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8/19/2019 Reacciones multisustrato.docx

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Reacciones multisustrato

Hay muchas enzimas de este tipo en la célula (1S * 2P; 2S * 1P; 2S * 2P; 3S). Hay que tener

en cuenta que los coenzimas se contailizan como sustratos! as" #eremos an$lisis de

reacciones con %&'! por eemplo.

Reacciones bisustrato

'entro de todas estas! nosotros analizaremos de orma cinética las reacciones isustrato.

Principalmente trataremos de los mecanismos de reaccin con la terminolo+"a de ,leland. -l

estudio cinético de estos modelos es sencillo si las enzimas se austan a una cinética

micaeliana. Podemos determinar este comportamiento mediante un estudio de #elocidad

an$lo+o a los realizados anteriormente! sal#o que ahora! al tener #arios sustratos! hacemos

que #ar"e uno de ellos! deando el resto constante y saturante. a #elocidad entonces se hace

independiente de la concentracin de los dem$s sustratos! d$ndonos si es el caso! un cinética

hiperlica.

Hay #arios modelos! pero estudiaremos estos dos! los mayoritarios.

Mecanismo ping"pong, o de desplazamiento doble. Consiste en la formaciónde dos complejos binarios, presentando la característica de no requerir queprimero entren los sustratos y luego los productos. Se trata, por tanto, de laentrada de uno de los sustratos, quedándose la enzima con alguna parte delsustrato, saliendo el resto como un primer producto. Una vez tengamos !, se uneel segundo sustrato, que recibe esa parte que tomó la enzima, resultando unsegundo producto. "ay que tener en cuenta que ese #algo$ que se lleva la enzimapara luego pasárselo al segundo sustrato puede ser desde un grupo funcional

relativamente grande, %asta un electrón, como ya veremos.

Mecanismo secuencial, o de desplazamiento simple. Se caracteriza por laformación de un complejo ternario y dos binarios, además, de por la entrada de losdos sustratos primero y la salida a continuación de los dos productos. &sí como enel modelo anterior no es difícil encontrar un orden, ya que aquel sustrato queposea el grupo a transferir deberá ser el primero, en este caso se complicabastante. 'e %ec%o, e(isten dos tipos. l modelo secuencial ordenado, en el quesiempre los sustratos y los productos presentarán un mismo orden de entrada ysalida y uno al azar, en el cual podrán entrar y salir los sustratos y productos deforma aleatoria, pudiendo la enzima escoger el camino deseado para escogersustrato independientemente de la salida que tendrán los productos, que tambi)nserá aleatoria. n de*nitiva, podrá elegir el mecanismo de acción.

-stos tres modelos son los mayoritarios y los que estudiaremos.

Cinética de las reacciones bisustrato

&ntes de presentar la ecuacin de &lerty! que cumplen todos los modelos! hay que hacer

hincapié en la cinética micaeliana de estas reacciones. ,omo ya hemos dicho! si hacemos un


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sustrato #ariale manteniendo el otro constante y saturante! otendremos una hipérola

rectan+ular correspondiente al modelo /0/ (siempre que tratemos con una enzima

micaeliana! si es alostérica e#identemente no nos dar$ esta representacin). -n esa cur#a o

mediante linearizaciones podremos determinar las constantes ma y m! pero estas ser$n

aparentes si la concentracin del sustrato constante no es saturante. -sto es l+ico! ya que

entonces la #elocidad m$ima no podr$ alcanzarse al no estar ocupada toda la enzima con el

sustrato (compleo que considerar"amos -a).

4eniendo esto claro! #eamos ahora la ecuacin +eneral de &lerty.

Como dato, decir que el termino entra par)ntesis del denominador, no aparece enel mecanismo +ing+ong. sto nos permitirá en el futuro discriminar un tipo delotro. n esta ecuación aparecen t)rminos, que aunque se entiende de forma

conceptual, es conveniente que los describamos-

• KmA- Se trata de la constante de ic%aelis para el sustrato & cuando mantenemosconstante y saturante /01.

• KmB- Se trata de la constante de ic%aelis para el sustrato 0 cuando mantenemosconstante y saturante /&1.

