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GALACTOSEMIA Y FRUCTOSURIA

Química Biológica Patológica

���� Dra. Silvia Varas

qbpatologica.unsl@gmail.com

Tema:9 (Bolilla 9)

TEMA 9:� Galactosemia. Manifestaciones clínicas.

Metabolismo de la galactosa en la galactosemia. Defectos enzimáticos. Metabolito tóxico. Diagnóstico. Prevención. Detección de portadores.

� Fructosuria. Metabolismo de la fructosa. Fructosuria esencial. Intolerancia hereditaria a la fructosa. Cuadro clínico. Mecanismo bioquímico. Diagnóstico.

Origen de Galactosa

� Leche� << Ligada con enlaces tipo β en ciertas

legumbres, verduras y frutas.� << En forma de galactocerebrósidos y

gangliósidos en algunas vísceras de animales

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Absorción de Gal

� SGLT1 � GLUT 2� GLUT 5

GLUCEMIA SANGRE

Glucosa-6-Fosfatasa

Via de las Pentosas→ → →D-Ribosa-5-P +NADPH + CO2

Glucosa-6- Deshidrogenasa

Via Glicolitica→ →→Piruvato →→→ Acetil CoA

Ciclo Krebs → → CO2+ H2O

Premio Nobel, 1970

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� “por su descubrimiento de los nucleótidos de azúcar y su rol en la biosíntesis de carbohidratos”

Metabolismo Normal: Vía Leloir

VIAS DE METABOLIZACION DE GALACTOSA

β-Cetogalactónico

Oxidación

Descarboxilación

D-xilulosa

Fosfatasa

Aldosa ReductasaGal Deshidrogenasa

UDP-Glu Pirofosforilasa

UDP-Gal Pirofosforilasa

VIAS DE METABOLIZACION DE GALACTOSA

β-Cetogalactónico

Oxidación

Descarboxilación

D-xilulosa

Fosfatasa

Aldosa ReductasaGal Deshidrogenasa

UDP-Glu Pirofosforilasa

UDP-Gal Pirofosforilasa

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Cuando hay incapacidad de metabolizar galactosa por las rutas normales

� La “vía de la pirofosforilasa” con UDP Galactosa Pirofosforilasa y UDP Glucosa Pirofosforilasa (Reacción 6 yReacción 7)

� Aldosa Reductasa puede ser reducida a galactitol (Reacción 4)

� Galactosa-Deshidrogenasa a galactonato (Reacción 5)

DESORDENES HEREDITARIOS DEL METABOLISMO GALACTOSA

� Galactoquinasa (GALK)� Galactosa 1- Fosfato Uridil Transferasa

(GALT)� Uridina difosfato galactosa 4- Epimerasa

(GALE)

Galactoquinasa (GALK)� El gen GALK1 se encuentra en el

brazo largo (q) del cromosoma 17 en la posición 24

� La enzima se expresa en hígado, GR, leucocitos, fibroblastos, placenta

y varios tejidos fetales y adultos en humanos

El dominio N terminal de la enzima monomerica se muestra en azul y el dominio C-terminal en rojo. Se muestra el sitio activo donde se une galactosa y fosfato inorgánico

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Galactosa 1- Fosfato Uridil Transferasa (GALT)

� El gen que codifica GALT esta localizado en el cromosoma 9p13 y tiene una extensión de 4,3Kb, constituido por 11 exones.

� Las dos subunidades del dímero de la enzima se muestran en color rojo y azul. Se indica la posición de los metales en formas de esferas. En el sitio activo de la enzima se encuentra unido UDPglucosa.

