practica tpfg

5/10/2018 PRACTICA TPFG - slidepdf.com

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¡A la práctica!

Analizando e interpretando datos devariación genética.



TFPGA

Structure

DnaSP( Excoffier y Heckel . 2006. Nature Rev. 7:745-58 )



TFPGA Tools for PopulationGenetic Analyses:

•Estadísticos descriptivos•Distancias genéticas•Estadísticos F•Pruebas de H-W•UPGMA•Prueba de Mantel

Marcadores

•Codominates (microsatélites,isoenzimas)•Dominantes (ISSR's, RAPD's)

Miller, 1997



StructureStructureStructure

Structure

“Investigate population structure”Inferencia de la presencia de distintaspoblacionesAsignación de individuos

Estudio de zonas híbridasIndividuos migrantes

(Pritchard, Stephens& Donnelly, 2000)

Gran variedadde marcadores,secuencias



DnaSP

Rozas y Rozas, 1995

•Variación genética,

polimorfismos nucleotídicos•Diferenciación genética entrepoblaciones•Flujo génico•Pruebas de selección yneutralidad•Coalescencia•Mismatches.

Análisis de secuenciasalineadascodificantes y no codificantes

DNA Sequence Polymorphism



Usaremos los programas,

pero el objetivo esinterpretar los datos.



Perritos de las praderas(Cynomys ludovicianus)

Familia Sciuridae (ardillasterrestres)

Especie clave

Comunidades con fuerte filopatría de las hembras

Complejos sistemas detúneles

Presas importantes



Colonias de hasta 65,000 km2 con400 millones de individuos

Intensas campañas de exterminio

Poblaciones pequeñas y

fragmentadas

Distribución original muyamplia



Proyecto:

Norte de México

154 individuos

9 loci de microsatélites

5 poblaciones

400 pb regióncontrol mitocondrial

12

3

45



TFPGA

Heterocigosis esperada HE

FST FIS FIT

Distancias genéticas entre laspoblaciones

Mantel



Structure

Evaluar la identidad de laspoblaciones.

Poblaciones mezcladas

Asignar individuos a laspoblaciones migrantespotenciales.

!



DnaSP

Diversidad nucleotídica

FST y Nm entre poblaciones

Mismatches



Tools For Populations Genetic Analyses

TFPGA

Mark P. Miller 1997

http://www.marksgeneticsoftware.net/tfpga.htm

Software gratuitopero no Libre

(No Open Source)

Linux viaemulador ( Wine )



Expresión Fenotípica

Dominancia Completa: Uno de los alelos domina y “silencia” la

expresión del otro.(Pur / Pur)

Flor Púrpura

(Bla / Bla)

Flor Blanca

Codominancia: Ambos alelos se expresan y pueden ser diferenciadosen el fenotipo.

(Pur / Pur)

Flor Púrpura

(Bla / Bla)

Flor Blanca

Dominancia Incompleta: Ambos alelos se expresan de maneraconjunta generando un tercer fenotipo “combinado”.

(Pur / Pur)

Flor Púrpura

(Bla / Bla)

Flor Blanca

(Pur / Bla)

Flor Púrpura

(Pur / Bla)Flor Blanca y Púrpura

(Pur / Bla)Flor Púrpura Claro



Marcadores con ExpresiónCodominante

Codominancia: En cada uno de los locus, ambos alelos se

expresan y pueden ser diferenciados en el fenotipo.

Alelo AAlelo BLocus 1

Alelo AAlelo BLocus 2

Frec. alélicas:p = D + ½ H

= 0.4 + ½ (0.4)= 0.6

q = 1 – p= 1 - 0.6

= 0.4

Frec. GenotípicasObservadas :D = 4 / 10 = 0.4H = 4 / 10 = 0.4R = 2 / 10 = 0.2

Locus 1 :

Frec. GenotípicasEsperadas :D = p2 = (0.6)2 = 0.36H = 2pq = 2(.6)(.4) = 0.48R = q2 = (0.4)2 = 0.16

M d E ió



Marcadores con ExpresiónCodominante

RFLP: Restriction Fragment Length PolymorphismDNA total --> Restricción --> electroforesis(Jeffreys, Wilson, & Thein,1985. Nature, 314:67-73)

Isoenzimas : Proteínas --> electroforesis(Lewontin y Hubbi, 1966. Genetics 54:577-94)

SSR (Microsatélite): Simple Sequence repeatedPCR con Iniciadores específicos de secuenciaflanqueante a ssr --> electroforesis.

