrées sur 443, 473, 481, 500, 518, 543, 565, 587, 610, et 655 nm.

Novembre, 2008

Propriétés optiques des nanocristauxPropriétés optiques des nanocristaux

Nature biotechnology • VOLUME 21 • JANUARY 2003 • www.nature.com/naturebiotechnology

• Large spectre d’absorption

• Spectre d’émission étroit

• Faible photo-blanchiement

Novembre, 2008

Problème quand plusieurs fluorochromes sont Problème quand plusieurs fluorochromes sont utilisés simultanémentutilisés simultanément

Le recouvrement des spectres d’émission des molécules rend la COMPENSATION nécessaire

(From Practical Flow Cytometry, Third Edition, Howard M. Shapiro)

Novembre, 2008

Que signifie « compensation »?Que signifie « compensation »?

La compensation est le processus par lequel le débordement La compensation est le processus par lequel le débordement spectral de fluorescence provenant d’un fluorochrome autre spectral de fluorescence provenant d’un fluorochrome autre que celui spécifié pour un détecteur donné est soustraite des que celui spécifié pour un détecteur donné est soustraite des signaux des autres détecteurs.signaux des autres détecteurs.

• Exemple : Le recouvrement entre les spectres de fluorescence Exemple : Le recouvrement entre les spectres de fluorescence du FITC et du PE signifie que des photons émis par le FITC (FL1) du FITC et du PE signifie que des photons émis par le FITC (FL1) sont collectés par le détecteur du PE (FL2), et inversement. sont collectés par le détecteur du PE (FL2), et inversement.

La quantité de photons émis par le FITC La quantité de photons émis par le FITC qui qui «bave» dans le détecteur de PE doit être «bave» dans le détecteur de PE doit être

prise en considération c’est-à-dire prise en considération c’est-à-dire compensée. compensée.

Novembre, 2008

Avez-vous besoin de compensation?Avez-vous besoin de compensation?

Pas nécessairement :

- Pour discriminer des groupes La compensation n’est pas obligatoire

- Pour distinguer entre cellule positive et négative Besoin de compensation

Novembre, 2008

Est-ce que la compensation est correcte?Est-ce que la compensation est correcte?

Novembre, 2008

Comment la compensation est-elle calculée?Comment la compensation est-elle calculée?

(adapté du site internet de Mario Roderer)

Novembre, 2008

Contrôle (cellule non fluorescente)Contrôle (cellule non fluorescente)

Paramètre 1 – FL1 (ua)

Par

amèt

re 2

– F

L2

(ua)

Cellule contrôle

Xu

Yu

Cytogramme théorique d’une cellule non marquée analysée par cytométrie en flux.

Dans le repère défini par les 2 fluorescences mesurées, la cellule est positionnée selon ses coordonnées x et y.

Novembre, 2008

Débordement du signal (cross-over)Débordement du signal (cross-over)

Paramètre 1 – FL1 (ua)

Par

amèt

re 2

– F

L2

(ua)

Cellule contrôle

Xu

Yu

Cellule avec un certain nombre de molécules fluorescentes

(anticorps fluorescents ou colorant)

Xu+dx

Yu+dy

+ dx + dy

Exemple d’une cellule marquée par un colorant fluorescent qui émet principalement dans

le Paramètre 1 (fluorescence verte) mais aussi dans le Paramètre 2 (fluorescence orange)

Nous assumons que les Paramètres 1 & 2 sont linéaires sur la gamme dynamique de fluorescence du colorant

et qu’il n’y a pas de masquage de fluorescence (transfert d’énergie de fluorescence par résonance FRET).

Novembre, 2008

Notion de recouvrement linéaire de Notion de recouvrement linéaire de fluorescence (cross-over trace line)fluorescence (cross-over trace line)

Xu

Yu

Xu+dx

Yu+dy

+ 2dx

+ 2dy

Exemple de cellules marquées par différentes quantités d’une molécule fluorescente

qui émet principalement dans le vert (paramètre 1)

Xu+2dx

Yu+2dyDroite de recouvrement

La droite de recouvrement

débute à XuYu

et sa pente est K12

Paramètre 1 – FL1 (ua)

Par

amèt

re 2

– F

L2

(ua)

Cellule contrôle

Cellule avec n molécules

fluorescentes

Cellule avec 2n molécules fluorescentes

) K12

Novembre, 2008

Généralisation à plusieurs cellulesGénéralisation à plusieurs cellules

Xu

Yu

Xu+dx

Yu+dy

Exemple de cellules marquées par des quantités variables d’une même molécule

qui émet principalement dans le vert (paramètre 1)