� Tiene regulación dietaria y hormonal

Se expresa en hígado, ID, ovarios, cerebro, fibroblastos

y eritrocitos

Uridina difosfato galactosa 4-Epimerasa (GALE)

� El gen GALE mapea en el cromosoma 1p36. El gen incluye 12 exones que se extienden alrededor de 4 kb de ADN genómico

� Cada subunidad de la enzima dimerica se plega en dos dominios. Los dominios N y C terminal están en color azul y rojo, respectivamente. Unido al sitio activo NADH y UDP-glucosa. La enzima se expresa en hígado, mucosa intestinal, fibroblastos, eritrocitos.

Etiología� Incidencia global: 1/50.000 Patogenia

� La deficiencia de GALK impide la fosforilación de galactosa a Gal-1-P, lo que supone un acúmulo de galactosa en sangre, y la consiguiente producción de galactonato y galactitol

� El acúmulo de galactitol produce edema de las fibras del cristalino, y una desnaturalización de las proteínas, responsable probablemente del desarrollo de la catarata.

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Patogenia II

� En el déficit GALE se produce un acúmulo de UDPGal e incluso de Gal-1-P

� Hay un déficit en la síntesis endógena de galactosa y en la producción de galactolípidos y galactoproteínas

Patogenia III

� El déficit GALT se produce un aumento de Gal-1-P eritrocitaria y de la galactosa plasmática con la consiguiente galactosuria

� La galactosa en exceso en el plasma es convertida en galactonato, y en galactitol.

Aumento de Galactitol� Catarata nuclear “en gota de aceite” que puede

tener un inicio intrauterino, en casos excepcionales

Biología Molecular � Galactoquinasa Al menos 25 mutaciones

diferentes han sido identificados en los lugares de GALK galactocinasa en pacientes.

� La enzima humana incluye 392 aminoácidos con una masa molecular de 42 kDa

� Algunas de las mutaciones son: � 1569C→T en el exón 2 (R68C), � 7093C→T en el exón 6 (T 288M),� 7538G→C en el exón 8 (A384P) y � una deleción de un par de bases en el exón 5

(2833del C).

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Galactosa-1-Fosfato Uridil Transferasa

� Las 6 mutaciones más comunes p.Q188R, p.S135L, p.K285N, p.L195P, p.T138M y p.Y209C son el 80% de los casos de galactosemia clásica. Una 7ª mutación IVS 2-2 A>G ha sido descrita en la población hispana.

� Mutación N314D: Variantes

Deficiencia de GALT: Alelos Duarte: La mutación N314D esta asociada con dos variantes de galactosemia que tienen actividad de GALT alterada pero con fenotipos subclínicos diferentes.

� Duarte-1 (Los Angeles) � Esta asociado con

aumento de la actividad de GALT (110-130% de lo normal)

� N314D es un ligamiento en desequilibrio con la sustitución silenciosa L218L (c.652C>T).

� La frecuencia de los alelos D1 es de 2,7

� Duarte-1 (Los Angeles) � Esta asociado con

aumento de la actividad de GALT (110-130% de lo normal)

� N314D es un ligamiento en desequilibrio con la sustitución silenciosa L218L (c.652C>T).

� La frecuencia de los alelos D1 es de 2,7

� Duarte-2 (D2) � Esta asociado con

disminución de la actividad de GALT

� El polimorfismo N314D es un ligamiento en desequilibrio con 3 sustituciones intrónicas (IVS 4nt-27g>c; IVS 5nt-24g>a y IVS 5nt+62g>a) y una deleción de 4pb en el promotor de GALT

� La frecuencia de los alelos D2 es de 5,1

La variante Duarte es un alelo polimorfico del gen GALT que resulta en actividad alterada de

la enzima. Este polimorfismo común en la población es sin signos clínicos o síntomas

� El Alelo Duarte puede tener significanciaclínica con otras mutaciones en el gen GALT, llamadas galactosemia DG (genotipo Duarte/Galactosemia).