M d E ió



Marcadores con ExpresiónDominante

Dominancia Completa: En cada uno de los locus, uno de los

alelos domina y “silencia” la expresión del otro.

Locus 1Alelo PAlelo a

Locus 2Alelo PAlelo a

Frec. alélicas:p = D + ½ H

= ¿? + ½ ¿?q = R + ½ H

= 0.4 + ½ ¿?

Frec. GenotípicasObservadas :D = 6/10 o menos ??

H = 6/10 o menos ??

R = 4 / 10 = 0.4

Locus 1 :

(Presencia, Presencia) = Presencia(Presencia, Ausencia ) = Presencia(Ausencia, Ausencia ) = Ausencia

Pero... en H.W. : R=q

2

q= Rq= 0.4q=0.63

p=1−q=1−0.63

=0.37

M d E ió



Marcadores con ExpresiónDominante

RAPD: Randomly Amplified Polymorphic DNA.

DNA total --> PCR con iniciadores aleatorios (c/altoG+C) --> electroforesis(Williams et al., 1990. Nuc.Ac.Res.18(22):6531-35)

ISSR: Inter Simple Sequence Repeated

DNA total --> PCR con iniciadores semi-aleatorios (8-10 pbde di o tri nucleótidos repetidos) --> electroforesis (Zietwicks et al., 1994. Genomics 20:176-83)

AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism.DNA total --> Enzimas de restricción --> Productos derestricción se ligan con adaptador --> PCR selectivocon iniciadores basados en el adaptador -->electroforesis.(Vos et al., 1995. 23(21):4407-14)CODOMINANTES (real) --> Dominantes (datos)



Archivo de entrada

1,1 11,13

1,1 12,221,1 11,121,1 13,131,1 22,231,211,23

1,2 11,001,2 12,131,2 11,231,2 13,120,0 00,00

Notas NotasNotas Notas

Población

Subpoblación

Loci

No dato

Separador (Espacio)

Separador de loci ( , )

Línea de fin de datos



Structure



http://pritch.bsd.uchicago.edu/structure.html

Software gratuitoy Libre(Sí Open Source)

LinuxUnix

Structure



Definiendo subpoblaciones,poblaciones y especies:

Herramientas basadas enestadística bayesiana.

En genética de poblaciones es útil clasificar los



Las poblaciones naturales típicamente tienen unaestructura “anidada” (i. e. grupos dentro de grupos).

En genética de poblaciones, es útil clasificar losindividuos en poblaciones.



Pero, ¿cómo definimos nuestros “sets”de poblaciones?

Definimos “unidades de interés”.

●Poblaciones predefinidas.

Necesitamos DNA de diferentes fuentes

potenciales.......



Perfecto, vamos a muestrear!!

E t l t bj ti



Además, puede ser difícil determinar si nuestro

asignamiento de individuos representa unaasignación natural, en términos genéticos.

Esto generalmente es subjetivo:

Barreras físicas.Localización geográfica.

En principio sería útil confirmar si nuestra



En principio sería útil confirmar si nuestraasignación es consistente con la información genética que podemos obtener y por lo tanto sea

de utilidad para nuestra pregunta.

?

Además podemos tener estructura poblacional



p p“críptica” (cualquiera que no podamos detectar).

Incluso, de entrada desconocer el origen de lasmuestras.

Esto sin considerar la biología de nuestro bicho.●Movilidad.●Vectores de polinización y dispersión.

Conectividad o barreras aparentes.

No todo está perdido.......



Se han desarrollado mútiples métodos para

asignar individuos a poblaciones desconocidas.

Métodos basados en distancia.Principalmente matrices de distancia y unarepresentación gráfica

Métodos basados en modelos paramétricos(Pobabilísticos).

Principalmente bayesianos con MCMC.

p



¿Pero por qué STRUCTURE?



¿Pero, por qué STRUCTURE?

Es popular, más de 1700 citas, sólo para el artículo del

método del original, Pritchard et al., 2000. (BAPS < 200).

Funciona para marcadores codominantes y dominantes.

Es posible “adaptar” datos de secuencias.

Tiene interfase gráfica y los datos son fáciles de ingresar.

El método es muy robusto y tiene varias ventajas.