Toutes les droites de recouvrement présentent la

même pente mais ont des origines différentes

Cellules contrôles présentant différentes intensités d’autofluorescence

Paramètre 1 – FL1 (ua)

Par

amèt

re 2

– F

L2

(ua)

Novembre, 2008

Généralisation à une population de cellulesGénéralisation à une population de cellules

Xu

Yu

Cellules marquées avec des quantités variables

d’1 molécule fluorescente Groupe de

Cellules contrôle

Droite de recouvrement moyenne

Groupe de cellules non marquées mais incubées avec la molécule fluorescente

Paramètre 1 – FL1 (ua)

Par

amèt

re 2

– F

L2

(ua)

Novembre, 2008

Incubation de 2 populations avec 2 Incubation de 2 populations avec 2 molécules fluorescentesmolécules fluorescentes

Xu

Yu

Droite de recouvrement

Cellules marquées par un colorant orange.

Le signal bave dans le détecteur 1.

Xu’

Yu’

Cellules non marquées

Cellules marquées par un colorant vert.

Le signal bave dans le détecteur 2.

Paramètre 1 – FL1 (ua)

Par

amèt

re 2

– F

L2

(ua)

Novembre, 2008

CompensationCompensation

Xu

Yu

Cross_over trace line

Xu’

Yu’

La compensation est le processus par La compensation est le processus par lequel le débordement spectral de lequel le débordement spectral de

fluorescence provenant d’un fluorescence provenant d’un fluorochrome autre que celui spécifié fluorochrome autre que celui spécifié

pour un détecteur donné est soustraite pour un détecteur donné est soustraite des signaux des autres détecteurs.des signaux des autres détecteurs.

Il semble que chaque population subit une rotation autour d’un pivot défini par les

cellules non marquées Problème : ce point pivot n’est pas clairement défini.

Paramètre 1 – FL1 (ua)

Par

amèt

re 2

– F

L2

(ua)

Novembre, 2008

Deux types de compensationDeux types de compensation

Compensation matérielle (Hardware) Compensation matérielle (Hardware) • Pendant l’acquisition Pendant l’acquisition Les données brutes sont Les données brutes sont

modifiées (« anciens » cytomètres en flux).modifiées (« anciens » cytomètres en flux).

Compensation par le logiciel (Software)Compensation par le logiciel (Software)• La compensation est faite La compensation est faite a posteriori, a posteriori, après l’acquisitionaprès l’acquisition

Les données brutes ne sont pas modifiées Les données brutes ne sont pas modifiées (nouvelles générations de cytomètres en flux)(nouvelles générations de cytomètres en flux)

Novembre, 2008

Compensation matérielle (Hardware )Compensation matérielle (Hardware )

Xu

Yu

Xu’

Yu’

La compensation consiste à soustraire un certain % de signal à un autre signal:

Icomp paramètre 1 = Iparamètre 1 – 0.2*Iparamètre 2

Icomp paramètre 2 = Iparamètre 2 – 0.3*Iparamètre 1 !

Droite de recouvrement

Cellules marquées par un colorant orange.

Le signal bave dans le détecteur 1 (i.e., 20%).

Cellules non marquées

Cellules marquées par un colorant vert.

Le signal bave dans le détecteur 2 (i.e. 30%).

Paramètre 1 – FL1 (ua)

Par

amèt

re 2

– F

L2

(ua)

Novembre, 2008

Géométrie de la compensationGéométrie de la compensation

Données non compensé

Données compensé (hardware)

- La compensation aboutit à 2 droites orthogonales

- Les intensités sont décalées ver l’origine

- L’origine des lignes avant et après compensation n’est pas la même

Il n’y a plus de pivot! La compensation n’est donc pas qu’une simple rotation.

Paramètre 1 – FL1 (ua)

Par

amèt

re 2

– F

L2

(ua)

Novembre, 2008

Avec une échelle logarithmiqueAvec une échelle logarithmique

I I0 I00 I000 I0000I

I0

I00

I000

I0000

- En échelle logarithmique les droites de recouvrement deviennent des courbes,

- Elles redeviennent des droites après compensation (droites orthogonales)

K21

K12

Paramètre 1 – FL1 (ua)

Par

amèt

re 2

– F

L2

(ua)

Données non compensé

Données compensé (hardware)

Novembre, 2008

Compensation matérielle: Compensation matérielle: une approche « incorrecte » une approche « incorrecte »

Xu

Yu

Xu’

Yu’

- Définir les intensités de fluorescence médiane Xmed et Y med

de la population non marquée ( )

- Ajuster la compensation (soustraction de signal) jusqu’à ce que les

intensités médianes de chaque population ( ), marquée par un seul

fluorochrome, soient égales à X med ou Y med.