� La combinación de una mutación clásica (G) y la variante D muestra una disminución de la actividad de GALT pero no resulta típicamente en los síntomas de galactosemia clásica

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E- Déficit Inmunitario

Sepsis E. coli

D- Galactitol en plasma y orinaD- Tubulopatía proximal

C- Aumento de Gal-1-P en eritrocitos

C- Fracaso hepático graveIctericiaHepato-esplenomegaliaAscitisDiátesis hemorrágica

B- Aumento de galactosa en plasma

B- Tubulopatía proximal renalAcidosis hiperclorémicaGlucosuriaAminoaciduriaAlbuminuria

B- Afectación oftalmo-lógica.

Cataratas

A-GalactosuriaA- Disfunción HepáticaHiperbilirrubinemiaHipoalbuminemiaDéficit complejo protrombina� GOT, GPT, GGT, LDH�Acidos Biliares plasmáticos.Hipoglucemia

A- Síntomas TóxicosVómitosRechazo del alimentoDepresión neurológica

III- Bioquímica EspecíficaII- Bioquímica InespecíficaI-Clínica de sospecha

Tabla II: Diagnostico de sospecha de la Galactosemia

Diagnostico Bioquímico

�Determinación de metabolitos

�Determinación de actividad enzimática

Determinación de metabolitos:

� Galactosa en Orina� Gal-1-P en eritrocitos� Gal TOTAL en eritrocitos

ElevadaNormal - ElevadaGALE

ElevadaElevadaGALT

NormalElevadaGALK

Gal-1-P (sangre)Galactosa (Plasma u Orina)

Deficiencia

Tabla VIII: Resumen de los niveles de metabolitos

Galactosa en Orina: Pesquisa Neonatal

Galactosa + O2 � Ac.Galactónico + H2O2

H2O2 + Cromógeno � Cromógeno oxidado + H2O

Galactosa oxidasa

Peroxidasa

Los valores normales en RN:

• hasta 60mg/dl de orina

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Galactosuria Cuantitativa� D- Galactosa es oxidada a D-galactonolactona (que

en un medio alcalino se hidroliza espontáneamente) en presencia de la enzima galactosa deshidrogenasa (EC1.1.1.48).

� La formación de NADH es medido en un intervalo de 10’, por incremento en la absorbancia a 340nm que es proporcional a la cantidad de D-Galactosa en la muestra.

� Gal-1-P= Gal Total (2º) – Gal (1º)

Determinación Enzimática

� Galactosa 1- Fosfato Uridil

Transferasa (GALT) en eritrocitos

Galactosa-1-Fosfato Uridil Transferase (GALT), en Sangre

Hemolizado de GR

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Ausencia NADPH – No hay decoloración del Azul de Metileno

>>>> NADPH ⇒⇒⇒⇒ >>>> actividad de GALT ⇒⇒⇒⇒>>>> rapidez de decoloración de AM

� Análisis Molecular:

� Detección de Mutaciones por

amplificación por PCR+ER

En Brasil la galactosemia tiene una frecuencia de 1:19.984 recién nacidos.

� Q188R: exon 6, Por PCR se amplifica PA: 256 bp. El cambio de de una A por G crea un sitio de corte para la enzima de

restricción HpaI. El alelo Q188R genera dos bandas de 158 y 98 bp. El alelo normal tiene un fragmento de 256pb.

� N314D, Duarte 2 variant:exon 10, Por PCR se amplifica PA: 166pb La mutación genera un sitio de corte para la enzima Ava IIEl alelo N314D genera dos bandas de 100 y 66 bp. El alelo normal tiene un fragmento de 166pb.

� S135L: exon 5, Por PCR se amplifica PA: 252 bp. La mutación genera un sitio de corte para la enzima TaqI en el exón 5.

El alelo S135L genera dos bandas de 192 y 60 bp. El alelo normal tiene un fragmento de 252pb.

Mutación Q188R

Mutación N314D

Mutación S135L

After amplification, the PCR products were digested overnight at 37-C using theenzymes HpaII for exon 6, AvaII for exon 10 and TaqI for exon 5.