• KsA- Se trate de la constante de disociación del primer complejo binario &, el cualobtenemos en el modelo secuencial ordenado2.

• KsB- Se trata de la constante de disociación del complejo primario 0, el cualobtenemos en el modelo secuencial al azar. n el modelo ordenado no tiene ning3n

sentido describirlo, sólo nos servirá como medio para determinar el orden, aunque%abrá otros. Como nota, %ay que apuntar que en el mecanismo secuencial al azar secumple la siguiente relación- KsA · KmB = =KsB · KmA. +or tanto, podríamossustituir un producto por el otro en la ecuación general de &lberty, evidentemente,sólo en los casos correspondientes a un modelo secuencial al azar.

• Vmax- Será igual determinada con & o con 0 variable, siempre y cuando, el otroest) en condiciones constantes y saturantes.

+ara asegurar esta representación %iperbólica a /01 constante, realizamos latransformación de la ecuación general de &lberty, al igual que lo %abíamos %ec%oen otras ocasiones. l resultado nos muestra claramente la dependencia de 4!ma(

de la concentración de sustrato al igual que 5!m&. stas constantescorresponderían a las obtenidas cuando el sustrato constante no llega a lasaturación. Si %acemos /01 constante y saturante-

5m0 del denominador 6para 4!ma(2 se %ace despreciable frente a /01, de modo,

que podemos eliminarla. l resultado,.


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l producto 5s& 7 5m0 6para 5!m&2 y 5m& del numerador y 5!m& deldenominador se %acen despreciables frente a /01, pudiendo eliminar esta

concentración. l resultado,.

Discriminación entre Ping"Pong y secuencial. Determinación de los

parámetros cinticos

Como ya %emos visto en la in%ibición, mejor que en la representación %iperbólica,utilizamos las linearizaciones para estos menesteres. &l igual que durante toda laasignatura, utilizaremos la representación de "anes8oolf.

Ping"Pong

9ecordemos que en este modelo, no aparece en el divisor el producto 65s& 7 5m02con lo que la linearización sería la siguiente para el ejercicio : de la %oja ;, donde/


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n este caso, ya que no nos interesa el corte en X , representaremos la otravariación que observamos, la de la pendiente, y la representamos frente a lainversa del sustrato que la %ace variar, /01. Siguiendo con el ejercicio :, elresultado sería el siguiente.

Aracias a la ecuación de la recta podemos determinar-

4ma(- +or la ordenada en el origen, B4ma(.

5m0- +or el corte en X , B 5m0.

Dodo esto, sobre todo 4ma(, nos permitirá calcular el valor de 5m& por la ordenadaen el origen de la representación primaria, 5m&4ma(.

E con esto, ya tendríamos todas las constantes. Dambi)n se e(plica esteprocedimiento en el propio ejercicio : de la %oja ;.

&demás de la enzima del ejercicio, tambi)n presenta este modelo cin)tico lacetoacilCo&transferasa, que pasa Co& del succinilCo& al acetato, dando comoproductos ácido succínico y acetoacetilCo&. videntemente, como ya dijimos, estemodelo no deja muc%as dudas acerca del orden, ya que la mol)cula que porta elgrupo a transferir debe ser la primera en entrar dejándoselo a la enzima, quepasará a ser ! al soltar el primer producto. 'espu)s ! pasará a recoger elsegundo sustrato, aquel que tiene recibir en grupo.

,ecuencial

Si para distinguir el modelo +ing+ong, decíamos que linearizábamos la ecuacióngeneral de &lberty, es evidente que debemos %acer lo mismo en este caso. Fa grandiferencia que podemos visualizar mediante la representación, es la ordenada en elorigen, que varía al ser dependiente de la concentración de cosustrato constante.sto es debido a la aparición del producto 65s& 7 5m02 en la ecuación general. +ara

poner un ejemplo, escogemos el ejercicio G de la %oja ;, donde /alato1 = /&1 y/


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&l igual que sucedía en el modelo +ing+ong, la complejidad de la pendiente y de laordenada en el origen, %ace que no podamos calcular ninguna constante en estarepresentación, si e(ceptuamos 5s&. sta constante se determina mediante elvalor de x en el punto de corte de las rectas. +ara conseguir estos valores debemos

recurrir, por tanto, a la representación secundaria. n este caso tenemos dosparámetros que varían con respecto a /01, la pendiente y la ordenada en el origen,siendo necesaria la representación de ambas rectas pera determinar todos losparámetros. sto es así ya que no obtenemos un valor limpio para 4ma( %asta larepresentación de las pendientes.