Droite de recouvrement

Cellules non marquées

Paramètre 1 – FL1 (ua)

Par

amèt

re 2

– F

L2

(ua)

Novembre, 2008

Principales sources d’erreurPrincipales sources d’erreur

Le centre du groupe de cellules autofluorescentes Le centre du groupe de cellules autofluorescentes n’est pas le point de pivot des droites de n’est pas le point de pivot des droites de recouvrement (recouvrement ( aboutit à une sous- ou sur- aboutit à une sous- ou sur-compensation)compensation)

Le groupe de cellules autofluorescentes est le Le groupe de cellules autofluorescentes est le plus souvent localisé près de l’origine (première plus souvent localisé près de l’origine (première décade) là ou le bruit électronique (pré-amp; décade) là ou le bruit électronique (pré-amp; ampli-log) est le plus important.ampli-log) est le plus important.

Novembre, 2008

Une alternative : La technique « High-Low »Une alternative : La technique « High-Low »

Xu

Yu

Xu’

Yu’

-Diviser chaque groupe en 2 sous-groupes (high et low)

- Déterminer les intensités médianes de fluorescence

pour chaque sous-groupe ( )

- Ajuster la compensation jusqu’à ce que ces médianes

soient égales.

Cette méthode ne prend plus en compte

la population autofluorescente

High

High

Low

Low

Cellules non marquées

Paramètre 1 – FL1 (ua)

Par

amèt

re 2

– F

L2

(ua)

Novembre, 2008

Compensation par logicielCompensation par logiciel

Xu

Yu

Xu’

Yu’

1- Estimation des pentes des droites de

recouvrement :

. Technique High-Low (FloJo)

. Algorithme d’ajustement (WinList)

2- Création d’une matrice

1 kP1P2

K = kP2P1 1

3- Inversion de la matrice K K-1

K-1 est la matrice de compensation

4- Multiplication par la matrice de compensation

Paramètre compensé = Paramètre * K-1

kP1P2= 0.3

kP2P1 = 0.2

Cellules non marquées

Paramètre 1 – FL1 (ua)

Par

amèt

re 2

– F

L2

(ua)

Novembre, 2008

Avantage de la compensation Avantage de la compensation par le logicielpar le logiciel

Applicable à n’importe quel nombre de paramètresApplicable à n’importe quel nombre de paramètres

Peut être automatiséePeut être automatisée

Novembre, 2008

Sources d’erreur qui affectent la Sources d’erreur qui affectent la compensationcompensation

Erreur de comptage des photons collectésErreur de comptage des photons collectés

cellule

Source lumineuse d’excitation

Direction de la détection

Le nombre « N » de photons collectés est un nombre fini.

Le signal est stochastique et sa variance est soumise à la distribution de POISSON

Photodétecteur (PMT)

L’erreur commise sur N est +/- = √N

Novembre, 2008

Erreur de comptage (suite)Erreur de comptage (suite)

Si l’efficacité d’ un cytomètre (Q) est définie par Si l’efficacité d’ un cytomètre (Q) est définie par le nombre de photons collectés par unité de le nombre de photons collectés par unité de fluorescence (e.g. MESF)fluorescence (e.g. MESF)

• Alors plus Q est faible, plus grande est l’erreur de Alors plus Q est faible, plus grande est l’erreur de comptagecomptage

Paramètre 1 (linéaire)

Pa

ram

ètr

e 2

(li

né

air

e)

Forte Q

Faible Q

Novembre, 2008

Conversion du signal Analogique-DigitalConversion du signal Analogique-Digital

Erreurs induite par le convertisseur Erreurs induite par le convertisseur analogique-digitalanalogique-digital

Troncature du signal provenant l’amplificateur logarithmique analogique

en une valeur entière.

100 101 102Canal

Paramètre 1 (linéaire)

Pa

ram

ètr

e 2

(li

né

air

e)

Forte résolution de l’ADC

Faible résolution de l’ADC

Cette erreur est amplifiée par la transformation Log.