(A) Q188R – exon 6 GALT gene. L, marker; lane1, mutated homozygous (referred case); lanes 2

and 3, heterozygous (two screened cases) andlanes 4–10, homozygous wild-type allele.

(B) N314D – exon 10 GALT gene. L, marker; lane4, homozygous mutated allele (referred case); lanes 1, 2, 5 and 6, heterozygous and lines 3, 7–

10, homozygous wild-type allele

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??

Duarte 2 homocigota, DG??

Tratamiento� La galactosa de la dieta debe ser

eliminada ante la menor sospecha � La ingesta diaria no debería contener

nunca más de 125 mg de galactosa (frente a los 6.500 mg que por término medio tiene una dieta de un adulto normal);

� Una dieta estricta contiene aproximadamente unos 40 mg

Alimentos lácteos

� La leche y todos sus derivados son la principal fuente de galactosa liberada en el intestino mediante hidrólisis de la lactosa; y por tanto deben ser excluidos de la dieta en cualquiera de sus formas.

� La caseína es probablemente también una fuente importante de galactosa libre, ya que 100 gr. aportan 184 mg, y una fórmula láctea cuyas proteínas sean un hidrolizado de caseína, puede llegar a tener 60-75 mg por litro.

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Más de 400 mgHigos secos, pasas, avellanas

Garbanzos

Más de 100 mgLentejas, guisantes, porotos

Entre 30-50 mgSoja, alubias

Entre 20-30 mgArándano

Tomate

Entre 10-20 mgKivi, sandia, piña.

Col de Bruselas, calabazas, sandia, batata.

Entre 5-10 mgManzana, banana, pera.

Brócoli, zanahoria, cebolla, nabo.

Menos de 5 mgMelón, uva, pomelo, naranja, fresas

Espárragos, remolacha, repollo, coliflor, apio, pepino, berenjena, espinaca, lechuga y

maíz.

Tabla IV: Contenidos aproximados en galactosa soluble de algunosalimentos(mg/100 gr de alimentos)

Control del tratamiento:

� Los marcadores utilizados para el seguimiento del tratamiento dietético son los niveles de Galactosa-1-P eritrocitarios, y galactitol plasmático.

� Valores de 4 mg % de Gal-1-P, y de � 25-30 µmol/L de galactitol plasmático

(mg/dl =38 x µmol/L), es lo máximo que puedan aceptarse como buenos

Bibliografía:� - Baldellou A.; Briones P. y Ruiz M.� AECOM: Asociación Española para Estudio de Errores Congénitos del Metabolismo:

Protocolo 9: Galactosemia. Protocolo de diagnóstico y tratamiento de los errores congénitos del metabolismo de la galactosa

� - Segal SS ; Berry GT. Disorders of Galactose Metabolism. En Scriver CR, BeaudetAL, Sly W S, Valle D (eds). The metabolic and molecular bases of inherited disease. New York, McGraw Hill, 2001; pag. 967-1000

� - Annet M. Bosch. Classical galactosaemia revisited. J Inherit Metab Dis (2006) 29:516–525

� - J. DíazRuiz, A.CordónMartínez,J.LópezLópezyA.JuradoOrtiz. Galactosemia. An Pediatr (Barc). 2011

� JM Flanagan, G McMahon, SH Brendan Chia, P Fitzpatrick, O Tighe, C O’Neill, P Briones, L Gort, L Kozak, A Magee, E Naughten1, B Radomyska, M Schwartz, JS Shin, WM Strobl,

� LA Tyfield, HR Waterham, H Russell, G Bertorelle, JKV Reichardt, PD Mayneand DT Croke. 2010. The role of human demographic history in determining thedistribution and frequency of transferase-deficient galactosaemia mutations. Heredity 104, 148–154

� - Amanda E. Carney, Rebecca D. Sanders, Kerry R. Garza, Lee Anne McGaha, Lora J. H. Bean, Bradford W. Coffee, James W. Thomas, David J. Cutler,Natalie L. Kurtkaya and Judith L. Fridovich-Keil. Origins, distribution and expression of the Duarte-2 (D2) allele of galactose-1-phosphate uridylyltransferase. Human Molecular Genetics, 2009, Vol. 18, No. 9

� - Mohamed Jama, Lesa Nelson, Rong Mao and Elaine Lyon. Simultaneous Amplification, Detection, and Analysis of Common Mutations in the Galactose-1-Phosphate Uridyl Transferase Gene.J Mol Diagn 2007, 9:618–623.

