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18.04.2018 Köln | Axel Hillmer | Istitut für Pathologie, UK Köln

State of the Art der Diagnostik somatischer Mutationen

18.04.20182 Köln | Axel Hillmer | Institut für Pathologie, UK Köln

Erklärung nicht-finanzieller Interessen

› 2017 – 2018 Molekularpathologe, Institut für Pathologie desUniversitätsklinikums Köln

› 2016 – 2017 Head of Clinical Cancer Genomics, TRON –Translationale Onkologie gGmbH

› 2016 - 2018 Group Leader, Genome Institute of Singapore


Fragestellung

› Es werden molekulare Marker untersucht, die für die richtige Diagnose und die Wahl der besten Therapie benötigt werden

› Es werden kontinuierlich neue Therapien in klinischen Studien getestet und zugelassen

› Die molekulare Diagnostik muss sich ständig anpassen


Ausgangsmaterial› Zytologische Präparate

› Blutplasma

› Paraffinblöcke


Klassische molekularpathologische Untersuchungen zur Mutationsbestimmung

› Sanger-Sequenzierung

› Pyrosequenzierung

› High Resolution Melting Analyse (HRM)

› quantitative allel-spezifische PCR

› Allel-Specific-Refractory-Mutation-System (Cobas)

› Fragmentlängenanalyse

Eignen sich gut für die Identifizierung wenigen Hotspotpunktmutationen

Goncalves Diniz et al. 2015 Tumor Biol


Vergleich von konventionellen Techniken und Parallelsequenzierungen

Sanger Sequenzierung

Vorteile

› Einfache Assay-Entwicklung

› Leichte Datenanalyse

Nachteile

› Einzellokussequenzierung

› Kein Probenmultiplexing

› Hohe Kosten/Base

› >20% Tumorzellgehalt

› 20 ng DNA pro PCR

› Nicht gut skalierbar

Next Generation Sequencin (NGS)

Vorteile

› Probenmultiplexing möglich

› Kein höherer Arbeitsaufwand für mehr Regionen

› Geringe Kosten/Base

› Wenig Tumorgewebe nötig (Biopsien, zytologisches Material, Plasma)

› >10% Tumorzellgehalt

› 20 – 200 ng DNA pro Probe

› Gut skalierbar

Nachteile

› Komplexe Assay-Entwicklung

› Komplexe Datenanalyse


EGFR12%

ALK3%

ROS1 1%

BRAF 3%, (1.5% V600E)

Warum benötigen wir Multiplex-Testung?

TKIs für zugelassene gezielte Therapien für ca. 18% der Patienten mit NSCLC

› EGFR: Gefitinib, Erlotinib, Afatinib

› EGFR T790M: Osimertinib

› ALK-Translokation: Crizotinib, Ceritinib, Alectinib

› ROS1-Translokation: Crizotinib

› BRAF V600 Mutationen: Dabrafenib+Trametinib

Möglichkeiten für Off Label Therapien

› HER2 Amp: Trastuzumab

› MET Amp: Crizotinib

› MET Ex 14 Skipping Mutation: Crizotinib

› RET Translokation: Cabozantinib, Alectinib

Weitere mögliche zukünftige Targets

› FGFR1, -2, -3, -4, NTRK1, -2, -3 …


DNA Population Separate Amplifizierung eines jeden Fragments

Separates Sequenzieren einzelner Amplikons

C G C C AC T/C A G CSanger Sequenzierung = First Generation Sequencing

max:

2 Kb

DNA Population

Parallel Sequenzierung = Next Generation Sequencing (NGS)

Parallele klonale Amplifizierung vieler Fragmente

max:

200 Gb

Parallelsequenzierung vieler Amplikonklone

Vergleich von konventionellen Techniken und Parallelsequenzierungen


> 10 ng

PCR- vs. Capture-basierte Parallelsequenzierung

PCR-basiert Capture-basiert


2. Schritt Anreichung (Enrichment) mittels Custom Sonden

Quantifizierung & Poolen der Proben

Fragmente: 250 - 300 bp

2. PCR (12 Zyklen)

Zielfragmente

SequencingStreptavidin Beads

80-120 bp

biotinylierteSonden

› Hybridisierung biotinylierter Sonden mit den Zielregionen

PCR- vs. Capture-basierte Parallelsequenzierung


Capture-Seq

Gleiche Ausgangsmoleküle. Duplikate können bioinformatisch eliminiert werden

Amplikon-Seq

Verschiedene Ausgangsmoleküle?