STRUCTURE.



Modelo donde existen k poblaciones (k puede ser

desconocida) cada cual está caracterizada por un juego de alelos en cada locus.

Básicamente, el método asigna individuos a las

poblaciones en base a sus genotipos, estimandosus frecuencias alélicas.

Tenemos entonces “clusters” (poblaciones) quu



Tenemos entonces clusters (poblaciones) quutienen un juego característico de frecuenciasalélicas.

Esto, por supuesto, permite crear otros

modelos.

Asumimos que cada población seencuentra en Hardy-Weinberg.



Usando estadística bayesiana

Frecuencias alélicas en

las poblaciones.

Pr (X | Z, P)

Genotipos

muestreados.

Número depoblaciones.

Bajo el teorema Bayesiano vamos a considerar lossupuestos a priori .

Entonces con el conocimiento



Entonces, con el conocimientode las frecuencias alélicas y del

número de poblaciones vamos apoder calcular la probabilidad denuestros datos.

Pr (X | Z, P)

Modelos a priori de Ancestría.



Modelo de “No admixture”.

Tenemos N bichos diploides con L loci, donde cada individuo se haoriginado en una de las k poblaciones, cada cual tiene su propio setde características.

Modelo de “Admixture”.

Este modelo permite considerar individuos “mezclados” mediante elparámetro QQkk que va a denotar la “proporción de mezcla” de cadaindividuo. Esto también se puede interpretar como la existencia deun grupo “ancestral” a partir del cual se originaron los demás.

Modelos a priori para las frecuencias alélicas.



Frecuencias alélicas independientes.

Las frecuencias alélicas de una población no van a dar informaciónacerca de las frecuencias alélicas de otra población.

Frecuencias alélicas correlacionadas.

Asume que las poblaciones divergieron de una ancestral (demanera simultánea), pero permite deriva. Modelo F, ya que serelaciona con los estimados de FST clásicos de Wright. Permitereconocer señales de estructuración más sutiles, aunque necesita

muchos loci.

Modelos de ligamiento



Modelos de ligamiento.

Permite la estimación del origen de regiones cromosomales,

es útil para distinguir fuentes de desequilibrio de ligamiento.

Desequilibrio de ligamiento “mixture”.Variación en la ancestría entre los individuos (que tanmezclados están los genomas de los individuos).

Desequilibrio de ligamiento “admixture”.Considera mosaicos (unidades ininterrumpidas) delcromosoma que son derivados de una u otra población.

N id D ilib i d li i “d f d ”



No se considera Desequilibrio de ligamiento “de fondo”

Se considera dentro de las poblaciones y decae enuna escala menor (miles de Kb's).

Por esto se pueden usar datos de marcadores ligados,pero no mucho.

i.e. no usar en poblaciones clonales.

El número de poblaciones (k) que sustentan los



El número de poblaciones (k ) que sustentan losdatos van a depender de que tan diferentespodríamos esperar las frecuencias alélicas en las

poblaciones.

Qué condiciones a priori vamos a especificar.



Una característica útil es la posibilidad deagregar información de poblaciones, paraasignar a ciertos individuos a una opoblación predefinida.



Datos no adecuados.

Alelos nulos.

Clonalidad.

Alta Endogamia.

Pocos loci.

¡¡¡¡¡¡Ahora sí, a correr mi STRUCTURE!!!!!



Sí, pero quedan todavía algunos “detalles”.

El parámetro , el cual va a “describir” la distribuciónde las frecuencias alélicas.

¿Qué pasó con ?

Entre más parámetros dejemos que el programacalcule, más tiempo tardarán los cálculos y lasprobabilidades tendrán mayor varianza.

No es tan grave, ¡pues ahora sí!



g ¡p

Pues no, viene el punto crucial:

Que tan largas queremos nuestras Cadenas deMarkov.

Usualmente 10,000 B.CH. y 30,000 MCMC basta,pero no siempre...... además esto puedealargaaaaaaaaaaaar el análisis. !

Bueno, ya lo corrí......



......... y ¿luego?

El número de poblaciones va a estar dado por el valor de k que tenga la probabilidad más alta.

Y, ¿esto qué?

Si las poblaciones son claras no debemos tener



problema para asignar k , aunque es posible queconforme aumenta k la probabilidad (Ln Pr(X|K)

incremente.

¿Entonces?