Fa determinación de las constantes, para el mecanismo secuencial, se resume enla siguiente tabla.

Vmax

n la representación secundaria pendiente 6Bria2 4s B/01. +or el corte de larecta con el eje Y . >tras muc%as formas, pero en este caso es un cálculodirecto, necesario para calcular las demás constantes.

KmA

n la representación secundaria ordenada 6Bria2 4s B/01. +or el corte de larecta con el eje Y . ediante el valor de la y del punto de corte de las rectasa distintas concentraciones de 0 en la representación primaria

KsA

n la representación primaria /&1 4 4s /&1. 4alor de la x del punto de cortede las rectas a distintas concentraciones de 0. +or la pendiente de larepresentación secundaria ordenada 6Bria2 4s B/01.

KmB

+endiente de la representación Bria, de la secundaria ordenada 6Bria2 4s B/01 y secundaria pendiente 6Bria2 4s B/01, además de corte con el eje X dela representación secundaria pendiente 6Bria2 4s B/01.

Discriminación entre ordenado y al aar

Ea sabemos entonces que la representación /sustrato variable14 4s /sustratovariable1 nos sirve para distinguir entre el modelo +ing+ong y secuencial, perodentro de este 3ltimo %ay dos posibles forma de organización, el modelosecuencial ordenado y al azar.


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Una forma de discriminar ente uno y otro es la in%ibición, es decir, el tipo dein%ibición reversible que produce un producto de la reacción, manteniendo unsustrato variable y el otro constante. stas variaciones son dependientes delorden. sto nos permite formar un patrón de in%ibición, el cual se representa en latabla de las %ojas. Fa más característica es, sin duda la del secuencial al azar, quepresenta todas las variantes como competitiva. sto es fácil de e(plicar, ya que silos dos sustratos y los dos productos no tienen una disposición de entrada y salida*ja, querrá decir que + y I podrán salir y unirse a la enzima aleatoriamente, o loque es lo mismo, que ambos serán complementarios del C.&. sto mismo sucederácon los sustratos. &&, 6independientemente de a quienllamemos &, 0, + o I2 nos dio la siguiente grá*ca.

"ay que recordar que los diferentes tipos de n%ibición reversible se diferenciabande forma visible en las linearizaciones, como esta de "8, en la cual se in%ibe adiferentes concentraciones. Fas diferencias en la pendiente, la ordenada en elorigen o ambas nos mostrarán el tipo de in%ibición. n el ejemplo %emos in%ibidocon >&& manteniendo constante el cosustrato


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caso, nos diría de forma evidente que el malato no entra primero, o que el >&& noes el 3ltimo en salir, tambi)n podría llevarnos a un error muy grave. s, por tanto,importante el mantener el orden a un lado, y %acer 3nicamente referencia a losnombres reales de los sustratos.

4olviendo al ejemplo, el patrón mi(to, sabiendo por el apartado anterior que es

secuencial nos muestra de forma inequívoca, independientemente del orden, quese trata de un proceso ordenado, al no presentar el modelo al azar in%ibiciónmi(ta.

'rden de entrada y salida1 2ntercam*io isotópico en el e+uili*rio

Una vez sabido si es +ing+ong o secuencial ordenado 6es una estupidez intentardeterminar el orden del modelo al azar Kno cre)isL2, %ay que intentar encontrar elorden. Ea dijimos que en el modelo +ing+ong era más fácil pero, a3n así, %ayveces en los que es necesario un estudio más.

