seminario chikv
TRANSCRIPT
Introduction
The human skin is a complex organ composed of multiple cell types, which plays a key role in the detection and defenseagainst pathogens.
Keratinocytes are the most abundant cells of this organ, are important because they play a key role in the detection and control of pathogens, their promotion by some virus (CHIKV) stimulates an intense antiviral program which differs from some other virus, that on the contrary are aimed these cells.
CHICUNGUNYA VIRUS
Vector
•Aedes albopictus
•Aedes aegypti
Virus
•Alphavirus with a positive sense single stranded RNA genome of about 11.6kb
Symptoms
•sudden onset
•biphasic fever
•strong joint pain or stiffness
•Rash (usually maculopapular)
•muscle pain,
•headache,
•fatigue
•nausea or vomiting
•iridocyclitis or uveitis
•retina lesions
QUERATINOCITOS
• Son las células predominantes de la epidermis (90% APROX)
¿QUE SON?
• Barrera contra daños ambientales (patógenos, perdida de calor, rayos UV, perdida de agua)
• Inductores de respuesta inmuneFUNCIÓN
Relación
CHIKV the particles are endocytosed by
keratinocytes
Expression of non-structural proteins
CHIKV activates an innate immune
response in human keratinocytes
transcriptional induction of innate
antiviral genes upon CHIKV challenge
keratinocytes are unable to replicate
the virus
In these cells, expression of non-structural proteins
and synthesis of genomic RNA are
impaired
Materiales y Metodos
Celulas
• Aedes albopictus
• Queratinocitos epidérmicos primarios
• HaCaT
• HEK293T
Virus
• pCHIKV-LR-3′GFP
• CHIKV(mCherry)
Anticuerpos y reactivos
• Inhibidores de BX795 y AG490
• C42 mAbs
• Anti-Rab5 mAbs
• Anti-mouse Ig
• Alexa 647-labeled
• Anti-human IFNα/β neutralizing serum
Materiales y Métodos
RT-PCR
Monitoriza la producción de nuevas
partículas virales
cuantifica ARN genómico viral en las
células
Examina la inducción transcripcional de genes antivirales
Amplificación enzimática de una secuencia de RNA
Materiales y Métodos
Inmunofluorescencia
la capacidad de CHIKV para ser endocitado por los
queratinocitos
detección de proteínas estructurales virales
Unión de anticuerpos a una sustancia fluorescente para demostrar la presencia de una molécula determinada
Materiales y Métodos
PCR en tiempo real
Cuantifica cantidad de ADN en la muestra
Producto de amplificación monitorizado conforme
avanza la reacción
Detecta de manera muy sensible los niveles de
ARNm
Detectar y cuantificar las secuencias especificas de ácidos nucleicos mediante
el uso de reporteros fluorescentes en la reacción
Materiales y Métodos
Transfección
Usada para infectar las células
Producción de pseudotipos virales
Permite la introducción de
material genético en las células
Primary and immortalized human keratinocytes are poorly permissive for
CHIKV replication
Células • NHEK
• HaCaT
• 293T
Proceso • Se uso GFP para el
control de la replicación
Tiempo • 24 horas
• 48 horas
CHIKV particles are endocyted by HaCaTcells
Células
• HaCaT.
Proceso
• Se incubaron con CHIKV. MOI=100
• Por 1hora a 37C.
Tinción
• Anti-capsidmAbs
• Alexa 647 marcado con aglutinina de germen de trigo (WGA)
CHIKV particles are endocyted by HaCaTcells
Células HaCaT.
Sometidas a CHIKV por 10minutos
MOI=500
Para aumentar la probabilidad de detectar CHIKV en el citoplasma.
Micrografía
Presencia de partículas virales en el citoplasma.
CHIKV particles are endocyted by HaCaTcells
Se evaluó
•En HaCaT
•La capacidad el CHIKV de colonizar endosomas Rab5
Qué se uso
•Antígenos específicos de proteínas de caspide : VERDE
•Antígeno Rab5: ROJO
Qué se obtuvo
•Presencia de gránulos amarillos/naranja.