� - Suzuki, M., West, C. and Beutler, E. (2001) Large-scale molecular screening for galactosemia alleles in a pan-ethnic population. Hum. Genet., 109, 210–215.

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Trastornos del metabolismo de la Fructosa

� Fructosuria esencial� Intolerancia hereditaria a la fructuosa� Deficiencia hereditaria de fructosa 1,6 bifosfatasa

Estructura

� No existen métodos específicos para la determinación de fructuosa en presencia de otros azucares. La mayoría de los métodos colorimétricos derivan de la reacción de Selivanoff

hidroximetilfurfural

resorcinol

Sin embargo, da positivo para las siguientes reacciones:

� Para confirmar la presencia de fructuosa se realiza por TLC y cromatografía liquida

Cromatografia de la orina del paciente y estándar de azucares.(Butanol-acido ácetico; 16 horas)

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� Fructuosa ingresa al enterocito a través del transportador apical GLUT5 por difusión facilitada.

� La captación desde el enterocito a la circulación portal es por medio del transportador basal GLUT2, el cual transporta también glucosa y galactosa.

Fosfohexosa isomerasa

Fosfofructo Quinasa-1 (PFK-1)

Aldolasa

MUSCULO

HIGADO

Fructuosa 1,6-bisfosfatasa (FBPasa-1)

Aldolasa B

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PFK-1 FBPasa-1

Glicerol, Lactato y Alanina

Glucosa

Enzimas del metabolismo de Fructuosa:

� Hexoquinasa (cerebro, músculo)� 1-Fosfofructoquinasa (músculo)

� Fructuosa 1,6 bisfosfatasa� Fructaldolasa (Fructuosa 1,6-difosfato

Aldolasa, Aldolasa)� Fructoquinasa (músculo e hígado)

� Fructuosa-1-fosfato aldolasa� Triosaquinasa

Efectos tóxicos de Fructuosa

� � Acido Úrico

� � Acido Láctico

2-Incremento de Lactato en sangre provocado por Fructuosa

� La mayor actividad de fructoquinasa comparada con la capacidad de la hexaquinasa + glucoquinasa para fosforilar glucosa;

� El hecho que en la fructolisis elude el paso de la vía glicolítica catalizado por la PFK-1 (fosfofructoquinasa) evita el punto principal de control metabólico a lo largo de la vía glicolítica;

� Una estimulación de piruvato quinasa, la segunda enzima regulatoria de la vía glicolítica, por fructosa 1−fosfato y por fructuosa 1,6− bisfosfato.

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Defectos hereditarios:

� Fructosuria benigna o esencial: Deficiencia de fructoquinasa (FK)

� Intolerancia hereditaria a la fructuosa: Deficiencia de la Aldolasa B

� Deficiencia hereditaria de fructosa 1,6 bifosfatasa

Fructosuria benigna o esencial: Deficiencia FK

� La enzima se expresa en hígado, riñón, intestino, islotes pancreáticos y corteza renal

� Esta enzima actúa en la conversión de fructosa a fru-1-P, de forma que la fructosa se acumula en la sangre y es eliminada por la orina aunque una parte, la ingerida, se puede metabolizar probablemente por otras vías minoritarias.

� Su frecuencia se estima en 1/120.000, aunque probablemente, dada su benignidad, haya muchos casos no diagnosticados y la frecuencia real sea superior.