Existen varios métodos para decifrar la lista de



Existen varios métodos para decifrar la lista denúmeros que nos da STRUCTURE.

Efectivamente, el ojímetro:

(Cegelski et al ., 2006)

Otro método lo proponen en el propio manual de



STRUCTURE (Pritchard y Wen, 2004).

“El método” es el propuesto por Evanno et al. (2005).



al . (2005).Básicamente es un análisis de la tasa de cambio

en los valores sucesivos de LnPr para cada k .

P d b



Pero, no debemosolvidar que en este

análisis ad hoc perdemos el primer valor de k así como elúltimo (es decir, no

sabremos si k =1).

¿Y luegooooooo?

Esto no es tan grave, ya que si k = 1 el valor



de probabilidad debe ser el más alto, mientras

que su varianza asociada debe ser muyreducida.

Pero bueno, por qué no aplicar varios

métodos para estar seguros.

¡Al fin! ¿Verdad?



Ehhhh, sí.......... sólo necesitamos una “buena” compu.

Procesador Pentium D a 2.4 Ghz.1 Ghz en RAM.S.O. Linux-Ubuntu con interfase gráfica.>200 Gb D. D.

91 loci, 130 individuos.k de 1 a 15.50,000 B.CH. y 50,000 MCMC.30 repeticiones.

Alrededor de 300 horas, 13 días.



Pues, como que ya no dan ganas

de usar el programita.......



Science, 2004

STRUCTURE.

20 000 B CH 100 000 MCMC



20,000 B.CH. y 100,000 MCMC

Subdividieron la muestra en grupos de 20.

a prior i valores de k 2 a 10.

Frecuencias alélicas correlacionadas.

Modelos “admixture” y “no admixture”.

Valor de k con coeficiente de similitud.

STRUCTURE a 85 razas con 4-5 individuos no relacionados.



STRUCTURE con varios valores de k para identificar las poblaciones ancestrales.



¡Los Shar-Pei son lobos!



Nature 2007

La mitad de los humanos (y el 90% de los que estudiamosen la Fac. Ciencias) estamos infectados por Helicobacter



) p pylori .

Además tiene una fuerte estructuración, lo que puedereflejar la filogeografía humana.

Un análisis previo mostró cuatro grupos principales, de los

cuales dos se encontraban subdivididos, esto reflejaeventos de migración de las poblaciones humanas.

STRUCTURE.



A priori k de 2 a 15.

Método de asignación, probabilidad posterior.

10,000 B.CH. y 30,000 MCMC.

Modelo “No Admixture”.

Resultados comparados con BAPS y corroboradosmediante Arlequin.

796 aislados provenientes de 51 etnias.



Obtuvieron 6 poblaciones, con varios grados de ancestríaderivados de 5 poblaciones ancestrales.



Biological Invasions, 2008.

El transporte mediado por humanos puede alterar la variación genética de las poblaciones



g pintroducidas.

El estudio de genética de poblaciones de especiesinvasoras puede dar información acerca de lospatrones de invasión y eventos de introducción.

Todo esto permite diseñar un control efectivo.



Los patrones de estructuración son raros.

STRUCTURE

A priori k fue 2 a 18.



Repitieron 3 veces el análisis para cada k .

250,000 BC y 750,000 MCMC, empírico para llegar auna estable.

Modelo “Admixture”.

Frecuencias alélicas independientes.

Valor de k con método de ojímetro.



Se encontraron 8 grupos (k = 8), no obstante, los gruposmuestran baja estructuración.También, la asignación de individuos es “difusa”.

Mayor estructuración en América del Norte que enEuropa.



No hay aislamiento por distancia.

Múltiples eventos de introducción de diferentes genotipos.

Bueno esta bien



Bueno, esta bien......

Hay que darle una oportunidad alprogramilla ese............

Conclusiones en general.

Es un método robusto y sensible para encontrar estructura



Es un método robusto y sensible para encontrar estructuraen una muestra, además muy flexible.

Especialmente útil cuando no es posible una delimitaciónde poblaciones y mejor cuando podemos asignar cadaindividuo a cada población.

Es relativamente fácil meter los datos, la interfase gráficaes amigable y el programa estable.



Muy importante: conocer lasventajas y limitaciones de su

método.



Nota:

Los datos e información son reales, no obstante los datos son simulados, bajo el modelo real, perosimulados.

¡Gracias!

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