Novembre, 2008

Influence de ces erreurs Influence de ces erreurs sur la compensationsur la compensation

Données non compensées

Données compenseés

Values négatives

• La combinaison des erreurs (de comptage et de conversion) crée une distribution

symétrique de part et d’autre des droites de recouvrement.

• Quand la compensation est correcte la distribution devient symétrique par rapport aux axes.

• Ceci est un problème quand les données sont en échelle Log car il n’y pas de valeur

négative ou nulle.

Combinaison des erreurs de comptage

et de conversion

Paramètre 1 (linéaire)

Pa

ram

ètr

e 2

(li

né

air

e)

Novembre, 2008

Conséquences avec l’échelle LogConséquences avec l’échelle Log

Paramètre 1 (linéaire)

Pa

ram

ètr

e 2

(li

né

air

e)

Les valeurs négatives sont ramenées à 0 Les évènements sont empilés sur l’axe

Les évènements s’accumulent sur l’axe (plus de discrimination possible)

Les données semblent sous-compensées sur-compensation.

Paramètre 1 (linéaire)

Pa

ram

ètr

e 2

(li

né

air

e)

Novembre, 2008

Une solution à ce problèmeUne solution à ce problèmede représentation graphiquede représentation graphique

Transformations Biexponentielle et HyperLogTransformations Biexponentielle et HyperLog• Fonction sin hyperbolique connue sous le nom de bi-exponentielle (Moore and Fonction sin hyperbolique connue sous le nom de bi-exponentielle (Moore and

Parks , 2002).Parks , 2002).• Plus récemment, la transformation HyperLog (Bagwell, Verity Software Plus récemment, la transformation HyperLog (Bagwell, Verity Software

House). House). Les 2 transformations ont des caractéristiques similairesLes 2 transformations ont des caractéristiques similaires(échelle log pour les fortes intensités, échelle linéaire au voisinage de l’origine, des (échelle log pour les fortes intensités, échelle linéaire au voisinage de l’origine, des

données symétriques par rapport à 0.données symétriques par rapport à 0.

Novembre, 2008

Transformation biexponentielleTransformation biexponentielle

Fonction sinus hyperbolique:Fonction sinus hyperbolique:sinh(x) = (esinh(x) = (exx - e - e-x-x)/2)/2

Généralisée en une fonction biexponentielle : Généralisée en une fonction biexponentielle :

f(x) = a ef(x) = a ebxbx - c e - c e-dx -dx

Novembre, 2008

Affichage biexponentielAffichage biexponentiel

0 103 104 105

0

103

104

105

101 102 103 104 105

101

102

103

104

105

101 102 103 104 105

101

102

103

104

105

Uncompensated Compensated

Log

Biexp

0 103 104 105

0

103

104

105

A B

C D

APC (ua)

AP

C-C

y7 (

ua)

Billes contenant 3 niveauxde fluorescence (APC)

Après transformation,les trois populations sont parfaitement alignées. Les évènements ne sont plus empilés sur l’axe.

Novembre, 2008

RésultatsRésultats

Echelle Log dans sa partie supérieure, Echelle Log dans sa partie supérieure, linéaire dans sa partie inférieure, et linéaire dans sa partie inférieure, et symétrique par rapport à 0.symétrique par rapport à 0.

Avec cette transformation l’ensemble du Avec cette transformation l’ensemble du domaine linéaire des données peut être domaine linéaire des données peut être transformé, préservant la symétrie de la transformé, préservant la symétrie de la distribution des erreurs (valeurs négatives distribution des erreurs (valeurs négatives après compensation)après compensation)

Les évènements ne sont plus empilés sur Les évènements ne sont plus empilés sur les axesles axes

Après compensation, chaque groupe Après compensation, chaque groupe apparaît homogène et continu (il n’y a plus apparaît homogène et continu (il n’y a plus de hiatus induit par l’empilement sur l’axe)de hiatus induit par l’empilement sur l’axe)

0 100 1000 10000 1x105

<FITC-A>

0

100

1000

10000

1x105

<PE

-A>

Novembre, 2008

ConclusionConclusion

La compensation est juste une façon visuelle de représenter les données afin de rendre leur analyse plus facile (cellule positive pour un fluorochrome, ou négative pour un autre)

La compensation par le logiciel permet de ne pas modifier les données brutes, de réaliser la compensation après l’acquisition, voire de la réaliser plusieurs fois.

La compensation ne permet pas de rattraper une mauvaise acquisition par le cytomètre car là les données brutes sont affectées

Tranformations HYPERLOG ou BIEXPONENTILLE …à vous de choisir.