PCR Artefakte beim Amplikon-Sequenzieren


Peng et al. BMC Genomics (2015) 16:589

Molekulares Barcoding


AAA

AA

C

C

C

T

Molekularer BarcodeBarcode Gruppe

1

2

3

4

Konsensus Allel

A

A

-

-

A

A

Kollabieren der Barcode Gruppen

Mutations-Call

A

Molekulares Barcoding


Lungenadenokarzinom, HER2 amp, Ratio 11,55

› CNVkit Software: https://cnvkit.readthedocs.io/en/stable/

› Wildtyp-DNA aus FFPE Gewebe als Referenz

Detektion von genomischen Aplifikationen aus DNA-Capture-Seq Daten


Identifizierung von Fusionsgenen

Genomischer Fusionspunkt kann durch DNA Capture-Seq identifiziert werden• Amplikon-basiert ist nicht möglich• 1 Fusionspartner kann unbekannt sein, ist jedoch

schwieriger• Bioinformatik ist komplex• Prozess erfordert viel Optimierung

Transkript-Fusionspunkt kann durch gezielte RNA-Seqidentifiziert werden• Amplikon-basiert ist möglich (Capture auch)• 1 Fusionspartner kann unbekannt sein (anchored primer)


Detektion von Fusionsgenen mittels DNA-Capture-Sequenzierung

Heydt et al., Ann Oncol 2016

18.04.201817 Köln | Axel Hillmer | Institut für Pathologie, UK KölnZheng et al. 2014 Nat Med

Anchored Multiplex PCR zur Identifizierung von Fusionen mit unbekanntem Partner


FISH: Zyto Light SPEC ROS1 Dual Color Break Apart Probe (ZytoVision)

Grüne Signale

Detektion von Genfusionen mittels gezielter RNA-Sequenzierung


Som

atis

che

Mu

tati

on

en/M

b

Lawrence et al. 2013 Nature

› Durch Missense-Mutationen entstandene körperfremde Protein-strukturen (Neoantigene) sind Angriffspunkte für das Immunsystem.

› Immuncheckpointinhibitoren zeigen insbesondere bei Tumoren mit hoher Mutationslast (Tumor Mutational Burden TMB) Therapieerfolge

Mutationslast als Biomarker für Immuntherapien


› Zur Zeit ist die Expression der Zielmoleküle (z.B. PD-L1) der Immuncheckpointinhibitoren der diagnostische Biomarker

› TMB wird sehr wahrscheinlich bald als diagnostischer Biomarker zugelassen

› Was ist eine kostengünstige und genaue Methode, TMB zu bestimmen?

› DNA-Capture-Seq von 1 Mb kodierender Region erlaubt die Abschätzung von TMB

Chalmers et al. 2017 Genome Medicine

DN

A C

aptu

re-S

eq(1

,1 M

b)

Exome Capture-Seq

Mutationslast als Biomarker für Immuntherapien


Schwarzenbach et al., Nat Rev Cancer 2011

Liquid Biopsy › Zulassung für Osimertinib für T790M (TKI Resistenz) bei NSCLC

› Kann von Gewebe oder Plasma mit einem validierten Assay getestet werden

Vorteile

› Minimal-invasiv

› Kann mehrfach wiederholt werden

Nachteile

› DNA Menge ist sehr gering -> negative Ergebnisse sind nicht informativ

Herausforderung

› Sensitivität der Detektionsmethode


Sensitive Detektionsmethoden – digitale droplet PCR (ddPCR)


1 Primerpaar, 2 Sonden

mut

aq wt

mut + wt

› Theoretische Sensitivität1:100,000 (0,001%)erfordert > 1 µg DNA

› Praktische Sensitivität1:1,000 (0,1%)

Detektion von T790M durch ddPCR


Sensitive Detektionsmethoden – ddPCR mit Standard-DNA

› Gute Konkordanz der Allelfrequenz zwischen ddPCR-Werten und der Horizon Angabe zur Test-DNA

› Detektion bis 0,1% Allelfrequenz

› Proben sollten in Triplikaten gemessen werden

Horizon Standard DNA: „DNA derived from engineered human cell lines, containing fragmented human genomic DNA (average size 160 bp) resembling cfDNA”


5% T790M

Sensitive Detektionsmethoden – NGS mit Standard-DNA

1% T790M 0.1% T790M

› Sensitivität bis 1%


› ZielHarmonisierung der Versorgung von Patienten mit fortgeschrittenem Lungenkrebs und Gewährleistung bestmöglicher Standards

› Start1. April 2018

› Gefördert durch die Deutsche Krebshilfe

Nationales Netzwerk Genomische Medizin (nNGM)


Task Forces

› Molekulare Diagnostik

› Qualitätssicherung

› Dokumentation und Evaluation

› Beratung

› Klinische Studien

› Forschungsanbindung

Nationales Netzwerk Genomische Medizin (nNGM)

Interpretation von Mutationen

› Evidenzkategorien

Zugelassenes Medikament

Noch nicht zugelassenes Medikament

Off Label Therapie

Klinische Studie

Keine Therapierelevanz

› In der Pathologie UK Köln sind > 1.100 verschiedene non-silent Mutationen für Lungenkrebs in 14 Genen

› Der Großteil dieser Mutationen ist von unbekannter funktioneller Konsequenz

› Gute Koordination zwischen Pathologie und Onkologie für die Interpretation von Mutationen


› NGS ist die Technologie der Wahl für die molekulare Diagnostik

› Es gibt technische Details die zu berücksichtigen sind, um eine gute Qualität zu erreichen

› Es bedarf eines intensiven Austauschs zwischen Pathologie und Onkologie für die richtige Interpretation der Daten

Fazit

Danke!

Besonderer Dank an Sabine Merkelbach-Brusefür einen Großteil der Präsentation

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