+ar determinar el orden cuando no es tan sencillo 6en ambos modelos2 nación laprueba llamadaintercam*io isotópico en el e+uili*rio. sta prueba consiste endejar que la reacción llegue al equilibrio. Una vez en ese estado, donde lavelocidad neta es M, se aJade una marca radiactiva y un par, 6productosustrato2 aunas concentraciones que no alteren el equilibrio, es decir, que si la razón en elequilibrio entre dos especies es B-BM, %abrá que aJadir el par en esa razón. ncuanto al sustrato caliente, debe encontrarse en una concentración tan ín*ma queno altere de forma susceptible el equilibrio. 'e esa forma. Fa velocidad netaseguirá siendo M, pero %abrá algo que podemos medir, la velocidad de intercambio

isotópico 6ej. &IN velocidad de intercambio isotópico=2. Ea que se %a aJadido sólo una especie marcada 6siempre uno de los sustratos2,

esa mol)cula se transformará a su producto correspondiente a una velocidad quedependerá de las concentraciones. sta dependencia de las concentraciones

deriva de las propias ecuaciones cin)ticas 62. 'e forma conceptual, es fácil de entender que /I1 aumentaría ya que-

"ay velocidad de formación de I, con lo que parte de la marca en & setransformaría.

"ay velocidad de desintegración de I, pero estas que se desintegrarían a t=M6momento en el que se aJade la marca y el par2 no estarían marcadas, por lotanto, la velocidad irá aumentando.

l aumento en la velocidad no es muy rápido, por el secuestro de la enzima

6in%ibición competitiva con este par, tanto en ordenado como en el azar2.

Se llega a la saturación, ya que %abrá un momento en el que la marca llegue asu equilibrio 6no químico, pero sí probabilístico2 con lo que la concentración y lavelocidad de formación se detendrán, como se observa en las %ojas.

Si aJadimos más concentración del par, el equilibrio se mantendrá, pero lasconcentraciones de ese par aumentarán. sta es la razón del aumento de


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pendiente que se observa en la grá*ca /I1 4s t, o lo que es lo mismo, la velocidadneta será M, pero %emos dic%o que las velocidades de formación y desintegraciónson directamente proporcionales a las concentraciones, de modo, que un aumentode las mismas %ará aumentar tambi)n a las velocidades, lo que se traducirá enuna velocidad de intercambio tambi)n mayor.

sto se observa mejor en la grá*ca de velocidad de aparición del productoradiactivo con respecto del par. Dambi)n se ve que el aumento llega a unestacionario, debido a la limitación en la cantidad de enzima, que estarácompletamente saturada no pudi)ndose aumentar la velocidad.

"ay varios ensayos, todos coinciden en el marcaje de un sustrato, no de losproductos, con un patrón de par, o el suyo, o el contrario. Dodos ellos darán unpatrón saturante como el de la grá*ca, e(ceptuando uno. sta diferencia se dará

en el modelo secuencial ordenado, cuando ensayemosfrente al par 0+. n este caso, se observará un aumento en la velocidad de

formación del producto radiactivo al aumentar el par, pero a diferencia de losdemás ensayos, llegará un punto en la que la velocidad descenderá, no semantendrá.

Fa grá*ca será, por tanto, como la que se e(pone en el ejercicio G de la página ;.sto nos indicaría de forma clara que el par con el que estamos trabajando 6elcontrario del que tiene la marca2 es el central, y por eso, un e(ceso en suconcentración %aría que la enzima quedará secuestrada en los pasos centrales. &ldisminuir los equilibrios que nos dan la enzima libre, el poco primer sustratomarcado que pueda unirse a ella, quedará atrapado en esos pasos centrales,disminuy)ndose la velocidad de intercambio. l par &I en este caso actuaríancomo limitantes, y %abría que aumentar tambi)n su concentración si queremosque aumente la velocidad de intercambio. l modelo de Cleland, siguiendo con elejercicio G será el siguiente-

-n de0niti%a# esta prue*a nos permite o*tener el orden de sustratos y

productos# en el caso de o*tener un e$ecto de descenso de la %elocidad

de intercam*io al tra*a)ar con el par contrario de la marca a3adida.