•En el citoplasma expuesto a CHIKV por 30 minutos
Keratinocytes membranes support fusionwith CHIKV envelope glycoproteins
pCMV: Promotor de Citomegalovirus.
Transporta los genes E3/E2/E1. Codón optimizado del CHIKV.
Keratinocytes membranes support fusionwith CHIKV envelope glycoproteins
EF1a: Factor de elongación junto con un potenciador.
Facilita los procesos de transcripción.
VSV-G (estomatosis vesicular)
Keratinocytes membranes support fusionwith CHIKV envelope glycoproteins
pHR: péptido de señalización especifica.
Transportar el GFP (proteína verde fluorescente).
HIV: necesario para la incorporación de LTR Y VLPS.
VLPS (pseudoparticulas retrovirales).
LTR (reparación terminal larga)
Keratinocytes membranes support fusionwith CHIKV envelope glycoproteins
Las células infectadas con CHIKV
liberaron pseudoparticulas de
100-120nm.
Presentaban una caspide crónica
característica del VIH1 maduro.
Pseudotipos de control: vectores que
codificaban la glicoproteína P del
VSV-G
Keratinocytes membranes support fusionwith CHIKV envelope glycoproteins
Análisis de Western blot.
Lisis celular Proteínas retrovirales en
estado inmaduro
Células libres
Proteínas retrovirales que se dividieron de
manera eficaz en caspsidas maduras
Keratinocytes membranes support fusionwith CHIKV envelope glycoproteins
•VLPs de CHIKV y de VSV-G
•Células 293T y HaCaT
Incubación
•Demostrar la funcionalidad de los reactivos (VLPs).
Para •La capacidad de las
glicoproteínas virales de fusionarse con la membrana de las células
•Dirigieron la expresión de GFP
Se demostró
Analysis of early CHIKV replication eventsin human keratinocytes
Pasos de replicación del CHIKV en:
293T.
HaCaT.
MOI=10.
Por 9, 14 y 48 horas.
CHIKV
Se marco con mCherry (rojo) que marca proteínas no estructurales nsP3.
Se hizo QRT-PCR
Para evaluar la acumulación de CHIKV RNA en las células.
Por 6, 9 y 14 horas.
CHIKV replication in keratinocytes withperturbation of the IFN signalling
pathway
Células HaCaT.
Infectadas con siRNA.
Para IRF3 y IRF7.
Se incubo por 72 horas.
Prueba de western blot.
Discussion
PERSON WHAT HE SAID? YES NO
Beglin
Here, we report that CHIKV poorlyreplicates in cultures of primaryand immortalized keratinocytesand despite differentiation status of these cells may be crucial forinfection/replication of someviruses (e.g. human papillomavirus) CHIKV behaved independentlyfrom the maturation stage of keratinocytes used in this study.
✔
Discussion
PERSON WHAT HE SAID? YES NO
Bernard
Despite internalizing viral particlesthat colocalized with Rab5-positive endosomal compartmentscompetent for CHIKV entry in permissive cells and while supportingfusion with viral membranes, keratinocytes are unable to replicatethe virus. In these cells, expression of non-structural proteins and synthesis of genomic RNA are impaired.
✔
Discussion
PERSON WHAT HE SAID? YES NO
Surasombatpattana
keratinocytes were proposed as keyplayers of early arboviral infectioncapable to produce high levels of infectious viruses in the skin favoringviral dissemination to the entirebody.
✔
Discussion
PERSON WHAT HE SAID? YES NO
Salvador
It is well known that alphavirusesdisplay a wide spectrum of target cells. Regarding CHIKV, a largevariety of in vitro susceptible cellshas been identified, includingfibroblasts, hepatocytes, neurons, astrocytes, microglial cells, neuroblastoma cells, skeletalmuscle progenitor cells, epithelialand endothelial cells
✔
Conclusions
keratinocytes represents a primary barrier againstinfection of CHIKV.
keratinocytes prevent the replication of CHIKV.
Keratinocytes membranes stimulate the fusion withCHIKV.
Other cells are permissive to replication and propagation of chikunguya such as kidney cells.