� No ocasiona síntomas clínicos, por lo que su detección suele ser un hallazgo casual.

� Esto sucede al encontrar sustancias reductoras en orina en pacientes que están ingiriendo fructosa o alimentos que la contengan.

Fructosuria benigna o esencial: Deficiencia FK

Intolerancia hereditaria a la fructuosa: Deficiencia de la Aldolasa B

� Frecuencia se estima en 1/23-25.000� Hay falta de actividad del enzima fructosa-

1,6-difosfoaldolasa o aldolasa B. � Metabolito TOXICO que se acumula: Fru-1-

P� Produce agotamiento de los depósitos de Pi

hepáticos.� Cae la [ATP] celular

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Algunos efectos tóxicos observados con hiperfructosemia

� � Acido Úrico� � Acido Láctico � � Magnasemia� � Fosfatemia� � Glucemia� Acidosis metabólica

� ATP (40%)� Pi (80%)

AMP deaminasa

Condiciones Normales

(+)

Intolerancia de Fructosa Hereditaria

���� AMP deaminasa

5’ NucleotidasaAdenosina

deaminasa

adenosina kinasa

Nucleósido Fosforilasa

Xantina Oxidasa

Xantina Oxidasa

Adenilato kinasa

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Intolerancia hereditaria a la fructuosa: Deficiencia de la Aldolasa B

Intolerancia hereditaria a la fructuosa: Deficiencia de la Aldolasa B

� Laboratorio

Intolerancia hereditaria a la fructuosa: Deficiencia de la Aldolasa B

� Mutaciones en gen de Aldolasa B

Restringida a sujetos sicilianos

Cambio en marco de lectura

L288∆C

16 %A174D

67%A149P (G�C)

Población Europea (50 pacientes.)

Porcentaje de alelos con la

mutación

Mutación

� El primer paciente con una deficiencia de FDPase-1 fue descrita en 1970. Lospacientes se presentan con la hipoglucemia, acidosis, cetonuria, ehiperventilación

� Se trata de un defecto autonómico recesivo que se caracteriza en el periodo neonatal por presentar episodios de hiperventilación, apnea, hipoglucemia con cetosis y acidosis láctica

Deficiencia hereditaria de Fructosa-1 ,6-difosfatasa (FDPase-1) hepática

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� El bloqueo metabólico altera la vía de formación de glucosa a través de la neoglucogénesis incluyendo el glicerol, lactato y alanina.

� En un recién nacido o un individuo después de un ayuno prolongado aumenta la necesidad de obtención de energía y al estar bloqueada la neoglucogénesis se produce hipoglucemia, que normalmente estáacompañada de hiperlactatemia, aumento del ácido pirúvico y cuerpos cetónicos.

Deficiencia hereditaria de Fructosa-1 ,6-difosfatasa (FDPase-1) hepática

PFK-1 FBPasa-1

Glicerol, Lactato y Alanina

Glucosa

� El objetivo principal del tratamiento es prevenir hipoglucemias y

� Evitar la neoglucogénesis, proporcionando una dieta fraccionada, con ingesta elevada de carbohidratos compuestos (cereales integrales)

Deficiencia hereditaria de Fructosa-1 ,6-difosfatasa (FDPase-1) hepática Tratamiento:

� Consiste en eliminar la fructosa de la dieta con la dificultad que esto con lleva, dado que la sacarosa suele ser componente de numerosos productos.

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Bibliografía:

� Gitzelmann R., Steimann B., Van den Berghe G. Disorders of FructuoseMetabolism. En Scriver CR, Beaudet AL, Sly W S, Valle D (eds). The metabolic and molecular bases of inherited disease. New York, McGraw Hill, 2001; Chapter 23. pag. 905-934.

� Nadia Bouteldja & David J. Timson.The biochemical basis of hereditary fructose intolerance. J Inherit Metab Dis(2010) 33:105–112

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