+uede que no %aya quedado claro que la determinación del par no esaleatoria, sino que responde a cuestiones químicas. +ara una mejor compresióndebemos *jarnos en los ejercicios : y G de la %oja ;, en los cuales los pares son&& no el


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m)todo para resolver los sistemas de determinantes que se nos formarían. Fadiferencia con los m)todos utilizados por nosotros, es que a%ora se tienen encuenta las constantes individuales. 'e este m)todo deriva la ecuación general de&lberty.

n la %oja que dio la profesora, se dilucida la ecuación para el mecanismo

+ing+ong, y se nos dice que la ejecución del m)todo sería muy similar a la que%abría que realizar para el modelo secuencial.

Dodo comienza dibujando el ciclo de la reacción en forma de *gura geom)trica 6eneste caso nos dará un cuadrado2 teniendo muc%o cuidado de marcar todas lasconstantes individuales. n segundo lugar se representan las posibles *guras conun lado menos, y llevando esas *guras sobre la del ciclo vamos determinandocuales serían posibles. sta posibilidad no es otra de la de alcanzar , es decir, simediante la *gura con un lado menos podríamos conseguir libre a partir de lasotras especies. +ara ello debemos seguir las @ec%as, teniendo muy en cuenta lairreversibilidad 6consideramos, al igual que en el modelo O que las etapas deformación de producto sin irreversibles al tiempo de medida2, que será la que nos

permita eliminar algunas. n nuestro caso, las dos primeras no serían posibles, yaque no %ay continuidad en las @ec%as, al ser el lado k ; irreversible y %acia abajo.Se determina entonces /1 6especie que buscábamos2 mediante las dos *gurasrestantes posibles. 'e cada uno de esos cuadros se multiplican todas lasconstantes y las concentraciones de las especies entrantes 6para el sentido quenos interesa, así & no entra en la reacción k B del tercer cuadrado2, y se suman ala de las demás *guras posibles 6en nuestro caso y como se ve en la %oja semultiplican todas las constantes de los tres lados y por /01 que entra en k ? y sesuman a la multiplicación de las constantes de los tres lados y la /01 de la cuarta*gura.

'e este modo se calcula /1, y de la misma forma se calculan /&1, /!1 y /!01,desec%ando las *guras que no permitan llegar a esa especie, en cada caso ysumando los productos de las constantes y de las especies entrantes de cada unade las *guras posibles. stas e(presiones no nos dan las concentraciones reales,sólo serán un paso %acia lo que queremos llegar.

Cuando ya tenemos todas las especies en las que se divide /1D, %acemos lo desiempre, despejar la especie que se encuentra en la ecuación gen)rica develocidad, que en este caso es v = k P 7 /!01 por el %ec%o de ser la 3ltima etapareversible. "emos dic%o que las concentraciones %alladas no son reales, ya que loque %ay de de*nir es la razón con la enzima total, y por eso dividimos /!01 por elsumatorio de todas las especies anteriores 6/1D2.

Una vez formada la razón, agrupamos las cosas comunes y sacamos una fracción,la cual multiplicada por /1D, nos dará /!01 pasa sustituir en la ecuación develocidad. 'espu)s de una serie de transformaciones obtenemos la ecuación parael mecanismo +ing+ong, donde se pueden observar los valores de las constantescin)ticas-

• K cat- Constantes implicadas en transformación. s la fracción del numerador. safracción multiplicada por /1D nos da 4ma(.


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• 5m&- +rimera fracción de constantes, multiplica a /01 en el denominador.

• 5m0- Segunda fracción de constantes, multiplica a /&1 en el denominador.

Se observa que no aparece el producto 5s& 7 5m0, que sí lo %ará en el modelosecuencial. n de*nitiva, saber de donde sale la ecuación general de &lberty, nada

más.Cuidado, en el mecanismo pingpong %ay mi(ta. "ablamos de %acerlo sabiendoque es secuencial.

9evisar el tema de in%ibición reversible.

+ondremos en ejemplo de las %ojas, pero como veremos más adelante %ay variasposibilidades

Si no es así desmentidmelo, pero creo que la enzima no diferencia isótopos, pero laprobabilidad nos dice que la marca se distribuirá al :MQ.

F>AT&

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